JP2024056926A - 第Ｘａ因子阻害剤に対する解毒剤 - Google Patents

Abstract

【課題】第Ｘａ因子阻害剤に対する解毒剤の提供。【解決手段】本開示は、第Ｘａ因子を標的とする抗凝固剤に対する解毒剤に関する。解毒剤は、第Ｘａ因子阻害剤に結合し、それによってそれらを実質的に中和するが、プロトロンビナーゼ複合体に集合しない第Ｘａ因子タンパク質誘導体である。一実施形態では、本明細書に記載の誘導体は、固有の凝固活性を欠いているか、または低下している。本開示は、第Ｘａ因子（ｆＸａ）タンパク質の誘導体（配列番号１３、「ｒ－解毒剤」とも呼ばれる）に対する改変を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１９日に出願された米国仮出願連続番号６２／６８６，９６８の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）の下での利益を主張する。

分野
本開示は、固有の凝固促進活性が低下または欠如しているが、ｆＸａ阻害剤に結合及び／または中和することができ、それによりｆＸａを標的とする抗凝固剤に対する解毒剤として作用する第Ｘａ因子（ｆＸａ）誘導体の使用に関する。

抗凝固剤は、例えば、凝固障害を有する患者、動けない期間を余儀なくされている患者、または医学的手術を受けている患者等、血栓を形成する傾向のある患者の望ましくない血栓症の治療または予防における市場のニーズを満たす。しかしながら、抗凝固療法の主な制限の１つは、治療に伴う出血のリスクと、過剰摂取の場合や緊急の外科的処置が必要な場合に抗凝固活性を迅速に逆転させる能力の制限である。したがって、全ての形態の抗凝固療法に対する特異的かつ効果的な解毒剤が非常に望ましい。安全性を考慮すると、新しい抗凝固薬の開発において抗凝固剤と解毒剤のペアを持つことも有利である。

したがって、望ましくない血栓症を引き起こさず、ｆＸａ阻害剤の過剰摂取の場合または出血を予防もしくは停止するために正常な止血を回復することが必要な場合にｆＸａ阻害剤の抗凝固活性を実質的に中和するのに有効である改善された解毒剤が必要である。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許、特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、第Ｘａ因子（ｆＸａ）タンパク質の誘導体（配列番号１３、「ｒ－解毒剤」とも呼ばれる）に対する改変を提供する。野生型ｆＸａタンパク質と比較して、ｒ－解毒剤はＧｌａドメインと活性部位に改変を有し、ｆＸａ阻害剤に結合するｆＸａの能力を保持するが、プロトロンビナーゼ複合体へと集合しない。したがって、ｒ－解毒剤はｆＸａ阻害剤の解毒剤として機能し得る。解毒剤を安定化し、その結合効率及び／またはｆＸａ阻害剤への特異性を改善するために、ｒ－解毒剤へのさらなる改変が企図されている。

本開示の一実施形態は、配列番号１３に対して少なくとも８０％（または少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された二本鎖ポリペプチドを提供する。このアミノ酸配列は、一態様では、（ａ）第Ｘａ因子阻害剤に結合することができ、（ｂ）プロトロンビナーゼ複合体へと集合しない。さらに、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して、以下から選択される少なくとも１つの変異を含む。（ｉ）ＤもしくはＮ残基での置換、（ｉｉ）セリンプロテアーゼ特異性ポケット内の残基での置換、または（ｉｉｉ）Ａ２９０、Ｈ１４７、もしくはＤ１９３での置換（Ａ２９０での置換はＡ２９０Ｓではない）、もしくはそれらの組み合わせ。

一実施形態では、変異は、１つまたは複数のＤまたはＮ残基での置換である。一態様では、置換された残基は、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸の形成をなし得ない。一態様では、置換は、Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、もしくはＮ２５９、またはそれらの組み合わせにある。そのような置換の非限定的な例には、Ｄ１２Ｅ、Ｄ２９Ｅ、Ｎ５９Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７１Ｓ、Ｎ７１Ａ、Ｎ８６Ｑ、Ｎ８６Ｓ、Ｄ１１４Ｅ、Ｄ１１４Ｓ、Ｎ１６３Ｓ、Ｎ１６３Ｑ、Ｎ２５９Ｑ、Ｎ２５９Ｓ、及びＮ２５９Ａ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの態様では、置換はＮ８６もしくはＤ１１４、またはそれらの組み合わせにある。そのような置換の非限定的な例には、Ｎ８６Ｑ、Ｎ８６Ｓ、Ｄ１１４Ｅ、及びＤ１１４Ｓ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。

一実施形態では、変異は、セリンプロテアーゼ特異性ポケットの残基での置換である置換である。いくつかの態様では、置換は、配列番号１３と比較して、第Ｘａ因子阻害剤への結合親和性を増加させる。いくつかの態様では、置換は、ポリペプチドが組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合するのを防ぐ。

いくつかの態様では、置換は、Ｖ２３２、Ｖ２５３、Ｄ２８４、Ａ２８５、Ｖ３０８、Ｇ３１１、Ａ３１５、Ｇ３２１、もしくはＹ３２３、またはそれらの組み合わせにある。いくつかの態様では、置換は、Ｖ２３２、Ｄ２８４、Ｖ３０８、もしくはＧ３１１、またはそれらの組み合わせにある。いくつかの態様では、置換は、Ｖ２３２Ｉ、Ｄ２８４Ｍ、Ｄ２８４Ｑ、Ｄ２８４Ｓ、Ｖ３０８Ｓ、Ｇ３１１Ｈ、Ｇ３１１Ｋ、Ｇ３１１Ｎ、Ｇ３１１Ｑ、及びＧ３１１Ｓ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの態様では、置換は、Ｄ２８４Ｍ；Ｄ２８４Ｍ及びＧ３１１Ｓ；Ｄ２８４Ｍ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｄ２８４Ｍ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｄ２８４Ｑ；Ｄ２８４Ｑ及びＧ３１１Ｓ；Ｄ２８４Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｄ２８４Ｑ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｄ２８４Ｓ及びＧ３１１Ｑ；Ｄ２８４Ｓ、Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｇ３１１Ｋ；Ｇ３１１Ｑ；Ｇ３１１Ｎ；Ｇ３１１Ｓ；Ｇ３１１Ｈ；Ｇ３１１Ｋ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｇ３１１Ｎ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；Ｇ３１１Ｈ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；ならびにそれらの組み合わせ等の置換の単一のものまたは群のから選択される。

一実施形態では、変異は、Ａ２９０、Ｈ１４７、またはＤ１９３での置換を含み、Ａ２９０での置換はＡ２９０Ｓではない。一態様では、置換は、Ａ２９０Ｎ、Ａ２９０Ｑ、Ａ２９０Ｋ、Ｈ１４７Ｓ、Ｈ１４７Ｔ、Ｈ１４７Ｎ、Ｈ１４７Ｑ、及びＤ１９３Ｎ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの態様では、置換は、Ａ２９０Ｎ；Ａ２９０Ｑ；Ａ２９０Ｋ；Ｈ１４７Ｓ；Ｈ１４７Ｔ；Ｈ１４７Ｎ；Ｈ１４７Ｑ；Ｈ１４７Ｓ及びＤ１９３Ｎ；Ｈ１４７Ｔ及びＤ１９３Ｎ；Ｈ１４７Ｎ及びＤ１９３Ｎ；またはそれらの組み合わせ等の置換の単一のものまたは群のから選択される。

一実施形態では、解毒剤ポリペプチドは、配列番号１３のＮ末端の疎水性残基の数を減らすための変異を含む。

さらに提供されるのは、一実施形態では、第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象の出血を予防または低減する方法であって、本開示の有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む、方法である。さらに提供されるのは、第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象において外因的に投与された第Ｘａ因子阻害剤に選択的に結合して阻害する方法であって、本開示の有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む、方法である。

本方法の一態様では、第Ｘａ因子阻害剤は、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、ダルテパリン、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、アピキサバン、リバーロキサバン、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、低分子量ヘパリン、ベトリキサバン、またはそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。第Ｘａ因子阻害剤は、ベトリキサバン、リバーロキサバン、アピキサバン、低分子量ヘパリン、及びそれらの組み合わせからも選択される。

いくつかの態様では、ポリペプチドは手術前に投与される。いくつかの態様では、対象はヒトである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された二本鎖ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、（ａ）第Ｘａ因子阻害剤に結合することができ、（ｂ）プロトロンビナーゼ複合体に集合せず、前記アミノ酸配列が、配列番号１３と比較して、以下からなる群から選択される、少なくとも１つの変異をさらに含む、前記ポリペプチド：
（ｉ）ＤまたはＮ残基における置換、
（ｉｉ）セリンプロテアーゼ特異性ポケットの残基での置換、
（ｉｉｉ）Ａ２９０、Ｈ１４７、またはＤ１９３での置換を含み、Ａ２９０での置換はＡ２９０Ｓではない、
ならびにそれらの組み合わせ。
（項目２）
前記少なくとも１つの変異が、（ｉ）ＤまたはＮ残基における置換を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記置換された残基が、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸の形成をなし得ない、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記置換が、Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、もしくはＮ２５９、またはそれらの組み合わせにある、項目２または３に記載のポリペプチド。（項目５）
前記置換が、Ｄ１２Ｅ、Ｄ２９Ｅ、Ｎ５９Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７１Ｓ、Ｎ７１Ａ、Ｎ８６Ｑ、Ｎ８６Ｓ、Ｄ１１４Ｅ、Ｄ１１４Ｓ、Ｎ１６３Ｓ、Ｎ１６３Ｑ、Ｎ２５９Ｑ、Ｎ２５９Ｓ、及びＮ２５９Ａ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記置換が、Ｎ８６もしくはＤ１１４、またはそれらの組み合わせにある、項目４に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記置換が、Ｎ８６Ｑ、Ｎ８６Ｓ、Ｄ１１４Ｅ、及びＤ１１４Ｓ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記少なくとも１つの変異が、（ｉｉ）セリンプロテアーゼ特異性ポケットの残基での置換を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記置換が、配列番号１３と比較して、第Ｘａ因子阻害剤への結合親和性を増加させる、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記置換が、前記ポリペプチドが組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合するのを防ぐ、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記置換が、Ｖ２３２、Ｖ２５３、Ｄ２８４、Ａ２８５、Ｖ３０８、Ｇ３１１、Ａ３１５、Ｇ３２１、もしくはＹ３２３、またはそれらの組み合わせにある、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記置換が、Ｖ２３２、Ｄ２８４、Ｖ３０８、もしくはＧ３１１、またはそれらの組み合わせにある、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記置換が、Ｖ２３２Ｉ、Ｄ２８４Ｍ、Ｄ２８４Ｑ、Ｄ２８４Ｓ、Ｖ３０８Ｓ、Ｇ３１１Ｈ、Ｇ３１１Ｋ、Ｇ３１１Ｎ、Ｇ３１１Ｑ、及びＧ３１１Ｓ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１１に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記置換が以下からなる群から選択される、項目１１に記載のポリペプチド：
ｘｘｉ）Ｄ２８４Ｍ；
ｘｘｉｉ）Ｄ２８４Ｍ及びＧ３１１Ｓ；
ｘｘｉｉｉ）Ｄ２８４Ｍ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｉｖ）Ｄ２８４Ｍ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｖ）Ｄ２８４Ｑ；
ｘｘｖｉ）Ｄ２８４Ｑ及びＧ３１１Ｓ；
ｘｘｖｉｉ）Ｄ２８４Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｖｉｉｉ）Ｄ２８４Ｑ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｉｘ）Ｄ２８４Ｓ及びＧ３１１Ｑ；
ｘｘｘ）Ｄ２８４Ｓ、Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｘｉ）Ｇ３１１Ｋ；
ｘｘｘｉｉ）Ｇ３１１Ｑ；
ｘｘｘｉｉｉ）Ｇ３１１Ｎ；
ｘｘｘｉｖ）Ｇ３１１Ｓ；
ｘｘｘｖ）Ｇ３１１Ｈ；
ｘｘｘｖｉ）Ｇ３１１Ｋ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｘｖｉｉ）Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｇ３１１Ｎ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘｘｉｘ）Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｌ）Ｇ３１１Ｈ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ならびにそれらの組み合わせ。
（項目１５）
前記少なくとも１つの変異が、（ｉｉｉ）Ａ２９０、Ｈ１４７、またはＤ１９３での置換を含み、Ａ２９０での置換はＡ２９０Ｓではない、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記置換が、Ａ２９０Ｎ、Ａ２９０Ｑ、Ａ２９０Ｋ、Ｈ１４７Ｓ、Ｈ１４７Ｔ、Ｈ１４７Ｎ、Ｈ１４７Ｑ、及びＤ１９３Ｎ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記置換が、以下からなる群から選択される、項目１５に記載のポリペプチド：
ｘｉ）Ａ２９０Ｎ；
ｘｉｉ）Ａ２９０Ｑ；
ｘｉｉｉ）Ａ２９０Ｋ；
ｘｉｖ）Ｈ１４７Ｓ；
ｘｖ）Ｈ１４７Ｔ；
ｘｖｉ）Ｈ１４７Ｎ；
ｘｖｉｉ）Ｈ１４７Ｑ；
ｘｖｉｉｉ）Ｈ１４７Ｓ及びＤ１９３Ｎ；
ｘｉｘ）Ｈ１４７Ｔ及びＤ１９３Ｎ；
ｘｘ）Ｈ１４７Ｎ及びＤ１９３Ｎ；
またはそれらの組み合わせ。
（項目１８）
配列番号１３のＮ末端の疎水性残基の数を減らすための変異を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１９）
第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象の出血を予防または低減する方法であって、先行項目のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目２０）
第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象において外因的に投与された第Ｘａ因子阻害剤に選択的に結合して阻害する方法であって、項目１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目２１）
前記第Ｘａ因子阻害剤が、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、ダルテパリン、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、アピキサバン、リバーロキサバン、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、低分子量ヘパリン、ベトリキサバン、またはそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第Ｘａ因子阻害剤が、ベトリキサバン、リバーロキサバン、アピキサバン、低分子量ヘパリン、及びそれらの組み合わせから選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ポリペプチドが手術前に投与される、項目１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象がヒトである、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
項目１～１８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２５に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された原核生物または真核生物の宿主細胞。

Ｌｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８６，ｗ ２５， ５０９８－５１０２．で報告され、表１に示す、ヒト第Ｘ因子（配列番号１）のドメイン構造を模式的に示す配列番号１は、先行技術で知られており、表２に示す、ヒトｆＸのヌクレオチド配列（配列番号２）によってコードされるヒトｆＸのアミノ酸配列である。例えば、翻訳されたアミノ酸配列はＬｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８６， ２５， ５０９８－５１０２において報告され、＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝８９１４２７３１＞におけるＧｅｎＢａｎｋの「ＮＭ＿０００５０４」に見出すことができる。この配列のアミノ酸番号付けはｆＸ配列に基づく。ヒトｆＸ前駆体（配列番号１）は、プレプロリーダー配列（配列番号１のアミノ酸１～４０）、続いて、ｆＸ軽鎖（ＬＣ）に対応する配列（配列番号１のアミノ酸４１～１７９）、ｆＸの分泌中に除去されるＲＫＲトリプレット（配列番号１のアミノ酸１８０～１８２）、及び活性化ペプチド（ＡＰ）（配列番号１のアミノ酸１８３～２３４）を含むｆＸ重鎖（配列番号１のアミノ酸１８３～４８８）、ならびに触媒ドメイン（配列番号１のアミノ酸２３５～４８８）を含む。 （配列番号３）は、成熟ヒト第Ｘ因子のアミノ酸配列を示す。この図のアミノ酸番号付けは、ｆＸ軽鎖のＮ末端から始まる成熟ｆＸ配列に基づく。第Ｘ因子は、ジスルフィド結合によって連結された二本鎖分子として血漿中を循環する。軽鎖（ＬＣ）は、１３９アミノ酸（配列番号１のアミノ酸４１～１７９）の残基を有し、短い芳香族スタック（ＡＳ）（配列番号３のアミノ酸４０～４５）を含むγ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）に富んだドメイン（配列番号３のアミノ酸１～４５）、続いて、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン（ＥＧＦ１：配列番号３のアミノ酸４６～８４、ＥＧＦ２：アミノ酸８５～１２８）を含む。重鎖（ＨＣ）は、３０６アミノ酸を有し、５２アミノ酸の活性化ペプチド（ＡＰ：配列番号３のアミノ酸１４３～１９４）、続いて、触媒ドメイン（配列番号３のアミノ酸１９５～４４８）を含む。キモトリプシンの番号付けにおけるＨ５７－Ｄ１０２－Ｓ１９５に相当する触媒三残基は、ｆＸ配列においてＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２、及びＳｅｒ３７９に位置し、下線を付す（配列番号３のアミノ酸２３６、２８２及び３７９）。 図２に示す成熟ヒト第Ｘ因子のドメイン構造を示す模式図である。この図中のアミノ酸番号付けは成熟ｆＸ配列に基づく。Ｇｌａ－ドメイン含有断片（配列番号３のアミノ酸１～４４）を除去するためのキモトリプシン消化の切断部位及び活性化ペプチドを除去するためのｆＸ活性化を強調する。ｆＸａのキモトリプシン消化により、１～４４のアミノ酸残基（配列番号４）を欠くＧｌａ－ドメインのないｆＸａがもたらされる。 ＣＨＯ細胞におけるｆＸａ三重変異体（配列番号１２）の発現のためのＤＮＡコンストラクトのマップを示す。プラスミドＤＮＡを直線化し、ＣＨＯ ｄｈｆｒ（－）細胞にトランスフェクトした。テトラヒドロ葉酸（ＨＴ）欠損培地にメトトレキサート（ＭＴＸ）を加えて使用して細胞を選択した。安定したクローンは、ＥＬＩＳＡによって高タンパク質発現についてスクリーニングされた。ｆＸａ三重変異体は無血清培地で生成され、イオン交換カラムとアフィニティーカラムの組み合わせによって精製された。マップ内の番号付けは、ヒトｆＸ配列番号１をコードするポリヌクレオチド配列に基づく。

Ｉ．定義
範囲を含む、ｐＨ、温度、時間、濃度、分子量等の全ての数値指定は、０．１刻みで変化する（＋）または（－）の近似値である。全ての数値指定の前に「約」という用語が付いていることを常に明示的に述べているわけではないが、理解されるべきである。本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、その均等物が当該技術分野で知られていることも常に明示的に述べているわけではないが、理解されるべきである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示していない限り、複数の言及対象を含む。例えば、「薬学的に許容される担体」という用語は、それらの混合物を含む、複数の薬学的に許容される担体を含む。

本明細書で使用されるとき、「含むこと」という用語は、その組成物と方法に、示されている要素が含まれているが、他の要素が排除されないことを意味することが意図されている。組成物及び方法を定義するために使用されるとき、「本質的に～からなる」とは、意図された使用のための組み合わせにとって任意の本質的に重要な要素の他を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製の方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、保存剤等の薬学的に許容される担体を除外しない。「～からなる」とは、他の成分の微量の要素及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップよりも多くを除外することを意味するものとする。これらの各移行句用語によって定められている実施形態は、本開示の範囲内である。

「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、それらの最も広い意味で、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットはペプチド結合によって連結されていてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はあない。本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然及び／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。天然に存在するアミノ酸の１文字と３文字の略語を以下に列挙する。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。

「第Ｘａ因子」または「ｆＸａ」または「ｆＸａタンパク質」は、不活性な第Ｘ因子（ｆＸ）から産生される血液凝固経路のセリンプロテアーゼを指す。第Ｘａ因子は、内因性Ｘアーゼとして知られる複合体の第ＩＸａ因子とその補因子である第ＶＩＩＩａ因子、または外因性Ｘアーゼとして知られる複合体の第ＶＩＩａ因子とその補因子である組織因子のいずれかによって活性化される。ｆＸａは、第Ｖａ因子と膜結合型プロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロンビンからトロンビンへの変換を触媒するプロトロンビナーゼ複合体の活性成分である。トロンビンは、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒する酵素であり、最終的に血栓の形成をもたらす。したがって、ｆＸａの生物学的活性は、本明細書では「凝固促進活性」と呼ばれることがある。

ヒト第Ｘ因子（「ｆＸ」）をコードするヌクレオチド配列は、（＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝８９１４２７３１＞）におけるＧｅｎＢａｎｋの「ＮＭ＿０００５０４」に見出すことができ、図１ｂ及び配列番号２に示される。ｆＸの対応するアミノ酸配列及びドメイン構造は、Ｌｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８６，
２５：５０９８－５１０２に記載されている。成熟ｆＸのドメイン構造はまた、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ， Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００２， ８２：１１９０－１２０６に記載されている。重鎖の最初の５２残基（配列番号３のアミノ酸１４３～１９４）の触媒的切断の際に、ｆＸは、ｆＸａ（配列番号６）へと活性化される。ＦＸａは軽鎖（配列番号８）及び重鎖（配列番号９）を含む。軽鎖の最初の４５アミノ酸残基（配列番号６の１～４５残基）は、１１個の翻訳後修飾されたγ－カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）が含まれているため、Ｇｌａドメインと呼ばれる。それはまた、短い（６アミノ酸残基）の芳香族スタック配列（配列番号６の４０～４５残基）を含む。キモトリプシン消化により、１～４４残基が選択的に除去され、Ｇｌａ－ドメインのないｆＸａ（配列番号４）が得られる。ｆＸａのセリンプロテアーゼ触媒ドメインはＣ末端重鎖に位置している。ｆＸａの重鎖は、トロンビン、トリプシン、活性化プロテインＣ等の他のセリンプロテアーゼと高い相同性がある。

成熟第Ｘ因子のドメイン構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．， ２００２， ８２， １１９０－１２０６に見出すことができる。この図のアミノ酸番号付けは、図３と同じである。軽鎖を活性化ペプチドに接続するＡｒｇ１４０－Ｌｙｓ１４１－Ａｒｇ１４２のトリペプチド（図１に示すＲＫＲトリプレット）は、トリペプチドを欠く形態が循環血漿で優勢であるため、示されていない。個々のドメインはボックスで示される。これには、図２のアミノ酸１～４５（配列番号３）が含まれる。機能的に重要な触媒残基は丸で囲まれており、「γ」はＧｌａ（γ－カルボキシグルタミン酸）残基を表す。

「天然ｆＸａ」または「野生型ｆＸａ」は、血漿中に天然に存在するか、または元の未修飾の形態で単離され、プロトロンビンを活性化し、したがって血餅の形成を促進する生物学的活性を処理するｆＸａを指す。この用語には、組織試料から単離された天然に存在するポリペプチド、及び組換えにより産生されたｆＸａが含まれる。「活性ｆＸａ」は、プロトロンビンを活性化する生物学的活性を有するｆＸａを指す。「活性ｆＸａ」は、凝固促進活性を保持する天然ｆＸａまたは改変ｆＸａであり得る。

「ｆＸａ誘導体」または「改変ｆＸａ」または「第Ｘａ因子タンパク質の誘導体」は、それらが直接的または間接的に第Ｘａ因子阻害剤に結合し、プロトロンビナーゼ複合体に集合しないように改変されたｆＸａタンパク質を指す。構造的に、誘導体は、凝固促進活性をもたらさないか、低下した凝固促進活性もたらすかのいずれかに改変されている。「凝固促進活性」は、本明細書では、血液凝固または血餅形成を引き起こす薬剤の能力を指す。低下した凝固促進活性は、凝固促進活性が、野生型ｆＸａと比較して少なくとも約５０％、または約９０％以上、または約９５％以上低下したことを意味する。例えば、組換えｆＸ－Ｓ３９５Ａは、ｆＸａ活性アッセイ等のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定しされるとき、本質的に凝固促進活性を有さない。

誘導体は、改変された活性部位、改変されたＧｌａドメイン、及びＮ末端を有する。追加の改変も企図されている。そのような改変は、以下の方法のうちの１つまたは複数でなされ得る：配列からの１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、１つもしくは複数のアミノ酸残基の１つもしくは複数の異なるアミノ酸残基による置換、及び／または、１つもしくは複数のアミノ酸側鎖もしくはその「Ｃ」もしくは「Ｎ」末端の操作。

「活性部位」という用語は、化学反応が起こる酵素または抗体の部分を指す。「改変された活性部位」は、化学反応性または特異性の増加または減少を活性部位に提供するために構造的に改変された活性部位である。活性部位の例には、２３５～４８８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘ因子の触媒ドメイン（図１）、及び１９５～４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメイン（図２及び３）が含まれるが、これらに限定されない。改変された活性部位の例には、位置Ｓｅｒ３７９におけるアミノ酸置換を含む、配列番号１１、１２、１３、または１５の１９５～４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

上述のように、本開示の誘導体は、改変されたＧｌａドメインを有しているか、またはＧｌａドメイン全体を除去していてもよい。本開示の方法において解毒剤として適切なｆＸａ誘導体の例は、本明細書に詳述されるような、ＧｌａドメインのないｆＸａ（配列番号４または５）、Ｇｌａ欠損ｆＸａ（本明細書に記載の改変を含む配列番号７）、触媒部位に改変を含むｆＸａ（配列番号１０または１１）、ｆＶ／ｆＶａ相互作用またはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａ相互作用に重要であることが知られている部位に改変を有するｆＸａ（位置Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４、またはＡｒｇ４２４において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号４、５、７、１０、または１１）である。本開示によって企図されるｆＸａ誘導体のさらなる例を以下に提供する。

「Ｇｌａ－ドメインのないｆＸａ」または「ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａ」は、Ｇｌａドメインを有さず、Ｇｌａドメインの除去に加えて他の改変（複数可）を有するｆＸａ誘導体を包含するｆＸａを指す。本開示におけるＧｌａドメインのないｆＸａの例には、配列番号３の１～３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体；以下でより詳細に説明されるＣＨＯ細胞で発現されるｆＸａ変異体（配列番号１２、表１２）に対応する、配列番号３の６～３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号１６）；ヒトｆＸａのキモトリプシン消化後のｄｅｓ－ＧｌａｆＸａに対応する、配列番号３の１～４４アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号４、図３）；及び、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９３， ２３２：９４７－９６６に記載される、配列番号３の１～４５Ｇｌａドメイン残基全体を欠くｆＸａ誘導体（配列番号５）が含まれる。他の例には、ｄｅｓ－Ｇｌａ ａｎｈｙｄｒｏ ｆＸａ（配列番号１０、表１０）及びｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａ－Ｓ３７９Ａ（配列番号１１、表１１）が含まれる。

いくつかの実施形態では、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４０～４４８、またはその均等物を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４５～４８８（配列番号４）、または、配列番号３の４６～４８８（配列番号５）、またはそれらの均等物を少なくとも含む。

いくつかの実施形態では、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４０～１３９、及び配列番号３の１９５～４４８、またはそれらの均等物を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４５～１３９、及び配列番号３の１９５～４４８、またはそれらの均等物を少なくとも含む。別の実施形態では、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４６～１３９、及び配列番号３の１９５～４４８、またはそれらの均等物を少なくとも含む。

「Ｇｌａ欠損ｆＸａ」とは、Ｇｌａドメインの遊離側鎖γ－カルボキシル基の数が減少したｆＸａを指す。ＧｌａドメインのないｆＸａと同様に、Ｇｌａ欠損ｆＸａも他の改変を保有することができる。Ｇｌａ欠損ｆＸａには、非カルボキシル化、低カルボキシル化、及び脱炭酸化されたｆＸａが含まれる。「非カルボキシル化ｆＸａ」または「脱炭酸ｆＸａ」は、Ｇｌａドメインのγ－カルボキシグルタミン酸残基のγ－カルボキシ基を有さないｆＸａ誘導体、例えば、そのＧｌａドメインの全てのγ－カルボキシグルタミン酸が異なるアミノ酸で置き換えられたｆＸａ、またはその側鎖γ－カルボキシルの全てがアミノ化、エステル化等の手段によって除去もしくはマスクされたｆＸａを指す。組換え発現タンパク質の場合、非カルボキシル化ｆＸａはカルボキシル化されていないｆＸａとも呼ばれる。「低カルボキシル化ｆＸａ」は、野生型ｆＸａと比較してＧｌａドメインのγ－カルボキシ基の数が少ないｆＸａ誘導体、例えば、そのＧｌａドメインの全てではないが１つまたは複数のγ－カルボキシグルタミン酸が１つまたは複数の異なるアミノ酸で置き換えられたｆＸａ、あるいはその側鎖の全てではないが少なくとも１つのγ－カルボキシルが、アミノ化及びエステル化等の手段によって除去またはマスクされているｆＸａを指す。

ヒトのＧｌａドメインのない第Ｘａ因子のドメイン構造は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．、Ｂｉｏｌ．， １９９３， ２３２， ９４７－９６６に見出すことができる。アミノ酸の番号付けは、キモトリプシンとのトポロジー的同等性に基づき、例えば、ヒトの成熟ｆＸの番号付けを使用した場合、Ｓｅｒ１９５は図２のＳｅｒ３７９に対応する。挿入は文字で示され、削除は２つの連続した番号付けで示される。重鎖の番号付けと区別するために、軽鎖の番号付けに３００が追加されている。β３６３は、β－ヒドロキシアスパラギン酸である。スラッシュは、結晶性材料で観察されたタンパク質分解による切断を示す。成熟ｆＸ（配列番号３）に基づく１～４５アミノ酸残基を欠くＧｌａドメインのないｆＸａの配列は、配列番号５に示される。

一実施形態では、ｆＸａ誘導体は、ｆＸａの軽鎖を欠いていてもよいが、それでも重鎖に存在するセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含んでいる。さらに、他のセリンプロテアーゼ触媒ドメインを有するキメラを使用して、重鎖の置換を行うことができる。

「ｐｄ－解毒剤」または「血漿由来解毒剤」は、ｄｅｓ－Ｇｌａ ａｎｈｙｄｒｏ ｆＸａ誘導体を指し、配列番号１０のアミノ酸残基を有する。

「ｒ－解毒剤」または「組換え解毒剤」は、以下により詳細に記載されるＣＨＯ細胞において発現されるｆＸａ変異体（配列番号１３、表１３ａ～ｂ）に対応する、配列番号３の６～３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体を指す。ｒ－解毒剤は、軽鎖と重鎖を含む２本鎖ポリペプチドである。

「抗凝固剤」または「抗凝固剤」は、血栓形成を阻害する薬剤である。抗凝固剤の例には、トロンビンの特異的阻害剤、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子または第ＶＩＩａ因子、ヘパリン及び誘導体、ビタミンＫ拮抗薬、ならびに抗組織因子抗体が含まれるが、これらに限定されない。トロンビンの特異的阻害剤の例には、ヒルジン、ビバリルジン（アンギオマツクス（登録商標））、アルガトロバン及びレピルジン（レフルダン（登録商標））が含まれる。ヘパリン及び誘導体の例には、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えば、エノキサパリン（ロベノックス（登録商標））、ダルテパリン（フラグミン（登録商標））、及びダナパロイド（オルガラン（登録登録））、ならびに合成五糖、例えば、フォンダパリヌクス（Ａｒｉｘｔｒａ（登録商標））が含まれる。ビタミンＫ拮抗薬の例には、ワルファリン（クマジン（登録商標））、フェノクマロール、アセノクマロール（シントロム（登録商標））、クロリンジオン、ジクマロール、ジフェナジオン、ビスクマ酢酸エチル、フェンプロクモン、フェニンジオン、及びチオクロマロールが含まれる。一実施形態では、抗凝固剤は第Ｘａ因子の阻害剤である。一実施形態では、抗凝固剤はベトリキサバンである。

「抗凝固療法」とは、望ましくない血栓または血栓症を予防するために患者に投与される治療レジームを指す。抗凝固療法は、患者の望ましくない血餅または血栓症を治療または予防するのに適した用量及びスケジュールで、２つ以上の抗凝固剤または他の薬剤の１つまたは組み合わせを投与することを含む。

「第Ｘａ因子阻害剤」または「第Ｘａ因子の阻害剤」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでのプロトロンビンからトロンビンへの変換を触媒する凝固第Ｘａ因子の活性を直接的または間接的に阻害できる化合物を指す。

「直接的な第Ｘａ因子阻害剤」はｆＸａに直接結合し、非限定的な例には、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ－ＤＸ－９０６５ａ（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９６ ２７６（３）：１０３０－８に記載される）、ＹＭ－６０８２８（例えば、Ｔａｎｉｕｃｈｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９８ ７９（３）：５４３－８に記載される）、ＹＭ－１５０（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ｂ．Ｉ．
ｅｔ． ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６（１１）， Ａｂｓｔｒａｃｔ １８６５に記載される）、アピキサバン、リバーロキサバン、ＴＡＫ－４４２、ＰＤ－３４８２９２（例えば、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ： Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ － Ｒｅａｃｈｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｍａｒｋｅｔ， ２００７に記載される）、オタミキサバン、エドキサバン（例えば、Ｈｙｌｅｋ ＥＭ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ ２００７ ８（９）：７７８－７８３に記載される）、ＬＹ５１７７１７（例えば、Ａｇｎｅｌｌｉ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００７ ５（４）：７４６－５３に記載される）、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、ベトリキサバン、またはそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせが含まれる。特定の態様において、直接的な第Ｘａ因子阻害剤はリバーロキサバンである。いくつかの態様では、直接的なｆＸａ阻リバーロキサバンの化学化合物である。

ｆＸａ活性の「間接的な第Ｘａ因子阻害剤」による阻害は、１つまたは複数の他の因子によって媒介される。間接的な第Ｘａ因子阻害剤の非限定的な例には、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、チンザパリン、低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）、及びそれらの組み合わせが含まれる。特定の局面において、間接的な第Ｘａ因子阻害剤はエノキサパリンである。

一実施形態では、第Ｘａ因子阻害剤は、ベトリキサバン、リバーロキサバン、ＬＭＷＨ、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、アピキサバン、及びそれらの組み合わせから選択される。

「ベトリキサバン」という用語は、化合物「［２－（｛４－［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）－５－メトキシフェニル］－Ｎ－（５－クロロ（２－ピリジル））カルボキサミド」またはその薬学的に許容される塩を指す。「［２－（｛４－［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）－５－メトキシフェニル］－Ｎ－（５－クロロ（２－ピリジル））カルボキサミド」は以下の構造を有する化合物：
、
またはその互変異性体もしくはその薬学的に許容される塩を指す。

ベトリキサバンは、２００６年１１月７日に出願された米国特許第６，３７６，５１５号及び同第６，８３５，７３９号ならびに米国特許出願公開第２００７／０１１２０３９号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ベトリキサバンは第Ｘａ因子の特異的阻害剤であることが知られている。

本明細書で使用されるとき、「解毒剤」または「第Ｘａ因子阻害剤に対する解毒剤」という用語は、利用可能なｆＸａ阻害剤との結合する活性ｆＸａと競合することによってｆＸａ阻害剤の凝固阻害活性を実質的に中和または逆転させることができるｆＸａの誘導体等の分子を指す。本開示の解毒剤の例は、ｄｅｓ－Ｇｌａ ｆＸａまたはＧｌａ欠損ｆＸａ等のリン脂質膜結合が低下したｆＸａ誘導体、及び活性部位改変ｆＸａ誘導体等の触媒活性が低下したｆＸａ誘導体、及びｆＶ／Ｖａ、またはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａとの相互作用が低下した誘導体である。膜結合が減少し、触媒活性が減少した本開示の解毒剤の例には、ａｎｈｙｄｒｏ－ｆＸａのキモトリプシン消化によるｄｅｓ－Ｇｌａ ａｎｈｙｄｒｏ－ｆＸａ（実施例１に記載）、変異導入によるｄｅｓ－ＧｌａｆＸａ－Ｓ３７９Ａ（キモトリプシン番号付けのＳ１９５Ａ）（実施例６に記載）が含まれるが、これらに限定されない。解毒剤は、全体を通して説明されているように、追加の変異を含む。例えば、本開示の解毒剤は、ｆＸａ誘導体が第Ｘａ因子阻害剤に結合することができ、プロトロンビナーゼ複合体に集合せず、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸形成を防止しすること、第Ｘａ因子の小分子阻害剤への結合親和性を増加させること、ＴＦＰＩ結合の防止、Ｎ末端の疎水性残基の数の減少、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの変異を有する。さらに、本開示の解毒剤は、例えば、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸の形成を防ぐための変異を有する。本開示の解毒剤の別の例は、翻訳後のメチオニン酸化を防ぐための変異を有する。

本開示の解毒剤の他の例には、ｆＸａ触媒ドメインと十分な構造的類似性を有し、したがって直接的なｆＸａ阻害剤に結合することができるセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドが含まれる。例には、ｆＸａ阻害剤ＧＳＫ９１３８９３に結合するトロンビン（Ｙｏｕｎｇ Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２００７， １７（１０）： ２９２７－２９３０）、ｆＸａ阻害剤アピキサバンに結合する血漿カリクレイン（Ｌｕｅｔｔｇｅｎ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２００６， １０８（１１） ａｂｓｔｒａｃｔ ４１３０）、及び、ｆＸａ阻害剤Ｃ９２１－７８にナノモル以下の親和性（Ｋｄ＝５００ｐＭ）で結合するトリプシン（またはその細菌ホモログであるサブチリシン）（Ｂｅｔｚ Ａ，
ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９９， ３８（４４）：１４５８２－１４５９１）が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態では、本開示の誘導体は、直接的または間接的に、第Ｘａ因子阻害剤に結合する。本明細書で使用されるとき、「結合すること」、「結合する」、「認識」、または「認識する」という用語は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出され得る分子間の相互作用を含むことを意味する。この用語は、分子間の「結合」相互作用を含むことも意味する。相互作用は、例えば、自然での、タンパク質－タンパク質、タンパク質－核酸、タンパク質－小分子、または小分子－核酸であってよい。結合は「直接的」または「間接的」であってよい。「直接的」な結合は、分子間の直接的な物理的接触を含む。分子間の「間接的」な結合は、１つまたは複数の中間分子と同時に直接物理的に接触する分子を含む。例えば、本開示の誘導体は、低分子量ヘパリン及び第Ｘａ因子の他の間接的な阻害剤に間接的に結合し、実質的に中和することが企図されている。この結合は、相互作用する分子を含む「複合体」の形成をもたらし得る。「複合体」とは、共有結合または非共有結合、相互作用、または力によって一緒に保持されている２つ以上の分子の結合を指す。

ｆＸａの阻害剤の活性を「中和する」、「逆転する」、もしくは「打ち消す」、または同様の語句は、ｆＸａ阻害剤の第Ｘａ因子阻害機能または抗凝固機能を阻害または遮断することを指す。そのような語句は、機能の部分的な阻害または遮断、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでのｆＸａ阻害剤活性のほとんどまたは全ての阻害または遮断を指す。

特定の実施形態では、第Ｘａ因子阻害剤は実質的に中和され、これは、第Ｘａ因子を直接的または間接的に阻害するその能力が、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下することを意味する。

「リン脂質膜結合」という用語は、Ｃａ^２＋イオンの存在下で、血小板等の、負に帯電したリン脂質膜または他の細胞膜に結合する活性ｆＸａの能力を指す。この結合は、ｆＸａのＧｌａドメインのγ－カルボキシグルタミン酸残基によって媒介される。

「低下した相互作用」という用語は、通常は野生型ｆＸａと結合または複合体を形成するイオンまたは他の補因子と結合または複合体を形成するｆＸａ誘導体の低下した能力を指す。そのような相互作用の例には、Ｃａ^２＋イオン及びリン脂質膜とのｆＸａの結合、ｆＶ／ｆＶａ、またはｆＶＩＩＩ／ｆ／ＶＩＩＩａとの相互作用等が含まれるが、これらに限定されない。ｆＸａ誘導体とイオンまたは他の補因子との相互作用が野生型ｆＸａの５０％に減少することが好ましい。より好ましくは、相互作用は、野生型ｆＸａの相互作用の１０％、１％、及び０．１％に減少する。これは、「プロトロンビナーゼ複合体に集合する」誘導体の能力を指す。

「ｆＸａ阻害剤結合活性」とは、ｆＸａの阻害剤に結合する分子の能力を指す。本開示の解毒剤は、直接的であろうと間接的であろうと、ｆＸａ阻害剤結合活性を有する。

「循環半減期」または「血漿半減期」という用語は、血漿中を循環する解毒剤の血漿濃度が、単回投与後にその初期濃度の半分に減少するのに必要な時間を指す。

「コンジュゲート部分」という用語は、ｆＸａ誘導体の残基と共有結合を形成することによってｆＸａ誘導体に付加することができる部分を指す。この部分は、ｆＸａ誘導体の残基に直接結合することができ、またはリンカーと共有結合を形成することができ、これは転じて、ｆＸａ誘導体の残基と共有結合を形成する。

本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体及び任意の抗原結合フラグメントまたはその一本鎖を含む。したがって、用語「抗体」は免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例には、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるがこれらに限定されない。

抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、任意の適切な生物学的供給源、例えば、マウス、ラット、ヒツジ及びイヌから単離され得る。

「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性、例えばアジュバント等の別の化合物または組成物との組み合わせを意味することを意図している。

本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、その組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に適するようにする不活性または活性な担体との組み合わせを指す。

「有効量」は、所望の生物学的及び／または治療的結果を誘導するのに十分な誘導体の量を指す。その結果は疾患の兆候、症状、もしくは原因の軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であり得る。本開示において、結果は、典型的には、以下のうちの１つまたは複数を含む：患者に投与されたｆＸａ阻害剤の中和、ｆＸａ阻害剤の抗凝固活性の逆転、血漿からのｆＸａ阻害剤の除去、止血の回復、及び出血の減少または停止。有効量は、使用される特定の解毒剤、対象が投与された特定のｆＸａ阻害剤、ｆＸａ阻害剤の投与レジメン、解毒剤の投与のタイミング、治療される対象及び病状、対象の体重及び年齢、病状の重症度、投与方法等によって異なり、これらは全て、当業者によって容易に決定することができる。

本明細書で使用されるとき、「治療すること」、「治療」等の用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、障害またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、及び／または障害及び／または障害に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。

「治療」には、哺乳類の障害の治療も含まれ、次のものが含まれる：（ａ）障害の素因となる可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない可能性がある対象において障害が発生するのを防ぐ、例えば、抗凝固剤の過剰摂取を伴う患者の出血を防ぐ；（ｂ）障害を抑制する、すなわち、その発症を阻止する、例えば、出血を抑制する；または（ｃ）障害を軽減または改善する、例えば出血を減らす。

本明細書で使用されるとき、「治療する」は、病状に関連する症状の全身的改善及び／または症状の発症の遅延をさらに含む。「治療」の臨床的及び無症状の証拠は、病状、個人、及び治療によって異なる。

「投与」は、一つの用量で実現可能であり、その用量は治療過程を通じて連続的または断続的である。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される組成物、治療目的、治療される標的細胞、及び治療される対象に合わせて変化することになる。単回または複数回投与は、担当医師により選択された用量レベル及びパターンに合わせて行うことができる。適切な投与製剤及び薬剤を投与する方法は当該技術分野で知られている。診断または治療の「対象」は、細胞またはヒトを含む哺乳動物である。診断または治療の対象となる非ヒト動物には、例えば、ラット、マウス等のネズミ科、イヌ等のイヌ科、ウサギ等のウサギ科、家畜、スポーツ動物、及びペットが含まれる。

本開示の薬剤及び組成物は、医薬品の製造において、及び医薬組成物中の有効成分等の従来の手順に従った投与によるヒト及び他の動物の治療のために使用することができる。

本開示の薬剤は、任意の適切な経路、特に非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）投与によって治療のために投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの状態及び年齢、ならびに治療される疾患によって異なることも理解されよう。

方法、すなわち、第Ｘａ因子阻害剤の阻害または逆転が、多くのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば抗ｆＸａ活性アッセイ、トロンビン生成アッセイ、ならびに臨床凝固アッセイ、例えば、ａＰＴＴ、ＰＴ、及びＡＣＴによって達成されるかどうかを判定することができる。

ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸に関連して本明細書において使用されるとき、用語「単離された」は、巨大分子の天然の供給源に存在しているそれぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然には存在せず、そして天然の状態では見出されないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離され、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味するポリペプチド及びタンパク質を指すために本明細書で使用される。他の実施形態では、「単離された」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片（複数可）であり、通常は自然界で関連している、細胞及びその他の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片（複数可）は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。

本明細書で使用されるとき、参照タンパク質、ポリペプチド、または核酸を指すときの「それらの均等物」という用語は、所望の機能性を維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。本明細書で言及される任意の改変タンパク質はまた、その均等物を含むことが企図される。例えば、相同性は、少なくとも７５％の相同性、代替的に少なくとも８０％、代替的に少なくとも８５％、代替的に少なくとも９０％、代替的に少なくとも９５％、代替的に９８％パーセントの相同性であり得、参照ポリペプチドまたはタンパク質と実質的に均等の生物学的活性を示し得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対する「配列同一性」のある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）を有し、整列されるとき、その塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージは、２つの配列を比較において同一であることを意味する。ｆＸａ（または関連するセリンプロテアーゼ）の重鎖のみが使用される場合、全体的な相同性は、例えば、６５％または５０％等の７５％未満である可能性があるが、所望の機能性は残ることに留意されたい。この整列及び相同性または配列同一性のパーセントは、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０， ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８， Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載されているものを使用して決定できる。好ましくは、デフォルトパラメーターが整列のために使用される。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝ハイスコアによる；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見つけることができる：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。

用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとり得、公知であれ未知であれ任意の機能をなし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの会合の前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。他に特定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態及び二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々を包含する。

ポリヌクレオチドは、次の４つのヌクレオチド塩基の特定の配列からなる：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；ポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表示は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能的ゲノム学及び相同性検索等のバイオインフォマティクス用途に使用することができる。

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列の類似性を指す。相同性は、比較の目的で整列させることができる各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められているとき、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致の位置または相同の位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」の配列は、本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。

ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対する「配列同一性」のある特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）を有し、整列されるとき、その塩基（またはアミノ酸）の割合は、２つの配列を比較において同一であることを意味する。この整列及び相同性または配列同一性のパーセントは、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを用いて決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメーターが整列のために使用される。１つの整列プログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴである。特に、プログラムはＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝ハイスコアによる；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見つけることができる：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、２００７年１１月２６日に最後にアクセスされた。生物学的に均等なポリヌクレオチドは、特定の相同性パーセントを有し、そして同一または類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。

「核酸のホモログ」という用語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列との、ある特定の相同性の程度を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その相補体とまたはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様において、核酸の相同体は核酸またはその相補体とハイブリダイズすることができる。

「遺伝子」は、転写及び翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のいずれかを使用して、それらが関連する遺伝子のより大きな断片または全長のコード配列を同定することができる。より大きな断片配列を単離する方法は、当業者に知られている。

「発現する」という用語は、遺伝子産物の産生を指す。

本明細書で使用されるとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されるときに、ポリペプチド及び／またはその断片のｍＲＮＡを産生するように転写及び／または翻訳することができる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、核酸の相補体であり、それからコード配列を推定することができる。

「ペプチドコンジュゲート」は、１つまたは複数のポリペプチドと別の化学的または生物学的化合物との共有結合または非共有結合による会合を指す。非限定的な例では、ポリペプチドと化合物との「コンジュゲーション」は、その意図された目的のためのポリペプチドの改善された安定性または効力をもたらす。一実施形態では、ペプチドは担体に結合しており、担体はリポソーム、ミセル、または薬学的に許容されるポリマーである。

「薬学的に許容されるポリマー」という語句は、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチドにコンジュゲートすることができる化合物の群を指す。ポリマーのポリペプチドへのコンジュゲーションは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチドの半減期を延長することができると考えられる。非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、糖、ポリオール、及びそれらの混合物が含まれる。

ＩＩ．解毒剤
ｒ－解毒剤に対するさらなる改変を含む第Ｘａ因子解毒剤
例えば、参照により本開示に組み込まれる、米国特許第８，１５３，５９０号に開示されるｒ－解毒剤へのさらなる改変が企図され、ｒ－解毒剤の、安定性、結合効率、及び／または結合特異性をさらに改善することができる。ｒ－解毒剤と同様に、改変解毒剤も軽鎖と重鎖を含む２鎖にすることができるが、重鎖のみを有する単鎖にすることもできる。解毒剤が二本鎖ポリペプチドである場合、軽鎖は、例えば、（配列番号１の）残基１７２と３４２の間の鎖間ジスルフィド結合を介して重鎖に連結することができる。
Ａ． 脱アミド化、イソアスパラギン酸の形成、または酸化の防止または低減

ｒ－解毒剤のＡｓｎ及びＡｓｐ側鎖は、翻訳後に脱アミド化またはイソアスパラギン酸形成を受ける可能性があり、その機能に影響を与えたり、製造プロセスを複雑にしたりする可能性がある。同様に、Ｍｅｔ側鎖は翻訳後に酸化を受ける可能性がある。したがって、脱アミド化、イソアスパラギン酸の形成、または酸化を回避するためのこれらの残基の選択的置換は、そのような潜在的な問題を改善するのに役立ち得る。

次の場所のＡｓｎ及びＡｓｐ残基は、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸形成の潜在的な標的である：Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、及びＮ２５９（（全て、表１３ｂに示される配列番号１３の軽鎖及び重鎖の配列の連続するアミノ酸番号に従った番号付け）。Ｄ１２とＤ２９はＥＧＦ様ドメイン１にあり、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６はＥＧＦ様ドメイン２にあり、Ｄ１１４、Ｎ１６３、Ｎ２５９は重鎖にある。

これらの残基の中で、Ｎ８６及びＤ１１４は、翻訳後の脱アミド化またはイソアスパラギン酸形成の影響を最も受けやすいことが発見されており、Ｄ１２、Ｄ２９、及びＮ５９も標的となる可能性がある。

これらのＡｓｎまたはＡｓｐは、脱アミド化またはイソアスパラギン酸の形成を防止または低減するために、改変、誘導体化、または置換することができる。例えば、それらは、Ｅ、Ｑ、Ｓ、またはＡで置換することができる。より具体的には、置換の非限定的な例には、Ｄ１２Ｅ、Ｄ２９Ｅ、Ｎ５９Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７１Ｓ、Ｎ７１Ａ、Ｎ８６Ｑ、Ｎ８６Ｓ、Ｄ１１４Ｅ、Ｄ１１４Ｓ、Ｎ１６３Ｓ、Ｎ１６３Ｑ、Ｎ２５９Ｑ、Ｎ２５９Ｓ、及びＮ２５９Ａが含まれる。

いくつかの態様では、１つまたは複数のＭｅｔ残基は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、またはＲ等であるがこれらに限定されない異なる残基で置換されている。
Ｂ． 「特異性ポケット」に対する改変

ｆＸａ等のセリンプロテアーゼは、ペプチド／タンパク質基質からのアミノ酸を収容する触媒セリン残基の近くに構造的に異なる部位（しばしば「特異性ポケット」またはＳ１サブサイトと呼ばれる）を有する。各セリンプロテアーゼは、ポケットのエンベロープを形成し、特定の基質アミノ酸側鎖（例えば、トリプシンの場合はＡｒｇ、Ｌｙｓ、キモトリプシンの場合はＰｈｅ）のみを収容できる固有の構造を提供する固有のアミノ酸セットを有している。

特異性ポケット内の１つまたは複数の残基の改変は、ｒ－解毒剤の結合親和性または特異性を改善するのを助けることができると考えられる。このような改変は、解毒剤の他の機能への影響を回避または最小化するように選択できる。

例えば、セリンプロテアーゼの結晶構造は、特異性ポケットに隣接して水チャネルのシステムがあることを示す。これらのチャネルは、基板側鎖がポケットに挿入されたときにポケット内の水分子が出ていくのを可能にする。結晶構造はまた、水分子が互いに、及びプロテアーゼの構造的完全性を維持するプロテアーゼ骨格／側鎖とともに、水素結合のシステムを形成することを示す。これらの水チャネルは特異性ポケット及び実際にプロテアーゼ構造の不可欠な部分であるため、ポケット内の残基の改変は水チャネルの完全性を維持する必要があると考えられる。

一態様では、改変には、配列番号１３（ｒ－解毒剤）と比較して、Ｖ２３２、Ｖ２５３、Ｄ２８４、Ａ２８５、Ｖ３０８、Ｇ３１１、Ａ３１５、Ｇ３２１、またはＹ３２３における、１つまたは複数の置換を含めることができる。特に、部位Ｖ２３２、Ｄ２８４、Ｖ３０８、及びＧ３１１が効果的であると考えられる。非限定的に、置換は、Ｖ２３２Ｉ、Ｄ２８４Ｍ、Ｄ２８４Ｑ、Ｄ２８４Ｓ、Ｖ３０８Ｓ、Ｇ３１１Ｈ、Ｇ３１１Ｋ、Ｇ３１１Ｎ、Ｇ３１１Ｑ、及びＧ３１１Ｓであってよい。

いくつかの態様では、モデリングは、置換の特定の組み合わせが結合親和性の改善に効果的であり得ることを示す。そのような置換の組み合わせの非限定的な例には、以下が含まれる、
ｉ）Ｄ２８４Ｍ；
ｉｉ）Ｄ２８４Ｍ及びＧ３１１Ｓ；
ｉｉｉ）Ｄ２８４Ｍ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｉｖ）Ｄ２８４Ｍ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｖ）Ｄ２８４Ｑ；
ｖｉ）Ｄ２８４Ｑ及びＧ３１１Ｓ；
ｖｉｉ）Ｄ２８４Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｄ２８４Ｑ、Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｉｘ）Ｄ２８４Ｓ及びＧ３１１Ｑ；
ｘ）Ｄ２８４Ｓ、Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｉ）Ｇ３１１Ｋ；
ｘｉｉ）Ｇ３１１Ｑ；
ｘｉｉｉ）Ｇ３１１Ｎ；
ｘｉｖ）Ｇ３１１Ｓ；
ｘｖ）Ｇ３１１Ｈ；
ｘｖｉ）Ｇ３１１Ｋ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｖｉｉ）Ｇ３１１Ｑ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｖｉｉｉ）Ｇ３１１Ｎ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｉｘ）Ｇ３１１Ｓ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ；
ｘｘ）Ｇ３１１Ｈ、Ｖ２３２Ｉ、及びＶ３０８Ｓ。

提供されるように、これらの置換及び置換の組み合わせは、解毒剤のｆＸａ阻害剤に対する結合親和性を増加させることができると考えられる。

第Ｘａ因子阻害剤は、一態様では、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、アピキサバン、リバーロキサバン、ＴＡＫ－４４２、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、ベトリキサバンまたはそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせ等の直接的な第Ｘａ因子阻害剤（例えば、小分子阻害剤）である。特定の態様において、直接的な第Ｘａ因子阻害剤はリバーロキサバンである。

第Ｘａ因子阻害剤は、一態様では、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、チンザパリン、低分子量ヘパリン及びそれらの組み合わせ等であるがこれらに限定されない間接的な第Ｘａ因子阻害剤である。特定の局面において、間接的な第Ｘａ因子阻害剤はエノキサパリンである。

いくつかの態様では、改変は、解毒剤が組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合するのを防ぐことができると考えられている。

特異性ポケット以外のサブサイトのアミノ酸も変更できると考えられる。そのようなアミノ酸には、例えば、（配列番号１３と比較して）Ｔ１８９、Ｙ１９０、Ｆ２６７、またはＩ２６８、またはそれらの組み合わせが含まれる。置換の非限定的な例には、Ｔ１８９Ｗ、Ｙ１９０Ｗ、Ｆ２６７Ｗ、Ｉ２６８Ｗ、またはそれらの組み合わせが含まれる。そのような置換は、タンパク質と小分子阻害剤との疎水性相互作用を増加させると考えられている。

別の態様では、置換は、ｆＸａ活性部位を取り囲む以下のループ、Ｔ１８６～Ｙ１９０、Ｒ２３７～Ｒ２４３、Ｓ２６５～Ｉ２６８、またはＧ３１１～Ｇ３１３のアミノ酸で行うことができる。

Ｃ． 触媒三残基の改変
本開示の解毒剤は、触媒作用を有さないか、または低下した触媒能力を有する。例えば、活性部位におけるｒ－解毒剤はＳｅｒ１９５Ａｌａ（プロテアーゼ番号付けによると、これは配列番号１３の２９０位にある）の置換を有する。この位置でのさらなる改変（Ｓｅｒに戻らない）、及び触媒三残基の他の２つの残基（キモトリプシン番号付けによるＨｉｓ５７及びＡｓｐ１０２、または配列番号１３に示すＨ１４７及びＤ１９３）での改変は、タンパク質の触媒能力を回復することなく、ｆＸａ阻害剤（直接的または間接的）に対する解毒剤の親和性をさらに向上させることができると考えられている。

Ａ２９０の置換の例には、とりわけＡｓｎ、Ｇｌｎ、及びＬｙｓを含めることができる。Ａｓｎは、Ｈ１４７及びリバーロキサバン＞Ｃ＝Ｏと水素結合を形成することができる。ＧｌｎとＬｙｓは、小分子との疎水性相互作用を追加することができる。

Ｈ１４７の置換の例には、とりわけＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎが含まれる。Ｈ１４７での変更は、Ａ２９０の変更に追加されてもよいが、Ｄ１９３は埋め込まれており、Ｈ１４７と直接相互作用するため、Ｈ１４７での変更はＤ１９３への影響も考慮に入れることができる。Ｈ１４７がＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎに変更された場合、Ｄ１９３は維持されるかＡｓｎに変更されてもよい。

したがって、一態様では、本開示の解毒剤は、（配列番号１３の）Ａ２９０、Ｈ１４７、またはＤ１９３のうちの１つまたは複数での１つまたは複数の置換を含む。

いくつかの態様では、置換は、Ａ２９０Ｎ、Ａ２９０Ｑ、Ａ２９０Ｋ、Ｈ１４７Ｓ、Ｈ１４７Ｔ、Ｈ１４７Ｎ、Ｈ１４７Ｑ、またはＤ１９３Ｎにあり得る。いくつかの態様では、置換、または置換の組み合わせには、以下のものが含まれる、
ｉ）Ａ２９０Ｎ；
ｉｉ）Ａ２９０Ｑ；
ｉｉｉ）Ａ２９０Ｋ；
ｉｖ）Ｈ１４７Ｓ；
ｖ）Ｈ１４７Ｔ；
ｖｉ）Ｈ１４７Ｎ；
ｖｉｉ）Ｈ１４７Ｑ；
ｖｉｉｉ）Ｈ１４７Ｓ及びＤ１９３Ｎ；
ｉｘ）Ｈ１４７Ｔ及びＤ１９３Ｎ；
ｘ）Ｈ１４７Ｎ及びＤ１９３Ｎ；
またはそれらの組み合わせ。

Ｄ． Ｎ末端またはＥＧＦドメインでの改変
一実施形態では、本開示の解毒剤は、ｒ－解毒剤（配列番号１３）と比較して、Ｎ末端の疎水性残基の数を減らすための１つまたは複数の変異を含むことができる。この態様では、ポリペプチドの変異が（配列番号１３の）Ａ１とＫ１１の間のアミノ酸残基にある。さらなる態様では、変異はＡ１とＹ１０の間のアミノ酸残基にある別の態様では、変異は、Ａ１とＹ１０の間のアミノ酸残基の欠失及びＫ１１のＧへの置換である。さらに別の態様では、変異は、Ａ１とＹ１０の間のアミノ酸残基の欠失及びＫ１１からＡへの置換である。

さらなる実施形態において、解毒剤は、配列番号１３と配列番号１６の組み合わせであり、配列番号１６は、少なくとも１つのアミノ酸変異、置換、または改変を有し、配列番号１３のＬ５とＦ６の間に挿入される。

一態様では、本開示の解毒剤は、翻訳後のメチオニン酸化を防ぐために、ｒ－解毒剤と比較して、変異を含む。翻訳後のメチオニン酸化を防ぐための変異には、Ｍ２７３Ｉ、Ｍ２７３Ｌ、またはＭ２７３Ｖが含まれ得る。

一態様では、解毒剤のＮ末端は、次のアミノ酸配列ＤＧＤ、ＫＤＧＤ、ＧＤＧＤ、ＡＤＧＤのいずれかで始まるように変更できる。そのような改変は、例えば、解毒剤のＮ末端の疎水性残基の数を減らすであろう。代替的に、ＥＧＦ様ドメインの一方または両方を欠失して、コンストラクトがＥＧＦ様ドメイン２：重鎖のみ、または重鎖プロテアーゼドメインのみを含むようにすることができる。別の実施形態では、セリンプロテアーゼドメインのみが使用され、例えば、重鎖の残基の変更が必要とされるであろう。（配列番号１３と比較した）置換Ｃ２２１ＳまたはＣ２２１Ａは、この実施形態では、必要であり、他の残基での変更は、Ｃ２２１に追加され、任意の組み合わせであり得る。

ｆＸａ軽鎖でのさらなる短縮、例えば、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ１プラスＥＧＦ２ドメイン、またはそれらの断片の追加の欠失、及び重鎖のみを有する不活性なｆＸａは、本開示の有用な解毒剤となり得ると考えられる。

Ｅ． 改変の組み合わせ
異なるタイプの改変の組み合わせもまた企図される。一態様では、解毒剤には、（ｉ）Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、及びＮ２５９での１つまたは複数のＡｓｎ及びＡｓｐ残基の置換、ならびに（ｉｉ）特異性ポケットの残基、例えば、Ｖ２３２、Ｖ２５３、Ｄ２８４、Ａ２８５、Ｖ３０８、Ｇ３１１、Ａ３１５、Ｇ３２１、またはＹ３２３での１つまたは複数の置換が含まれる。一態様では、ＡｓｎまたはＡｓｐは、Ｎ８６もしくはＤ１１４、またはＤ１２、Ｄ２９、もしくはＮ５９から選択される。一態様では、特異性ポケット内の残基は、Ｖ２３２、Ｄ２８４、Ｖ３０８、及びＧ３１１から選択される。

別の態様では、解毒剤には、（ｉ）Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、及びＮ２５９での１つまたは複数のＡｓｎ及びＡｓｐ残基の置換、ならびに（ｉｉｉ）触媒三残基（例えば、Ａ２９０、Ｈ１４７、またはＤ１９３）での１つまたは複数の残基での置換が含まれる。一態様では、ＡｓｎまたはＡｓｐは、Ｎ８６もしくはＤ１１４、またはＤ１２、Ｄ２９、もしくはＮ５９から選択される。一態様では、触媒三残基での残基はＡ２９０である。

一態様では、解毒剤は、（ｉ）Ｄ１２、Ｄ２９、Ｎ５９、Ｎ７１、Ｎ８６、Ｄ１１４、Ｎ１６３、及びＮ２５９での１つもしくは複数のＡｓｎ及びＡｓｐ残基の置換、（ｉｉ）特異性ポケットでの残基、例えば、Ｖ２３２、Ｖ２５３、Ｄ２８４、Ａ２８５、Ｖ３０８、Ｇ３１１、Ａ３１５、Ｇ３２１、もしくはＹ３２３での１つもしくは複数の置換、または（ｉｉｉ）触媒三残基（例えば、Ａ２９０、Ｈ１４７、もしくはＤ１９３）の１つもしくは複数の残基での置換、及び（ｉｖ）上述のようなＮ末端またはＥＧＦドメインでの改変のうちの１つまたは複数を含む。

組み合わせはまた、上述の改変のうちの１つまたは複数、及びその内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１０／１１７７２９に開示されるもの等の１つまたは複数の既知の改変を含み得る。一態様では、追加の改変は、重鎖のＮ末端にある活性化ペプチドの全部または一部を欠失することである。一実施形態では、これには、活性化ペプチドまたは配列番号３またはその均等物の１４３～１９４のアミノ酸残基の全部または部分の欠失を含む。

別の実施形態では、追加の改変は、βペプチドの切断を防止するアミノ酸改変であり、ここで、βペプチドは、重鎖の一部または全体を指す。この改変には、アミノ酸の欠失、置換、または挿入が含まれ得る。このような改変には、Ａｒｇ４２９またはＳｅｒ４３６（キモトリプシン番号付け）の１つまたは複数の置換が含まれる。さらに別の実施形態では、追加の改変は、βペプチドの欠失である。βペプチドの欠失は、少なくとも配列番号３またはその均等物の４３０～４４８のアミノ酸残基の欠失を含む。

一実施形態では、追加の改変には、補因子ｆＶ／ｆＶａとのｆＸａ相互作用に重要であることが知られているｆＸａ残基での変異が含まれる。このような残基には、非限定的に、Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、またはＬｙｓ４１４（配列番号３及び７、これらのアミノ酸は、キモトリプシン番号付けにおけるＡｒｇ１２５、Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１６５、Ｌｙｓ１６９、Ｌｙｓ２３０に対応する）が含まれる。さらに、配列番号３及び７のＡｒｇ４２４（キモトリプシン番号付けのＡｒｇ２４０）等、ｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａ相互作用に重要であることが知られているｆＸａ残基での変異を、ｆＸａ阻害剤解毒剤としても使用できる。

ｆＸａの活性部位残基またはセリンプロテアーゼ相互作用に重要であることが知られている残基の他の改変、例えば、配列番号３及び７中のＧｌｕ２１６、Ｇｌｕ２１８、及びＡｒｇ３３２（それぞれキモトリプシン番号付けのＧｌｕ３７、Ｇｌｕ３９、及びＡｒｇ１５０）の他のアミノ酸残基での置換もまた含むことができる。

さらなる追加の実施形態では、追加の改変は、潜在的な分解を排除するためのＦＸａ重鎖の自己消化ループでの変異であり得る。ＦＸａは、ファミリーの他のセリンプロテアーゼと同様に、様々なプロテアーゼによる切断を受けやすい露出した表面ループ（自己消化ループ）を有する。配列番号１の３６６～３７６のアミノ酸を含むこのループは、いくつかの正に帯電した残基（Ａｒｇ３６６、Ｌｙｓ３７０、Ａｒｇ３７２、Ａｒｇ３７６）を含み、Ａｒｇ３７２が切断の潜在的な認識部位である。これらの帯電した残基は、Ｇｌｎ（Ｑ）またはＡｌａ（Ａ）に変異させて、切断の可能性を防ぐことができる。一態様では、変異はＡｒｇ３６６Ｑ／Ａである。別の態様では、変異はＬｙｓ３７０Ｑ／Ａである。さらに別の態様では、変異はＡｒｇ３７２Ｑ／Ａである。さらに別の態様では、変異はＡｒｇ３７６Ｑ／Ａである。いくつかの実施形態では、ｆＸａ誘導体にはそのような変異を１つまたは複数有する。

ＩＩＩ． 解毒剤を調製する方法
本開示のポリペプチドは、適切な宿主細胞において本開示のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって調製することができる。これは、当業者に知られている組換えＤＮＡ技術の方法によって達成することができる。本開示のタンパク質及びポリペプチドはまた、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡによって製造されたものである、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ等の市販の自動ペプチドシンセサイザーを使用する化学合成によって得ることができる。合成されたタンパク質またはポリペプチドは沈殿させ、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することができる。したがって、本開示はまた、タンパク質の配列ならびにアミノ酸及び酵素等の試薬を提供し、アミノ酸を適切な配向及び直線状配列で一緒に連結することによって、本開示のタンパク質を化学的に合成するためのプロセスを提供する。

変更された特性を提供するために任意のペプチドに改変を加えることができることは当業者に知られている。本開示のポリペプチドは、非天然アミノ酸を含むように改変することができる。したがって、ペプチドは、ペプチドに特別な特性を伝えるために、Ｄ－アミノ酸、Ｄ－及びＬ－アミノ酸の組み合わせ、ならびに様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β－メチルアミノ酸、Ｃ－α－メチルアミノ酸、及びＮ－α－メチルアミノ酸等）を含むことができる。さらに、特定のカップリングステップで特定のアミノ酸を割り当てることにより、α－ヘリックス、βターン、βシート、α－ターン、及び環状ペプチドを含むペプチドを生成することができる。一般に、αヘリックス二次構造またはランダム二次構造が好ましいと考えられている。

さらなる実施形態において、有用な化学的及び構造的特性を与えるポリペプチドのサブユニットが選択されるであろう。例えば、Ｄ－アミノ酸を含むペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＬ－アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性があり得る。Ｄ－アミノ酸を有する改変化合物は、逆の順序で整列されたアミノ酸を用いて合成されて、本開示のペプチドをレトロ－インベルソペプチドとして生成し得る。さらに、本開示は、より明確な構造特性を有するペプチドの調製、ならびにペプチド模倣物、及びエステル結合等のペプチド模倣結合を使用して、新規の特性を有するペプチドを調製することを想定している。別の実施形態では、還元ペプチド結合、すなわち、Ｒ_１－ＣＨ_２ＮＨ－Ｒ_２を組み込んだペプチドを生成することができ、ここで、Ｒ_１及びＲ_２はアミノ酸残基または配列である。還元ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入され得る。そのような分子は、ペプチド結合の加水分解、例えばプロテアーゼ活性に耐性があるであろう。このような分子は、代謝分解またはプロテアーゼ活性への耐性によるｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の延長等、独自の機能と活性をリガンドに提供する。さらに、特定のシステムでは、拘束されたペプチドが増強された機能的活性を示すことはよく知られており（Ｈｒｕｂｙ （１９８２） Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１：１８９－１９９ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２６８：２４９－２６２）；本開示は、他の全ての位置にランダム配列を組み込む拘束されたペプチドを生成する方法を提供する。

以下の非古典的アミノ酸は、特定の構造的モチーフを導入するために、本開示のペプチドに組み込まれ得る：１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート（Ｋａｚｒｎｉｅｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２２７５－２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）－メチル－フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）－メチル－フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）－メチル－フェニルアラニン及び（２Ｒ，３Ｒ）－メチル－フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ （１９９１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２（４１）：５７６９－５７７２）；２－アミノテトラヒドロナフタレン－２－カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ （１９８９） Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）；ヒドロキシ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ．Ｔａｋｅｄａ Ｒｅｓ． Ｌａｂｓ． ４３：５３－７６）、ヒスチジンイソキノリンカルボン酸（Ｚｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｉｎｔ． Ｊ．Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３８（２）：１３１－１３８）；ならびにＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔ． Ｊ．Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４２（１）：６８－７７）及び（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｃｔａ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｃ． ４８：１２３９－１２４１）。

以下のアミノ酸類似体及びペプチド模倣物をペプチドに組み込んで、特定の二次構造を誘導または支持することができる：ＬＬ－Ａｃｐ（ＬＬ－３－アミノ－２－プロペニドン－６－カルボン酸）、βターン誘導ジペプチド類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５０：５８３４－５８３８）；β－シート含有類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：５０８１－５０８２）；β－ターン含有類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：５０５７－５０６０）；α－ヘリックス含有類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：４９３５－４９３８）；α－ターン含有類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５４：１０９：１１５）；以下の参照文献によって提供される類似体： Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ （１９８５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２６：６４７－６５０；ａｎｄ ＤｉＭａｉｏ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． ｐ．
１６８７；Ｇｌｙ－Ａｌａターン類似体（Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３０：２３１７）；アミド結合アイソスター（Ｃｌｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：３８５３－３８５６）；テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８）
Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１１０：５８７５－５８８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｉｎｔ． Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐ． Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）；ならびにＯｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １１２：３２３－３３３ ａｎｄ Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ
ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．５６：４３６で教示される類似体。ベータターン及びベータバルジの立体配座的に制限された模倣物、及びそれらを含むペプチドは、１９９５年８月８日にカーンに発行された米国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。

ペプチドの生物学的機能を変化させない１つまたは複数の機能的に均等なアミノ酸で１つまたは複数のアミノ酸を置換することによって、任意のペプチドに改変を加えることができることは当業者に知られている。一態様では、アミノ酸は、疎水性、サイズ、または電荷を含むがこれらに限定されない、同様の固有の特性を有するアミノ酸によって置換される。置換されるべき適切なアミノ酸及びどのアミノ酸に置換するかを決定するために使用される方法は、当業者に知られている。非限定的な例には、Ｄａｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖｏｌ． ５ ｓｕｐｐｌ． ２ （ｅｄ． Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ）， ｐｐ． ３４５－３５２． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣによって記載されているような経験的置換モデル；Ｄａｙｈｏｆｆ行列を含むＰＡＭ行列（Ｄａｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）、前出、またはＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ８：２７５－２８２、及びＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１１４５によって記載されているようなＪＴＴ行列；Ａｄａｃｈ ａｎｄ Ｈａｓｅｇａｗａ （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４２：４５９－４６８によって記載されている経験的モデル；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９によって記載されているブロック置換行列（ＢＬＯＳＵＭ）；Ｎｅｉ （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．によって記載されているポアソンモデル；ならびにＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． １９：８－１３によって記載されている最尤（ＭＬ）法が含まれる。

ＩＶ． 第Ｘａ因子解毒剤の使用方法
本開示は、抗凝固療法を受けている対象における出血を予防または低減する治療方法に関する。本開示の解毒剤は、傷害に対して有害な血行力学的副作用または増殖性血管反応の悪化を引き起こすことなく、ｆＸａ阻害剤の従来の抗凝固特性を安全かつ特異的に中和することができる選択的または緊急の状況で使用される短期間の薬物となり得ると考えられる。

本開示の一態様は、本開示の有効量の解毒剤を対象に投与することによって第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象の出血を予防または低減する方法に関する。

別の態様では、本明細書で提供される方法は、本開示の有効量の解毒剤を対象に投与することを含む、第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象において外因的に投与された第Ｘａ因子阻害剤に選択的に結合して阻害する。対象は、細胞またはヒト等の哺乳動物であり得る。

この治療に適した患者は、以前に抗凝固療法を受けており、例えば、第Ｘａ因子の阻害剤等の１つまたは複数の抗凝固剤が投与されている。

第Ｘａ因子阻害剤は、一態様では、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、アピキサバン、リバーロキサバン、ＴＡＫ－４４２、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、ベトリキサバンまたはそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせ等の直接的な第Ｘａ因子阻害剤（例えば、小分子阻害剤）である。特定の態様において、直接的な第Ｘａ因子阻害剤はリバーロキサバンである。

第Ｘａ因子阻害剤は、一態様では、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、チンザパリン、低分子量ヘパリン及びそれらの組み合わせ等であるがこれらに限定されない間接的な第Ｘａ因子阻害剤である。特定の局面において、間接的な第Ｘａ因子阻害剤はエノキサパリンである。

同様に、本開示によって提供されるのは、本開示の１つまたは複数の解毒剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。組成物は、それを必要とする対象に、所望の利益、出血の減少または停止を提供する量で投与される。組成物は、第Ｘａ因子解毒剤の活性を補完または増強する任意の適切な薬剤または治療と共投与することができる。そのような例は、解毒剤の血漿半減期を延長することができる第２の薬剤である。適切な第２の薬剤の例には、ｆＸａ重鎖のエキソサイトを認識する抗ｆＸａ抗体またはα－２－マクログロブリン結合ｆＸａ解毒剤が含まれるが、これらに限定されない。ｆＸａ解毒剤と第２の薬剤（エキソサイト抗体またはα－２－マクログロブリン）の間の複合体の形成は、高分子相互作用を遮断するが、活性部位依存性阻害剤結合の能力を保持する。共投与に適した抗ｆＸａ抗体の例には、Ｙａｎｇ Ｙ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６， １；１７７（１１）：８２１９－２５、Ｗｉｌｋｅｎｓ， Ｍ ａｎｄ
Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ， Ｓ．， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２００２， ２７７ （１１）， ９３６６－９３７４、及びＣｈｕｒｃｈ ＷＲ， ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， １９８８， ７２（６）， １９１１－１９２１に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、解毒剤は、対象が出血のリスクにさらされる可能性がある、ｆＸａ阻害剤の過剰投与後、または手術の前に投与される。

本明細書に記載の方法のいずれにおいても、必ずしも明示的に述べられていなくても、本開示の解毒剤の有効量が対象に投与されることを理解されたい。この量は、治療する医師によって経験的に決定することができ、対象の年齢、性別、体重、及び健康状態によって変動する。治療する医師が考慮すべき追加の因子には、投与された可能性のある第Ｘａ因子阻害剤の同一性及び／または量、解毒剤が対象に投与される方法またはモード、解毒剤の製剤、及び患者の治療の評価項目が含まれるが、これらに限定されない。これらの変数を念頭に置いて、当業者は、治療対象に治療有効量を投与する。対象の抗凝固剤を中和する、または実質的に中和するのに十分な本明細書に記載の解毒剤の治療有効量は、対象の体重１キログラムあたり約０．０１ミリグラムの解毒剤から解毒剤の対象の体重１キログラムあたり１グラムの解毒剤までを含み得ることが企図される。さらに、解毒剤は、約１０ナノモル濃度～約１００マイクロモル濃度、または約１０ナノモル濃度～約５マイクロモル濃度、または約１００ナノモル濃度～約２．５マイクロモル濃度の範囲の濃度で対象に提供され得ることが企図される。

本明細書に開示される改変のいくつかは、解毒剤の中和能力を高めることができる。したがって、有効量は、対象の体重１キログラムあたり約０．００１ミリグラムの解毒剤から、解毒剤の対象の体重１キログラムあたり０．５グラムの解毒剤まで、より低くすることができる。

特定の態様では、約１、２、３、４、５、６、７、または８ミリグラム（ｍｇ）から約０．５、１、または１．５グラム（ｇ）までを含む単位用量製剤が提供される。本発明によって企図される他の量には、約５０ｍｇ～約１ｇ；約１００ｍｇ～約０．８ｇ；及び約２００ｍｇ～約５００ｍｇが含まれる。

別の実施形態では、単位用量製剤は、少なくとも約３０分間、第Ｘａ因子阻害剤の循環濃度に対するポリペプチドの循環濃度の少なくとも約０．５：１倍のモル比である中和量で投与される。他の実施形態では、モル比は、約０．１：１、または約０．２：１または約１：１である。

投与された場合の製剤は、第Ｘａ因子阻害剤を少なくとも約２０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％中和する。

組成物は、解毒剤が対象の第Ｘａ因子阻害剤を直接的または間接的に選択的に認識して結合するのに有効な量で投与することができる。それらはまた、対象において外因的に投与された第Ｘａ因子阻害剤を実質的に阻害または実質的に中和する量で投与することができる。

いくつかの実施形態では、解毒剤は、上述の解毒剤のいずれかである。いくつかの実施形態では、解毒剤は、解毒剤の循環半減期を延長することができる部分とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、部分は、ポリエチレングリコール、アシル基、リポソーム、担体タンパク質、人工リン脂質膜、及びナノ粒子からなる群から選択される。例えば、本明細書に記載のｆＸａ解毒剤の非活性部位のリジンまたはシステイン残基は、ポリエチレングリコール分子に付着するように化学的に修飾され得る。Ｗｅｒｌｅ， Ｍ．
＆ Ｂｅｒｎｋｏｐ－Ｓｃｈｎｕｒｃｈ， Ａ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｌａｓｍａ Ｈａｌｆ Ｌｉｆｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ， Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２００６， ３０（４）：３５１－３６７に記載されている他の方法は、本開示の解毒剤の結晶半減期を延長するために使用できる。

本開示の他の実施形態では、本開示の解毒剤の半減期は、解毒剤をＦｃ担体ドメインに結合することによって改善される。一実施形態では、解毒剤は、免疫グロブリンペプチド部分またはＩｇＧ１断片等のＦｃ断片に結合する。一実施形態では、ｆＸａ解毒剤と免疫グロブリンペプチド部分を含むキメラタンパク質が企図される。さらに別の実施形態では、ｆＸａ解毒剤と免疫グロブリンペプチドは、ヒトＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖定常領域とのジスルフィド結合等の化学反応によって結合される。

一実施形態では、治療有効量の解毒剤は、高い治療指数を示す。毒性と治療効果と間の用量比は、治療指数であり、それはＬＤ_５０とＥＤ_５０との間の比率として表され得る。ＬＤ_５０は集団の５０％に致命的な用量であり、ＥＤ_５０は集団の５０％で治療的に有効な用量である。ＬＤ_５０及びＥＤ_５０は、動物細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。本開示の解毒剤は、対象の血漿中に存在するｆＸａ阻害剤の効果を中和するために必要な場合に、１回または数回投与することができる。好ましくは、本開示の解毒剤は、単回投与で投与される場合に十分である。

本開示の解毒剤の典型的な投与量は、実際の臨床状況及び血漿中の阻害剤濃度に依存すると考えられる。抗ｆＸａ活性アッセイ及びトロンビン生成等のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ａＰＴＴ、ＰＴ、及びＡＣＴ等の臨床凝固アッセイでは、治療有効量の解毒剤が１０％以上のｅｘ ｖｉｖｏ凝固活性の補正をもたらすと予想される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、解毒剤／阻害剤の比率が１．０を超えると、逆転効果を示すはずであることを示す。解毒剤の最大血漿中濃度は、マイクロモル濃度範囲、おそらく１０マイクロモル濃度以下であると予想される。

臨床状態では、解毒剤の有効性を判断する際の基準の１つは、解毒剤が実際の出血の測定値にいくらかの変化をもたらすことである。臨床試験では、主要な出血のカテゴリーには、致命的な出血、重要な臓器への出血（頭蓋内、眼内、腹腔内、脊髄、心膜）、再手術または新しい治療手順を必要とするいずれかの出血（例えば、手術した膝の吸引、血胸のための開胸チューブ挿入、内視鏡的電気凝固等）、または明白な出血に関連している場合は２．０以上の出血指数が含まれる。出血指数は、輸血された濃厚赤血球または全血の単位数に出血エピソード前のヘモグロビン値を加えて、出血が安定した後のヘモグロビン値を引いたものとして定義される（グラム／デシリットル単位）。

臨床状況での解毒剤の有効性に関する別の基準は、臨床的に重要な非主要な出血を減らすことである。このカテゴリーの出血には、持続性または再発性でかなりの量の鼻血または介入なしでは止まらない鼻血；持続性または再発性でかなりの量の鼻血、または介入なしでは止まらない鼻血；治療手順（フォーリーカテーテルの新規挿入や膀胱鏡検査等）を必要とするレベルまで上昇しない直腸または尿路の出血、注射部位または他の場所での自発的または些細な外傷で発生する実質的な血腫；かなりの失血；計画外の輸血を必要とする出血を含む重大ではないが通常よりも多い出血が含まれ、臨床的注意が必要である。本明細書で使用されるとき、「実質的な失血」は、外科的処置に通常関連する量よりも多い失血の量を指す。かなりの失血は腫脹につながるが、それはドレナージを必要としないため、保守的に管理される。

一実施形態では、本開示の解毒剤は、血漿中に存在するｆＸａ阻害剤を実質的に中和するのに十分な血漿循環半減期を有する。活性化されたｆＸａは、ＡＴＩＩＩ、ＴＦＰＩ、及びその他の血漿阻害剤によって効果的に阻害されるため、ヒトでの循環半減期は本質的にない（Ｆｕｃｈｓ， Ｈ．Ｅ． ａｎｄ Ｐｉｚｚｏ， Ｓ．Ｖ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， １９８３， ７２：２０４１－２０４９）。不活性なｆＸａは、ヒトでの循環半減期が２～３時間であることが示されている。ヒヒモデルでは、ＤＥＧＲ（［５－（ジメチルアミノ）１－ナフタレンスルホニル］－グルタミルグリシルラルギニルクロロメチルケトン）によって活性部位で遮断されたｆＸａの半減期は、同位体または酵素結合免疫吸着アッセイによって決定されるとき、それぞれ、約１０時間または２時間であった（Ｔａｙｌｏｒ， Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， １９９１， ７８（２）：３６４－３６８）。

解毒剤の半減期を２４～４８時間に延長することが望ましい場合がある。以下の部分のうちの１つまたは複数のコンジュゲーションまたは付加は、解毒剤の血漿半減期を増加させることと考えられている：
ａ）ポリエチレングリコール；
ｂ）アシル基；
ｃ）リポソーム及び封入剤；
ｄ）担体タンパク質；
ｅ）人工リン脂質膜；
ｆ）免疫グロブリン；ならびに
ｇ）ナノ粒子。

コンジュゲーションが解毒剤の阻害剤結合部位（複数可）をマスクしない限り、コンジュゲーション部位は特別な鎖または残基に限定されなくてもよい。本明細書に記載の解毒剤は、上述の化合物のいずれか１つまたは１つを超えて組み合わせて投与することができる。

一般に、投与された抗体は、循環血液凝固タンパク質よりもはるかに長い半減期を有する。Ｇｌａドメイン欠損ｆＸａとｆＸａのエキソサイトに結合する抗体とからなる複合体を、循環半減期が延長した解毒剤として使用することができる。ｆＸａとエキソサイトを標的とする抗体との間の複合体の形成は、Ｇｌａドメイン欠損ｆＸａと高分子基質及び阻害剤、例えばプロトロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩ等との相互作用を減少させ得るが、一方で活性部位のクレフトを乱さずに残して、直接的な阻害剤に向けられた活性部位に結合する解毒剤として複合体が作用し得る。α－２－マクログロブリン－ｆＸａ複合体の形成は、ｆＸａの直接的な阻害剤の解毒剤としても有用であり得る。

ｆＸａ阻害剤の抗凝固活性及びその凝固促進活性の逆転における解毒剤の有効性は、当業者によるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び動物モデルによって決定され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、抗ｆＸａ活性アッセイ、トロンビン生成、ａＰＴＴ、ＰＴ、及びＡＣＴ等の臨床凝固アッセイである。本開示の解毒剤は、ｅｘ ｖｉｖｏ凝固活性の１０％以上の補正をもたらし得ると考えられる。例えば、マウス等のげっ歯類、イヌ、及びサル等の霊長類における出血時間及び／または失血のいくつかのｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルを使用して、効力を測定することができる。

Ｖ．ポリヌクレオチド、宿主細胞、及び組成物
本開示はまた、本開示の任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの相補体を提供する。相補性は、中程度または高いストリンジェンシーの条件下で従来のハイブリダイゼーションを使用して決定することができる。本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに修飾ヌクレオチドを意図する。例えば、本開示はまた、アンチセンスポリヌクレオチド鎖、例えば、これらの配列またはそれらの相補体に対するアンチセンスＲＮＡを提供する。

本発明のポリペプチド及びポリペプチド複合体と実質的に相同で生物学的に均等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。実質的に相同で生物学的に均等であるとは、少なくとも６５％、または代替的に少なくとも７０％、または代替的に少なくとも７５％、または代替的に少なくとも８０％、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９７％の、上述で定義された相同性等の様々な程度の相同性を有し、第Ｘａ因子阻害剤に結合する生物学的活性を有し、本明細書に記載されるようにプロトロンビナーゼ複合体に集合しないポリペプチドをコードするものを意図する。実質的に相同なポリペプチド及びポリヌクレオチドに対する実施形態が、本開示の各態様、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び抗体を対象としていることを常に明示的に述べているわけではないが、理解されるべきである。

本開示のポリヌクレオチドは、従来の組換え技法を使用して複製することができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技術を使用して複製することができる。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；及び同第４，６８３，２０２号の課題であり、ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ （１９９４））、及び、それらの中の参照文献に記載されている。さらに、当業者は、本明細書で提供される配列及び市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して、ＤＮＡを複製することができる。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチドの直線状配列、適切なプライマー分子、酵素等の化学物質、及びそれらの複製のための指示を提供し、ヌクレオチドを適切な配向で化学的に複製または連結してポリヌクレオチド得ることによって、本開示のポリヌクレオチドを得るためのプロセスを提供する。別の実施形態では、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。さらに、当業者は、ポリヌクレオチドを、宿主細胞におけるそれらの発現のための制御配列に作動可能に連結することができる。ポリヌクレオチド及び制御配列は、複製及び増幅のために宿主細胞（原核生物または真核生物）に挿入される。そのように増幅されたＤＮＡは、当業者に周知の方法によって細胞から単離することができる。この方法によってポリヌクレオチドを取得するためのプロセスは、そのようにして得られたポリヌクレオチドと同様に、本明細書でさらに提供される。

ＲＮＡは、最初にＤＮＡポリヌクレオチドを適切な原核生物または真核生物の宿主細胞に挿入することによって得ることができる。ＤＮＡは、任意の適切な方法、例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）の使用によって、またはエレクトロポレーションによって挿入することができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、次いで、ＲＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ
Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）、前出に記載されているように、当業者に周知の方法を使用して単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）、前出に記載されている手順に従って、様々な溶解酵素または化学溶液を使用して単離するか、製造元から提供された付随する取扱説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出することができる。

本開示はまた、本開示のタンパク質またはポリペプチドと特異的に複合体を形成することができる抗体を提供し、これは、本開示の治療方法において有用である。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、抗体断片、ならびにそれらの誘導体（上述）を含む。抗体には、マウス、ラット、ウサギ、またはヒトの抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、細胞培養、ファージ、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿等を含むがこれらに限定されない様々な動物で産生され得る。抗体はまた、治療用ポリペプチドを同定及び精製するために有用である。

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む宿主細胞も提供される。一態様では、ポリペプチドは発現され、細胞表面に（細胞外に）存在する。開示されたポリペプチドを含む適切な細胞には、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、及びヒト細胞が含まれるがこれらに限定されない原核生物及び真核生物細胞が含まれる。細菌細胞の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉが含まれる。細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）等の商業的ベンダーから購入するか、または当該技術分野で知られている方法を使用して分離株から培養することができる。適切な真核細胞の例には、２９３Ｔ ＨＥＫ細胞、ならびにハムスター細胞株ＣＨＯ、ＢＨＫ－２１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｃ１２７と指定されたマウス細胞株、類人猿細胞株ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、及びヒト細胞株ＨｅＬａ、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌから市販）Ｕ－９３７、及びＨｅｐ Ｇ２が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞の非限定的な例には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａが含まれる。発現に有用な酵母の例には、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、トルロプシス属、ヤロウイア属、またはピキア属が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８１２，４０５号、同第４，８１８，７００号、同第４，９２９，５５５号、同第５，７３６，３８３号、同第５，９５５，３４９号、同第５，８８８，７６８号、及び同第６，２５８，５５９号を参照されたい。

本開示はさらに、本開示の解毒剤及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

一実施形態では、第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象における出血を予防または低減するための、本開示の解毒剤及び薬学的に許容される担体を含む組成物が本明細書で提供される。

別の実施形態では、第Ｘａ因子阻害剤による抗凝固療法を受けている対象において外因的に投与された第Ｘａ因子阻害剤に選択的に結合して阻害する組成物が提供される。組成物は、有効量で対象に投与され、本開示の解毒剤及び薬学的に許容される担体を含む。

さらなる実施形態では、組成物は、手術の前に対象に投与される。

「薬学的に許容される担体」は、本開示の組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または担体を指す。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩または炭酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロタミン硫酸塩等の、飽和植物脂肪酸、水、塩、または電解質の部分グリセリド混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が含まれる。適切な薬学的担体は、この分野の標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。それらは、好ましくは、意図された投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ等に関して選択され、従来的な薬務と一致している。

本開示の医薬組成物は、とりわけ、従来の造粒、混合、溶解、カプセル化、凍結乾燥、または乳化プロセス等の当該技術分野において周知の方法によって製造され得る。組成物は、顆粒剤、沈殿物、または微粒子、凍結乾燥された、回転乾燥された、もしくは噴霧された粉末を含む粉末、無定形粉末、アモルファス粉末、注射剤、乳濁液、エリキシル剤、懸濁液または溶液を含む様々な形態に産生できる。製剤は、任意選択で、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、可溶化剤、バイオアベイラビリティ調整剤、及びこれらの組み合わせを含み得る。

薬学的製剤は、油、水、アルコール、及びそれらの組み合わせ等の滅菌液体を使用した液体懸濁液または溶液として調製され得る。薬学的に好適な界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤が、経口または非経口投与のために添加され得る。懸濁液は、ピーナツ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、及びオリーブ油等の油を含み得る。懸濁液製剤はまた、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリド、及びアセチル化脂肪酸グリセリド等、脂肪酸のエステルを含み得る。懸濁液製剤は、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール、及びプロピレングリコール等のアルコールを含み得る。ポリ（エチレングリコール）等のエーテル、鉱油及びワセリン等の石油系炭化水素、ならびに水はまた、懸濁液製剤に使用され得る。

本開示の組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの医薬投与のために製剤化される。本開示のそのような医薬組成物は、様々な方法で、好ましくは非経口的に投与することができる。

緊急事態において患者の血漿中に存在するｆＸａ阻害剤の抗凝固活性を迅速に逆転させるために、本開示の解毒剤は、非経口投与を介して体循環に投与することができるか、または投与してもよいと考えられる。本明細書で使用されるとき、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射または注入技法を含む。しかしながら、中和されているｆＸａ阻害剤の血漿半減期が長い場合、ｆＸａ阻害剤に結合して、ｆＸａ阻害剤が生体から除去される前に活性ｆＸａを解放するために持続注入または持続放出製剤が必要になることがある。

本発明の組成物の滅菌の注射可能な形態は、水性または油性の懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、好適な分散または湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当該技術分野で既知の技法に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液等の非毒性の非経口として許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液及び生理食塩液である。加えて、滅菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、注射可能物の調製に有用であり、同様に、オリーブ油またはひまし油等の天然の薬学的に許容される油は、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンにおいて、有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、乳剤または懸濁液を含む、薬学的に許容される剤形の製剤化で一般的に使用される、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤等、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造で一般的に使用される、他の一般的に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、及び他の乳化剤、またはバイオアベイラビリティ強化剤もまた、製剤化の目的で使用され得る。組成物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の単位剤形は、アンプルまたは多用量容器中にあってもよい。

上述の剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤及び担体ならびに剤形は、一般に当業者に知られており、本開示に含まれる。任意の特定の患者に対する特定の投薬量及び治療レジメンは、用いられる特定の解毒剤の活性、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別及び食事、腎臓及び肝臓の機能、ならびに投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、治療する医師または獣医師の判断、ならびに治療される特定の疾病の重症度を含む様々な因子に依存することもまた、理解されるべきである。

ＸＩ．キット
本開示はキットまたはパッケージをさらに提供する。いくつかの実施形態では、本開示のキットは以下を含む：（ａ）血栓症の治療のための定期投与用のｆＸａ阻害剤を含む第１の容器、及び（ｂ）（ａ）でｆＸａ阻害剤の過剰摂取がある場合、または、出血を止めたり予防したりするために正常な止血を回復する必要がある場合に使用される本開示の解毒剤を含む第２の容器。他の実施形態では、キットは、（ａ）と（ｂ）のこれらの２つの薬剤をいつ使用すべきかを説明するラベルをさらに含む。

第１及び第２の容器は、ボトル、ジャー、バイアル、フラスコ、注射器、チューブ、バッグ、または医薬品の製造、保管、または流通に使用される他の任意の容器であり得る。添付文書は、キットの医薬組成物に関連する情報を記載するラベル、タグ、マーカー等であり得る。記載されている情報は通常、米国食品医薬品局等、医薬組成物が販売される地域を管理する規制機関によって決定される。好ましくは、添付文書は、医薬組成物が承認された適応症を具体的に記載している。添付文書は、人物がその中またはその上に含まれる情報を読むことができる任意の材料でできていてもよい。好ましくは、添付文書は、紙、接着剤で裏打ちされた紙の段ボール、ホイル、またはプラスチック等の印刷可能な材料であり、その上に所望の情報が印刷または塗布されている。

本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のための診断キットまたはパッケージをさらに提供する。一実施形態では、本開示のキットは、本開示の解毒剤を含む容器を含む。解毒剤は全血または血漿に添加されてｆＸａ阻害剤を中和し、凝固アッセイ等のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験との阻害剤の干渉を取り除く。いくつかの実施形態では、本開示のキットは以下を含む：（ａ）阻害剤の定期的な診断試験のためのｆＸａ阻害剤を含む第１の容器、及び（ｂ）効果を決定するかまたは解毒剤の使用を導くための本開示の解毒剤を含む第２の容器。

本開示は、本発明の純粋に例示的であることを意図する以下の実施例を参照することによってさらに理解される。本発明は、例示の目的のために意図されるにすぎない、本明細書に記載される具体的な実施形態によって、範囲を限定されるものではない。機能的に均等な方法はどれでも、本開示の範囲内に含まれる。本明細書説明されるものに加えて、本発明の様々な改変が、上述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。

特に明記されていない限り、全ての温度は摂氏である。また、これらの実施例や他の場所では、略語は次の意味を有する。

実施例１ 乏血小板血漿（ＰＰＰ）または多血小板血漿（ＰＲＰ）でのトロンビン生成アッセイ
この実施例では、０．３２％クエン酸塩に採取された健康なドナーの血液から、乏血小板血漿または多血小板血漿の試料が調製された。ＰＲＰ及びＰＰＰは、抗凝固処理された血液を、室温で、それぞれ約１００倍の重力または１０００倍の重力で２０分間回転させることによって調製された。７５～１００マイクロリットル（ｕＬ）の血漿を、ＣａＣｌ_２及びＺ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－アミノメチルクマリン（Ｚ－ＧＧＲ－ＡＭＣ、トロンビン蛍光発生基質）と混合した。組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ，Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を追加して、トロンビンの生成を開始した。典型的な実験では、反応混合物は１５ミリモル濃度（ｍＭ）のＣａ^２＋、１００マイクロモル濃度（μＭ）のＺ－ＧＧＲ－ＡＭＣ、及び０．１ナノモル濃度（ｎＭ）の組織因子（ＴＦ）（Ｉｎｎｏｖｉｎ）を含んだ。トロンビン形成は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定する蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって３７℃で継続的にモニターした。阻害剤及び解毒剤が存在する場合、トロンビン生成を開始する前に、血漿とともに室温で２０分間プレインキュベートした。

実施例２ 凝固延長アッセイ
２つの凝固アッセイ形式を使用して、凝固延長に対する第Ｘａ因子阻害剤と解毒剤の効果を試験した。第１の形式では、９６ウェルプレートを使用して複数の試料を同時に測定した。第２のアッセイ形式では、ａＰＴＴを従来の凝固装置（ＭＬＡ Ｅｌｅｃｔｒａ ８００自動凝固タイマー）で測定した。

９６ウェルプレート形式法では、ヒトの乏血小板血漿または多血小板血漿を、実施例２の手順と同様に調製した。７５～１００μＬの血漿をＣａＣｌ_２で再石灰化し、３７℃で３分間インキュベートし、組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ， Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）またはａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ ＦＳ， Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を添加して血餅形成を開始した。ＯＤ４０５の変化は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって継続的にモニターした。凝固時間は、吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）の変化の最大値の半分に達した時間（秒）として定義された。第Ｘａ因子阻害剤と解毒剤が存在する場合は、反応を開始する前に、血漿と室温で２０分間プレインキュベートした。

活性ｆＸａの凝固活性を試験したとき、７５～１００ｕＬのｆＸ欠損血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）をＣａＣｌ_２で再石灰化し、３７℃で３分間インキュベートし、キモトリプシン消化後のｆＸａ生成物を血漿に添加して血餅形成を開始した。ＯＤ４０５の変化は、前述のようにプレートリーダーによって継続的にモニターした。

実施例３ ＣＨＯ細胞における組換え解毒剤の発現
この実施例では、解毒剤変異体はＣＨＯ細胞で直接発現させることができ、機能性タンパク質は以下に記載するように培養上清から精製される。組換え解毒剤の機能的活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び動物モデルで試験できる。

本明細書に記載の解毒剤をコードするＤＮＡ配列は、配列決定され、発現ベクターに挿入され得る。次いで、ベクターを直線化し、ＣＨＯ ｄｈｆｒ（－）細胞にトランスフェクトすることができる。テトラヒドロ葉酸（ＨＴ）欠損培地にメトトレキサート（ＭＴＸ）を加えて使用して細胞を選択する。安定したクローンは、ｆＸ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＦＸ－ＥＩＡ）を使用して高タンパク質発現についてスクリーニングされる。解毒剤は無血清培地で発現し、培養上清が回収され、精製のために処理される。

培養上清中の標的タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーによって単離され得、その後、シングルステップアフィニティークロマトグラフィー（マトリックスに結合した抗ｆＸａ抗体等）または疎水性及びサイズ排除マトリックス等のいくつかのクロマトグラフィーステップの組み合わせによって精製される。アフィニティー精製には、ベンザミジン－セファロースまたは大豆トリプシン阻害剤－アガロース（ＳＴＩ－アガロース）等、ｆＸａ活性部位のクレフトに選択的に結合するクロマトグラフィー材料が含まれ得る。

実施例４ 解毒剤によるｆＸａの阻害の逆転
ベトリキサバンによるｆＸａ活性の阻害及びその阻害効果の逆転を測定するために、精製された活性ｆＸａ、異なる濃度のベトリキサバン、及び本開示の異なる解毒剤を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａ^２＋、及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へと添加できる。室温で２０分間インキュベートした後、１００μＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ－ｆＸａ（第Ｘａ因子発色基質、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を混合物に添加し、基質切断速度をプレートリーダーによって４０５ナノメートル（ｎｍ）で５分間継続的にモニターする。発色活性は、いずれの阻害剤も存在しない活性ｆＸａに対して正規化される。阻害剤及び解毒剤濃度の関数としての生成物形成の初速度を非線形回帰によって分析して、解毒剤に対するベトリキサバンの親和性を推定する。

発色基質Ｓ２２８８（２００μＭ）に対するトロンビン活性に対する解毒剤の効果は、特異的な小分子ＩＩａ阻害剤であるアルガトロバンを含んでも含まずとも、以前と同様に測定される。

実施例５ ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデル
解毒剤の投与を伴ってまたは伴わず、オスのＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるベトリキサバンの薬物動態学的及び薬力学的（ＰＫ－ＰＤ）プロファイルを試験する。ベトリキサバンの単回経口投与は、対照群では０、１５、２５、及び７５ｍｇ／ｋｇで投与される。解毒剤処理群には１５ｍｇ／ｋｇが使用される。解毒剤（３００ｕｇ／２００μＬ）またはビヒクル（通常の生理食塩水、２００μＬ）の単回静脈内（ＩＶ）注射は、１．５時間の時点の５分前に投与される。

ベトリキサバンの経口投与後１．５、２．０、及び４．０時間で、マウスをケタミンカクテル（ＳＣ）で麻酔し、心臓穿刺により失血させる。血液試料（０．５ｍＬ）を、５０μＬのクエン酸三ナトリウムで採取する。全血ＩＮＲは、製造者の取扱説明書に従って、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．カートリッジ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して測定する。マウスの乏血小板血漿は、ベトリキサバン及び解毒剤の（ＥＬＩＳＡ）血漿濃度測定のために遠心分離によって調製される。

解毒剤実験では、対照群のマウスに０、１５、２５、及び７５ｍｇ／ｋｇのベトリキサバンを経口投与する。解毒剤（３００μｇ／２００μＬ）処理群には１５ｍｇ／ｋｇが使用される。ベトリキサバンの経口投与の１．５時間後（解毒剤注射の５分後）に試料を採取する。

本発明を上述の実施形態に関連して説明してきたが、前述の説明及び実施例は例示を意図しており、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点及び改変は、本発明が関係する当業者には明らかであろう。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。