TW202400224A - 用於冷凍乾燥血漿蛋白之新穎液體調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於血漿蛋白、尤其ADAMTS-13蛋白之醫藥調配物，及用於預防或治療血栓疾病之包含該血漿蛋白的組成物。本發明之醫藥調配物顯著改良血漿蛋白穩定性，該血漿蛋白由於自血液分離及純化之後隨即被污染及變性的風險高，因此其藥理學活性及品質在長期儲存期間劣化；且特定言之，本發明之醫藥調配物能夠維持血漿蛋白之膠體穩定性、冷藏穩定性、純度以及抑制血漿蛋白在高含量時聚集，且允許冷凍乾燥後的餅塊外觀得到長期良好維持。因此，本發明之醫藥調配物可有利地用於長期維持及儲存ADAMTS-13蛋白而不會使治療有效量的蛋白質出現損失，該蛋白質為用於治療各種血栓疾病的重要資源。

Description

用於冷凍乾燥血漿蛋白之新穎液體調配物
發明領域
本發明係關於血漿蛋白、尤其ADAMTS-13蛋白之液體調配物。
發明背景
在蛋白質藥物開發中，一個重要問題是開發出有效的冷凍乾燥調配物，以確保穩定性低的蛋白質具有足夠的儲存穩定性。調配物在冷凍乾燥製程開始之前，必需在液態下儲存特定的時段。為了防止此儲存期期間發生品質劣化，必需確保某種程度的穩定性，即使是液體調配物。
視材料特性而定，冷凍乾燥調配物中所用的賦形劑分為二種類型：結晶及非晶形。結晶賦形劑充當冷凍乾燥調配物中的增積劑且向冷凍乾燥的餅塊提供機械強度，從而使餅塊更穩固。典型的結晶賦形劑包括例如甘露糖醇及甘胺酸。另一方面，非晶形賦形劑充當冷凍乾燥調配物中的蛋白質穩定劑，鄰近於蛋白質存在且用於使蛋白質穩定以防在冷凍乾燥製程期間產生的應力。
同時，蛋白質藥物調配物中主要使用的氯化鈉可以二種形式存在：非晶形及結晶，此視添加的濃度而定。一般而言，已報導，當NaCl以150 mM或更小之濃度添加時，其主要呈非晶態，且當其以200 mM或更大之濃度添加時，其大部分發生結晶。
冷凍乾燥調配物中的穩定劑保護蛋白質且使蛋白質穩定以防在冷凍乾燥製程期間產生的應力，且在乾燥完成之後的儲存及復原期間亦促成蛋白質穩定。因此，就蛋白質用作治療資源的價值及效用而言，特別是在預定藉由冷凍乾燥進行長期儲存的蛋白質調配物中，搜尋最佳穩定劑組分及他們之間的最佳含量比與發現新藥理學成分同樣重要。
整篇說明書中提及且引述了多個出版物及專利文獻。所引述之出版物及專利文獻的揭示內容以全文引用之方式併入本文中，以便更清楚地描述相關技術之狀況及本發明之內容。
發明概要 技術問題
本發明人已進行充分的研究，以便開發出一種改良血漿蛋白穩定性的極佳液體調配物，該血漿蛋白在自血液分離及純化後隨即被污染及變性的風險高；且該極佳液體調配物能夠長期維持血漿蛋白的物理特性、生物活性及藥理學作用，甚至尤其在冷凍乾燥期間。因此，本發明人已發現，當一調配物包含0至1.5 w/v%糖穩定劑(具體言之，蔗糖)以及100 mM至400 mM無機鹽(具體言之，NaCl)時，該調配物就各種指標而言展現明顯出色的穩定性，包括膠體穩定性、冷藏穩定性、抑制蛋白質去摺疊、阻斷蛋白質聚集，及冷凍乾燥之後的餅塊外觀，藉此完成本發明。
因此，本發明之一目標為提供血漿蛋白之醫藥調配物。
本發明之另一目標為提供一種用於預防或治療血栓疾病的組成物。
本發明之其他目標及優點自本發明之以下實施方式、隨附申請專利範圍及附圖將變得更顯而易見。 技術解決方案
在本發明之一個態樣中，提供一種醫藥調配物，其包含以調配物之總體積計0至1.5 w/v%之量的糖穩定劑以及100 mM至400 mM無機鹽。
本發明人已進行充分的研究，以便開發出一種改良血漿蛋白穩定性的極佳液體調配物，該血漿蛋白在自血液分離及純化後隨即被污染及變性的風險高；且該極佳液體調配物能夠長期維持血漿蛋白的物理特性、生物活性及藥理學作用，甚至尤其在冷凍乾燥期間。因此，本發明人已發現，當一調配物包含0至1.5 w/v%糖穩定劑(具體言之，蔗糖)以及100 mM至400 Mm無機鹽(具體言之，NaCl)時，該調配物就各種指標而言展現明顯出色的穩定性，包括膠體穩定性、冷藏穩定性、抑制蛋白質去摺疊、阻斷蛋白質聚集，及冷凍乾燥之後的餅塊外觀。
如本文所用，術語「血漿蛋白」係指存在於人類或動物血漿中的水溶性蛋白質，包括血液中的所有蛋白質組分(除白血細胞及紅血細胞中所含之彼等組分之外)。血漿蛋白佔總血漿之約8%且負責止血(凝血酶原及血纖維蛋白原)、激素轉運(血清白蛋白、脂蛋白等)及免疫作用(免疫球蛋白及補體蛋白)。血漿蛋白可藉由此項技術中已知之各種分級分離及純化方法獲得，但必須克服由於長期儲存及環境變化所致的化學及物理不穩定性問題。物理不穩定性涉及不引起蛋白質共價變化的修改，亦即，吸附、聚集及沈澱，且化學不穩定性涉及諸如以下之修改：去醯胺化、外消旋化、水解、氧化、β-消去及二硫鍵交換。此等不穩定性引起內在生物活性的變化及藥理學作用的降低。
如本文所用，術語「穩定劑」係指添加至調配物中的任何添加劑，以增強活性成分穩定性且防止活性成分被任意地變性、氧化、聚集、結晶或修飾成相關物質，藉此防止活性成分之藥理學活性消失或減小。穩定劑不受特別限制，只要其在醫藥學上可接受即可。
術語「糖穩定劑」係指藉由將糖作為主要組分或輔助組分添加至調配物中來誘導上述穩定作用的穩定劑。
根據本發明之一具體實施例，糖為選自由以下組成之群的至少一者：蔗糖、海藻糖及其醫藥學上可接受之鹽。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」包括衍生自醫藥學上可接受之無機酸、有機酸或鹼的鹽。適合酸之實例包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、甲苯-對磺酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、甲烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸及其類似物。衍生自適合鹼之鹽實例包括鹼金屬(諸如鈉)、鹼土金屬(諸如鎂)、銨之鹽及其類似物。
如本文所用，術語「無機鹽」係指衍生自不含C-H鍵之無機物質的鹽，其為由水溶液中之陽離子與陰離子之離子組合組成的鹽。可用於本發明中之無機鹽實例包括但不限於NaCl、CaCl 2、KCl、MgCl 2及其組合。具體而言，本發明之無機鹽為NaCl與CaCl 2之混合物。
根據一具體實施例，以調配物之總體積計，本發明之調配物包含0.5至1.3 w/v% (具體言之，0.7至1.3 w/v%，更具體言之，0.9至1.1 w/v%，且最具體言之，約1 w/v%)之量的糖穩定劑。
根據一具體實施例，本發明之調配物包含150 mM至350 mM無機鹽。
更具體而言，當以調配物之總體積計包含0至1 w/v%之量的糖穩定劑時，包含120 mM至200 mM之量的無機鹽。
更具體而言，當以調配物之總體積計包含1.4至1.6 w/v%之量的糖穩定劑時，包含160 mM至200 mM之量的無機鹽。
更具體而言，當以調配物之總體積計包含1.9至2.1 w/v%之量的糖穩定劑時，包含約200 mM之量的無機鹽。
根據一具體實施例，在無機鹽中，包含2 mM至6 mM (更具體言之，3 mM至5 mM，且最具體言之，約4 mM)之量的CaCl 2。
根據本發明之一具體實施例，本發明之調配物包含10 mM至30 mM組胺酸，更具體言之，15 mM至25 mM組胺酸，最具體言之，約20 mM組胺酸。
根據本發明之一具體實施例，調配物進一步包含40 mM至200 mM胺基酸穩定劑。
術語「胺基酸穩定劑」係指藉由將胺基酸作為主要組分或輔助組分添加至調配物中來誘導上述穩定作用的穩定劑。
根據一具體實施例，本發明之調配物包含60 mM至180 mM胺基酸穩定劑，更具體言之，60 mM至160 mM胺基酸穩定劑，甚至更具體言之，60 mM至140 mM胺基酸穩定劑，甚至更具體言之，80 mM至135 mM胺基酸穩定劑，甚至更具體言之，100 mM至130 mM胺基酸穩定劑，且最具體言之，約120 mM胺基酸穩定劑。
根據本發明之一具體實施例，胺基酸為選自由以下組成之群的至少一者：精胺酸(Arg)、脯胺酸(Pro)及其醫藥學上可接受之鹽。
根據一具體實施例，當本發明之調配物中進一步包含40 mM至200 mM之量的胺基酸穩定劑時，以調配物之總體積計包含0至1.5 w/v%之量的糖穩定劑，且包含200 mM至300 mM之量的無機鹽。
更具體而言，以調配物之總體積計，包含0.5至1.3 w/v% (甚至更具體言之，0.7至1.3 w/v%，甚至更具體言之，0.9至1.1 w/v%，且最具體言之，約1 w/v%)之量的糖穩定劑。
更具體而言，當以調配物之總體積計包含0至0.6 w/v%之量的糖穩定劑時，包含200 mM至280 mM之量的無機鹽。
更具體而言，當以調配物之總體積計包含0.9至1.1 w/v%之量的糖穩定劑時，包含240 mM至280 mM之量的無機鹽。
本發明人已發現，胺基酸穩定劑、糖穩定劑及無機鹽各自對彼此的最佳含量具有相互影響，且詳言之，液體調配物冷凍乾燥之後用於維持良好餅塊特性的條件根據是否添加胺基酸穩定劑而不同。當調配物中主要含有100 mM至140 mM胺基酸(具體言之，精胺酸)時，即使添加1.0%糖穩定劑時，亦可添加至多280 mM的無機鹽。因此，在需要增加非晶形穩定劑(諸如蔗糖或精胺酸)含量以達成產物穩定性的情況下，可藉由增加無機鹽含量來維持餅塊特性。
根據本發明之一具體實施例，以調配物之總體積計，調配物進一步包含0.01至0.1 v/v%之量的非離子界面活性劑。
如本文所用，術語「界面活性劑」係指用於增強疏水性材料之水溶性或用於增強具有不同疏水性之多種材料之相容性的可溶化合物。術語「非離子界面活性劑」係指一種界面活性劑，由於其整個分子結構不含有電離的官能基或原子基團，因此其即使溶解於水溶液中亦不解離。
根據本發明之一具體實施例，可用於本發明中的非離子界面活性劑為選自由聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60及聚山梨醇酯40組成之群的至少一者，且更具體言之，為聚山梨醇酯80。
根據本發明之一具體實施例，本發明之調配物包含0.03至0.08 v/v%的非離子界面活性劑，最具體言之，約0.05 v/v%的非離子界面活性劑。
根據本發明之一具體實施例，所施用之本發明調配物中的血漿蛋白為ADAMTS13 (具有凝血栓蛋白1型模體的解整合素及金屬蛋白酶，成員13)蛋白質、其變異體或其功能片段。
如本文所用，術語「功能片段」係指全長蛋白質缺失一或多個胺基酸殘基而產生的片段，其為保持全長蛋白質之生物活性及功能的全長蛋白質類似物。
根據本發明，SEQ ID NO: 1為由1,427個胺基酸組成的ADAMTS13蛋白之胺基酸序列。因此，根據本發明的ADAMTS13變異體蛋白或其功能片段可為ADAMTS13變異體，其中胺基酸突變已引入全長(1,427個a.a.) ADAMTS13蛋白或其包含75至685個a.a.區域的片段中。包含75至685個a.a.區域的片段可為例如1至685個a.a. (685個a.a.)或75至685個a.a. (611個a.a.)區域。
SEQ ID NO: 1為ADAMTS13蛋白之胺基酸序列且基本上包含ADAMTS13蛋白之功能片段，亦包括與上述序列顯示基本一致性的胺基酸序列。如本文所用，術語「基本一致性」係指當一種胺基酸序列與任何其他序列對準以便儘可能多地對應且利用此項技術中常用的算法分析所比對的序列時，該胺基酸序列顯示至少70%同源性(具體言之，至少80%同源性，更具體言之，至少90%同源性，最具體言之，至少95%同源性)。
根據本發明之一具體實施例，ADAMTS13蛋白之變異體包含SEQ ID NO: 1之至少一個胺基酸殘基的取代，該至少一個胺基酸殘基選自由以下位置的殘基組成之群：85、93、126、135、278、282、308、314、317、334、364、376、413、427、452、465、567、578、585、589、607、608、609、612、618、624、630、635、643、650、651、654、655、656、658、664及672。
本發明人已鑑別出由抗ADAMTS13自體抗體識別的核心區，且已發現，當對此等區域中之一些胺基酸進行取代時，可阻斷此等區域結合至自體抗體且可維持vWF降解活性及其血栓症抑制活性。因此，上述位置具有突變的ADAMTS13蛋白可作為有效的治療組成物用於由過度血栓形成引起的各種疾病，包括血栓性血小板減少性紫癲(TTP)。
如本文所用，術語「自體抗體」係指由個體自身免疫系統產生的抗體，其識別且靶向個體自身蛋白質。自體抗體為包含至少一個結合至抗原之抗原決定基之可變域且特異性地識別該抗原的免疫球蛋白蛋白質。自體抗體的存在引起自體抗體特異性識別之蛋白質降解或固有功能或生物活性損失且從而引起各種疾病。
根據本發明之一具體實施例，ADAMTS13蛋白之變異體選自由變異體蛋白組成之群，該等變異體蛋白包含以下位置之胺基酸殘基的取代：
位置85及317；位置612；位置282、465及672；位置635中之二者或更多者；位置452及612；位置278、334及427中之二者或更多者；位置618；位置135；位置126、567及651中之二者或更多者；位置413；位置334；位置314；位置93、364及376中之二者或更多者；位置308；位置656；位置607；位置612及624；位置589；位置650及656；位置643；位置585及658；位置630、654及664中之二者或更多者；位置589、608、609、624及655中之四者或更多者；位置578；位置585；位置314及635；及位置314及612。
更具體而言，胺基酸殘基之取代為選自由以下組成之群的至少一者：在位置85經Phe取代、在位置93經Val取代、在位置126經Met取代、在位置135經Ile取代、在位置278經Ile取代、在位置282經Ala取代、在位置308經Lys取代、在位置314經Thr取代、在位置317經His取代、在位置334經Thr或Val取代、在位置364經Arg取代、在位置376經Asp取代、在位置413經Asp取代、在位置427經Asn取代、在位置452經Ile取代、在位置465經Asp取代、在位置567經Ser取代、在位置578經Leu取代、在位置585經Asn或Met取代、在位置589經Gln取代、在位置607經Arg取代、在位置608經Met取代、在位置609經Leu取代、在位置612經Phe或Tyr取代、在位置618經Ser取代、在位置624經Asp或Cys取代、在位置630經Leu取代、在位置635經Val取代、在位置643經Phe取代、在位置650經His取代、在位置651經Asp取代、在位置654經Gly取代、在位置655經Val取代、在位置656經Arg或His取代、在位置658經His取代、在位置664經Asn取代，以及在位置672經Val取代。
根據本發明之一具體實施例，本發明之血漿蛋白與衍生自IgG4免疫球蛋白的Fc區結合。
本發明人已發現，當衍生自IgG4免疫球蛋白的Fc區與本發明之ADAMTS13變異體蛋白結合時，變異體蛋白的活體內穩定性大大增加，同時維持固有的vWF裂解活性及其中和抗體逃逸活性，且特定言之，以開放式片段呈現的結構不穩定性顯著減小，該等開放式片段已自ADAMTS13之C端之一部分移除。
根據本發明的一更具體實施例，Fc區包含至少一個胺基酸殘基的取代，該至少一個胺基酸殘基選自由SEQ ID NO: 2之位置22、24及26的殘基組成之群。更具體而言，胺基酸殘基的取代為選自由以下組成之群的至少一者：在位置22經Tyr取代、在位置24經Thr取代，及在位置26經Glu取代。
根據本發明，SEQ ID NO: 2為衍生自IgG4免疫球蛋白之Fc區(217個a.a.)的胺基酸序列。本發明人已發現，當來源於IgG4免疫球蛋白的Fc區[IgG4 (YTE)](其中位置22、24及26之殘基分別經Tyr、Thr及Glu取代)與上述ADAMTS13變異體蛋白或其功能片段融合時，該蛋白質的血液半衰期可最大化且其在投予之後的生理學活性可長時間維持。
根據本發明之一具體實施例，血漿蛋白與來源於IgG4免疫球蛋白的Fc區之間進一步包含來源於IgG1免疫球蛋白的鉸鏈區。
根據本發明，來源於IgG1免疫球蛋白的鉸鏈區可由SEQ ID NO: 3 (15 a.a.)表示。
在本發明之另一態樣中，提供一種用於預防或治療血栓疾病的組成物，該組成物包含本發明之上述醫藥調配物作為活性成分，該醫藥調配物含有ADAMTS13蛋白、其變異體或其功能片段作為血漿蛋白。
如本文所用，術語「血栓疾病」係指一種全身性疾病，其中血流由於血管之微循環系統中之血小板凝集產生血凝塊而減少或被阻斷，對諸如腎臟、心臟及腦之器官產生局部缺血性損傷。
若ADAMTS13酶活性被中和抗體抑制且未能恰當地降解Willebrand因子(vWF)，則發生過度的血小板凝集及血栓的過度產生。因此，高效率逃避中和抗體、同時維持或改良其vWF降解活性的本發明ADAMTS13變異體蛋白可用作針對各種血栓性疾病的有效預防或治療組成物。
如本文所用，術語「預防」意謂遏制尚未診斷患有病症或疾病、但可能會罹患該病症或疾病之個體發生該病症或疾病。
如本文所用，術語「治療」係指(a)抑制病症、疾病或病狀發展；(b)緩解病症、疾病或病狀；或(c)消除病症、疾病或病狀。當本發明之組成物投予個體時，其用於特異性地識別且降解vWF (不論中和抗體存在或不存在)，藉此阻斷血凝塊形成，藉此抑制血栓性疾病進展，或消除或緩解血栓疾病。因此，本發明之組成物可為用於單獨治療此等疾病的組成物，或可作為治療佐劑與其他藥理學成分一起投予，用於治療上述疾病。因此，如本文所用，術語「治療」或「治療劑」包括「治療助劑」或「治療佐劑」的含義。
如本文所用，術語「投予(administration)」或「投予(administer)」係指將治療有效量之本發明組成物直接投予個體，以便在個體之身體中形成相同的量。
如本文所用，術語「治療有效量」意謂醫藥組成物的含量，其足以將組成物中所含之藥理學組分的治療或預防作用提供給待投予組成物的個體，且因此意欲包括「預防有效量」。
如本文所用，術語「個體」包括(不限於)人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、犬、貓、馬、乳牛、豬、猴、黑猩猩、狒狒或恆河猴。具體而言，本發明之個體為人類。
根據本發明之一具體實施例，血栓疾病為血栓微血管病(TMA)。更具體而言，血栓微血管病選自由以下組成之群：血小板減少性紫癲(TTP)、溶血尿毒症候群(HUS)、HELLP (溶血、升高的肝酶、低血小板計數)、子癇前症及鐮狀細胞疾病。仍更具體而言，血栓微血管病為血小板減少性紫癲或鐮狀細胞疾病。最具體而言，血栓微血管病為血小板減少性紫癲。
在本發明之另一態樣中，提供一種用於預防或治療血栓疾病的方法，該方法包括將本發明之上述醫藥調配物投予個體，該醫藥調配物包含ADAMTS13蛋白、其變異體或其功能片段作為血漿蛋白。
由於本發明所用之血漿蛋白、用於調配其的組分及可用其預防或治療的血栓疾病已描述如上，因此其在本文中省去以避免過度重疊。 有利效應
本發明之特點及優點概述如下：
(a)本發明提供血漿蛋白、尤其ADAMTS-13蛋白之醫藥調配物，及用於預防或治療血栓疾病之包含該血漿蛋白的組成物。
(b)本發明之醫藥調配物顯著改良血漿蛋白之穩定性，該血漿蛋白由於自血液分離及純化之後隨即被污染及變性的風險高，因此其藥理學活性及品質在長期儲存期間劣化；且特定言之，本發明之醫藥調配物能夠維持血漿蛋白之膠體穩定性、冷藏穩定性、純度以及抑制血漿蛋白在高含量時聚集，且允許冷凍乾燥之後的餅塊外觀得到長期良好的維持。因此，本發明之醫藥調配物可有利地用於長期維持及儲存ADAMTS-13蛋白而不會使治療有效量的蛋白質出現損失，該蛋白質為用於治療各種血栓疾病的重要資源。
較佳實施例之詳細說明
在下文中，將參照實例更詳細地描述本發明。此等實例僅用於更詳細地解釋本發明，且對於熟習此項技術者顯而易見的是，根據本發明之標的之本發明範圍不受以下實例限制。
實例
實例1 ： 選擇用於調配ADAMTS13 蛋白的組分
經由以下方法測定下述實例3中所述之ADAMTS13蛋白液體調配物中的各組分及含量。
冷凍乾燥製程
調配完成之後，將1.0 ml各樣品溶液分配至各玻璃瓶(3 ml)中，接著用橡膠塞部分地塞住且負載於冷冷凍乾燥燥器(Lyostar 3, SP Scientific)之擱架上。隨後，在下表1中所示之條件下執行冷凍乾燥，且製成的冷凍乾燥調配物在冷凍乾燥完成之後用鋁蓋蓋好。
[表1]
步驟 操作 評級/保持 存放溫度 時間(min) 真空度(mTorr)
1 負載 保持 5℃ 20 N/A
2 冷凍乾燥 評級 -55℃ 200 N/A
3 冷凍乾燥 保持 -55℃ 300 N/A
4 第一次升溫 評級 -25℃ 100 60
5 第一次乾燥 保持 -25℃ 2000 60
7 第二次升溫 評級 25℃ 167 50
8 第二次乾燥 保持 25℃ 600 50
用1.0 ml蒸餾水復原之後，分析所製備之冷凍乾燥調配物的穩定性。
尺寸排阻液相層析(SE-HPLC)
為了進行尺寸排阻液相層析，樣品用移動相(1×PBS, Lonza)稀釋至1.0 mg/ml (1.0 mg/mml或更小的樣品不稀釋)且接著無菌過濾。將200 μL過濾樣品插入小瓶插件中，接著插入螺旋蓋小瓶中。接著，將移動相連通至泵浦，且接著將分析管柱(TSKgel G3000SWXL, Tosoh)安裝於Waters e2695及Waters 2489系統(日本Waters)中，同時允許移動相以0.5 mL/min之流量流動。允許移動相以0.5 mL/min之速率流動超過30分鐘以達到平衡，直至偵測器信號穩定。當自動取樣器的溫度下降至4℃時，將樣品插入取樣器中。注射30 μL樣品，且接著使移動相流動35分鐘，且量測280 nm偵測峰值。接著，在PC上使用Empower Pro軟體執行分析。
膠體穩定性(B 22)
由於蛋白質-蛋白質相互作用程度影響聚集及溶解性，因此膠體穩定性為蛋白質調配物開發中必須被考慮的重要項。使用B 22(第二維里係數(virial coefficient))，一種有代表性的膠體穩定性指標。一般而言，當B 22值為大正值時，蛋白質之間的排斥力強且發生聚集的機率降低。
將待分析的樣品稀釋成5種濃度(1.2、0.96、0.72、0.48及0.24 mg/ml)之後，將8.8 μL稀釋樣品重複三次注入Uni樣品裝載器(Unchained Labs)中。在各種相應濃度下量測散射光強度且減去安慰劑緩衝液之散射光強度之後，使用Zimm式計算最終B 22值。使用UNcle分析軟體(Unchained Labs)進行螢光資料分析。
濁度分析
使用Lunatic (Unchained Labs)分析濁度。將2.0 µL樣品注射至Lunatic盤中且在350 nm量測濁度。藉由自樣品濁度值減去安慰劑緩衝液之濁度來計算終值。
熱去摺疊 及熱聚集分析
可如下量測蛋白質去摺疊程度：隨著溫度升高，當蛋白質去摺疊時，偵測表面上所暴露之色胺酸的發射波長。UNCLE (Unchained Labs)系統用於差示掃描螢光測定分析，該分析基於此內在螢光強度。為了使用上述系統分析蛋白質的熱穩定性，如下量測T m(熱去摺疊)及T agg(熱聚集)：
將8.8 μL樣品兩次注入Uni樣品裝載器(Unchained Labs)中，且接著以1℃/min的速率使溫度自25℃升高至95℃。在升高溫度的同時，量測在266 nm之激發波長下發射之波長(250-720 nm)的強度。使用UNCLE分析軟體(Unchained Labs)進行螢光資料分析。
經由上述分析，螢光發射峰處於最大值時的溫度定義為T m。量測蛋白質在266 nm的靜態光散射(SLS266)，且蛋白質聚集開始時的溫度(蛋白質聚集起始溫度)定義為T agg。
評價冷凍乾燥組成物的品質取決於NaCl 濃度
以50、100、120、150、200及300 mM的濃度將NaCl添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果證實當NaCl濃度增加時，餅塊外觀更堅硬且更佳(圖1a)。然而，作為SE-HPLC的結果，觀測到取決於NaCl濃度的純度無顯著差異(圖1b)。
評價取決於NaCl 濃度的液相穩定性
以0、40、80、120及160 mM的濃度將NaCl添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及20 mM精胺酸的鹼性組成物(pH 7.4)中。在室溫下儲存期間的第4、8及12小時，對所調配的各液體樣品進行SE-HPLC分析。因此，如圖2中所示，已證實NaCl濃度愈高，則液相穩定性愈佳。
評價冷凍乾燥組成物的品質取決於糖濃度(120 mM NaCl)
將蔗糖以0.0、0.5、1.0或2.0% (w/v)或將海藻糖以1.0% (w/v)添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、120 mM NaCl、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果證實，在120 mM NaCl下，當添加1.0%蔗糖時未發生塌縮，但當添加2.0%蔗糖時發生塌縮，表明塌縮起始時的蔗糖濃度在1.0與2.0%之間(圖3a)。含有1.0%海藻糖之調配物顯示的外觀類似於含有1.0%蔗糖之調配物的外觀(圖3a)。同時，SE-HPLC的結果證實，觀測到取決於糖添加濃度之純度無顯著差異，表明即使當塌縮發生時，純度亦得以維持(圖3b)。
評價冷凍乾燥組成物的品質取決於蔗糖與增積劑之間的含量比(120 mM NaCl)
將蔗糖與增積劑(甘露糖醇或甘胺酸)以1.0/3.0% (w/v)(1:3含量比)或2.0/2.0% (w/v)(1:1含量比)添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、120 mM NaCl、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果證實，當NaCl固定在120 mM且蔗糖與增積劑以1:3或2:2之含量比添加時，在所有情況下發生塌縮(圖4a)，且SE-HPLC結果顯示樣品之間無顯著差異(圖4b)。
評價冷凍乾燥品質取決於甘胺酸濃度(120 mM NaCl)
將甘胺酸以0、20、40、60、80及100 mM的濃度添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、120 mM NaCl、1.0%蔗糖、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果可發現，當固定地添加120 mM NaCl及1.0%蔗糖且增加甘胺酸濃度時，餅塊外觀受到不利的影響，且當甘胺酸以60 mM或更大之濃度添加時，餅塊完全塌陷(圖5)。
評價冷凍乾燥品質取決於精胺酸濃度(120 mM NaCl)
將精胺酸以0、20、60及100 mM的濃度添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、120 mM NaCl、1.0%蔗糖、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果證實，當固定地添加120 mM NaCl及1.0%蔗糖且增加精胺酸濃度時，餅塊外觀受到不利的影響，且當精胺酸以60 mM或更大之濃度添加時，餅塊完全塌陷(圖6)。
評價冷凍乾燥品質取決於NaCl 與 蔗糖之間的含量比( 無 精胺酸)
向含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為120、160及200 mM的NaCl，且添加濃度為1.0、1.5及2.0% (w/v)的蔗糖。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果顯示，當增加NaCl濃度時且當降低蔗糖濃度時，餅塊外觀更佳。具體而言，已證實i)當添加120 mM NaCl時，在1.0至1.5%的蔗糖濃度範圍內開始塌縮；ii)當添加160 mM NaCl時，在1.5至2.0%的蔗糖濃度範圍內開始塌縮，以及iii)當添加200 mM NaCl時，在高於2.0%的蔗糖濃度下開始塌縮(圖7a)。
同時，SE-HPLC的結果證實，當不添加精胺酸時，未觀測到取決於NaCl與蔗糖之間之含量比的顯著變化(圖7b)。
評價冷凍乾燥品質取決於NaCl 與 蔗糖之間的含量比(120 mM 精胺酸)
向含有0.5 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、0.05% PS80及120 mM精胺酸的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為160、200、240及280 mM的NaCl且添加濃度為0.0、0.5及1.0% (w/v)的蔗糖。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀且進行SE-HPLC分析。結果證實，當固定地添加120 mM精胺酸時，隨著NaCl濃度增加且隨著蔗糖濃度降低，餅塊外觀堅硬。具體而言，可發現當i)添加160 mM NaCl時，在0.0至0.5%的蔗糖濃度範圍內開始塌縮；ii)當添加200 mM NaCl時，在高於1.0%的蔗糖濃度下開始塌縮；iii)當添加240 mM NaCl時，在高於1.0%的蔗糖濃度下開始塌縮，以及iv)當添加280 mM NaCl時，在高於1.0%的蔗糖濃度下開始塌縮(圖8a)。
同時，SE-HPLC結果證實，當添加120 mM精胺酸時，未觀測到取決於NaCl及蔗糖之濃度的純度發生明顯變化，但含有160 mM NaCl且無蔗糖之調配物的純度為97.4%，相對低於其他樣品之純度(圖8b)。
評價冷凍乾燥穩定性取決於NaCl 與 蔗糖之混合比率(120 mM 精胺酸)
向含有0.5 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、0.05% PS80及120 mM精胺酸的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為200、240及280 mM的NaCl且添加濃度為0.0、0.5及1.0% (w/v)的蔗糖。將所調配的各樣品冷凍乾燥且評價其經加速的穩定性(40℃)。結果證實，相較於初始階段，在120 mM精胺酸存在下，在40℃下經歷1個月後之取決於NaCl與蔗糖混合比率的純度未發生顯著變化(圖9)。
評價五種穩定劑的膠體穩定性 (UNCLE 、B 22 )
為了評價五種穩定劑的膠體穩定性，將100 mM甘胺酸、離胺酸、脯胺酸、丙胺酸或精胺酸作為胺基酸添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、120 mM NaCl及1.0%蔗糖的鹼性組成物(pH 7.4)中。
使用UNCLE裝置分析各種所調配之組成物之液體樣品(B 22)的膠體穩定性。
較高的正B 22值意謂蛋白質分散良好而無聚集。因此，如圖10中所示，膠體穩定性之高低順序經證實為：精胺酸＞甘胺酸＞脯胺酸＞丙胺酸＞離胺酸＞對照。
針對七種穩定劑之SE -HPLC 評價
將100 mM精胺酸、絲胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、脯胺酸或甘胺酸作為胺基酸穩定劑添加至含有0.9 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、2.0 mM CaCl 2及120 mM NaCl的鹼性組成物(pH 7.4)中，或將1.0 w/v%蔗糖作為糖穩定劑添加至鹼性組成物中。
調配完成之後，將各種組成物的液體樣品在室溫下儲存7小時且接著進行SE-HPLC分析。因此，如圖11中所示，已證實精胺酸在為了比較而測試的七種穩定劑中展現出最佳的液相穩定性且穩定性及純度的高低順序為：精胺酸＞蔗糖＞脯胺酸＞甘胺酸＞纈胺酸，蘇胺酸＞對照＞絲胺酸。
評價液相穩定性取決於精胺酸的添加
為了評價液相穩定性取決於是否將20 mM精胺酸添加至含有0.049 mg/mL ADAMTS蛋白、15 mM磷酸鈉及50 mM NaCl的組成物(pH 7.4)中，將所調配的液體樣品在室溫下儲存3小時及19小時且接著在各分析時間點藉由SE-HPLC加以分析。因此，如圖12中所示，已證實當添加20 mM精胺酸時，5℃下的冷藏穩定性相較於對照發生顯著改良。
評價液相穩定性取決於目標蛋白質濃度及精胺酸濃度
SE-HPLC分析
向含有20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2及160 mM NaCl的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為0.2、0.6及1.0 mg/ml的ADAMTS蛋白，且添加濃度為20、80及140 mM的精胺酸，從而製備液體樣品。評價各液體樣品的穩定性。
將所調配的各樣品在室溫下儲存18小時且接著進行SE-HPLC。因此，如圖13a中所示，已證實當目標蛋白質的濃度降低時且當精胺酸濃度增加時，純度增加。
DOE設計
同時，執行DOE (實驗設計)以更密切地探究精胺酸及目標蛋白質的最佳濃度。將二種操作參數精胺酸濃度及ADAMTS蛋白濃度設定為因子(X值)且將純度(SE-HPLC)設定為反應(Y值)，且接著使用JMP ®10.0統計程式執行DOE設計。具體而言，使用反應表面模型(RSM)，且將軸向點設定為中央合成設計(CCD)類型。最終，設計總共9種運作條件，包括「2個因子的全階乘設計：2種位準的4次運作 + 中心點1次運作 + 軸上點4次運作」。
根據DOE條件，將精胺酸添加至樣品儲備溶液(1.1 mg/mL)中，且稀釋樣品溶液，在室溫(約15至25℃)下擱置18小時，且接著進行SE-HPLC分析。
利用逐步回歸、經由多元回歸分析執行DOE統計分析，且模型的建立遵循反應表面模型化方法。利用JMP的Fit模型方法進行分析，且模型中利用的效應包括二種主要效應：雙因子相互作用，及各種主效應的平方項。作為用於移除無意義因子及選擇有效項的終止規則，使用P值臨限值(P值≤0.25，方向：混合)。
作為分析結果，模型之R方為0.96且R方校正值為0.94。模型之ANOVA (變異數分析) P值為0.0006，其小於0.05的有效位準，表明此模型有效。
根據P值低於有效位準α=0.05而視為有效的因子為主效應蛋白質濃度及主效應精胺酸濃度。精胺酸*精胺酸曲率的P值為0.0765，其接近於有效位準α=0.05 (圖13b)。
作為預測分析器分析的結果，可發現在約120 mM精胺酸時，單體%值最高，表明100至140 mM為最佳的精胺酸濃度(圖13c)。
防止攪拌誘導的聚集 ， 此聚集取決於聚山梨醇酯80 濃度
將聚山梨醇酯80以0.0、0.001、0.005、0.01、0.05及0.1% (v/v)的濃度添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、120 mM NaCl及1.0%蔗糖的鹼性組成物(pH 7.4)中。使所調配的各液體樣品渦旋以產生人工剪應力，且接著加以分析(外觀、濁度及SE-HPLC)。攪拌開始之後的30秒及2分鐘取樣加以分析。攪拌2分鐘之後分析外觀的結果證實，當聚山梨醇酯80以0.005%或更大之濃度添加時，樣品變得澄清且透明(圖14a)。
同時可發現，當聚山梨醇酯80以0.005%或更大之濃度添加時，濁度相較於初始階段無變化，表明未發生攪拌誘導的聚集(圖14b)。另外，SE-HPLC的結果證實，當添加0.05%或更大的聚山梨醇酯80時，純度相較於初始階段降低5%或更小(圖14c)。
評價取決於聚山梨醇酯80 濃度的液相穩定性
將聚山梨醇酯80以0.0、0.005、0.01、0.05及0.09% (v/v)的濃度添加至含有0.5 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、120 mM NaCl及1.0%蔗糖的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各液體樣品在室溫下儲存6小時且接著藉由SE-HPLC加以分析。結果證實，當聚山梨醇酯80濃度增加時，液相穩定性(純度)稍微降低(圖15)。
評價取決於聚山梨醇酯80 濃度的冷凍乾燥品質
將聚山梨醇酯80以0.0、0.005、0.01、0.05及0.09% (v/v)的濃度添加至含有0.5 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4.0 mM CaCl 2、120 mM NaCl及1.0%蔗糖的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各液體樣品冷凍乾燥且接著藉由SE-HPLC加以分析。結果證實，隨著聚山梨醇酯80濃度增加，防止純度由於冷凍乾燥製程而損失的作用增強，且當聚山梨醇酯80以0.01%或更大之濃度添加時，發現94%或更大的單體恢復率(圖16a)。另外，隨著聚山梨醇酯80濃度增加，高階聚集體的形成被有效地阻斷(圖16b)。
評價取決於pH 的 熱去摺疊 及熱聚集
製備含有鹼性組成物(含有20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2及0.05% PS80)且具有6.0、6.5、7.0、7.2及7.4之不同pH的透濾緩衝液，且接著與含有ADAMTS蛋白的溶液進行緩衝液交換，從而製備樣品。使用Amicon ®Ultra-15離心過濾單元30K，且在冷藏條件下以3,000 rpm進行離心。
緩衝液交換的樣品具有含有10 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2及0.05% PS80的共同組成物，且其pH分別為6.0、6.5、7.0、7.2及7.4。
使用UNCLE系統對所調配之液體樣品進行T m及T agg分析的結果證實，與蛋白質之結構熱穩定性成比例的熱去摺疊(T m)值隨著pH提高而增大，且樣品在pH 6.0顯示的Tm值低於其他樣品(圖17a)。已證實反映不穩定聚集程度的熱聚集(T agg)值隨著pH提高而增大，且樣品在pH 6.0及pH 6.5顯示的T agg值低於其他樣品(圖17b)。
評價取決於CaCl 2 濃度的冷凍乾燥品質
將CaCl 2以2.0、4.0及8.0 mM的濃度添加至含有1.2 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、120 mM NaCl、1.0%蔗糖及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥且進行SE-HPLC分析。結果證實，不論CaCl 2濃度，樣品均顯示部分塌縮的外觀(圖18a)。SE-HPLC分析的結果證實，隨著CaCl 2濃度增大，純度增加(圖18b)。
實例2 ： 用於調配ADAMTS13 蛋白之組分的進一步最佳化
評價取決於NaCl 與 蔗糖混合比率之冷凍乾燥品質
向含有0.36 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、120 mM L-Arg及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為100、150、200、250、300、350及400 mM的NaCl，且添加濃度為0、0.5、1及1.5% (w/v)的蔗糖。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測餅塊外觀，且在冷凍乾燥製程之前及之後藉由SE-HPLC分析其純度。如下表2中所示，結果證實，觀測到取決於NaCl與蔗糖之間之含量比的純度無顯著變化，表明高純度維持在測試的所有範圍內。
[表2]冷凍乾燥之後的純度恢復率(%)
NaCl (mM)
100 150 200 250 300 350 400
蔗糖 (%) 0 100.6 100.8 100.3 100.1 99.4 99.8 100.0
0.5 100.7 100.9 100.3 100.2 99.9 99.9 99.9
1 100.7 100.9 100.4 100.2 100.2 99.9 99.9
1.5 100.1 101.0 100.1 100.2 100.2 100.0 100.0
然而，如圖19a及19b中所示，已證實隨著NaCl濃度增加且隨著蔗糖濃度降低，餅塊外觀更佳。
評價取決於高濃度蔗糖處理的冷凍乾燥品質
向含有0.36 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、120 mM L-Arg及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為200、250及300 mM的NaCl，且添加濃度為1.5及2.5%的蔗糖。將所調配的各樣品冷凍乾燥且觀測其餅塊外觀。如圖20中所示的結果證實，當增加NaCl濃度時且當降低蔗糖濃度時，餅塊外觀更佳。
評價取決於精胺酸濃度的膠體穩定性(B 22 、kD)
將精胺酸以40、80、120、160及200 mM的濃度添加至含有0.36 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、280 mM NaCl、1%蔗糖及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。使用UNCLE系統分析所調配之各液體樣品的膠體穩定性(B 22、kD)。較高的B 22及kD正值意謂蛋白質良好分散而不出現聚集，且如圖21中所示，證實愈接近於120 mM精胺酸，膠體穩定性愈佳。
評價取決於精胺酸濃度的冷凍乾燥品質
將精胺酸以40、80、120、160及200 mM的濃度添加至含有0.36 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、280 mM NaCl、1%蔗糖及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中。將所調配的各樣品冷凍乾燥，觀測其餅塊外觀，且藉由SE-HPLC分析其純度。結果證實，當精胺酸濃度為80 mM及120 mM時，餅塊外觀良好(圖22a)，但觀測到取決於精胺酸濃度的純度無顯著差異(圖22b)。
GC1126A 最終液體調配物的儲存時間及溫度穩定性
將含有0.36 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、120 mM L-Arg、280 mM NaCl、1%蔗糖及0.05% PS80的所調配液體樣品(pH 7.4)在室溫(25℃)或冷藏(4℃)條件下儲存，且接著藉由執行純度(SE-HPLC)、力價(ADAMTS13活性)、蛋白質濃度(UV)及濁度之分析來檢查樣品的時間依賴性變化。分析純度的結果證實，在室溫下儲存3天時及之後，純度相較於初始階段降低約4%，且在儲存7天時，純度相較於初始階段降低約15%，且直至冷藏儲存第7天，未觀測到時間依賴性變化(圖23a)。
觀測力價變化的結果證實，在室溫下儲存7天時，力價相較於初始階段降低約50%，且考慮力價分析的偏差，直至冷藏儲存7天才觀測到隨時間發生的時間依賴性顯著變化(圖23b)。
在室溫下儲存第3天時，蛋白質濃度相較於初始階段增加，咸信此為UV吸收率增加的結果，原因在於樣品的不透明度因顆粒聚集而增加。冷藏儲存長達7天未觀測到時間依賴性變化(圖23c)。
同時，最終液體調配物的濁度傾向於自室溫儲存第3天時增加，但直至冷藏儲存第7天時才觀測到時間依賴性變化(圖23d)。
NaCl 及蔗糖濃度的最佳化
向含有0.5 mg/ml ADAMTS蛋白、20 mM組胺酸、4 mM CaCl 2、120 mM L-Arg及0.05% PS80的鹼性組成物(pH 7.4)中添加濃度為200、240及280 mM的NaCl且添加濃度為0、0.5及1%的蔗糖。
進行實驗設計(DOE)以探究NaCl及蔗糖的最佳濃度。設置二種操作參數(NaCl及蔗糖濃度)作為因子(X值)且設置純度(SE-HPLC)及力價(ADAMTS13活性)作為反應(Y值)之後，使用JMP ®10.0統計程式進行DOE設計。進行DOE設計時，使用全階乘設計，且包括二個中心點。最終設計總共6個條件，包括「全階乘設計：2種位準的4次運作 + 中心點2次運作」。
[表3]
運作 X
NaCl (mM) 蔗糖
1 280 0
2 (中心點) 240 0.5
3 280 1
4 200 0
5 200 1
6 (中心點) 240 0.5
根據預設計條件製備調配物緩衝溶液且與儲備溶液混合，從而製備最終儲備溶液。將所製備的1 ml調配物分配至各3 ml小瓶中且冷凍乾燥，且將冷凍乾燥的樣品冷藏(5℃)且在6個月之後分析其品質。
利用逐步回歸、經由多元回歸分析來進行DOE統計分析。使用JMP之「Fit模型」方法進行分析，且模型中所用的效應包括二個主要效應：雙因子相互作用及各種主效應的平方項。作為用於移除無意義因子及選擇有效項的終止規則，使用P值臨限值(P值≤0.25，方向：混合)。
分析結果顯示在所有實驗條件下，良好純度持續6個月，且未觀測到取決於NaCl及蔗糖之濃度的純度存在差異(圖24a)。另外，相較於各樣品的初始力價，6個月之後的力價在分析偏差內且不顯示顯著差異(圖24b)。
實例3 ： 構築ADAMTS13 蛋白變異體
本發明人使用隨機誘變方法構築人類ADAMTS13變異體，該等變異體能夠有效地避開aTTP患者所具有之ADAMTS13中和抗體。為了檢查MDTCS部分或區域S中具有突變之變異體是否可逃避ADAMTS13中和抗體，使用HuCAL系統(Bio-Rad)構築識別人類ADAMTS13之不同抗原決定基之抗體的Fab，且選擇對人類ADAMTS13具有極佳結合親和力的16種Fab。關於各種抗體的結合區，如圖25c中所示，Ab 4-16特異性結合至區域S，Ab 67特異性結合至MDTCS部分，且Ab 66特異性結合至C端部分(區域TSP-2至區域TSP-8)。
經由分析野生型ADAMTS13構築體及未突變或靜默突變變異體(在下文中稱為野生型殖株)的相對結果來進行變異體的評價，在經由隨機誘變產生的變異體中，該等非突變或靜默突變的變異體具有與野生型ADAMTS13相同的胺基酸序列。分析Ab 4-16及Ab 67對總共59種野生型殖株的活性及結合親和力。各種野生型殖株的分析結果基於野生型ADAMTS13構築體的所得值相對化，且結果顯示於圖26中。圖26顯示含有保守胺基酸取代之野生型ADAMTS13 (n=59)、突變ADAMTS13 (n=304)及所選ADAMTS13 (n=26)對抗體Ab 4-16及Ab 67的逃逸比及相對活性。野生型殖株儘管不具有突變，但與野生型ADAMTS13構築體的所得值顯示差異。在突變的ADAMTS13 (n=304)中，選擇數值等於或高於下表4中所示之特定逃逸比或相對活性的26種突變ADAMTS13。
具體而言，突變ADAMTS13對Ab 4-16的逃逸比在-29.5%至33.4%範圍內，且其對Ab 67的逃逸比在24.4%至30.5%範圍內，且其相對活性在62.7%至128.9%範圍內(表4)。作為利用三σ規則應用正態分佈的結果，Ab 4-16逃逸比在-34.1%至38.5%範圍內，Ab 67逃逸比在-38.5%至42.3%範圍內，相對活性在47.0%至145.2%範圍內，且WT殖株的幾乎所有結果均預期在此分佈範圍內。因此，基於三σ之最大值選擇變異體時，應用超過38.5%的Ab 4-16逃逸比、超過42.3%的Ab 67逃逸比或47.0%或更大的相對活性作為選擇準則。
[表4]中和抗體Ab4-16及Ab-67的逃逸比以及相對活性
類別 Ab 4-16逃逸比 Ab 67逃逸比 相對活性
最小值 -29.5% -24.4% 62.7%
最大值 33.4% 30.5% 128.9%
平均值 2.2% 1.9% 96.1%
標準差 12.1% 13.5% 16.4%
平均值-3個標準差 -34.1% -38.5% 47.0%
平均值+3個標準差 38.5% 42.3% 145.2%
選擇逃避ADAMTS13中和抗體且活性高於野生型ADAMTS13的變異體
將WT殖株及具有胺基酸突變之變異體中之每一者轉染至細胞中之後，量測各培養基中存在之蛋白質的量，且對具有50 ng/mL或更大之蛋白質表現濃度的304種變異體進行中和抗體結合親和力及活性分析。已證實相較於WT殖株，具有胺基酸突變之變異體的中和抗體結合親和力或相對活性存在多樣化分佈。在此等變異體中，最終選擇滿足選擇準則的26種變異體。已證實26種變異體中的18種在區域S中具有突變，且特定言之，在區域S中具有突變的13種變異體(1C03、1G07、2B01、2B02、3B05、3G04、5C09、5G08、6B12、7A02、8C04、8D01及8F01)具有較高的Ab 4-16逃逸比，且五種變異體(7E01、7G08、8C02、8D01及8D05)顯示較高的相對活性(表5)。六種變異體在區域D中具有突變，且其中五種變異體(46、3A06、4C07、4E11及4H07)顯示較高的Ab 67逃逸比。另外，鑑別出在區域M中具有突變的6種變異體、在區域C中具有突變的2種變異體以及在區域T中具有突變的2種變異體。經由三次重複實驗，針對26種所選變異體測試結果的重複再現性，且選擇在重複測試中對WT殖株連續維持優勢的12種變異體作為活體外功效測試的對象。在12種變異體中，1C03、2B01、2B02、3B05、5C09、5G08、7A02及8D01由於其極佳Ab4-16抗體逃逸比而被選，且4C07、4E11及4H07由於其極佳的Ab67逃逸比而被選。最後，基於優異的相對活性選擇8D05。
為了檢查所選的12種變異體逃避其他中和抗體的能力，除用於篩選的Ab4-16及Ab67抗體之外，本發明人檢查此等變異體是否亦可逃避中和抗體Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64及Ab65。在該等12種變異體中，區域S中具有胺基酸突變之9種變異體中的8種變異體(1C03、2B01、2B02、3B05、5C09、5G08、7A02及8D01)(排除8D05)對基於aTTP患者所具有之ADAMTS13自體抗體序列構築的Ab4-16及Ab4-20展現高逃逸比，且亦顯示逃避Ab60及Ab61之極佳能力。另一方面，區域D中具有胺基酸突變的變異體4C07、4E11及4H07對Ab67具有高逃逸比(圖27及表6)。
[表5]
選擇對Ab4-16及Ab67中和抗體具有高逃逸比或極佳相對活性的26種變異體
變異體ID 具有突變之區域 突變的胺基酸殘基 Ab4-16抗體逃逸比 Ab67抗體逃逸比 相對活性
46 M,D L85F, P317H 46.30% 53.90% 66.80%
1C03 S S612Y 48.00% 10.40% 104.60%
1G07 M,C,S V282A, A465D, D672V 41.40% 57.90% 63.80%
2B01 S D635V 87.40% 5.40% 62.20%
2B02 C,S R452I, S612Y 69.80% 15.30% 88.80%
3A06 M,D,T R278I, A334T, D427N 42.60% 58.50% 62.90%
3B05 S P618S 66.00% 48.40% 71.20%
3E01 M T135I 52.30% 36.00% 60.00%
3G04 M,S V126M, A567S, E651D 42.00% 29.40% 103.50%
3H12 T N413D -69.00% -104.60% 162.40%
4C07 D A334V -6.60% 72.30% 153.10%
4E11 D A314T 10.30% 96.40% 71.90%
4H03 M, D F93V, K364R, E376D 40.30% 37.60% 65.70%
4H07 D N308K 30.20% 64.60% 106.40%
5C09 S S612F 60.90% -10.50% 88.50%
5G08 S Q656H 41.40 26.00% 91.90%
6B12 S G607R 43.90% -101.60% 93.80%
7A02 S S612F, G624D 57.00% -80.50% 128.50%
7E01 S R589Q -36.60% -89.70% 149.90%
7G08 S Q650H, Q656R -25.20% -47.60% 160.70%
8C02 S I643F -19.20% -50.90% 168.10%
8C04 S I585N, Y658H 51.30% 34.80% 69.00%
8C12 S V630L, D654G, E664N -12.00% 73.20% 48.10%
8D01 S R589Q, K608M, M609L, G624C, I655V 85.10% -78.30% 193.60%
8D05 S P578L -1.20% -5.70% 172.30%
8F01 S I585M 45.20% 34.40% 99.40%
[表6]
評價所選12種變異體的單一中和抗體逃逸比及相對活性
變異體 ID 突變位置 中和抗體逃逸比 (%) 相對活性
AAb4-16 AAb4-20 AAb60 AAb61 AAb64 AAb65 AAb67
1C03 S612Y 57.5% 59.4% 97.2% 94.7% 5.2% -11.0% 15.1% 103.7%
2B01 D635V 82.9% 88.6% 92.4% 97.4% 96.3% 8.1% 7.9% 66.8%
2B02 R452I, S612Y 65.4% 61.1% 97.3% 95.5% 0.9% -15.0% 15.1% 112.6%
3B05 P618S 51.3% -6.5% 24.9% 39.4% 19.4% -63.8% 37.4% 77.3%
4C07 A334V 4.2% -5.0% -3.3% -6.9% -2.2% -4.7% 78.5% 152.2%
4E11 A314T 16.6% -1.3% 2.7% 3.2% 5.4% -0.8% 98.9% 78.3%
4H07 N308K 27.9% 1.5% 11.0% 16.4% 17.0% 12.8% 61.3% 94.7%
5C09 S612F 64.6% 54.7% 97.3% 95.2% 7.8% -1.6% 11.8% 104.8%
5G08 Q656H 47.0% 7.2% 32.1% 46.2% 27.4% -51.4% 30.3% 95.9%
7A02 S612F, G624D 57.1% 55.4% 97.6% 95.5% 1.9% -26.2% -12.9% 125.3%
8D01 R589Q, K608M, M609L, G624C, I655V 90.1% 98.5% 95.2% 94.1% 20.0% -95.9% 7.3% 127.0%
8D05 P578L -9.3% -43.1% 3.2% 15.9% -0.9% -116.4% 11.5% 154.7%
同時，結構-功能研究已報導，在ADAMTS13的總共14個區域中，在C端自TSP-2移除CUB2區域之後剩餘的MDTCS區域具有類似於ADAMTS13的金屬蛋白酶功能且能夠裂解VWF (Shelat等人, 2005)。此表明，僅MDTCS片段(而非全長ADAMTS13)便可充當TTP疾病的治療劑，且為能夠避開患者血漿中之結合至C端之中和抗體的截斷形式。
因此，自所選的12種變異體獲得MDTCS片段，且另外藉由將所選的突變型胺基酸殘基組合來構築具有二個胺基酸突變的DM1及DM2變異體。根據上述方法，使用細胞表現過的培養基及純化溶液，量測單一或混合型中和抗體的逃逸比及相對活性以選擇最終候選物。
使用培養基量測逃避8種單一中和抗體結合之逃逸比及相對活性的結果證實，2B01、3B05、4H07、5G08、8D05及DM1逃避所有中和抗體的位準相似(圖28及下表7)。1C03、2B02、5C09、7A02、8D01及DM2顯示逃避3-01及Ab60結合的高逃逸比。所有六種候選物均在區域S中具有胺基酸突變，且除8D01之外的五種候選物在位置612的胺基酸殘基處具有突變。4E11與DM2具有逃避Ab67結合的高逃逸比，且在區域D中之位置314的胺基酸殘基處均具有突變。DM1具有最低的相對活性(57.9%)，且1C03具有最高的相對活性(133.1%)。除上述二種候選物之外的所有候選物均顯示78.2至125.1%的相對活性，此類似於MDTCS-Fc對照組的相對活性(表7)。為了檢查除4C07及5C09之外之12種候選變異體在等比例混合在一起之9種中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65、Ab66及Ab67)處理條件下相較於對照MDTCS-Fc的抗體逃逸能力，將7.5 nM中和抗體混合物與其中各種變異體已得以表現的4 nM培養基混合。接著將所得混合物在室溫下培育1小時，且量測各種變異體的殘餘活性。已證實MDTCS-Fc具有3.5%的殘餘活性，且3B05、4E11、4H07、5G08及8D05具有1.24至2.42%的殘餘活性，低於MDTCS-Fc的殘餘活性(圖29)。另一方面，已證實1C03、2B01、2B02、7A02、8D01、DM1及DM2具有7.69至18.81%的殘餘活性，表明此等候選變異體逃避混合型中和抗體的能力優於MDTCS-Fc (圖29)。
為了使用純化的溶液檢查候選變異體逃避中和抗體的能力，使用Phytip系統(蛋白質A樹脂)自各培養基純化蛋白質，且使用所得經純化的溶液量測各種變異體的單一中和抗體逃逸比。結果證實，大部分變異體的傾向類似於在培養基狀態下所評價的結果(圖30)。
已證實2B01、5G08、8D05及DM1變異體對所有8種中和抗體顯示24.6%或更大的中和抗體逃逸比，且1C03、2B02、7A02、8D01及DM2顯示逃避3-01及Ab60結合的高逃逸比，類似於使用培養基獲得的結果。已證實4E11及DM2顯示逃避Ab67結合的高逃逸比，與使用培養基獲得的結果相同。各種變異體的相對活性顯示於圖30及下表8中。在混合型中和抗體處理條件下量測殘餘活性的結果證實，MDTCS-Fc具有3.76%的殘餘活性，且3B05、4E11、4H07及8D05變異體具有2.05至3.50%的殘餘活性，低於MDTCS-Fc的殘餘活性。另一方面，已證實1C03、2B01、2B02、5G08、7A02、8D01、DM1及DM2具有6.34至12.8%的殘餘活性，表明此等變異體相較於MDTCS-Fc具有逃避混合型中和抗體的極佳能力(圖31)。
基於以上結果，選擇五種候選物用於其他研究，包括考慮到混合型中和抗體之相對活性或逃逸比而選擇的1C03、2B02、7A02及DM2，以及因位置612之胺基酸突變而被認為具有逃避混合型中和抗體之極佳能力的5C09。
[表7]
包括14種變異體在內之MDTCS片段之單一中和抗體逃逸比及相對活性的量測(培養基條件)
變異體 ID 突變位置 中和抗體逃逸比 (%) 相對活性
3-01 4-16 4-20 Ab60 Ab61 Ab64 Ab65 Ab67
1C03 S612Y 100.0% 2.0% -11.0% 91.3% 3.9% -5.9% -16.9% 1.1% 133.1%
2B01 D635V 25.1% 28.2% 38.1% 38.4% 36.2% 26.8% 11.0% 24.9% 78.2%
2B02 R452I, S612Y 99.0% 1.2% 4..2% 93.5% 2..9% -2.1% -12.9% 3.1% 116.5%
3B05 P618S 35.3% 18.9% 25.5% 23.6% 19.1% 21.3% 17.9% 17.8% 92.7%
4C07 A334V -5.9% -11.2% -9.6% -11.3% -3.3% -12.4% -14.6% 14.5% 118.2%
4E11 A314T 15.3% 7.3% 11.9% 8.1% 9.0% 9.7% 8.8% 83.5% 89.7%
4H07 N308K 36.1% 20.4% 25.8% 19.5% 22.5% 25.1% 21.0% 53.8% 93.6%
5C09 S612F 100.0% 15.7% 18.7% 100.0% 12.4% 13.0% 0.5% 8.5% 108.2%
5G08 Q656H 48.7% 38.3% 41.2% 44.2% 41.9% 37.2% 27.8% 47.6% 85.4%
7A02 S612F, G624D 100.0% 7.5% 17.4% 97.5% 11.2% 7.2% -7.2% 12.3% 125.1%
8D01 R589Q, K608M, M609L, G624C, I655V 100.0% 38.9% 49.1% 71.2% 31.6% 36.3% 18.1% 41.8% 78.4%
8D05 P578L 39.6% 29.9% 38.3% 32.6% 32.4% 32.5% 21.5% 43.7% 82.1%
DM1 A314T, D635V 52.3% 48.2% 56.9% 60.6% 54.7% 51.6% 38.1% 86.8% 57.9%
DM2 A314T, S612F 100.0% 12.0% 22.0% 95.1% 21.6% 13.0% 7.3% 84.8% 97.7%
[表8]
包括14種變異體在內之MDTCS片段之單一中和抗體逃逸比及相對活性的量測(純化溶液條件)
變異體 ID M 突變位置 中和抗體逃逸比 (%) 相對活性
3-01 4-16 4-20 Ab60 Ab61 Ab64 Ab65 Ab67
1C03 S612Y 100.0% 15.6% 21.1% 100.0% 16.3% 7.3% -7.1% 10.9% 81.4%.
2B01 D635V 46.0% 37.8% 49.6% 65.5% 43.7% 49.7% 28.5% 28.2% 56.3%
2B02 R452I, 100.0% 8.4% 15.0% 100.0% 10.3% 4.4% -9.0% 0.2% 91.1%
S612Y
3B05 P618S 25.5% 11.9% 13.3% 14.9% 10.5% 13.8% 7.9% 10.2% 83.7%
4E11 A314T 19.6% 6.2% 11.5% 15.7% 1.8% 8.8% 12.6% 84.4% 77.5%
4H07 N308K 32.6% 12.80% 16.8% 29.0% 9.4% 16.9% 17.0% 47.1% 77.5%
5G08 Q656H 89.6% 64.5% 70.2% 81.9% 57.90% 68.9% 59.0% 37.7% 18.3%
7A02 SS612F, G624D 100.0% 10.4% 12.8% 100.0% 8.5% 3.4% -7.3% 14.4% 97.8%
8D01 RR589Q, K608M, M609L, G624C, I655V 100.0% 29.5% 48.2% 91.7% 20.5% 17.1% 14.2% 31.5% 65.1%
8D05 P578L 51.0% 27.4% 35.1% 49.5% 27.2% 33.8% 29.9% 46.0% 56.3%
DM1 A314T, D635V 50.2% 34.0% 54.0% 66.50% 45.3% 52.9% 24.6% 85.1% 50.3%
DM2 A314T, S612F 100.0% 16.2% 24.2% 100.0% 24.0% 11.5% 11.0% 86.5% 73.1%
藉由將IgG1-YTE與最終選擇之5種MDTCS變異體片段中之每一者結合而達成DNA，且在細胞表現過的培養基中量測各種DNA逃避8種單一中和抗體結合的逃逸比及各種DNA的相對活性。結果證實，1C03、2B02、5C09及7A02顯示逃避Ab3-01及Ab60結合的高逃逸比，且DM2具有逃避Ab3-01、Ab60及Ab67結合的高逃逸比(圖33)。相對活性為98.6至127.7%，類似於MDTCS-IgG1-YTE的相對活性(圖33)。為了檢查5種變異體在等比例混合在一起之9種中和抗體處理條件下相較於對照MDTCS-IgG1-YTE的逃避能力，將混合型中和抗體(n=9)與其中各種變異體已表現的培養基混合。接著將所得混合物在室溫下培育1小時，且量測各種變異體的殘餘活性。已證實MDTCS-IgG1-YTE展現5.5%的殘餘活性，且5種變異體展現8.18至13.42%的殘餘活性，表明該等變異體相較於對照具有逃避中和抗體的極佳能力(圖34)。
使用Phytip系統(蛋白質A樹脂)自其中與五種MDTCS變異體片段中之每一者結合之IgG1-YTE已表現的培養基中純化蛋白質。量測純化溶液中之中和抗體的殘餘活性及比活性。藉由Fc ELISA測定純化液體中的濃度，且經由銀染色證實目標蛋白質溶離。在混合型中和抗體處理條件下量測殘餘活性的結果證實，MDTCS-IgG1-YTE具有0.4%的殘餘活性，且1C03、2B02、5C09、7A02及DM2分別展現5.7%、1.7%、8.8%及2.6%及7.9%的殘餘活性，表明其相較於MDTCS-IgG1-YTE具有逃避混合型中和抗體的極佳能力。量測比活性的結果證實，除7A02 (10,288 IU/mg)之外的四種變異體展現19,091至22,379 IU/mg的比活性，類似於對照組的比活性(18,030 IU/mg)(圖35)。結果證實，IgG1-YTE與5種變異體片段中之每一者的結合物相較於對照具有逃避混合型中和抗體的極佳能力，且除7A02之外的4種變異體具有類似於對照組的比活性。
評價Fc 結合是否延長MDTCS 片段變異體的半衰期
為了證實與MDTCS結合的Fc (IgG1-YTE)是否實際上引起半衰期延長，用小鼠進行藥物動力學分析。為此目的，經由尾靜脈將MDTCS、與IgG1-YTE結合之MDTCS及已與IgG1-YTE結合之四種最終候選物(1C03、5C09、7A02及DM2)變異體片段蛋白質中的每一者投予小鼠，且接著隨時間收集血漿。基於比活性投予各種物質以達到160 IU/kg，且藉由活性分析量測在各時間點收集之血漿中剩餘之物質的活性。藉由原始匯集方法概述所得結果，且利用該等結果、藉由非隔室分析進行藥物動力學分析。經測定，MDTCS的半衰期為2.898小時，MDTCS-IgG1-YTE的半衰期為11.51小時，且各種變異體的半衰期為5.184至9.902小時。相較於對照MDTCS，IgG1-YTE結合物的半衰期延長1.79至3.97倍。另外，IgG1-YTE結合物使得表示候選物之活體內平均滯留時間的平均滯留時間(MRT)值為7.189至11.67小時，相較於對照組的平均滯留時間(3.743小時)延長(表9及圖32)。結果證實，根據血液半衰期及活體內平均滯留時間，IgG1-YTE融合物有效地維持活性。
[表9]
藥物動力學結果
候選物 PK分析參數
終末t 1/2(hr) AUC Inf(IU*hr/mL) MRT (hr)
MDTCS 2.898 5.467 3.743
MDTCS-IgG1-YTE 11.51 16.89 11.67
1C03-IgG1-YTE 6.087 12.33 8.695
5C09-IgG1-YTE 5.184 12.06 7.982
7A02-IgG1-YTE 9.902 14.49 10.35
DM2-IgG1-YTE 5.986 11.39 7.189
如上文所述，本發明人已發現26種新穎變異體逃避ADAMTS13中和抗體結合至MDTCS部分或區域S或展現等於或高於野生型ADAMTS13活性的活性。在此等變異體中，選出具有逃避9種中和抗體之最佳能力或具有明顯良好之相對活性的12種變異體，且構築MDTCS片段，該等片段為vWF裂解必不可少的、同時有效地避開中和抗體結合至C端，藉此鑑別出逃避自體抗體結合至aTTP患者中之ADAMTS13之區域D、C或S之能力顯著增強的變異體。當IgG1-YTE結合物延長本發明變異體之血液半衰期時，本發明之變異體可有利地用作具有改良之穩定性及持久之生理學活性的有效藥理學成分。
評價變異體在aTTP 模擬疾病小鼠模型中的Poc
為了利用所建立的aTTP模擬小鼠模型選出最終候選物，投予對照物質(MDTCS-IgG1-YTE)或所選五種變異體候選物(1C03-IgG1-YTE、2B02-IgG1-YTE、5C09-IgG1-YTE、7A02-IgG1-YTE及DM2-IgG1-YTE)中之每一者，且接著評價其中和抗體逃逸比(圖36a)。在五種變異體中，DM2-IgG1-YTE在5,000或7,000 IU/kg之劑量下展現最高的人類ADAMTS13活性(圖36b)。最終選擇展現最高中和抗體逃逸比的DM2-IgG1-YTE且以不同劑量投予，且藉此檢查其人類ADAMTS13活性及臨床症狀緩解程度(圖37a)。結果證實，隨著DM2劑量增加，臨床症狀緩解程度增大，且以7,000 IU/kg之劑量投予DM2-IgG1-YTE之群組中的血小板及LDH含量高於以7,000 IU/kg之劑量投予MDTCS-IgG1-YTE的群組(圖37b)。作為檢查人類ADAMTS13活性的結果，可觀測到與血小板及LDH含量的改善一致，ADAMTS13活性與對照物質或候選物質之劑量成比例增強(圖37b)。觀測臨床症狀的結果證實，投予對照物質或候選物質使aTTP模擬小鼠模型中出現的死亡或血尿症緩解。特定而言，在DM2-IgG1-YTE處理組的情況下，所有投予劑量均未出現死亡，且在7,000 IU/kg或更大劑量投予後，未觀測到小鼠顯示血尿症症狀(圖37c)。當投予7000 IU/kg時，DM2-IgG1-YTE的平均殘餘活性為0.32 IU/mL，比MDTCS-IgG1-YTE的平均殘餘活性0.03 IU/mL高9.6倍。咸信上述臨床症狀觀測結果的差異歸因於殘餘活性的此差異。作為通用血液測試、臨床化學測試及臨床症狀觀測的結果，投予MDTCS-IgG1-YTE及DM2-IgG1-YTE傾向於緩解aTTP模擬小鼠模型的aTTP臨床症狀，表明具有活體內功效。詳言之，已證實當投予7,000 IU/kg時，DM2-IgG1-YTE對aTTP臨床症狀的緩解作用優於MDTCS-IgG1-YTE。
評價變異體在cTTP 疾病小鼠模型中之活體內功效
使用5種變異體候選物當中在aTTP模擬小鼠模型中展現最高功效的DM2-IgG1-YTE，本發明人評價DM2-IgG1-YTE是否會緩解cTTP小鼠模型出現之TTP疾病的血液學及臨床症狀，且評價其對人類ADAMTS13活性的恢復(圖38a)。可證實隨著DM2-IgG1-YTE的劑量增加，血小板及LDH含量以濃度依賴性方式增加。在以360 IU/kg之劑量投予DM2-IgG1-YTE 180的群組中，血小板含量相較於對照組顯著增加，且特定言之，可發現在投予360 IU/kg的群組中，血小板含量恢復至正常含量(圖38b)。已證實，在投予180 IU/kg的群組中，LDH含量恢復至類似於對照組的含量(圖38b)。在ADAMTS13活性的情況下，以60 IU/kg或更大之劑量投予DM2-IgG1-YTE的群組展現0.1 IU/mL或更大的平均ADAMTS13活性，且在360 IU/kg之劑量下量測到1.08 IU/mL之平均ADAMTS13活性(圖38b)。因此，可發現在患有cTTP疾病的小鼠中，DM2-IgG1-YTE變異體有效地減輕臨床症狀且恢復ADAMTS13活性。因此，本發明人如上述實例1及2中所述使用DM2-IgG1-YTE對ADAMTS13蛋白質調配物組分進行篩選及最佳化。
藉由描述本發明之具體實施例，對於熟習此項技術者顯而易見的是，本說明書僅為其較佳實施例，且不限制本發明之範圍。因此，本發明的實質範圍將由隨附申請專利範圍及其等效物限定。
(無)
圖1顯示不同NaCl濃度下的餅塊外觀(圖1a)以及藉由SE-HPLC評價不同NaCl濃度下的純度(圖1b)。
圖2顯示執行SE-HPLC的結果，其取決於在20 mM精胺酸存在下，液體調配物中之NaCl濃度。
圖3顯示餅狀外觀(圖3a)及SE-HPLC結果(圖3b)，其取決於蔗糖濃度及在120 mM NaCl存在下添加或不添加海藻糖。
圖4顯示餅塊外觀(圖4a)及SE-HPLC結果(圖4b)，其取決於蔗糖與作為增積劑的甘露糖醇或甘胺酸之間之混合比率。
圖5比較餅塊外觀，其取決於在120 mM NaCl存在下的甘胺酸濃度。
圖6比較餅塊外觀，其取決於在120 mM NaCl存在下的精胺酸濃度。
圖7顯示餅塊外觀(圖7a)及SE-HPLC結果(圖7b)，其取決於在精胺酸不存在下的NaCl與蔗糖混合比率。
圖8顯示餅塊外觀(圖8a)及SE-HPLC結果(圖8b)，其取決於在120 mM精胺酸不存在下的NaCl與蔗糖混合比率。
圖9顯示在40℃下經歷1個月之後的純度變化量測結果，其取決於NaCl與蔗糖的混合比率。
圖10顯示量測B 22值的結果，以評價分別含有五種胺基酸穩定劑之調配物的膠體穩定性。
圖11顯示在七種穩定劑(六種胺基酸及蔗糖)中之每一者添加之後執行尺寸排阻液相層析(SE-HPLC)的結果，以評價單體在室溫下的恢復率。
圖12顯示藉由SE-HPLC評價冷藏穩定性的結果，其取決於20 mM精胺酸的添加(相較於對照)。
圖13a-c顯示為了評價純度及穩定性而執行SE-HPLC的結果，其取決於作為藥理學成分之蛋白質(ADAMTS-13)的濃度及精胺酸的濃度。
圖14顯示藉由觀測外觀(圖14a)、量測濁度(圖14b)及執行SE-HPLC (圖14c)來評價防止攪拌誘導聚集之作用的結果，其取決於聚山梨醇酯80的濃度。
圖15顯示藉由SE-HPLC評價液相穩定性的結果，其取決於聚山梨醇酯80的濃度。
圖16顯示藉由執行SE-HPLC (圖16a)及測定是否產生高階聚集體(圖16b)來評價冷凍乾燥後之調配物品質的結果，其取決於聚山梨醇酯80的濃度。
圖17顯示量測熱去摺疊(T m)(圖17a)及評價熱聚集(T agg)(圖17b)的結果，其取決於pH。
圖18顯示冷凍乾燥的餅塊外觀(圖18a)及SE-HPLC分析結果(圖18b)，其取決於CaCl 2的濃度。
圖19顯示評價外觀的結果，其取決於NaCl及蔗糖濃度(圖19a)；且顯示各種濃度下的餅塊外觀(圖19b)。
圖20顯示餅塊外觀，其取決於NaCl及蔗糖濃度。
圖21為顯示評價膠體穩定性之結果的圖解，其取決於精胺酸濃度。
圖22顯示餅塊外觀(圖22a)及純度(圖22b)，其取決於精胺酸濃度。
圖23顯示本發明最終選擇之液體調配物的物理特性且具體地顯示純度的時間依賴變化(圖23a)、力價的時間依賴變化(圖23b)、蛋白質濃度的時間依賴變化(圖23c)及濁度的時間依賴變化(圖23d)。
圖24顯示長期儲存穩定性，其取決於NaCl及蔗糖濃度；且具體地顯示在儲存初始階段及在儲存6個月之後的純度變化(圖24a)及力價變化(圖24b)。
圖25顯示鑑別ADAMTS13之各區域中的結合至中和抗體之結合位的結果。具體而言，圖25a示意性地顯示具有各種區域之組合的六種類型之ADAMTS13片段(或野生型全長ADAMTS13)，其經構築以證實ADAMTS13之表現比率或中和抗體結合位。圖25b顯示在使用自各ADAMTS13區域表現之蛋白質、使用蛋白質A-瓊脂糖與各種中和抗體之混合物執行免疫沈澱之後，對抗V5抗體執行西方墨點法的結果。輸入顯示各區域的蛋白質表現位準。圖25c示意性地顯示ADAMTS13之中和抗體結合位，且顯示Ab 4-16抗體特異性結合至區域S，Ab 67抗體特異性結合至區域D，且Ab 66抗體特異性結合至區域T2至T8區域。
圖26顯示逃避抗ADAMTS13抗體或具有比野生型ADAMTS13更佳的活性之變異體的篩選結果。量測Ab 4-16抗體(圖26a)及Ab 67抗體(圖26b)逃逸比以及野生型殖株及ADAMTS13變異體之ADAMTS13活性。藉由測定野生型殖株及變異體之比活性且將測定值代入以下方程式來計算相對活性：相對活性(%) = 變異體之比活性/野生型ADAMTS13之比活性×100
圖27a及27b顯示量測12種全長ADAMTS13變異體之單一中和抗體逃逸比的結果。量測12種全長ADAMTS13變異體針對7種中和抗體(Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65及Ab67)的抗體逃逸比。如下計算中和抗體逃逸比：相較於WT ADAMTS13的結合位準測定相對結合位準以測定相對逃逸比，且接著將相對逃逸比代入以下方程式：逃逸比(%) = (1-變異體之結合親和力/WT ADAMTS13之結合親和力)×100
圖28a及28b顯示在其中與Fc結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基條件下量測單一中和抗體逃逸比的結果。自十二種所選變異體中之每一者獲得MDTCS片段且使Fc與其結合，從而獲得12種MDTCS片段變異體。另外，藉由將所選變異體胺基酸殘基組合來獲得具有二種胺基酸突變的二種變異體(DM1及DM2)。使用其中14種變異體(包括12種MDTCS片段變異體及二種變異體)中之每一者已得到表現的培養基，量測變異體針對8種單一中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65及Ab67)的中和抗體逃逸比及變異體的相對ADAMTS13活性。逃逸比(%) = (1-對變異體的結合親和力/結合親和力)×100；相對活性(%)=變異體的比活性/WT ADAMTS13的比活性×100
圖29顯示在其中與Fc結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基條件下，評價與Fc結合之各MDTCS片段變異體逃避混合型中和抗體之能力的結果。將等比例混合在一起的九種中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65、Ab66及Ab67)混合且與其中對照MDTCS-Fc及12種候選變異體中之每一者已得到表現的4 nM培養基一起培育，且接著使用以下方程式計算各種候選變異體的殘餘活性：殘餘活性(%) = A÷B×100 (A：混合型中和抗體處理條件下的活性，且B：中和抗體未處理條件下的活性)。
圖30a及30b顯示在其中與Fc結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基及純化溶液條件下評價單一中和抗體逃逸比的結果。使用其中12種變異體(1C03、2B01、2B02、3B05、4E11、4H07、5G08、7A02、8D01、8D05、DM1及DM2)中之每一者已得到表現的培養基或經由使用Phytip系統純化而獲得的純化溶液，量測各種變異體針對8種單一中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65及Ab67)的中和抗體逃逸比及各種變異體的相對活性(圖30a及30b)。藉由Fc ELISA測定相應純化溶液的濃度。逃逸比(%) = (1-對變異體的結合親和力/對MDTCS-Fc的結合親和力)×100；相對活性(%) = 變異體的比活性/MDTCS-Fc的比活性×100。藍色條柱表示純化變異體蛋白的中值，且灰色條柱表示所表現之變異體蛋白的中值。
圖31顯示在其中與Fc結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基及純化溶液條件下量測混合型中和抗體逃逸比的結果。將等比例混合在一起的八種中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65及Ab67)混合且與其中對照MDTCS-Fc及12種候選變異體中之每一者已得到表現的4 nM培養基或純化溶液一起培育，且接著量測各種變異體的殘餘活性。使用以下方程式計算殘餘活性。殘餘活性(%) = A÷B×100 (A：混合型中和抗體處理條件下的活性，且B：中和抗體未處理條件下的活性)。
圖32為顯示與Fc結合之MDTCS片段變異體之藥物動力學結果的圖解。經由尾靜脈將MDTCS、與Fc (IgG1-YTE)結合之MDTCS及已與IgG1-YTE結合之四種最終候選變異體(1C03、5C09、7A02及DM2)片段蛋白質中之每一者投予小鼠，且接著隨時間收集血漿。基於其比活性投予各種物質以達到160 IU/kg，且藉由活性分析量測在各時間點獲得之血漿中剩餘之物質的活性。
圖33顯示在其中與IgG1-YTE結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基條件下評價單一中和抗體逃逸比的結果。自五種所選變異體獲得MDTCS片段且使IgG1-YTE與其結合。使用其中與IgG1-YTE結合之各變異體已得到表現的培養基，量測與IgG1-YTE結合之各變異體針對8種單一中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65及Ab67)的中和抗體逃逸比以及與IgG1-YTE結合之各變異體的相對活性(圖33a及33b)。逃逸比(%)=(1-對變異體的結合親和力/對MDTCS-IgG1-YTE的結合親和力)×100；相對活性(%)=變異體的比活性/MDTCS-IgG1-YTE的比活性×100。
圖34顯示在其中與IgG1-YTE結合之各MDTCS片段變異體已得到表現的培養基條件下，評價逃避混合型中和抗體之能力的結果。將等比例混合在一起的九種中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65、Ab66及Ab67)混合且與其中對照MDTCS-IgG1-YTE及五種候選變異體中之每一者已得到表現的4 nM培養基一起培育，且接著使用以下方程式計算各種候選變異體的殘餘活性：殘餘活性(%) = A÷B×100 (A：混合型中和抗體處理條件下的活性，且B：中和抗體未處理條件下的活性)。
圖35顯示在純化溶液條件下評價與IgG1-YTE結合之各MDTCS片段變異體逃避混合型中和抗體之能力的結果。將等比例混合在一起的九種中和抗體(Ab3-01、Ab4-16、Ab4-20、Ab60、Ab61、Ab64、Ab65、Ab66及Ab67)混合且與對照MDTCS-IgG1-YTE及五種候選變異體中之每一者的4 nM純化溶液一起培育，且接著使用以下方程式計算各種候選變異體的殘餘活性：殘餘活性(%) = A÷B×100 (A：混合型中和抗體處理條件下的活性，且B：中和抗體未處理條件下的活性)。
圖36示意性地顯示使用aTTP模擬小鼠模型測試中和抗體逃逸比的程序(圖36a)，且顯示各種變異體候選物的劑量依賴性殘餘ADAMTS13活性(圖36b)。
圖37顯示使用TTP模擬小鼠模型測試展現最高中和抗體逃逸比及臨床症狀之DM2-IgG1-YTE之劑量依賴性殘餘ADAMTS13活性之程序的示意圖(圖37a)，觀測改良之血小板及LDH含量以及ADAMTS13活性的結果(圖37b)，以及觀測臨床症狀之結果(圖37c)。
圖38顯示測試DM2-IgG1-YTE投予cTTP小鼠模型是否減輕血液學及臨床症狀之程序以及測試人類ADAMTS13活性之恢復程度的示意圖(圖38a)，以及觀測改良之血小板及LDH含量的結果及觀測ADAMTS13活性恢復之結果(圖38b)。
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Claims (21)

  1. 一種用於血漿蛋白的醫藥調配物，以該調配物之總體積計，其包含0至1.5 w/v%之量的糖穩定劑，以及100 mM至400 mM無機鹽。
  2. 如請求項1之醫藥調配物，其中該糖為選自由以下組成之群的至少一者：蔗糖、海藻糖及其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之醫藥調配物，其中該無機鹽為選自由以下組成之群的至少一者：NaCl、CaCl 2、KCl及MgCl 2。
  4. 如請求項3之醫藥調配物，其中該無機鹽為NaCl與CaCl 2之混合物。
  5. 如請求項1之醫藥調配物，其中以該調配物之總體積計，該調配物包含0.7至1.3 w/v%之量的糖穩定劑，以及150 mM至350 mM無機鹽。
  6. 如請求項1之醫藥調配物，進一步包含40 mM至200 mM胺基酸穩定劑。
  7. 如請求項6之醫藥調配物，其中該胺基酸為選自由以下組成之群的至少一者：精胺酸(Arg)、脯胺酸(Pro)及其醫藥學上可接受之鹽。
  8. 如請求項6之醫藥調配物，其中該調配物包含200 mM至300 mM無機鹽。
  9. 如請求項1之醫藥調配物，以該調配物之總體積計，進一步包含0.01至0.1 v/v%之量的一非離子界面活性劑。
  10. 如請求項9之醫藥調配物，其中該非離子界面活性劑為選自由以下組成之群的至少一者：聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60及聚山梨醇酯40。
  11. 如請求項1之醫藥調配物，其中該血漿蛋白為ADAMTS13 (具有凝血栓蛋白1型模體的解整合素及金屬蛋白酶，成員13)蛋白、其變異體或其功能片段。
  12. 如請求項11之醫藥調配物，其中該ADAMTS13蛋白之該變異體包含至少一個胺基酸殘基的取代，該至少一個胺基酸殘基選自由SEQ ID NO: 1之以下位置的殘基組成之群：85、93、126、135、278、282、308、314、317、334、364、376、413、427、452、465、567、578、585、589、607、608、609、612、618、624、630、635、643、650、651、654、655、656、658、664及672。
  13. 如請求項12之醫藥調配物，其中該ADAMTS13蛋白之該變異體選自由變異體蛋白質組成之群，該等變異體蛋白質包含以下位置之胺基酸殘基的取代： 位置85及317；位置612；位置282、465及672中之二者或更多者；位置635；位置452及612；位置278、334及427中之二者或更多者；位置618；位置135；位置126、567及651中之二者或更多者；位置413；位置334；位置314；位置93、364及376中之二者或更多者；位置308；位置656；位置607；位置612及624；位置589；位置650及656；位置643；位置585及658；位置630、654及664中之二者或更多者；位置589、608、609、624及655中之四者或更多者；位置578；位置585；位置314及635；以及位置314及612。
  14. 如請求項12之醫藥調配物，其中該胺基酸殘基的取代為選自由以下組成之群的至少一者：在位置85經Phe取代、在位置93經Val取代、在位置126經Met取代、在位置135經Ile取代、在位置278經Ile取代、在位置282經Ala取代、在位置308經Lys取代、在位置314經Thr取代、在位置317經His取代、在位置334經Thr或Val取代、在位置364經Arg取代、在位置376經Asp取代、在位置413經Asp取代、在位置427經Asn取代、在位置452經Ile取代、在位置465經Asp取代、在位置567經Ser取代、在位置578經Leu取代、在位置585經Asn或Met取代、在位置589經Gln取代、在位置607經Arg取代、在位置608經Met取代、在位置609經Leu取代、在位置612經Phe或Tyr取代、在位置618經Ser取代、在位置624經Asp或Cys取代、在位置630經Leu取代、在位置635經Val取代、在位置643經Phe取代、在位置650經His取代、在位置651經Asp取代、在位置654經Gly取代、在位置655經Val取代、在位置656經Arg或His取代、在位置658經His取代、在位置664經Asn取代，及在位置672經Val取代。
  15. 如請求項11之醫藥調配物，其中該血漿蛋白與來源於IgG4免疫球蛋白之一Fc區結合。
  16. 如請求項15之醫藥調配物，其中該Fc區包含至少一個胺基酸殘基的取代，該至少一個胺基酸殘基選自由SEQ ID NO: 2之位置22、24及26的殘基組成之群。
  17. 如請求項16之醫藥調配物，其中該胺基酸殘基的取代為選自由以下組成之群的至少一者：在位置22經Tyr取代、在位置24經Thr取代，及在位置26經Glu取代。
  18. 如請求項15之醫藥調配物，其中該血漿蛋白與來源於IgG4免疫球蛋白的該Fc區之間進一步包含來源於IgG1免疫球蛋白的一鉸鏈區。
  19. 一種用於預防或治療血栓疾病的組成物，其包含如請求項11至18中任一項之醫藥調配物作為一活性成分。
  20. 如請求項19之組成物，其中該血栓疾病為血栓微血管病(TMA)。
  21. 如請求項20之組成物，其中該血栓微血管病選自由以下組成之群：血小板減少性紫癲(TTP)、溶血尿毒症候群(HUS)、HELLP (溶血、升高的肝酶、低血小板計數)、子癇前症及鐮狀細胞疾病。
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