CN116478272A - 一组金环蛇抗凝肽bf9的突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组金环蛇抗凝肽BF9的突变体及其应用，所述突变体为：将BF9‑N17R多肽的氨基酸序列的第19位(L19)进行突变，所述的BF9‑N17R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及所述突变体在制备抗凝血药物中的应用。

Description

一组金环蛇抗凝肽BF9的突变体及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一组金环蛇抗凝肽BF9的突变体及其应用。
背景技术
抗凝血药物作为预防和治疗静脉血栓的主流药物，可追溯到传统抗凝药肝素和华法林的使用，距今已有60多年的历史。随着人们对血栓栓塞性疾病治疗药物研发力度不断的加大，抗凝药物的作用靶点从对多个凝血因子的抑制转向对凝血过程中起关键作用的单个凝血因子的抑制。目前上市的经典抗凝药物，如肝素和华法林等，存在治疗窗口期窄、需要定期监测出血风险、疗效受食物影响、需要反复多次给药、肝肾功能损害等限制药物使用的因素。新型直接口服抗凝剂(DOACs)，如利伐沙班，虽然在治疗过程中无需定期监测[1]，在某些特殊情况下使用也可减少颅内出血的风险，但是胃肠出血的风险却增加了，加之肾功能损害，也限制了部分DOACs的临床使用[2,3]。因此，寻找抗凝效果更好、出血风险和毒副作用更低的新型抗凝药物及新的抗凝药物作用靶点，一直是抗凝药物研发的热点。
FXI(凝血因子FXI)缺乏患者的流行病学调查发现，血浆FXI的水平＜正常人的15％-20％，不会有出血情况的发生；严重缺乏(正常水平的20％-40％)时，仍有＞60％的患者在未经治疗的情况下进行拔牙、扁桃体摘除、鼻腔手术和泌尿系手术，也只有轻微的出血；如果血浆FⅪ水平＞正常人水平上线，会适度增加患VTE和缺血性脑卒中的风险[4-6]。无论是FXI缺乏的临床病案[7,8]，还是FXI敲除的血栓动物模型[9-12]，都提示FXI在减弱血栓形 成的过程中出血风险更低，凝血因子FXIa是抗凝血药作用的新靶点。
动物毒液产生于有毒动物的特殊腺体，是一种具有生物活性的复杂混合物，其成分取决于产生毒液的物种，作用于目标动物身上，可以干扰正常生理或生化过程[11]动物毒液中的有毒成分主要是毒素蛋白质和多肽。动物毒素作为天然的多肽药物资源宝库，备受抗凝药物研发者的青睐[13]。1970年上市的针对凝血酶(FII)的抗凝药水蛭素的先导药物分子来源于欧洲医用水蛭[14-16]，2008年上市的针对凝血因子X(FX)新型口服抗凝药利伐沙班的先导药物分子是非洲吨缘蜱虫[17-19]。国外的研工作者也从响尾蛇、蝮蛇、澳洲东部棕蛇、吸血蝙蝠、牛虻及蚊子等的毒液或是唾液进行研究，以寻找更理想的新型天然抗凝药物先导药物。
金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9来源于眼镜蛇科环蛇属的金环蛇毒液。既往通过凝血功能检测筛选，发现金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9具有抑制内源性凝血途径的作用，进一步研究显示金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9对FXIa有较强的抑制作用[20]，为本课题寻找抗凝药物作用的新靶点，提供了新的思路。
对金环蛇新型金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9构效关系的初步研究，发现了抗FXIa生物活性更好的多肽分子BF9-N17R[21]；但是令人遗憾的是，金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9- N17R抑制纤溶酶活性的功能相比野生型抗凝多肽BF9明显增强，有违设计初衷。在增强金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R抗凝血功能的同时，如何减弱其抗纤溶酶的活性，是本课题组将要解决的科学问题，也是金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R将要研究的方向。
基于此，提出本发明。
参考文献
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发明内容
本发明首先涉及一组金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体，其特征在于，将BF9-N17R多肽的氨基酸序列的第19位(L19)进行突变，所述的BF9-N17R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述的突变选自如下任意突变：L19P、L19D、L19V、L19Q、L19Y、L19H、L19G、L19A、L19I、L19M、L19S、L19N、L19T、L19F、L19W、L19E、L19R、L19K；
更优选的，所述的突变选自如下任意突变：L19P、L19D、L19V、L19Q、L19Y、L19H；
最优选的，所述的突变为：L19P、L19D。
本发明还涉及编码所述金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体的核苷酸片段，优选的，所述的BF9-N17R的核苷酸片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及包含所述突变体的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物含有治疗有效量的所述突变体或编码所述突变体的核酸，以及必要的药用辅料。
本发明还涉及所述突变体或所述核酸的如下应用：
(1)制备抗FXIa的制剂；优选的，所述的制剂不抑制纤溶酶活性；
(2)制备抗凝血药物。
本发明的有益效果在于：
系统优化了金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R，获得FXIa抑制活性增强，纤溶酶抑制活性减弱的新型抗凝多肽，具有进一步进行临床开发的价值。
附图说明
图1、BF9-N17R和BF9-N17R-L19P色谱检测结果，吸光度波长设置为270nm，A图和B图分别显示了BF9N17R和BF9N17R-L19P蛋白浓缩液通过高效液相色谱仪时分离出的蛋白洗脱峰图，箭头所指的峰即为目标蛋白洗脱峰。
图2、18个BF9-N17R突变体多肽的APTT活性评价，18个BF9-N17R突变体检测APPT的终浓度是2857nM；PBS为阴性对照，阴性对照的APTT检测值为36.97±0.42秒。
图3、18个BF9-N17R突变体多肽的PT活性评价，18个BF9-N17R突变体多肽检测PT的终浓度是2857nM；PBS为阴性对照，阴性对照的PT检测值：14.03±0.12秒。
图4、18个BF9-N17R突变体多肽的TT活性评价，18个BF9-N17R突变体多肽检测TT的终浓度是2857nM；PBS为阴性对照，阴性对照的TT检测值：9.67±0.05秒。
图5、BF9-N17R的6个突变多肽的FXIa和Plasmin的检测
FXIa：
BF9-N17R-L19P(5A)检测终浓度为0nM、45.00nM、120.00nM、335.00nM、860.50nM、2500.00nM；
BF9-N17R-L19D(5B)检测终浓度为0nM、0.68nM、1.33nM、5.18nM、8.25nM、19.53nM；
BF9-N17R-L19V(5C)检测终浓度为0nM、1.22nM、2.44nM、4.88nM、9.77nM、19.53nM、39.05nM、78.13nM；
BF9-N17R-L19Y(5D)检测终浓度为0nM、5.00nM、15.00nM、21.25nM、29.00nM、39.06nM、62.50nM、78.13nM；
BF9-N17R-L19Q(5E)检测终浓度为0nM、1.18nM、2.83nM、4.75nM、10.00nM、16.30nM、19.53nM、78.13nM；
BF9-N17R-L19H(5F)检测终浓度为0nM、1.25nM、5.00nM、8.75nM、15.75nM、27.00nM、39.06nM、78.13nM。
Plasmin：BF9-N17R-L19P、BF9-N17R-L19D、BF9-N17R-L19V、BF9-N17R-L19Y、BF9-N17R-L19Q、BF9-N17R-L19H的检测终浓度均为0nM、78.13nM、156.25nM、312.50nM、625.00nM、1250.00nM、2500.00nM。
具体实施方式
BF9-N17R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：
KNRPTFCNLLPETGRCRALIPAFYYNSHLHKCQKFNYGGCGGNANNFKTIDECQRTCAAKYGRSS
密码子优化后的BF9-N17R的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，
SEQ ID NO.2：
aaaaaccgcccgaccttttgcaacctgctgccggaaaccggccgctgccgcgcgctgattccggcgttttattataacagccatctgcataaatgccagaaattt aactatggcggctgcggcggcaacgcgaacaactttaaaaccattgatgaatgccagcgcacctgcgcggcgaaatatggccgcagcagctga
实施例1、金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的分子设计和表达抗凝血功能的研究
将金环蛇Kunitz型抗凝BF9-N17R活性结构域的亮氨酸(L19)依据氨基酸侧链结构和理化性质的不同，采用20种氨基酸依次定点突变的设计方法将BF9-N17R(L19)位点进行突变为：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、络氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)，共获得18个突变体。依据氨基酸侧链结构和理化性质的不同，将这18个BF9-N17R的突变体多肽分成五类(表1)。
表1金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R突变体的设计
18个重组多肽合成方法：
(1)通过分子克隆，获得金环蛇Kunitz型抗凝BF9-N17R的18个重组多肽的重组质粒；
(2)测序正确的质粒转入工程菌(大肠杆菌DE3)进行扩菌培养；
(3)通过IPTG诱导获得蛋白包涵体，破壁和洗涤后，6M盐酸胍变性；
(4)通过稀释复性法获得复性蛋白液，超滤浓缩后采用高效液相色法(HPLC)将其纯化；
BF9N17R和BF9N17R-L19P的高效液相色谱图如图1所示；其他17个突变体的峰形类似。冷冻冻干机冻干后，鉴定保存。
实施例2、金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R突变体的抗凝血功能
活化部分凝血活酶时间(APTT)是反映内源凝血途径特别是第一阶段的凝血因子综合活性的一项凝血功能检查指标，广泛用于测定内源途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ，同时也可用于出血疾病的初筛诊断以及肝素抗凝治疗的实验室监测。
凝血酶原时间(Prothrombin time，PT)是指在缺乏血小板的血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子，凝血酶原转化为凝血酶，导致血浆凝固所需的时间，PT是反映血浆中 凝血因子活性的指标。凝血酶原时间测定是检查机体外源性凝血系统功能有无障碍的过筛试验，也是临床抗凝治疗的重要监测指标。
凝血酶时间(thrombin time，TT)，是指在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固 的时间。在共同凝血途径中，所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，可用凝血酶时时间(TT)来反映。
本实施例中，采用比浊法，检测18个重组多肽的凝血功，具体为：活化部分凝血酶时间(APTT)检测、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)检测，具体实施方案如下：
(1)分别取50μl不同浓度的重组多肽以及阴性对照和阳性对照(阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为肝素)；
(2)依次加入至上样检测杯中；
(3)取100μl正常人血浆(TT检测200μl)，依次分别加入到已装有不同浓度的重组多肽、阴性对照和阳性对照的检测杯中；
(4)将其放入全自动凝血功能检测仪的标本检测位后开始检测。检测结束后记录检测结果，重复3次。
APTT检测结果显示(图2)：
(1)18个BF9-N17R突变体多肽都具有明显的抗凝活性；
(2)在终浓度为2857nM时，BF9-N17R-L19A的抗凝活性最强，APTT延长约22倍，优于金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R(APTT延长约15倍)；
(3)BF9-N17R-L19G，BF9-N17R-L19P和BF9-N17R-L19Q这三个多肽的抗凝活性明显减弱，在终浓度为2857nM时，BF9-N17R-L19G的APTT延长4.76倍，BF9-N17R-L19P的APTT延长4.39倍，BF9-N17R-L19Q的APTT延长6.16倍；
(3)其余15个多肽，其抗凝活性介于BF9-N17R-L19A和这三个多肽之间。
PT(图3)和TT(图4)活性检测显示，和BF9-N17R多肽一样，18个BF9-N17R突变体多肽对PT和TT凝血途径都没有明显的抑制作用。
上述结果显示：BF9-N17R的L19位点的分子改造，不影响BF9-N17R系列多肽对内源性凝血途径的专一性抑制。
实施例3、优化抗凝多肽的抗凝血分子机制研究
抗凝血因子FXIa检测方案：
(1)96孔板中按25μl/孔依次加入不同浓度的重组多肽以及阴性对照，阴性对照为PBS缓冲液；
(2)按25μl/孔依次加入合适浓度的凝血因子FXIa(HCXIA-0160，MW：160kDa，Haematologic Technologies Inc，凝血因子为FXIa浓度为1.5μg/mL，和重组多肽加在同一孔内)；
(3)另选一排孔，按50μl/孔依次加入合适浓度的对应的凝血因子FXIa专用发光底物S2366(货号：82109039，MW：539.0Da，Chromogenix)。
(4)将加完测试液的96孔板放入恒温摇床，<120rpm，37℃孵育20分钟后，取出96孔板；
(5)用排枪同时将各孔中50μl凝血因子FXIa专用发光底物加入含凝血因子FXIa和优化抗凝多肽混合液的孔内，立即检测(设置波长为405nm)，然后每隔1分钟检测1次，共检测7次。
记录检测结果，计算残留酶活性、抑制率和IC50值；重复检测3次。
抗纤溶酶Plasmin检测方案：
(1)96孔板中按25μl/孔依次加入不同浓度的重组多肽以及阴性对照，阴性对照为PBS缓冲液；
(2)按25μl/孔依次加入合适浓度的纤溶酶Plasmin(货号P1867，MW：86kDa，Sigma公司，纤溶酶Plasmin浓度为100nM，和重组多肽加在同一孔内)；
(3)另选一排孔，按50μl/孔依次加入合适浓度的对应的纤溶酶Plasmin专用发光底物S2403(货号：82033239，MW：561Da，Chromogenix)。
(4)将加完测试液的96孔板放入恒温摇床，<120rpm，37℃孵育20分钟后，取出96孔板；
(5)用排枪同时将各孔中50μl纤溶酶Plasmin专用发光底物加入含纤溶酶Plasmin和优化抗凝多肽混合液的孔内，立即检测(设置波长为405nm)，然后每隔1分钟检测1次，共检测7次。
记录检测结果，计算残留酶活性、抑制率和IC50值；重复检测3次。
结果显示：
(1)18个BF9-N17R突变体多肽抑制FXIa的活性由强到弱依次为：
D>V>Q>I>N>E>T>S>Y>A>F>H>R>W>M>K>P>G(表2)；
(2)18个BF9-N17R突变体多肽抑制Plasmin(纤溶酶)的活性弱至强依次为：
P>G>H>Y>D>V>W>M>Q>N>T>I>S>A>F>K>R>E(表2)；
(3)通过对比18个BF9-N17R突变体多肽抑制FXIa的活性和抑制Plasmin的活性，发现18个BF9-N17R突变体多肽对FXIa的选择性指数(Plasmin IC50/FXIa IC50)由强到弱依次为：
P>D>V>Y>Q>H>N>I>T>W>S>M>A>F>G>K>R>E(表2)。
综合18个BF9-N17R突变体多肽的FXIa抑制活性和其对FXIa的选择性指数，获得6个FXIa抑制活性增强、纤溶酶抑制活性减弱的候选多肽BF9-N17R-L19P、BF9-N17R-L19D、BF9-N17R-L19V、BF9-N17R-L19Y、BF9-N17R-L19Q和BF9-N17R-L19H(图5)。
其中，BF9-N17R-L19P多肽对FXIa的选择性指数最好，在抑制FXIa的同时不具有抑制Plasmin的作用，成为金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R突变体中，抗FXIa的单靶点最优抗凝多肽。
BF9-N17R-L19D对FXIa的抑制活性最好，其抑制FXIa的IC50为1.67±3.07nM，相对BF9-N17R多肽(其IC50为2.97±2.44nM)略有提高，而对FXIa选择性指数(选择性指数＝Plasmin IC50/FXIa IC50)为51.86倍，相对BF9-N17R多肽(其选择性指数为5.83)，有明显的提高，成为金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R突变体中，高活性和高选择性多肽。
表2、18个BF9-N17R突变体多肽对FXIa和纤溶酶(Plasmin)抑制活性
这些研究表明，本发明通过BF9-N17R的L19位点分子设计，获得FXIa抑制活性增强，纤溶酶抑制活性减弱的新型抗凝多肽的科学设想是可行的。同时，本部分的研究工作也为本项目继续开展候选优化多肽的抗凝分子机制和抗血栓活性的研究奠定了坚实的基础。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一组金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体，其特征在于，将BF9-N17R氨基酸序列的第19位(L19)进行突变，所述的BF9-N17R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体，其特征在于，所述的突变选自如下任意突变：L19P、L19D、L19V、L19Q、L19Y、L19H、L19G、L19A、L19I、L19M、L19S、L19N、L19T、L19F、L19W、L19E、L19R、L19K。
3.根据权利要求1所述的金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体，其特征在于，所述的突变选自如下任意突变：L19P、L19D、L19V、L19Q、L19Y、L19H。
4.根据权利要求1所述的金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体，其特征在于，所述的突变为：L19P或L19D。
5.编码权利要求1-4任一所述的金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体的核苷酸片段。
6.根据权利要求5所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的BF9-N17R的核苷酸片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.包含权利要求1-4任一所述金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体、权利要求5或6所述的核苷酸片段的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物含有治疗有效量的所述突变体或所述核苷酸片段，以及必要的药用辅料。
8.权利要求1-4任一所述金环蛇Kunitz型抗凝多肽BF9-N17R的突变体、权利要求5或6所述核苷酸片段的如下应用：
(1)制备抗FXIa的制剂；优选的，所述的制剂不抑制纤溶酶活性；
(2)制备抗凝血药物。
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