JP2015507929A - 第Xa因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス - Google Patents
第Xa因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015507929A JP2015507929A JP2014557747A JP2014557747A JP2015507929A JP 2015507929 A JP2015507929 A JP 2015507929A JP 2014557747 A JP2014557747 A JP 2014557747A JP 2014557747 A JP2014557747 A JP 2014557747A JP 2015507929 A JP2015507929 A JP 2015507929A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- polypeptide
- seq
- isolated
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title abstract description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 115
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 112
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 175
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 50
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 21
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 15
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 6
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 14
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 12
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 11
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 101001022148 Homo sapiens Furin Proteins 0.000 description 10
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- -1 antibody Proteins 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008165 X-Box Binding Protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010035430 X-Box Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N betrixaban Chemical compound C=1C=C(Cl)C=NC=1NC(=O)C1=CC(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C(=N)N(C)C)C=C1 XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950011103 betrixaban Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101001081251 Drosophila melanogaster Protein held out wings Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000835023 Homo sapiens Transcription factor A, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 102100025902 RNA-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101150113624 Rbm3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102100026155 Transcription factor A, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000050253 human FURIN Human genes 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6454—Dibasic site splicing serine proteases, e.g. kexin (3.4.21.61); furin (3.4.21.75) and other proprotein convertases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
Abstract
fXa阻害剤拮抗剤として作用する機能性fXa誘導体タンパク質の改善された生産に有益な方法および単離された細胞が開示される。1つの態様はr−拮抗剤ポリヌクレオチドおよびフーリンポリヌクレオチドを含む単離された細胞に関連する。他の態様は、事前にプロセシングされたr−拮抗剤ポリペプチドおよびフーリンポリペプチドを細胞内で発現させることにより、切断された2鎖r−拮抗剤を調製する方法に関連する。本明細書に説明される方法および細胞は、r−拮抗剤およびフーリンの生体内での同時発現によって、機能性r−拮抗剤の向上した生産をもたらす。【選択図】図3
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法119条(e)に基づき、2012年2月14日に出願された米国特許仮出願第61/598,694号の利益を主張し、上記仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法119条(e)に基づき、2012年2月14日に出願された米国特許仮出願第61/598,694号の利益を主張し、上記仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示はfXa誘導体の発現および精製のために有益な細胞および方法に関連する。
抗凝血剤は、市場において、たとえば、凝固障害を有する、不動状態の期間を余儀なくされる、または医療用外科手術を受ける患者といった、血餅を形成する傾向を伴う患者の望まれない血栓症の治療または予防の役に立つ。しかし、抗凝血剤治療の重大な制限の1つに、治療に関連した出血の危険性があり、および、過剰投与の場合に、または緊急な外科手術処置が必要な際に、抗凝血作用を素早く逆転させる性能に対する制限がある。したがって、抗凝血剤治療の形態すべてに対して特効のある、および効果的である拮抗剤が非常に望まれている。安全性への考慮のために、新しい抗凝血医薬品の開発において、抗凝血剤−拮抗剤の組み合わせを有しておくことも好都合である。
これまでに報告されているfXaタンパク質の修飾誘導体は、fXaを標的とした抗凝血剤に対する拮抗剤として有益である。fXaタンパク質の修飾誘導体は、プロトロンビナーゼ複合体の構築においてはfXaと競合しないが、そのかわりに、fXa阻害剤といった抗凝血剤に結合し、および/または、fXa阻害剤といった抗凝血剤を実質的に中和させる。これらの修飾タンパク質誘導体は、米国公開公報第2009/0098119号および第2010/0255000号に記載され、適切な構造および機能のために翻訳後修飾を必要とする。そのような翻訳後修飾には、fX誘導体の前駆体におけるプレプロペプチドの除去および内部−RKRRKR−(配列番号5)リンカー配列の切断が含まれ、成熟したfX誘導体タンパク質を形成する。
宿主細胞系における不完全または非効率なプロセシングは、機能性タンパク質の単離の低下につながり得る。したがって、当該技術分野において、fXa阻害剤拮抗剤として有益な機能性fXa誘導体タンパク質のプロセシングの効率を向上させるシステムの必要性がある。
本明細書では、機能性r−拮抗剤タンパク質の生産の増加のための方法および細胞を開示する。ヒト第Xa因子誘導体(すなわち、前駆r−拮抗剤)のフーリンとの生体内処理が、機能性2鎖タンパク質の向上したプロセシングを可能にするということは、以前は知られていなかった。したがって、本明細書に説明される方法および細胞は、r−拮抗剤およびフーリンの生体内での同時発現によって、機能性r−拮抗剤の向上した生産をもたらす。
本開示の態様は、単離された細胞に関連しており、前記単離された細胞は:
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1および第2ポリヌクレオチドは別々のポリヌクレオチド構築物上にあり、またいくつかの実施形態では、第1および第2ポリヌクレオチドは同じポリヌクレオチド構築物上にあり、これらは、別々の調節エレメントを有し得る。
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1および第2ポリヌクレオチドは別々のポリヌクレオチド構築物上にあり、またいくつかの実施形態では、第1および第2ポリヌクレオチドは同じポリヌクレオチド構築物上にあり、これらは、別々の調節エレメントを有し得る。
関連する態様では、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物が提供される。
別の態様は、配列番号3に示されるアミノ酸配列または配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドを含む切断された2鎖ポリペプチドを調製する方法に関連し、前記方法は、単離された細胞内に次のものを発現させることを含む:
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド。
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド。
単離された細胞は、必要な翻訳後修飾のプロセシングおよび切断を提供する任意の適切な宿主細胞であり得る。適切な細胞には、非制限的な例として、酵母細胞といった真菌細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞が含まれる。1つの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞である。関連する実施形態では、前記哺乳動物細胞はCHO、COS、BHKおよびHEK293から成る群から選択される細胞型である。さらなる実施形態では、前記細胞型はCHOである。さらなる実施形態では、前記CHO細胞型は、亜型K、MまたはDG44のものである。
I.定義
本開示の実施には、他に断りがない限り、従来技術の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組み換えDNAを利用し、これらは当該分野の技術内である。たとえば、Sambrookら(1989)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;Ausubelら編(1987)、Current Protocols In Molecular Biology;MacPherson、B.D.HamesおよびG.R.Taylor編(1995)、PCR2:A Practical Approach;HarlowおよびLane編(1988)、Antibodies,A Laboratory Manual;Harlow およびLane編(1999)、Using Antibodies,a Laboratory Manual;ならびにR.I.Freshney編(1987)、Animal Cell Cultureを参照されたい。
本開示の実施には、他に断りがない限り、従来技術の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組み換えDNAを利用し、これらは当該分野の技術内である。たとえば、Sambrookら(1989)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;Ausubelら編(1987)、Current Protocols In Molecular Biology;MacPherson、B.D.HamesおよびG.R.Taylor編(1995)、PCR2:A Practical Approach;HarlowおよびLane編(1988)、Antibodies,A Laboratory Manual;Harlow およびLane編(1999)、Using Antibodies,a Laboratory Manual;ならびにR.I.Freshney編(1987)、Animal Cell Cultureを参照されたい。
すべての数値指定、たとえばpH、温度、時間、濃度および分子量は、範囲も含め、必要に応じて1.0または0.1ずつ(+)または(−)に変化する近似値である。いつも明確に提示されるとは限らないが、すべての数値指定に「約」という語が先行するということを理解されなくてはならない。また、いつも明確に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものであり、その同等品が当該技術分野では公知であることも理解されなくてはならない。
本明細書および特許請求の範囲で使用される通り、単数形である「1つの」(「a」、「an」)および「その」(「the」)は、文脈によって明らかでない限り、複数形への言及も含む。
本明細書で使用される通り、「含む」(comprising)という語句は、組成物および方法が、明示された要素を含むが、他を排除はしない、という意味であることが意図される。組成物および方法を定義するために使用される「から本質的に成る」は、意図された目的のために使用される場合、その組み合わせに本質的に重要な他の要素を排除することを意味するであろう。このように、本明細書で定義される要素から本質的に成る組成物は、微量汚染物または不活性担体を除外しない。「から成る」は他の成分および重要な方法工程の微量元素より多くを除外することを意味するであろう。これらの各移行語によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「タンパク質」「ペプチド」および「ポリペプチド」という語は、同じ意味で使用され、その最も広い意味で、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣薬の化合物を指す。サブユニットはペプチド結合で結合していてもよい。別の実施形態では、サブユニットは他の結合、たとえばエステル、エーテルなど、によって結合されていてもよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有していなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は一切設けられない。本明細書で使用される通り、「アミノ酸」という語は天然および/もしくは非天然または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンおよびDおよびL光学異性体の双方、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣薬を含む。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という語は同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかを指す。ポリヌクレオチドは任意の3次元構造を有し得、公知または未知に関わらず、いかなる機能も実行し得る。ポリヌクレオチドの非制限的な例としては、次のものが挙げられる:遺伝子または遺伝子断片(たとえば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エキソン、イントロン、伝令RNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、RNAi、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログといった、修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造物への修飾が起こる場合は、ヌクレオチド構築物への修飾はポリヌクレオチドの構築の前後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは重合後に、標識成分との結合などによって、さらに修飾されてもよい。この語はまた二重および単鎖の分子の双方も指す。他に断りがないまたは要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の実施形態はどれも二重鎖形態および二重鎖形態を構成すると知られるまたは予想される2つの各相補単鎖形態の双方を包括する。
ポリヌクレオチドは4つのヌクレオチド塩基の特定の配列から構成される:アデニン(A);シトシン(C);グアニン(G);チミン(T);およびポリヌクレオチドがRNAの時はチミンの代わりにウラシル(U)。このように、「ポリヌクレオチド配列」という語はポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記を、中央処理装置を有するコンピューター内のデータベースに入力し、ゲノム機能解析および相同性検索といった生命情報科学の適用に使用することができる。
DNAまたはRNAといった核酸に関して本明細書で使用される「単離された」および「組み換え」という語は高分子およびポリペプチドの天然源にそれぞれ存在する他のDNAまたはRNAから分離された分子を指す。「単離された」という語句は、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すためにも使用され、精製および組み換えポリペプチドの双方を包括することを意図されている。他の実施形態では、「単離された、または、組み換え」という語は、細胞性およびそれ以外の構成成分から分離されたことを意味し、その中では、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が、通常天然に付随している。たとえば、単離された細胞とは、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、その本来または自然の環境、たとえば染色体上で通常一緒に付随している3’および5’の隣接するヌクレオチドから単離される。当業者には明らかな通り、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はその断片(複数可)は、「単離」して天然に存在する対応物から区別する必要はない。
他に意図されない限り、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関連する際、その同等物または生物学上の同等物が本開示の範囲内にあることを意図されていることは、明確な明示がなくとも推測される。本明細書で使用される通り、「その生物学上の同等物」という語は、基準タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸を指す場合、「その同等物」と同義であることが意図されており、望まれる構造または機能性をまだ維持する一方で最小限の相同性を有するものを意図する。別の実施形態では、ポリヌクレオチド「の生物学上の同等物」は、基準ポリヌクレオチドまたはその補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものを指す。本明細書で特に明示されない限り、本明細書で言及されるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はその同等物を含むことが企図される。たとえば、同等物は、少なくとも約80%の相同性または同一性、および、あるいは少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または98%パーセントの相同性または同一性を意図し、基準タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。
「ハイブリダイゼーション」は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得るハイブリダイゼーション反応を指す。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大する条件は広く知られており、当該技術分野で公表されている:たとえば、Sambrookら、infraを参照されたい。関連する条件の例としては(ストリンジェンシーが増大する順で)次のものが含まれる:25℃、37℃、50℃および68℃のインキュベーション温度;10倍SSC、6倍SSC、1倍SSC、0.1倍SSCの緩衝液濃度(ここで、SSCは0.15MのNaClおよび15mMのクエン酸緩衝液である)および他の緩衝液系を用いたそれらの同等;0%、25%、50%および75%のホルムアミド濃度;5分〜24時間のインキュベーション時間、および、継続時間を増やし、頻度を増やし、または緩衝液濃度を低下していく洗浄。
別の配列と一定のパーセンテージ(たとえば、80%、85%、90%または95%)の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドまたはポリペプチド領域)は、配置された際、塩基(またはアミノ酸)の割合がその2つの配列を比べた場合に同じであることを意味する。その配置およびパーセント相同性または配列同一性は当該技術では公知のソフトウェアプログラム、たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1987)別冊30、セクション7.7.18、表7.7.1に記載されるものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトのパラメーターを配列のために使用する。好ましい配列プログラムはデフォルトのパラメーターを用いたBLASTである。とりわけ、好ましいプログラムは次のデフォルトのパラメーターを用いたBLASTNおよびBLASTPである:遺伝子コード=標準;フィルター=無し;鎖=両方;カットオフ=60;見込み=10;マトリックス=BLOSUM62;表示=50配列;分類=高得点;データベース=非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+SwissProtein+SPupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は次のインターネットアドレスで見つけることが可能である:ncbi.nlm.nih.gov/cgi−bin/BLAST。
「相同性」「同一性」または「類似性」は2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために配置され得る各配列の位置を比較することで決定することができる。比較される配列での位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する、一致したまたは相同の位置の数の関数である。「非関連」または「非相同性」配列は40%未満の同一性、あるいは25%未満の同一性を本開示の配列の1つと共有する。
本明細書で使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現に、真核細胞内でのmRNAのスプライシングが含まれてもよい。
「ポリフェクション」はポリエチレンイミン(PEI)といったポリマーをもとにしたトランスフェクション技術を指す。
DNA構築物と細胞をトランスフェクトする際、対象の遺伝子(すなわち、フーリン、選択マーカーおよびr−拮抗剤前駆体)を保有するDNA構築物に加え、非コード担体DNAをトランスフェクトしてもよい。「トランスフェクトされた全DNA」は、DNAの総量(通常はμgで)を指し、プラスミドDNA(または他のDNA構築物)および担体DNAを含む。
タンパク質単離の文脈で使用される「分画」という語は、特定の性質に基づいて分離された物質の収集物を指す。特定な性質には、非制限的な例として、サイズ、質量、等電点、電荷などが挙げられる。
ポリヌクレオチドに適用される「コードする」という語は、その本来の状態または当業者にはよく知られている方法で操作される際に、転写および/または翻訳されてポリペプチドおよび/またはその断片のためのmRNAを生成することができたら、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補物であり、コードする配列はそこから推定することができる。
本明細書で使用される「構築物」という語は、人口的なDNA断片を指す。これらには、たとえば、プラスミド、プライマー、コスミド、発現ベクターなどが含まれる。
「非内因性」という語は、その細胞に由来しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。「非内因性」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一般的に遺伝子導入またはタンパク質投与によって細胞内に導入されたものである。「非内因性」という語がポリヌクレオチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドは染色体外または染色体内に位置してもよい(宿主細胞ゲノム内へのDNAの組み込まれた断片として)。
「内因性」という語は、その細胞由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチド(すなわち、その細胞に自然に発現するまたは存在するもの)を指す。
「発現量」という語は、細胞内に存在するタンパク質の量を指す。発現量は別のタンパク質(内因的にまたは非内因的のいずれかで発現される)の量と比較して定義されてもよい。タンパク質の発現量を決定する方法は当該技術分野では公知であり、本明細書に記載される。
「第Xa因子」または「fXa」または「fXaタンパク質」という語は、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼを指し、これは不活性第X因子(fX)から作られる。第Xa因子は、内因性Xaseとして知られる複合体で、補助因子である第VIIIa因子をともなう第IXa因子によって、または、外因性Xaseとして知られる複合体で、補助因子である組織因子を伴う第VIIa因子のいずれかによって活性化される。fXaは、第Va因子と一緒に膜結合プロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロンビナーゼ複合体内では、プロトロンビンからトロンビンへの転化を触媒する有効成分である。トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンへの転換を触媒する酵素であり、これによって最終的に血餅形成を促す。
「des−Gla fXa」はGla領域を有さないfXaを指す。これらfXa誘導体は、米国特許第8,153,590号に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される通り、「fXa誘導体」はプロトロンビナーゼ複合体の構築においてはfXaと競合せず、軽減した凝血促進活性を有する、または一切凝血促進活性を有さないが、fXa阻害剤といった抗凝血剤と結合し、実質的に中和する修飾fXaタンパク質を指す。fXa誘導体の例は国際公開第2009/042962号で提供されており、配列番号3(図8)およびその生物学上の同等物などが、さらに本明細書で提供される。
本明細書で使用される「フーリン」または「対塩基性アミノ酸切断酵素」という語は、ジェンバンク受託番号NP_002560(ヒト)、NP_001074923(マウス)またはNP_062204(ラット)の代表的なフーリン配列のいずれかに実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。フーリンをコードする好適なcDNAは、ジェンバンク受託番号NM_002569(ヒト)、NM_001081454(マウス)またはNM_019331(ラット)にて提供される。ある特定の態様では、フーリンはヒトフーリンを指す。代表的なヒトフーリンタンパク質配列は配列番号2(図7)で提供され、代表的なヒトフーリンcDNA配列は配列番号4(図7)で提供される。
「r−拮抗剤前駆体」は配列番号1によって表され、fXaと比べて3つの突然変異を含むfXa誘導体を指す。第1の突然変異はFXのGla領域における6−39aaの欠失である。第2の突然変異は活性化ペプチド配列143−194aaの−RKR−との置換である。これによって、軽鎖および重鎖を結びつける−RKRRKR−(配列番号5)リンカーが生成される。分泌の際、このリンカーはCHOで切断され、切断された2鎖ポリペプチドにつながる。したがって、「切断された2鎖ポリペプチド」という語は、2鎖を有し、少なくとも1つのジスフィルド結合によって一緒につながっている配列番号3に示されるポリペプチド、または配列番号3と80%の同一性を有するポリペプチドを指す。N末端鎖は配列番号3のアミノ酸1−105から成り、C末端鎖は配列番号3のアミノ酸106−359から成る。場合によっては、LC鎖はリンカーのアミノ酸残基を1、2、3、4、5または6つ含んでいてもよい。そのような追加の残基はリンカーポリペプチドの不完全除去の結果である。第3の突然変異は、活性部位残基S379のAla残基への突然変異である。このアミノ酸置換は、それぞれ配列番号1および3に示されるアミノ酸296および290に対応する。「r−拮抗剤」という語は、リンカーの切断およびプロセシング後のポリペプチドを指す。これは配列番号3によって表される。
「CHO」という語は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を指す。
「COS」は巨大T抗原を生産できるがゲノム複製においては欠陥を有するSV40ゲノムのバージョンを有するアフリカミドリザルの腎細胞由来であるCV−1細胞株を不死化することによって得られた細胞株を指す。COSという単語はCV−1(サル)由来(Origin)であり、SV40遺伝子材料を保有する細胞に由来する頭文字語である。
「BHK」はベビーハムスター腎臓細胞を指す。
「HEK293」は、組織培養で成長したヒト胎生腎細胞に本来由来するヒト胎生腎293細胞を指す。
「選択マーカー」という語は、人為的な選択のために好適な特色を与える、細胞内に導入される遺伝子を指す。これらは、臨床微生物学、分子生物学および遺伝子工学において使用され、トランスフェクションまたは外来DNAを細胞内に導入することを意図された他の方法の成功を示す、レポーター遺伝子の種類である。選択マーカーは、非制限的な例として、たとえばピューロマイシン、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどに対する抗生物質耐性を与える遺伝子といった、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。ピューロマイシンN−アセチル−トランスフェラーゼ(PAC)遺伝子はピューロマイシンに対する耐性を与える。ネオ遺伝子はネオマイシン、カナマイシンンおよびジェネテシンヘの耐性を与える。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)はハイグロマイシンへの耐性を与える。また、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)といった遺伝子またはその突然変異体も含まれる。「選択マーカー」という語は、研究者が所望する細胞と所望しない細胞を区別することができるマーカーを説明することも意図されている。例としては、色素や蛍光といった識別表現型を有するタンパク質を生産する遺伝子が含まれる。
「抗生物質耐性」という語は、抗生物質へ曝露しても残存する能力を有する細胞を指す。抗生物質の濃度は、抗生物質耐性遺伝子に欠ける細胞を除去すると知られている濃度、および、抗生物質耐性遺伝子を有する細胞が生き残ることを可能にする濃度である。一般的に、抗生物質耐性を有する細胞は継続的に選択されなくても抗生物質耐性を維持するであろう。しかし、自然突然変異が耐性の損失につながり得、その場合、耐性を失った細胞を除去するために、選択または抗生物質への曝露がさらに必要であり得る。
「DNA構築物」という語は、対象のポリヌクレオチドおよび場合によっては他の機能要素を含むDNAを指す。他の機能要素には、たとえば、複製起点、選択マーカー、プロモーターおよび終結配列が含まれる。
「染色体外DNA」は、染色体から離れた細胞内に位置するまたは維持されるDNAを指す。
DNA構築物の文脈で使用される「組み込まれる」という語は、DNA構築物を宿主細胞(すなわち、単離された細胞)ゲノムに挿入することを指す。
「プラスミド」または「DNAプラスミド」は染色体DNAから分離された、染色体DNAとは独立して複製することができる染色体外DNA分子である。多くの例で、環状であり、二重鎖である。プラスミドは微生物の個体群での水平遺伝子導入の機構を提供し、一般的には、所与の環境状態下で選択優位性を提供する。プラスミドは、競争環境的なニッチで天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を保有し得、あるいは、生産されたタンパク質は類似した環境下で毒素として作用し得る。
「細胞培養培地」という語は、細胞の培養に使用される培地を指す。培養培地は細胞の成長を支えるように設計されており、細胞型によって異なる。宿主細胞型に基づいて適切な培地を選択することは当業者に知られている。一般的な細胞培養技術および培地の例は、本明細書で説明される。
本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入する」、「トランスフェクトする」などは、導入のために用いられた方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチド(「導入遺伝子」と呼ばれることもある)の宿主細胞への導入を指す語である。
II.細胞および構築物
ヒト第Xa因子誘導体(すなわち、r−拮抗剤前駆体)のフーリンとの生体内処理は、機能性2鎖タンパク質の向上したプロセシングを可能にする。したがって、本開示の態様は、fXa誘導体の発現およびプロセシングのための細胞および構築物に関連する。
ヒト第Xa因子誘導体(すなわち、r−拮抗剤前駆体)のフーリンとの生体内処理は、機能性2鎖タンパク質の向上したプロセシングを可能にする。したがって、本開示の態様は、fXa誘導体の発現およびプロセシングのための細胞および構築物に関連する。
本開示は、1鎖r−拮抗剤前駆体から、fXa阻害剤への拮抗剤として作用する切断された2鎖r−拮抗剤タンパク質へのプロセシングの向上または強化のための細胞および方法を提供する。したがって、本開示の1つの実施形態は、fXa誘導体をコードする第1ポリヌクレオチドおよびフーリンタンパク質をコードする第2ポリヌクレオチドを含む単離された細胞を提供する。1つの態様では、第1および第2ポリヌクレオチドは別々のポリヌクレオチド構築物上に存在する。別の態様では、第1および第2ポリヌクレオチドは同じポリヌクレオチド構築物上に存在する。このように、本開示の別の実施形態は、第1および第2ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を提供する。
1つの態様では、fXa誘導体は配列番号1に示されるアミノ酸配列または配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドを有する。配列番号1で表されるfXa誘導体はfXaと比較して、3つの突然変異を含む。第1の突然変異はFXのGla領域における6−39aaの欠失である。第2の突然変異は活性化ペプチド配列143−194aaを−RKR−と置換する。これによって、軽鎖および重鎖を結びつける−RKRRKR−(配列番号5)リンカーが生成される。分泌の際、このリンカーはCHOで切断され、2鎖fXa分子につながる。第3の突然変異は、活性部位残基S379のAla残基への突然変異である。このアミノ酸置換は、それぞれ配列番号1および3に示されるアミノ酸296および290に対応する。fXa誘導体は、プロトロンビナーゼ複合体の構築においてはfXaと競合しないが、その代わり、fXa阻害剤といった抗凝血剤と結合し、および/またはfXa阻害物質といった抗凝血剤を中和する。拮抗剤として有益な誘導体は、内因性凝血促進および抗凝血作用を低下または除去するように修飾され、一方で阻害剤に結合する能力は持ち続ける。構造上、誘導体は凝血促進作用を一切提供しない、または、低下した凝血促進作用を提供するように修飾される。「凝血促進作用」は、本明細書において、血液凝固または血餅形成を生じさせる媒介物の能力を指す。低下した凝血促進作用は、凝血促進作用が、野生型fXaに比べて少なくとも約50%、または約90%超、または約95%超低下したことを意味する。
別の実施形態では、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、野生型第Xa因子に比べ、低下した凝血促進作用を有する。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列はプロトロンビナーゼ複合体を形成しない。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列は野生型第Xa因子に比べ、低下した凝血促進作用を有する。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列はプロトロンビナーゼ複合体を形成しない。
1つの実施形態では、単離された細胞は、配列番号3に示されるアミノ酸配列または配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む2鎖ポリペプチドをさらに含む。
1つの態様では、フーリンタンパク質は、配列番号2(図1)に示されるアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載される単離された細胞は、細胞内で発現し得る選択マーカーをさらに含む。さらなる実施形態では、選択マーカーはピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物に対する耐性を提供する。1つの実施形態では、選択マーカーはメトトレキセートに対する耐性を提供する。さらなる実施形態では、選択マーカーはピューロマイシンに対する耐性を提供する。別の実施形態では、選択マーカーはその細胞に対する抗生物質耐性を提供する。
本明細書で説明されるポリヌクレオチドは、DNA構築物上に含まれ得、および/または、DNA構築物から発現し得る。DNA構築物の例としては、プラスミド、コスミド、発現ベクター、ファージミド、フォスミド、ならびに細菌人工染色体、酵母人工染色体およびヒト人工染色体といった人工染色体が含まれる。特定の実施形態では、第1および第2ポリヌクレオチドは染色体外DNA構築物上に存在する。別の実施形態では、第1または第2ポリヌクレオチドは、単離された細胞の染色体DNAに組み込まれたDNA構築物上に存在する。発現ベクターがそのゲノム内に組み込まれた安定した細胞株は、細胞群内でさらに安定したタンパク質発現を可能にし、さらに一貫した結果につながる。第1および第2ポリヌクレオチドは1つのDNA構築物または別々の構築物上に含まれ得る。1つの構築物上に含まれる場合、それらは発現のために別々のプロモーターまたは同じプロモーターを使用し得る。1つのプロモーターから2つのタンパク質を発現する方法は当該技術分野で公知であり、たとえば、内部リボソームエントリー配列(IRES)の使用が含まれる。
第1および第2ポリヌクレオチドを含むDNA構築物またはプラスミドを、当業者には公知である様々な方法によって、細胞内にトランスフェクトすることができる。1つの実施形態では、DNAプラスミドまたは構築物はポリフェクションによって単離された細胞内にトランスフェクトされる。さらなる実施形態では、第2ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはDNA構築物は、トランスフェクトされた全DNAの約1%〜約50%である。あるいは、第2ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはDNA構築物は、トランスフェクトされた全DNAの約1%〜約90%、または、トランスフェクトされた全DNAの約1%〜約80%、もしくは約1%〜約70%、もしくは約1%〜約60%、もしくは約1%〜約50%、もしくは約1%〜約40%、もしくは約1%〜約30%、もしくは約1%〜約10%、もしくは約3%〜約10%である。さらなる実施形態では、第2ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはDNA構築物は、トランスフェクトされた全DNAの約3%、または、トランスフェクトされた全DNAの約5%、もしくは約10%、もしくは約15%、もしくは約20%、もしくは約25%、もしくは約30%、もしくは約35%、もしくは約40%、もしくは約45%、もしくは約50%、もしくは約60%である。
本開示の細胞は、第1ポリヌクレオチドおよび第2ポリヌクレオチドを、遺伝子送達担体を用いて細胞または組織内に導入することによって調製できる。遺伝子送達のための方法は様々な公知の技術を含み、たとえば、ベクター媒介遺伝子導入(たとえば、ウイルス感染/トランスフェクションまたは他の様々なタンパク質系または脂質系遺伝子送達複合体によって)ならびに「裸」のポリヌクレオチドの送達を助長する技術(たとえば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」伝達およびポリヌクレオチドの導入のために使用される他の様々な技術)が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞内に安定にまたは一過性的に保持されてもよい。安定した保持には、一般的に、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製の起点を含むか、または染色体外レプリコン(たとえば、プラスミド)といった宿主細胞のレプリコンまたは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれるかのいずれかを必要とする。当該技術分野で知られる通り、複数のベクターが、遺伝子の哺乳動物細胞への導入を媒介することができると知られている。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはトランスフェクションによって細胞に導入される。トランスフェクション技術は当該技術分野ではよく知られており、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリフェクションといった化学物質ベースのトランスフェクション、ならびに、エレクトロポレーション、光学トランスフェクションおよび遺伝子の電気的導入といった非化学物質ベースのトランスフェクションが含まれ得る。また、リポフェクション技術も含まれる。リポフェクションは通常、正荷電を持つ(カチオン性)脂質を用いて負荷電を持つ(アニオン性)遺伝子材料との凝集体を形成する。この凝集体上の正味正電荷は、負電荷を持つリン脂質二重層を通したトランスフェクションの効果を高めると考えられている。
1つの態様では、第1ポリヌクレオチドの導入は第2ポリヌクレオチドの導入前に実施される。別の態様では、第1ポリヌクレオチドの導入は第2ポリヌクレオチドの導入後に実施される。さらに別の態様では、第1および第2ポリヌクレオチドの双方は細胞と同時にインキュベートされる。特定の態様では、第1および第2ポリヌクレオチドは同じ構築物上に存在し、したがって、その導入は同時に行われる。
さらなる実施形態では、本明細書で説明される単離された細胞は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第1ポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む第2ポリペプチドまたは配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む。ペプチドの非効率な切断は、配列番号1に示される単鎖ポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドにつながる。本明細書で説明される方法および単離された細胞はfXa誘導体の切断における効率性の向上をもたらす。したがって、配列番号3、配列番号3と80%の相同性またはリンカー残基を含む配列番号3を有する2鎖ポリペプチドと、配列番号1に示されるポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドとの割合は、特定の実施形態において、少なくとも約9:1であり得る。あるいは、その割合は少なくとも約7:3、8:2、95:5または99:1であり得る。
本明細書に記載される細胞において、フーリンは、その細胞の内因性発現量よりも高い発現量で生成される。本開示の実施形態は、本明細書で説明される通り、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む単離された細胞に関する。関連する実施形態では、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量は、内因性フーリンの発現量の少なくとも3倍である。さらなる実施形態では、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量は、内因性フーリンの発現量の少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍である。
タンパク質を適切な宿主細胞系から発現および精製することができる。適切な宿主細胞には原核および真核細胞が含まれ、これらは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞およびヒト細胞を含むが、これらに限定されない。細菌細胞の例としては、大腸菌、腸炎菌およびストレプトコッカス・ゴルドニが挙げられる。特定の実施形態では、細胞は酵母細胞または哺乳動物細胞である。細胞は、米国培養細胞系統保存機関(ATCC、米国メリーランド州ロックビル)といった販売業者から購入することが可能であり、または、当該技術分野で公知の方法を用いて分離株から培養することも可能である。適切な真核細胞の例としては、HEK293細胞、ハムスター細胞株BHK−21、CHO細胞;NIH3T3、NS0およびC127といったマウス細胞;COSおよびベロといったサル細胞株;ならびにHeLa、PER.C6(クリューセル(Crucell)社から市販されている)、U−937およびHep G2といったヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、CHO、COS、BHKおよびHEK293から成る群から選択される細胞型である。さらなる実施形態では、細胞型はCHOである。さらなる実施形態では、細胞は、K、MおよびDG44から成る群から選択されるCHO細胞亜型である。昆虫細胞の非制限的な例として、スポドプテラ・フルギペルダが含まれる。発現のために有益な酵母菌の例としては、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、トルロプシス、ヤロウイアまたはピキアが含まれるが、これらに限定されない。たとえば、米国特許第4,812,405号;第4,818,700号;第4,929,555号;第5,736,383号;第5,955,349号;第5,888,768号および第6,258,559号を参照されたい。
III.fXa誘導体調製の方法
r−拮抗剤前駆体タンパク質を発現する細胞株から機能性r−拮抗剤を調製するための以前の方法は、前駆体タンパク質の非効果的な切断のために、機能性r−拮抗剤の収率の低下につながった。r−拮抗剤前駆体(配列番号1)およびフーリンの双方の生体内同時発現は、前駆体から機能性2鎖r−拮抗剤タンパク質(配列番号3)への効果的な切断を可能にする。さらに、r−拮抗剤前駆体タンパク質およびフーリンの双方の生体内同時発現は、細胞からのr−拮抗剤タンパク質の発現および機能の増大を可能にする。特定の実施形態では、r−拮抗剤前駆体の約70%が切断される。他の実施形態では、約75%、80%または85%のr−拮抗剤前駆体が切断される。好ましい実施形態では、約90%以上が切断される。さらに好ましい実施形態では、約95%以上が切断される。さらに別の好ましい実施形態では、約99%以上が切断される。細胞内で発現されるフーリンの量は、単鎖ポリペプチドから2鎖ポリペプチドへの切断を少なくとも約70%可能にする量である。あるいは、フーリンの発現量は、単鎖ポリペプチドの切断を少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%または99%可能にする量である。切断はリンカーに依存するだけでなく、リンカーを囲む配列にも依存する。実施例3(図4)は、全てのfX誘導体がリンカー切断の効果を向上させるわけではないことを示す。
r−拮抗剤前駆体タンパク質を発現する細胞株から機能性r−拮抗剤を調製するための以前の方法は、前駆体タンパク質の非効果的な切断のために、機能性r−拮抗剤の収率の低下につながった。r−拮抗剤前駆体(配列番号1)およびフーリンの双方の生体内同時発現は、前駆体から機能性2鎖r−拮抗剤タンパク質(配列番号3)への効果的な切断を可能にする。さらに、r−拮抗剤前駆体タンパク質およびフーリンの双方の生体内同時発現は、細胞からのr−拮抗剤タンパク質の発現および機能の増大を可能にする。特定の実施形態では、r−拮抗剤前駆体の約70%が切断される。他の実施形態では、約75%、80%または85%のr−拮抗剤前駆体が切断される。好ましい実施形態では、約90%以上が切断される。さらに好ましい実施形態では、約95%以上が切断される。さらに別の好ましい実施形態では、約99%以上が切断される。細胞内で発現されるフーリンの量は、単鎖ポリペプチドから2鎖ポリペプチドへの切断を少なくとも約70%可能にする量である。あるいは、フーリンの発現量は、単鎖ポリペプチドの切断を少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%または99%可能にする量である。切断はリンカーに依存するだけでなく、リンカーを囲む配列にも依存する。実施例3(図4)は、全てのfX誘導体がリンカー切断の効果を向上させるわけではないことを示す。
プロセシングしたfXa誘導体を調製する方法も提供される。1つの態様では、その方法は、fXa誘導体およびフーリンタンパク質を本開示の細胞内に発現させることを伴う。別の態様では、その方法はさらに、発現されたfXa誘導体を細胞内でフーリンタンパク質に切断されることを可能にする。
切断のおかげで、プロセシングされていない単鎖fXaタンパク質は2鎖ポリペプチドになる。このタンパク質はフーリンによって切断され、これは、PACE(対塩基性アミノ酸切断酵素)としても知られている。フーリンは、塩基性アミノ酸標的配列(標準的に、Arg−X−(Arg/Lys)−Arg;配列番号6)のちょうど下流でタンパク質を切断する。
配列番号3のポリペプチドまたは配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドは、fXaの阻害剤に対する拮抗剤として作用する、切断された2鎖fXa誘導体タンパク質を指す。このタンパク質はプロセシングおよび切断され、−RKRRKR−(配列番号5)リンカー配列の除去につながる。リンカー配列は、配列番号1のアミノ酸番号106−111に対応する。特定の実施形態では、切断はリンカー配列が完全に除去されることなく起こり得る。したがって、切断された2鎖ポリペプチドは配列番号3に示されるアミノ酸105の後ろにリンカーアミノ酸を1、2、3、4、5または6つ伴う配列番号3を含み得る。切断の際、2鎖fXa誘導体は2本の鎖間のジスフィルド結合のために結合したままである。
別の実施形態では、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、野生型第Xa因子に比べ、低下した凝血促進作用を有する。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、プロトロンビナーゼ複合体を形成しない。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、野生型第Xa因子に比べ、低下した凝血促進作用を有する。さらなる実施形態では、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、プロトロンビナーゼ複合体を形成しない。
本明細書に開示される方法態様のさらなる実施形態は、細胞から、配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質分画を単離することをさらに含む。関連する実施形態では、単離されたタンパク質分画は、配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む。配列番号3、配列番号3と80%の相同性またはリンカー残基を含む配列番号3を有するポリペプチドは、切断された2鎖ポリペプチドを表し、これは機能性タンパク質である。ペプチドの非効率的な切断は、配列番号1の単鎖ポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドにつながる。本明細書で記載される方法および単離された細胞は、fXa誘導体の切断における効率の向上を提供する。したがって、配列番号3、配列番号3と80%の相同性またはリンカー残基を含む配列番号3を有する2鎖ポリペプチドと、配列番号1に示されるポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドとの割合は、特定の実施形態において、少なくとも約9:1であり得る。あるいは、その割合は少なくとも約7:3、8:2、95:5または99:1であり得る。
本明細書に記載される細胞において、フーリンは、その細胞の内因性発現量よりも高い発現量で生成される。本開示の実施形態は、本明細書で説明される通り、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む単離された細胞に関する。関連する実施形態では、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量は、内因性フーリンの発現量の少なくとも3倍である。さらなる実施形態では、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量は、内因性フーリンの発現量の少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍である。
別の実施形態では、本開示は、本明細書で説明される細胞、構築物または方法で調製された2鎖fXa誘導体の調製物を提供する。
切断されたfXa誘導体は、当業者には公知の方法を用いて、宿主細胞から精製され得る。これらの技術は、ある段階で、細胞環境からポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への粗い分画化を伴う。ポリペプチドを他のタンパク質から分離したら、対象のポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製され得、部分的または完全な精製(または均一性までの精製)が達成される。純粋なペプチドまたはポリペプチドの調製にとりわけ適した分析的方法は、濾過、イオン交換クロマトグラフィー、混合モード樹脂、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーまたは等電点電気泳動である。ペプチド精製のとりわけ効果的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーであるか、またはHPLCでもいい。
一般的に、「精製される」とは、分画化に供せられ、他の異なる構成成分が除去されたタンパク質またはペプチド組成物を指し、前組成物はその発現される生物学的活性を実質的に保持する。「実施的に精製される」という語が使用される場所では、この名称は、タンパク質またはペプチドが、組成物中約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%以上のタンパク質を含むというように、組成物の主要成分を形成する組成物を指す。
タンパク質またはペプチドの精製の度合いを定量化するための様々な方法が、本開示を踏まえて当業者には知られるであろう。これらには、たとえば、活性分画の比活性を決定すること、または、SDS/PAGE分析によって分画内のポリペプチドの量を測定することが含まれる。分画の純度の好ましい測定方法は、分画の比活性を算出すること、それを初期抽出物の比活性と比較すること、および、こうして、本明細書で「−倍精製数値」によって評価される、純度の度合いを算出することである。活性の量を表すのに使用される実際の単位は、もちろん、精製に続いて選ばれた特定のアッセイ技術、および、発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
タンパク質精製での使用に適切な様々な方法が当業者にはよく知られるであろう。これらには、たとえば、硫酸アンモニウム、PEG(ポリエチレングリコール)、抗体などとの沈殿または熱変性による沈殿、続いて遠心分離;イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィー工程;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにそれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術分野では一般的に知られている通り、様々な精製工程を実施する順番は変わってもよい、または、特定の工程は省略してもよく、それでも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製物のために適切な方法につながると考えられている。
実施例1
r−拮抗剤タンパク質を発現する安定した親細胞株の開発
r−拮抗剤生産細胞株は、初めにr−拮抗剤cDNAを含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされて親クローンになった、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)クローンである。親クローンを、異なるベクター中の完全長ヒトフーリンcDNAでさらにトランスフェクトし(「フーリンスーパートランスフェクション」)、r−拮抗剤前駆体の−RKRRKR−(配列番号5)リンカーのプロセシングを向上させた。r−拮抗剤のアミノ酸配列および発現ベクターのDNA配列は記載されている。
r−拮抗剤タンパク質を発現する安定した親細胞株の開発
r−拮抗剤生産細胞株は、初めにr−拮抗剤cDNAを含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされて親クローンになった、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)クローンである。親クローンを、異なるベクター中の完全長ヒトフーリンcDNAでさらにトランスフェクトし(「フーリンスーパートランスフェクション」)、r−拮抗剤前駆体の−RKRRKR−(配列番号5)リンカーのプロセシングを向上させた。r−拮抗剤のアミノ酸配列および発現ベクターのDNA配列は記載されている。
r−拮抗剤タンパク質を生産するために使用した宿主細胞株は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)が欠損したCHO−DUX B11細胞株である。前記細胞株を、カチオン性リポソームトランスフェクション剤(リポフェクタミン2000)を使用して、r−拮抗剤をコードする発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションプールの「サブプール」を、段階的に増やしたメトトレキセート(0、50、250および500nM)と共に培養した;500nMのメトトレキセートに適応させたサブプールを、市販の無血清培地(CDM4CHO、ハイクローン社、ユタ州、ローガンから市販されている)内で懸濁培養に適応させた。最も良好な成長および生成物発現を示したサブプールをサブクローンした。クローンを成長および生産性に関してスクリーニングした。CDM4CHO培地内に、最も良好なサブクローン3つ(13F5−3C11、14G1−3A4、14G1−6A8)から研究細胞バンク(RCBs)を作製し、無菌性およびマイコプラズマの不在を試験した。
13F5−3C11および14G1−6A8細胞株を最初の細胞培養開発およびフーリンスーパートランスフェクションのために選択した。完全長ヒトフーリンcDNAで安定にトランスフェクトしたクローン14G1−6A8を、r−拮抗剤生産のための最終細胞株として最終的に選択した。
実施例2
フーリン含有ベクターとの一過性トランスフェクション
細胞性因子のr−拮抗剤発現およびプロセシングに対する影響を評価するため、ProCHO培地中の14G1クローン(14G1−6A8)を、フーリン、Rbm3(推定RNA結合タンパク質3)、XBP1(Xボックス結合タンパク質1)、ATF6(活性化転写因子6)またはTCTP(翻訳により調節される腫瘍タンパク質)cDNA(相補デオキシリボ核酸)のいずれかを含むベクターと一過性にトランスフェクトした。いくつかの場合で、これらのベクターのうち、2つを同時にトランスフェクトし、それらの併用効果を試験した。r−拮抗剤の発現量および品質を、一過性トランスフェクションに続いて3、5、7および10日目に検査した。興味深いことに、フーリントランスフェクションのみが機能性タンパク質の全パーセンテージを向上させ、おそらく−RKRRKR−(配列番号5)リンカーの強化されたプロセシングまたはプロセシングおよび分泌に対する細胞内の妨げからの解放のためである。図1は最適化された完全長ヒトフーリンcDNAおよび翻訳されたアミノ酸配列を示す。図2はタンパク質発現量および機能活性を示す。図3はウェスタンブロットによって測定されるタンパク質の性質を示し、フーリンのトランスフェクションが完全に単鎖r−拮抗剤前駆体を除去した一方で、他の試験した例は、存在した単鎖r−拮抗剤前駆体の量に一切影響を及ぼさなかったことを示している。
フーリン含有ベクターとの一過性トランスフェクション
細胞性因子のr−拮抗剤発現およびプロセシングに対する影響を評価するため、ProCHO培地中の14G1クローン(14G1−6A8)を、フーリン、Rbm3(推定RNA結合タンパク質3)、XBP1(Xボックス結合タンパク質1)、ATF6(活性化転写因子6)またはTCTP(翻訳により調節される腫瘍タンパク質)cDNA(相補デオキシリボ核酸)のいずれかを含むベクターと一過性にトランスフェクトした。いくつかの場合で、これらのベクターのうち、2つを同時にトランスフェクトし、それらの併用効果を試験した。r−拮抗剤の発現量および品質を、一過性トランスフェクションに続いて3、5、7および10日目に検査した。興味深いことに、フーリントランスフェクションのみが機能性タンパク質の全パーセンテージを向上させ、おそらく−RKRRKR−(配列番号5)リンカーの強化されたプロセシングまたはプロセシングおよび分泌に対する細胞内の妨げからの解放のためである。図1は最適化された完全長ヒトフーリンcDNAおよび翻訳されたアミノ酸配列を示す。図2はタンパク質発現量および機能活性を示す。図3はウェスタンブロットによって測定されるタンパク質の性質を示し、フーリンのトランスフェクションが完全に単鎖r−拮抗剤前駆体を除去した一方で、他の試験した例は、存在した単鎖r−拮抗剤前駆体の量に一切影響を及ぼさなかったことを示している。
驚くことに、以前に開示された(米国特許出願第2010−0255000号)代替fX誘導体des−Gla Xiとフーリンの同時トランスフェクションは、図4で見られる通り、−RKRRKR−(配列番号5)リンカー切断を改善しなかった。これらの結果は、フーリンによる−RKRRKR−(配列番号5)リンカーの切断は−RKRRKR−(配列番号5)リンカーおよび前記リンカーに隣接するアミノ酸配列の2つの因子に依存することを示す。さらに、同じfXa誘導体構築物内で−RKRRKR−(配列番号5)リンカーを−RKR−で置換すると、適切にプロセシングされた2鎖分子が生産されなかったことが、以前から示されている(たとえば、米国特許第5,968,897号を参照)。これらの先行発見をもとに、14G1クローンを、安定した細胞株の作製のために、ピューロマイシン選択中のフーリンベクターとのトランスフェクションに供した。
実施例3
安定にトランスフェクトされたヒトフーリンcDNAを伴うr−拮抗剤生産細胞株
14G1−6A8細胞株を、完全長ヒトフーリンcDNAを含むベクターでトランスフェクトすることで、r−拮抗剤生産細胞株を作製した。ピューロマイシン選択マーカーを含む第2のベクターを、クローン選択のために同時にトランスフェクトした。
安定にトランスフェクトされたヒトフーリンcDNAを伴うr−拮抗剤生産細胞株
14G1−6A8細胞株を、完全長ヒトフーリンcDNAを含むベクターでトランスフェクトすることで、r−拮抗剤生産細胞株を作製した。ピューロマイシン選択マーカーを含む第2のベクターを、クローン選択のために同時にトランスフェクトした。
簡潔にまとめると、r−拮抗剤発現ベクターを含みCDM4CHO培地中で作製した、安定した親細胞株(14G1−6A8)を、最初の細胞培養開発プロセス中にProCHO5培地(Lonzaから市販されている、カタログ番号BE12−766Q)にはじめに適応させた。最適化した完全長ヒトフーリンcDNAを含むベクターのトランスフェクションの前に、クローン14G1−6A8をMTX(メトトレキセート、500nM)と一緒にProCHO5培地中で維持した。
フーリン含有ベクターを、ピューロマイシン選択ベクターと同時にトランスフェクトした。同時トランスフェクションは、ポリマーベースの化学的方法(ポリフェクション)によって、MTXを持たないProCHO5培地内で実施した。化学的トランスフェクションで使用したプラスミドDNAの最適比(w/w)は、10%のフーリンベクタープラスミド:10%のピューロマイシン−ベクタープラスミド:80%の担体DNAであった。
同時にトランスフェクトした細胞を、ピューロマイシン中(15μg/mL)で10日間維持した。選択プロセスの最後には、選択剤の存在下で、良好な成長性能を伴うトランスフェクトされた細胞のプールを得た。各プールの細胞をバックアップとして凍結した。
ピューロマイシンを持たない100μLのProCHO5培地中96ウェルプレート内にプールを限界希釈(1つのウェルあたり細胞1つ)することで、単細胞クローニングを実施した。それぞれのクローンを、r−拮抗剤発現量、機能活性およびウェスタンブロットに基づいて選択した。
続いて、候補クローンを小遠心管培養物内で増殖およびスクリーニングし、ProCHO5中で6日間培養した。タンパク質の発現量および性質に基づいて、異なる培養条件を試験するマトリックス実験のために10クローンのサブセットを選択し、そのうち4つの候補クローン(クローン♯92、♯94、♯126および♯127)を選択し、RCBを作製した。クローン♯92および♯94の成長をマトリックス実験(図5)および1.5Lのバイオリアクター内(図6A、B)でさらに試験した。クローン♯94をr−拮抗剤生産のための最終クローンとして、最終的に選択した。
96ウェルプレート内での候補クローンからの最初の細胞増殖に続き、MTXまたはピューロマイシンを持たないProCHO5培地中でクローン#92、#94、#126および#127の全10継代後、RCBを作製した。MTXまたはピューロマイシンを持たない10%のDMSO+90%のProCHO5培地をRCB(1mL/バイアル、30×106細胞/mL)のための凍結培地として使用した。
論文、特許および特許出願の内容ならびに本明細書で言及および引用された他の全ての文献および電子的に入手可能な情報は、それぞれの各出版物が参照により組み込まれることが明確におよび個々に指示されているようであるのと同じ程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、任意の論文、特許、特許出願または他の物理的および電子的文献からの任意のおよび全ての資料および情報を本出願に物理的に組み込む権利を有している。
本開示は、本明細書において大まかにおよび総称的に説明されている。総称的な開示内に含まれるさらに狭い種および亜属分類も、本開示の部分を形成する。これには、本開示の総称的な説明も含まれ、ただし、切り取られた物質が具体的に本明細書で挙げられているかどうかに関わらず、属から任意の対象物を取り除くという条件または消極的な制限を伴う。
他の実施形態も続く特許請求の範囲に含まれる。さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群で説明される際、当業者は、本開示もマーカッシュ群の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーのいずれかの側面からそれによって説明されていることが分かるであろう。
Claims (53)
- 単離された細胞であり:
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2の非内因性ポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。 - 前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、請求項1に記載の単離された細胞。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項2に記載の単離された細胞。
- 前記哺乳動物細胞がCHO、COS、BHKおよびHEK293から成る群から選択される細胞型である、請求項3に記載の単離された細胞。
- 前記細胞型がCHOである、請求項4に記載の単離された細胞。
- 前記細胞がK、MおよびDG44から成る群から選択されるCHO細胞亜型である、請求項5に記載の単離された細胞。
- 前記細胞が細菌細胞である、請求項2に記載の単離された細胞。
- 前記細菌細胞が大腸菌である、請求項7に記載の単離された細胞。
- 選択マーカーをさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離された細胞。
- 前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、請求項9に記載の単離された細胞。
- 前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、請求項10に記載の単離された細胞。
- 前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、請求項10に記載の単離された細胞。
- 前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、請求項12に記載の単離された細胞。
- 第1または第2ポリヌクレオチドが染色体外のDNA構築物上にある、請求項1に記載の単離された細胞。
- 第1または第2ポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体DNAに組み込まれたDNA構築物上にある、請求項1に記載の単離された細胞。
- 第1および第2ポリヌクレオチドが1つのDNAプラスミド上にある、請求項1に記載の単離された細胞。
- 第1および第2ポリヌクレオチドが異なるDNAプラスミド上にある、請求項1に記載の単離された細胞。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の単離された細胞であり、
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドおよび
配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドまたは配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。 - 前記第2ポリペプチドと第1ポリペプチドの割合が少なくとも約8:2である、請求項18に記載の単離された細胞。
- 前記第2ポリペプチドと第1ポリペプチドの割合が少なくとも約9:1である、請求項18に記載の単離された細胞。
- 請求項1〜20のいずれかに記載の単離された細胞であり、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも3倍である、請求項21に記載の単離された細胞。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の単離された細胞および細胞培養培地を含む組成物。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列または配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドを含む切断された2鎖ポリペプチドを調製するための方法であり、前記方法が単離された細胞内に:
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2の非内因性ポリヌクレオチドを発現させることを含む、方法。 - 前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO、COS、BHKおよびHEK293から成る群から選択される細胞型である、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞型がCHOである、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞がK、MおよびDG44から成る群から選択されるCHO細胞亜型である、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞が細菌細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記細菌細胞が大腸菌である、請求項30に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子を細胞内に発現させることをさらに含む、請求項24〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、請求項32に記載の方法。
- 前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、請求項33に記載の方法。
- 前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、請求項33に記載の方法。
- 前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、請求項35に記載の方法。
- 前記第1または第2のヌクレオチドが染色体外DNA構築物から発現される、請求項24に記載の方法。
- 前記第1または第2のポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体DNAに組み込まれたDNA構築物から発現される、請求項24に記載の方法。
- 第1および第2ポリヌクレオチドが1つのDNAプラスミド上にある、請求項24に記載の方法。
- 第1および第2ポリヌクレオチドが異なるDNAプラスミド上にある、請求項24に記載の方法。
- 前記DNAプラスミドがポリフェクションによって前記単離された細胞内にトランスフェクトされる、請求項39または40に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全DNAの約1%〜約50%である、請求項41に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全DNAの約1%〜約30%である、請求項42に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全DNAの約3%である、請求項43に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全DNAの約10%である、請求項43に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全DNAの約30%である、請求項43に記載の方法。
- 配列番号3と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質分画を前記細胞から単離することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記タンパク質分画が配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項47に記載の方法。
- 配列番号3に示される切断された2鎖ポリペプチドと配列番号1に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約8:2である、請求項48に記載の方法。
- 配列番号3に示される切断された2鎖ポリペプチドと配列番号1に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約9:1である、請求項48に記載の方法。
- 第2ポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも3倍である、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1に記載の単離された細胞または請求項24に記載の方法で調製された2鎖fXa誘導体の調製物。
- ポリヌクレオチド構築物であり、
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド;および
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号2と少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド構築物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261598694P | 2012-02-14 | 2012-02-14 | |
US61/598,694 | 2012-02-14 | ||
PCT/US2013/025985 WO2013123087A1 (en) | 2012-02-14 | 2013-02-13 | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015507929A true JP2015507929A (ja) | 2015-03-16 |
JP2015507929A5 JP2015507929A5 (ja) | 2016-03-17 |
Family
ID=47755035
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014557747A Pending JP2015507929A (ja) | 2012-02-14 | 2013-02-13 | 第Xa因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US20130230901A1 (ja) |
EP (1) | EP2814955A1 (ja) |
JP (1) | JP2015507929A (ja) |
KR (1) | KR20140131957A (ja) |
CN (1) | CN104254603A (ja) |
HK (1) | HK1205188A1 (ja) |
IL (1) | IL234073A0 (ja) |
WO (1) | WO2013123087A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2453910B1 (en) * | 2009-07-15 | 2016-08-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidote for factor xa inhibitors for use in preventing bleeding |
US20140346397A1 (en) | 2012-12-27 | 2014-11-27 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
US9200268B2 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-01 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
FR3064917A1 (fr) * | 2017-04-07 | 2018-10-12 | Universite Grenoble Alpes | Facteur x mute |
JP2021527435A (ja) * | 2018-06-19 | 2021-10-14 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子阻害剤に対する解毒剤 |
JP2022543302A (ja) * | 2019-08-08 | 2022-10-11 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第xa因子及び誘導体を調製するための組成物及び方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09295945A (ja) * | 1996-04-30 | 1997-11-18 | Hoechst Yakuhin Kogyo Kk | 成熟型骨誘導因子の製造方法 |
JP2001506987A (ja) * | 1996-12-13 | 2001-05-29 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法 |
JP2001513632A (ja) * | 1997-02-27 | 2001-09-04 | バクスター・アクチエンゲゼルシャフト | X因子欠失突然変異体およびそのアナログ |
JP2010539945A (ja) * | 2007-09-28 | 2010-12-24 | ポートラ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子阻害剤に対する抗体およびその使用の方法 |
WO2011008885A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
JP2011525363A (ja) * | 2008-06-24 | 2011-09-22 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 延長されたインビボ半減期を有する第viii因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4818700A (en) | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US4812405A (en) | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5583107A (en) | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
JP4236698B2 (ja) * | 1990-11-26 | 2009-03-11 | ジェネティックス インスティチュート,リミテッド ライアビリティ カンパニー | 宿主細胞でのpaceの発現およびその使用法 |
US5955349A (en) | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
US5736383A (en) | 1996-08-26 | 1998-04-07 | Zymogenetics, Inc. | Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants |
US5888809A (en) * | 1997-05-01 | 1999-03-30 | Icos Corporation | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
US6258559B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-07-10 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing proteins in transformed Pichia |
EP1728798A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-06 | ZLB Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
JP5526332B2 (ja) * | 2005-12-21 | 2014-06-18 | シーエヌジェイ ホールディングス,インコーポレイテッド | 組み換え法によって生物活性ビタミンk依存性タンパク質を製造する方法 |
WO2010117729A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
-
2013
- 2013-02-13 US US13/766,652 patent/US20130230901A1/en not_active Abandoned
- 2013-02-13 CN CN201380012568.9A patent/CN104254603A/zh active Pending
- 2013-02-13 EP EP13706859.9A patent/EP2814955A1/en not_active Withdrawn
- 2013-02-13 WO PCT/US2013/025985 patent/WO2013123087A1/en active Application Filing
- 2013-02-13 JP JP2014557747A patent/JP2015507929A/ja active Pending
- 2013-02-13 KR KR1020147025409A patent/KR20140131957A/ko not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-08-11 IL IL234073A patent/IL234073A0/en unknown
-
2015
- 2015-06-16 HK HK15105733.4A patent/HK1205188A1/xx unknown
- 2015-06-22 US US14/745,901 patent/US20150376592A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-12-27 US US15/391,020 patent/US20170240879A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-09-11 US US16/127,864 patent/US20190127720A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-07-28 US US17/387,806 patent/US20220098565A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-03-22 US US18/188,043 patent/US20230383276A1/en active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09295945A (ja) * | 1996-04-30 | 1997-11-18 | Hoechst Yakuhin Kogyo Kk | 成熟型骨誘導因子の製造方法 |
JP2001506987A (ja) * | 1996-12-13 | 2001-05-29 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法 |
JP2001513632A (ja) * | 1997-02-27 | 2001-09-04 | バクスター・アクチエンゲゼルシャフト | X因子欠失突然変異体およびそのアナログ |
JP2010539945A (ja) * | 2007-09-28 | 2010-12-24 | ポートラ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子阻害剤に対する抗体およびその使用の方法 |
JP2011525363A (ja) * | 2008-06-24 | 2011-09-22 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 延長されたインビボ半減期を有する第viii因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体 |
WO2011008885A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GENE THERAPY, 2009, VOL.16, PP.1314-1319, JPN6017000302, ISSN: 0003476824 * |
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2006, 281(13):8773-8779, JPN6017000304, ISSN: 0003476826 * |
PNAS, 2008, 105(21):7416-7421, JPN6017000303, ISSN: 0003476825 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150376592A1 (en) | 2015-12-31 |
US20130230901A1 (en) | 2013-09-05 |
US20230383276A1 (en) | 2023-11-30 |
US20190127720A1 (en) | 2019-05-02 |
IL234073A0 (en) | 2014-09-30 |
US20170240879A1 (en) | 2017-08-24 |
WO2013123087A1 (en) | 2013-08-22 |
EP2814955A1 (en) | 2014-12-24 |
KR20140131957A (ko) | 2014-11-14 |
CN104254603A (zh) | 2014-12-31 |
HK1205188A1 (en) | 2015-12-11 |
US20220098565A1 (en) | 2022-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220098565A1 (en) | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor | |
Ji et al. | Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development by subtractive PCR and cDNA array | |
KR102588469B1 (ko) | 변형된 줄기세포 기억 t 세포, 이의 제조 방법 및 사용 방법 | |
CA3082588A1 (en) | Compositions of engineered exosomes and methods of loading luminal exosome payloads | |
AU2014369175B2 (en) | Novel eukaryotic cells and methods for recombinantly expressing a product of interest | |
KR102288232B1 (ko) | 신규한 진핵 세포 및 관심 생성물의 재조합 발현 방법 | |
US10982191B2 (en) | Engineered mammalian cells for production of recombinant proteins | |
US11390652B2 (en) | Transcriptional regulatory fusion polypeptide | |
JP2023062130A (ja) | 標的タンパク質への検出可能なタグのCRISPR/Cas制御組み込みに基づく細胞の選択方法 | |
CN113661247A (zh) | 细胞穿透转座酶 | |
Kim et al. | Knockout of the lysosomal membrane protein, LAMP2C, improves transient gene expression in HEK293 cells via increased intracellular plasmid availability | |
Hojati et al. | Enhanced expression of bioactive recombinant VEGF-111 with insertion of intronic sequence in mammalian cell lines | |
CN109293763B (zh) | 水貂激活素b蛋白及其制备与应用 | |
CN114514324A (zh) | 稳定哺乳动物细胞的方法 | |
Carrigan et al. | Employing Template-Directed Assembly to Create a Novel Coagulation Assay | |
Mo | PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS OF ARABIDOPSIS HOMOLOGUES OF POLYADENYLATION FACTORS CLP1P AND PCF11P | |
BR112016024534B1 (pt) | Métodos para produzir de forma recombinante um polipeptídeo de interesse, para produzir uma célula de vertebrado isolada, e para selecionar uma célula, bem como uso de uma célula de vertebrado |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160129 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160129 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170113 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180202 |