KR20140131957A - Xa 인자 억제제에 대한 재조합 해독제를 제조하는 방법 - Google Patents

Xa 인자 억제제에 대한 재조합 해독제를 제조하는 방법 Download PDF

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파멜라 비 콘리
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Abstract

fXa 억제제 해독제로서 작용하는 작용성 fXa 유도체의 제조 개선을 위한 방법 및 단리된 세포가 개시된다. 일 양태는 r-해독제 폴리뉴클레오타이드 및 퓨린 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다. 다른 양태는 세포에서 미리 프로세싱된 r-해독제 폴리펩타이드 및 퓨린 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 개열된 2개 사슬 r-해독제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Xa 인자 억제제에 대한 재조합 해독제를 제조하는 방법{PROCESS FOR MAKING RECOMBINANT ANTIDOTE TO FACTOR XA INHIBITOR}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2012년 2월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/598,694호(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)의 이익을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 fXa 유도체의 발현 및 정제에 유용한 세포 및 방법에 관한 것이다.
항응고제는 응고 장애를 갖거나, 일정 기간 이동 불가능하게 강박되거나, 의학 수술을 받은 환자 등과 같은 혈전을 형성하는 경향을 갖는 환자에서 원치 않는 혈전증의 치료 또는 예방에서 시장의 수요를 제공한다. 그러나, 항응고 치료의 주요한 제한 중 하나는 치료와 관련된 출혈 위험 및, 과용량의 경우 또는 긴급한 수술적 시술이 필요한 경우, 항응고 활성을 신속히 역전시키는 능력에 대한 제한이다. 따라서, 항응고 치료의 모든 형태에 대한 특이적이고 효과적인 해독제가 매우 바람직하다. 안정성을 고려하여, 새로운 항응고 약물의 개발에서 항응고제-해독제 쌍을 갖는 것이 또한 유리하다.
이전에 보고된 fXa 단백질의 변형 유도체는 fXa를 표적화하는 항응고제에 대한 해독제로서 유용하다. fXa 단백질의 변형 유도체는 프로트롬비나제(prothrombinase) 복합체로 조립되는 데 있어서 fXa와 경쟁하지 않고, 대신에 항응고제, 예컨대 fXa 억제제에 결합하고/하거나 이를 실질적으로 중화시킨다. 미국 공보 2009/0098119 및 2010/0255000에 기재된 이 변형 단백질 유도체는 적절한 구조 및 기능을 위해 번역후 변형을 요한다. 이러한 번역후 변형은 성숙 fX 유도체 단백질을 형성하기 위해 프리프로펩타이드의 제거 및 fX 유도체 전구체에서 내부 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커 서열의 개열을 포함한다.
숙주 세포 시스템에서의 불완전 또는 비효과적 프로세싱은 작용성 단백질의 단리를 감소시킬 수 있다. 따라서, fXa 억제제 해독제로서 유용한 작용성 fXa 유도체 단백질의 프로세싱의 효율을 개선하는 시스템에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
작용성 r-해독제 단백질의 제조 증가를 위한 방법 및 세포가 본 명세서에 개시된다. 퓨린에 의한 인간 Xa 인자 유도체(즉, 전구체 r-해독제)의 생체내 처리가 작용성 2개 사슬 단백질의 개선된 프로세싱을 허용한다는 것이 이전에 공지되지 않았다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 세포는 생체내 r-해독제 및 퓨린의 동시발현에 의한 작용성 r-해독제의 개선된 제조를 제공한다.
본 개시내용의 양태는,
서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및
서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물 상에 있고, 몇몇 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 조절 구성요소를 가질 수 있는 동일한 폴리뉴클레오타이드 작제물 상에 있다.
관련 양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물이 제공된다.
다른 양태는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 개열된 2-사슬 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및
서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 단리된 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
단리된 세포는 필요한 번역후 변형의 프로세싱 및 개열을 위해 제공되는 임의의 적합한 숙주 세포일 수 있다. 적합한 세포는, 비제한적인 예의 방식으로, 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 박테리아 세포 및 포유류 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 포유류 세포 또는 효모 세포이다. 관련 실시형태에서, 포유류 세포는 CHO, COS, BHK 및 HEK 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포형이다. 추가의 실시형태에서, 세포형은 CHO이다. 다른 추가의 실시형태에서, CHO 세포형은 아형 K, M 또는 DG44를 갖는다.
도 1은 최적화된 인간 퓨린 cDNA 서열 및 번역된 아미노산을 도시한 것이다. 번역된 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 2라 칭한다. 도시된 cDNA 서열은 서열 번호 4를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2b는 14G1에 대한 실시예 2에 기재된 퓨린 형질감염의 효과를 나타낸다(해독제의 발현 수준: 도 2a 및 기능적 활성: 도 2b). 3%, 10%, 30% 및 100%는 전체 형질감염된 DNA에 대한 퓨린 함유 플라스미드의 백분율을 의미한다. 도 2에서의 GFP는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein)을 의미한다. 단일 사슬 및 이중 사슬 해독제 분자 둘 다를 인식하는 항체를 사용하여 효소 결합 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 발현 수준을 측정한다. fXa 억제제 베트릭사반의 존재 하에 fXa 발색 활성 검정에 의해 기능적 활성을 측정한다. 적절히 개열된 r-해독제 분자만이 베트릭사반에 결합하고 fXa에 대한 이의 억제 활성을 중화할 수 있다.
도 3은 해독제의 14G1 발현 및 프로세싱에 대한 실시예 2에 기재된 퓨린 형질감염의 효과(LC(경쇄) 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의한 품질)를 나타낸다. 웨스턴 블롯에 의해 평가된 단백질 품질은 퓨린의 형질감염이 단일 사슬(SC) r-해독제 전구체를 완전히 제거한다는 것을 나타낸다.
도 4는 대안적인 fX 유도체 작제물에 의한 퓨린의 일시 형질감염(웨스턴 블로팅에 의한 품질)을 나타낸다. 실시예 2에 기재된 것처럼, 퓨린에 의한 동시형질감염은 des-Gla fX 유도체의 개열 효율을 개선하지 않는다.
도 5a 내지 도 5b는 실시예 3에 기재된 14G1-퓨린 미니-매트릭스 실험(클론 #92, #94)에서 해독제 단백질의 발현 수준(도 5a) 및 기능적 활성(도 5b)을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 실시예 3에 규명된 클론 #94에 대한 해독제 단백질의 발현 수준(도 6a) 및 기능적 활성(도 6b)을 도시한 것이다. 항-HC(중쇄, 도 6c) 항체 및 항-LC(경쇄, 도 6d) 항체를 사용하는 웨스턴 블롯이 또한 도시되어 있다. 2일 및 4일에 BR(벤치 스케일 반응기) 6 공급 3을 첨가한다. BR6에 대해 시딩 밀도는 10x105개 세포/㎖이다.
도 7은 106 내지 111번 아미노산에서 링커를 갖는 fXa 유도체(전구체 r-해독제라고도 칭함)인 서열 번호 1을 나타낸다.
도 8은 링커가 제거된 fXa 유도체(r-해독제라고도 칭함)인 서열 번호 3을 나타낸다.
I. 정의
본 개시내용의 실행은, 달리 기재되지 않은 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래의 기법을 이용한다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Ausubel et al., eds. (1987) Current Protocols In Molecular Biology; MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Harlow and Lane, eds. (1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual; 및 R.I. Freshney, ed. (1987) Animal Cell Culture]을 참조한다.
모든 숫자 표기, 예를 들면 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 적절한 1.0 또는 0.1의 증분으로 (+) 또는 (-)로 변하는 대략치이다. 항상 명확히 기재되어 있지는 않지만, 모든 숫자 표시에 용어 "약"이 오는 것으로 이해된다. 항상 명확히 기재되어 있지는 않지만, 본 명세서에 기재된 시약은 단지 예시적이고 이의 균등물이 당해 분야에 공지되어 있는 것으로 또한 이해된다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 기재하지는 않지만, 복수의 지시 대상을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 구성성분을 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "로 실질적으로 이루어진"은, 조성물 및 방법을 한정하기 위해 사용될 때, 의도되는 목적에 사용될 때의 조합에 대한 임의의 필수 의미의 다른 구성요소를 배제한다는 것을 의미해야 한다. 따라서, 본 명세서에 한정된 구성요소로 실질적으로 이루어진 조성물은 미량의 오염물질 또는 불활성 담체를 배제하지 않을 것이다. "로 이루어진"은, 미량보다 많은 다른 성분의 구성요소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미해야 한다. 이 각각의 전환어에 의해 한정된 실시형태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
용어 "단백질," "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호 교환되어 사용되고, 이의 광의로 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)의 화합물을 의미한다. 서브유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들면 에스터, 에터 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2종의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한은 없다. 본 명세서에 사용되는 용어 "아미노산"은 글라이신을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 D 및 L 광학 이성체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 교환되어 사용되고, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 다형 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지 또는 비공지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 유전자 또는 유전자 단편(예를 들면, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 이동 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보짐, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머는 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비뉴클레오타이드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 라벨링 성분과의 접합에 의해 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 다를 의미한다. 달리 기재되지 않거나 필요하지 않은 경우, 폴리뉴클레오타이드인 본 개시내용의 임의의 실시형태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측된 2개의 상보성 단일 가닥 형태의 각각 둘 다를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민에 대해 유라실(U)의 4개의 뉴클레오타이드 염기의 특이적 서열로 이루어진다. 따라서, 상기 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳순 표시이다. 이 알파벳순 표시는 중앙 프로세싱 유닛을 갖는 컴퓨터에서 데이터베이스로 입력되고 작용성 유전체학 및 상동성 조사와 같은 생물정보학 분야에 사용될 수 있다.
핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA와 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "단리된" 또는 "재조합"은 거대분자 및 폴리펩타이드의 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리되는 분자를 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 본 명세서에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 의미하도록 사용되고, 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하도록 의도된다. 다른 실시형태에서, 용어 "단리된 또는 재조합"은 구성성분으로부터, 세포내 및 달리 분리된다는 것을 의미하고, 이 세포, 조직, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편은 보통 자연에서 관련된다. 예를 들면, 단리된 세포는 비유사 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 이의 네이티브 또는 천연 환경에서 예를 들면 염색체 상에서 보통 관련되는 3' 및 5' 인접 뉴클레오타이드로부터 분리된다. 당해 분야의 당업자에게 명확한 것처럼, 비천연 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)은 이의 천연 대응물로부터 이를 구별하는 "단리"를 요하지 않는다.
분명한 언급 없이, 달리 의도되지 않는 한, 본 개시내용이 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체에 관한 것일 때, 이들의 등가물 또는 생물학적 등가물은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도되는 것으로 추론된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "이들의 생물학적 등가물"은 기준 단백질, 항체, 폴리펩타이드 또는 핵산을 언급할 때 "이들의 등가물"과 동의어인 것으로 의도되고, 최소 상동성을 가지면서 원하는 구조 또는 기능을 여전히 유지시키는 것을 의도한다. 대안적인 실시형태에서, 용어 폴리뉴클레오타이드의 "생물학적 등가물"은 엄격한 조건 하에 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체에 하이브리드화하는 것을 의미한다. 본 명세서에 구체적으로 언급되지 않은 한, 본 명세서에 언급된 임의의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 이들의 등가물을 또한 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들면, 등가물은 적어도 약 80%의 상동성 또는 동일성 및 대안적으로, 적어도 약 85% 또는 대안적으로 적어도 약 90% 또는 대안적으로 적어도 약 95% 또는 대안적으로 98%의 상동성 또는 동일성 백분율을 의도하고 기준 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 실질적으로 균등한 생물학적 활성을 나타낸다.
"하이브리드화"는 상이한 "엄격도(stringency)"의 조건 하에 수행될 수 있는 하이브리드화 반응을 의미한다. 하이브리드화 반응의 엄격도를 증가시키는 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 공개되어 있다: 예를 들면 하기 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌을 참조한다. 관련 조건의 예는 (엄격도를 증가시키는 순서로): 25℃, 37℃, 50℃ 및 68℃의 항온처리 온도; 10X SSC, 6X SSC, 1X SSC, 0.1X SSC(여기서, SSC는 0.15M NaCl이고, 15mM은 시트르산염 완충제임)의 완충제 농도 및 다른 완충제 시스템을 사용한 이들의 균등물; 0%, 25%, 50% 및 75%의 폼아마이드 농도; 5분 내지 24시간의 항온처리 시간 및 기간 증가, 빈도 증가 또는 완충제 농도 감소의 세척을 포함한다.
다른 서열에 특정한 백분율(예를 들면, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 구역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 구역)은, 정렬될 때, 2개의 서열을 비교 시 염기(또는 아미노산)의 백분율이 동일하다는 것을 의미한다. 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) 증보판 30, 섹션 7.7.18, 표 7.7.1]에 기재된 것과 같은 당해 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램을 이용하여 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 바람직하게는, 정렬에 디폴트 매개변수를 사용한다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 하기 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전 코드 = 표준; 필터 = 무; 가닥(strand) = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 정렬 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비중복(non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이 프로그램의 상세내용은 하기 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
"상동성", "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩타이드 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 상동성을 결정할 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 이 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유된 상동성 위치 또는 일치 수의 함수이다. "비연관" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시내용의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본 명세서에 사용되는 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 이후 번역되는 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래하는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 포함할 수 있다.
"다중감염(polyfection)"은 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI)에 기초한 형질감염 기법을 의미한다.
세포를 DNA 작제물로 형질감염할 때, 관심 있는 유전자를 보유하는 DNA 작제물(즉, 퓨린, 선택 가능한 마커 및 r-해독제 전구체) 이외의 비코딩 운반체 DNA를 형질감염시킬 수 있다. "전체 형질감염된 DNA"는 (일반적으로 ㎍ 단위의) DNA의 전체 양을 의미하고, 플라스미드 DNA(또는 다른 DNA 작제물) 및 운반체 DNA를 포함한다.
용어 "분획"은, 단백질 단리의 문맥에서 사용될 때, 특정한 특성에 기초하여 분리된 재료의 수집을 의미한다. 특정한 특성은, 비제한적인 예의 방식으로, 크기, 질량, 등전점, 전하 등을 포함할 수 있다.
용어 "코딩한다"는, 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때, 폴리펩타이드의 네이티브 상태에서 또는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 제조하도록 폴리펩타이드가 전사되고/되거나 번역될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "코딩한다"고 말해지는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 보체이고 코딩 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "작제물"은 인공 DNA 단편을 의미한다. 이는 예를 들면 플라스미드, 프라이머, 코스미드, 발현 벡터 등을 포함한다.
용어 "비내생"은 세포에 네이티브가 아닌 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. "비내생" 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 통상적으로 유전자 이동 또는 단백질 투여에 의해 세포로 도입된 것이다. 용어 "비내생"이 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때, 폴리뉴클레오타이드는 염색체외 또는 염색체내 (숙주 세포 게놈으로의 DNA의 통합 절편으로서) 위치할 수 있다.
용어 "내생"은 세포에 네이티브인 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(즉, 세포에서 천연 발현되거나 존재하는 것)를 의미한다.
용어 "발현 수준"은 세포에 존재하는 단백질의 양을 의미한다. 발현 수준은 (내생으로 또는 비내생으로 발현된) 다른 단백질과 관련하여 정의될 수 있다. 단백질의 발현 수준을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다.
"Xa 인자" 또는 "fXa" 또는 "fXa 단백질"은 불활성 X 인자(fX)로부터 제조된 혈액 응고 경로에서의 세린 프로테아제를 의미한다. Xa 인자는 내인성 Xase로 공지된 복합체에서 IXa 인자와 함께 이의 보조인자, VIIIa 인자에 의해, 또는 외재성 Xase로 공지된 복합체에서 VIIa 인자와 함께 이의 보조인자, 조직 인자에 의해 활성화된다. fXa는 Va 인자와의 막 결합 프로트롬비나제 복합체를 형성하고, 트롬빈으로의 프로트롬빈의 전환을 촉매화하는 프로트롬비나제 복합체에서의 활성 성분이다. 트롬빈은 피브린으로의 피브리노겐의 전환을 촉매화하는 효소이고, 이로써 결국 혈전을 형성한다.
"des-Gla fXa"는 Gla-도메인을 갖지 않는 fXa를 의미한다. 이 fXa 유도체는 미국 특허 제8,153,590호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 "fXa 유도체"는 프로트롬비나제 복합체로 조립하는 데 있어서 fXa와 경쟁하지 않고, 응고촉진 활성이 감소하거나 이를 갖지 않고, 항응고제, 예컨대 fXa 억제제에 결합하고/하거나 이를 실질적으로 중화시키는 변형 fXa 단백질을 의미한다. 서열 번호 3(도 8) 및 이의 생물학적 등가물과 같은 fXa 유도체의 예는 W02009/042962에 제공되고, 본 명세서에 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "퓨린" 또는 "쌍을 이룬 기본 아미노산 개열 효소"는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_002560(인간), NP_001074923(마우스) 또는 NP_062204(래트)의 임의의 대표적인 퓨린 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 적합한 cDNA 코딩 퓨린은 진뱅크 수탁 번호 NM_002569(인간), NM_001081454(마우스) 또는 NM_019331(래트)에 제공된다. 특정한 양태에서, 퓨린은 인간 퓨린을 의미한다. 대표적인 인간 퓨린 단백질 서열은 서열 번호 2(도 7)에 제공되고, 대표적인 인간 퓨린 cDNA 서열은 서열 번호 4(도 7)에 제공된다.
"r-해독제 전구체"는 fXa에 대한 3개의 돌연변이를 함유하는 서열 번호 1로 표시되는 fXa 유도체를 의미한다. 제1 돌연변이는 FX의 Gla-도메인에서 6-39개의 aa의 결실이다. 제2 돌연변이는 활성화 펩타이드 서열 143-194개의 aa를 -RKR-로 대체한다. 이는 경쇄 및 중쇄를 연결하는 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커를 제조한다. 분비 시, 이 링커는 CHO에서 개열되어 개열된 2-사슬 폴리펩타이드를 생성시킨다. 따라서, 용어 "개열된 2-사슬 폴리펩타이드"는, 2개 사슬을 갖고 적어도 1개의 이황화 결합에 의해 함께 연결된, 서열 번호 3의 폴리펩타이드 또는 서열 번호 3과 80%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. N-말단 사슬은 서열 번호 3의 1-105번 아미노산으로 이루어지고, C-말단 사슬은 서열 번호 3의 106-359번 아미노산으로 이루어진다. 임의로, LC 사슬은 링커의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 추가의 잔기는 링커 폴리펩타이드의 불완전한 제거로부터 생긴다. 제3 돌연변이는 Ala 잔기로의 활성 부위 잔기 S379의 돌연변이이다. 이 아미노산 치환은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 296번 및 290번 아미노산에 상응한다. 용어 "r-해독제"는 링커의 개열 및 프로세싱 후의 폴리펩타이드를 의미한다. 이는 서열 번호 3으로 표시된다.
용어 "CHO"는 중국 햄스터 난소 세포를 의미한다.
"COS"는 큰 T 항원을 제조할 수 있지만 게놈 복제에서 결함을 갖는 SV40 게놈의 버전을 갖는 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey)의 신장 세포로부터 유래한 CV-1 세포주를 불활화함으로써 얻은 세포주를 의미한다. 단어 COS는 CV-1(유인원) 기원(Orgin)이고 SV40 유전 재료를 보유하는 세포로부터 유래한 두문자어이다.
"BHK"는 베이비 햄스터 신장 세포를 의미한다.
"HEK 293"은 조직 배양에서 성장된 인간 배아 신장 세포로부터 원래 유래한 인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney) 293 세포를 의미한다.
용어 "선택 가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 특성을 부여하는 세포로 도입된 유전자를 의미한다. 이는 실험실 미생물학, 분자 생물학 및 형질감염 또는 외래 DNA를 세포로 도입하도록 의도되는 다른 절차의 성공을 나타내는 유전 조작에 이용되는 리포터 유전자의 유형이다. 선택 가능한 마커는, 비제한적인 예의 방식으로, 항생제 내성 유전자, 예를 들면 퓨로마이신, 네오마이신 및 히그로마이신 등에 항생제 내성을 제공하는 유전자 등을 포함할 수 있다. 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(PAC) 유전자는 퓨로마이신에 내성을 부여한다. 네오 유전자는 네오마이신, 카나마이신 및 제네티신에 내성을 제공한다. 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph)는 히그로마이신에 내성을 제공한다. 메토트렉세이트에 내성을 제공하는 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 또는 이의 돌연변이체와 같은 유전자가 또한 포함된다. 용어 "선택 가능한 마커"는 또한 조사자가 원하는 세포와 원치 않는 세포 사이를 구별하도록 하는 마커를 기술하도록 의도된다. 예는 안료 또는 형광과 같은 구별되는 표현형을 갖는 단백질을 제조하는 유전자를 포함한다.
용어 "항생제 내성"은 항생제에 대한 노출에 생존하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 항생제의 농도는 항생제 내성 유전자가 결여된 세포를 제거하는 것으로 공지되고 항생제 내성 유전자를 갖는 세포가 생존하게 하는 농도이다. 통상적으로, 항생제 내성을 갖는 세포는 선택 연속 없이 항생제 내성을 유지시킨다. 그러나, 자연 돌연변이는 내성을 손실시킬 수 있고, 이 경우, 항생제에 대한 추가의 선택 또는 노출은 내성을 손실한 세포를 제거하는 것이 필요할 수 있다.
용어 "DNA 작제물"은 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 및 임의로 다른 작용성 구성요소를 함유하는 DNA를 의미한다. 다른 작용성 구성요소는 예를 들면 복제 기원, 선택 가능한 마커, 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있다.
"염색체외 DNA"는 염색체 외의 세포에 위치하거나 유지되는 DNA를 의미한다.
용어 "통합된"은, DNA 작제물의 맥락에서 사용될 때, 숙주 세포(즉, 단리된 세포) 게놈으로의 DNA 작제물의 삽입을 의미한다.
"플라스미드" 또는 "DNA 플라스미드"는 염색체 DNA를 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우에, 이는 원형 및 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내 수평 유전자 이동의 기전을 제공하고 소정의 환경 상태 하에 선택적 이점을 통상적으로 제공하다. 플라스미드는 경쟁적 환경 적소에서 천연 항생제에 내성을 제공하는 유전자를 보유할 수 있거나, 대안적으로 제조된 단백질은 유사한 환경 하에 독소로서 작용할 수 있다.
용어 "세포 배양 배지"는 세포 배양에 사용되는 배지를 의미한다. 배양 배지는 세포의 성장을 지지하도록 설계되고 세포형에 따라 달라진다. 이는 숙주 세포형에 기초하여 적절한 배지를 선택하는 당업자의 지식 내에 있다. 통상적인 세포 배양 기법 및 배지의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 "유전자 전달", "유전자 이동", "형질도입", "형질감염" 등은, 도입에 이용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포로의 외인성 폴리뉴클레오타이드(때때로 "전이유전자"라 칭함)의 도입을 의미하는 용어이다.
II. 세포 및 작제물
퓨린에 의한 인간 Xa 인자 유도체 (즉, r-해독제 전구체)의 생체내 처리는 작용성 2개 사슬 단백질의 개선된 프로세싱을 허용한다. 따라서, 본 개시내용의 양태는 fXa 유도체의 발현 및 프로세싱을 위한 세포 및 작제물에 관한 것이다.
본 개시내용은 fXa 억제제에 대한 해독제로서 작용하는 개열된 2개 사슬 r-해독제 단백질로의 1개 사슬 r-해독제 전구체의 개선된 또는 증대된 프로세싱을 위한 세포 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 일 실시형태는 fXa 유도체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 퓨린 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 단리된 세포를 제공한다. 일 양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물 상에 있다. 다른 양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 작제물 상에 있다. 따라서, 본 개시내용의 다른 실시형태는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 제공한다.
일 양태에서, fXa 유도체는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 갖는다. 서열 번호 1로 표시되는 fXa 유도체는 fXa에 대한 3개의 돌연변이를 함유한다. 제1 돌연변이는 FX의 Gla-도메인에서 6-39개의 aa의 결실이다. 제2 돌연변이는 활성화 펩타이드 서열 143-194개의 aa를 -RKR-로 대체한다. 이는 경쇄 및 중쇄를 연결하는 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커를 제조한다. 분비 시, 이 링커는 CHO에서 개열되어 2개 사슬 fXa 분자를 생성시킨다. 제3 돌연변이는 Ala 잔기로의 활성 부위 잔기 S379의 돌연변이이다. 이 아미노산 치환은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 296번 및 290번 아미노산에 상응한다. fXa 유도체는 프로트롬비나제 복합체로 조합 시 fXa와 경쟁하지 않고, 대신에 항응고제, 예컨대 fXa 억제제에 결합하고/하거나 이를 실질적으로 중화시킨다. 해독제로서 유용한 유도체는 변형되어, 억제제에 결합하는 능력을 보유하면서 내인성 응고촉진 및 항응고 활성을 감소시키거나 제거한다. 구조적으로, 유도체는 변형되어 응고촉진 활성을 나타내지 않거나 응고촉진 활성이 감소한다. "응고촉진 활성"은 본 명세서에서 혈액 응고 또는 혈전 형성을 발생시키는 물질의 능력을 의미한다. 응고촉진 활성 감소는 응고촉진 활성이 야생형 fXa와 비교하여 적어도 약 50% 또는 약 90% 초과 또는 약 95% 초과 감소한다는 것을 의미한다.
다른 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 Xa 인자와 비교하여 응고촉진 활성이 감소한다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 프로트롬비나제 복합체로 조합되지 않는다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 Xa 인자와 비교하여 응고촉진 활성이 감소한다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 프로트롬비나제 복합체로 조합되지 않는다.
일 실시형태에서, 단리된 세포는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 퓨린 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열(도 1)을 갖는다.
특정한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 세포는 세포에서 발현될 수 있는 선택 가능한 마커를 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 퓨로마이신, 메토트렉세이트, 네오마이신 및 히그로마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 내성을 제공한다. 일 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 메토트렉세이트에 내성을 제공한다. 추가의 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 퓨로마이신에 내성을 제공한다. 다른 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 세포에 항생제 내성을 제공한다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 DNA 작제물 상에 함유되고/되거나 이로부터 발현될 수 있다. DNA 작제물의 예는 플라스미드, 코스미드(cosmid), 발현 벡터, 파지미드, 포스미드(fosmid) 및 인공 염색체, 예컨대 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체 및 인간 인공 염색체를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드는 염색체외 DNA 작제물 상에 있다. 다른 실시형태에서, 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드는 단리된 세포의 염색체 DNA로 통합된 DNA 작제물 상에 있다. 발현 벡터가 이의 게놈으로 통합된 안정한 세포주는 세포 집단에서 더 안정한 단백질 발현을 허용하여, 더 일관된 결과를 발생시킬 수 있다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 1개의 DNA 작제물 또는 별개의 작제물 상에 함유될 수 있다. 이들이 1개의 작제물 상에 함유될 때, 이들은 발현을 위한 별개의 프로모터 또는 동일한 프로모터를 사용할 수 있다. 1개의 프로모터로부터 2종의 단백질을 발현하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 내부 리보솜 진입 서열(internal ribosome entry sequence: IRES)의 사용을 포함한다.
제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 DNA 작제물 또는 플라스미드는 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포로 형질감염될 수 있다. 일 실시형태에서, DNA 플라스미드 또는 작제물은 다중감염에 의해 단리된 세포로 형질감염된다. 추가의 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 DNA 작제물은 전체 형질감염된 DNA 중 약 1% 내지 약 50%이다. 대안적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 DNA 작제물은 전체 형질감염된 DNA 중 약 1% 내지 약 90%, 또는 전체 형질감염된 DNA 중 약 1% 내지 약 80% 또는 약 1% 내지 약 70% 또는 약 1% 내지 약 60% 또는 약 1% 내지 약 50% 또는 약 1% 내지 약 40% 또는 약 1% 내지 약 30% 또는 약 1% 내지 약 10% 또는 약 3% 내지 약 10%이다. 추가의 실시형태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 DNA 작제물은 전체 형질감염된 DNA 중 약 3%, 또는 전체 형질감염된 DNA 중 약 5% 또는 약 10% 또는 약 15% 또는 약 20% 또는 약 25% 또는 약 30% 또는 약 35% 또는 약 40% 또는 약 45% 또는 약 50% 또는 약 60%이다.
유전자 전달 비히클을 사용하여 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 도입함으로써 본 개시내용의 세포를 제조할 수 있다. 유전자 전달 방법은 다양한 널리 공지된 기법, 예컨대 (예를 들면, 바이러스 감염/형질감염 또는 다양한 다른 단백질 기반 또는 지질 기반 유전자 전달 복합체에 의한) 벡터 매개 유전자 이동, 및 "네이키드(naked)" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 수월하게 하는 기법(예컨대 전기천공, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드의 도입에 사용되는 다양한 다른 기법)을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정한 유지는 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포와 상용성인 복제 기원을 함유하거나 숙주 세포의 레플리콘, 예컨대 염색체외 레플리콘(예를 들면, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체로 도입되는 것을 통상적으로 요한다. 다수의 벡터는 당해 분야에 공지된 것처럼 포유류 세포에 대한 유전자의 이동을 중재할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
특정한 실시형태에서, 형질감염에 의해 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입한다. 형질감염 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 화학 기반 형질감염, 예컨대 인산칼슘 형질감염 및 다중감염, 및 비화학 기반 형질감염, 예컨대 전기천공, 광학 형질감염, 및 유전자 전기이동을 포함할 수 있다. 리포펙션(lipofection) 기법이 또한 포함된다. 리포펙션은 일반적으로 양으로 하전된 (양이온) 지질을 사용하여 음으로 하전된 (음이온) 유전 재료와 응집물을 형성한다. 이 응집물에서의 순 양전하는 음으로 하전된 인지질 2층을 통해 형질감염의 유효성을 증가시키는 것으로 추정된다.
일 양태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 전에 제1 폴리뉴클레오타이드의 도입을 수행한다. 다른 양태에서, 제2 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후에 제1 폴리뉴클레오타이드의 도입을 수행한다. 또 다른 양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다 세포와 동시항온처리된다. 특정한 양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 작제물 상에 있고, 따라서 도입은 동시에 수행된다.
추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 세포는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 펩타이드의 비효과적 개열은 서열 번호 1의 단일 사슬 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 생성시킨다. 본 명세서에 기재된 방법 및 단리된 세포는 fXa 유도체의 개열의 효율 개선을 제공한다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 서열 번호 3, 서열 번호 3과 80%의 상동성 또는 링커 잔기를 함유하는 서열 번호 3을 갖는 2-사슬 폴리펩타이드 대 서열 번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 9:1일 수 있다. 대안적으로, 이 비는 적어도 약 7:3, 8:2, 95:5 또는 99:1일 수 있다.
본 명세서에 기재된 세포에서, 퓨린은 세포의 내생 발현 수준보다 높은 발현 수준에서 제조된다. 본 개시내용의 실시형태는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 본 명세서에 기재된 단리된 세포에 관한 것이다. 관련 실시형태에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 3배이다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배 또는 적어도 10배이다.
단백질은 적합한 숙주 세포 시스템으로부터 발현되고 정제될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 쥣과 세포, 래트 세포, 양 세포, 유인원 세포 및 인간 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 박테리아 세포의 예는 에스체리치아 콜라이(이. 콜라이)(Escerichia coli), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii)를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 세포는 효모 세포 또는 포유류 세포이다. 세포는 상업용 공급업체, 예컨대 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC, 미국 메릴랜드 록빌 소재)로부터 구입할 수 있거나, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 단리물로부터 배양될 수 있다. 적합한 진핵 세포의 예는 HEK 293 세포, 햄스터 세포주 BHK-21, CHO 세포; 쥣과 세포주, 예컨대 NIH3T3, NSO 및 C127; 유인원 세포주, 예컨대 COS 및 Vero; 및 인간 세포주, 예컨대 HeLa, PER.C6(크루셀(Crucell)로부터 상업적으로 구입 가능), U-937 및 Hep G2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 실시형태에서, 포유류 세포는 CHO, COS, BHK 및 HEK 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포형이다. 추가의 실시형태에서, 세포형은 CHO이다. 다른 추가의 실시형태에서, 세포는 K, M 및 DG44로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포 아형이다. 곤충 세포의 비제한적인 예는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)를 포함한다. 발현에 유용한 효모의 예는 사카로마이세스(Saccharomyces), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 야로위아(Yarrowia) 또는 피치아(Pichia)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 미국 특허 제4,812,405호; 제4,818,700호; 제4,929,555호; 제5,736,383호; 제5,955,349호; 제5,888,768호 및 제6,258,559호를 참조한다.
III. fXa 유도체의 제조 방법
r-해독제 전구체 단백질을 발현하는 세포주로부터 작용성 r-해독제를 제조하는 이전 방법은 전구체 단백질의 비효과적 개열로 인해 작용성 r-해독제의 수율을 감소시킨다. r-해독제 전구체(서열 번호 1) 및 퓨린 둘 다의 생체내 동시발현은 작용성 2개 사슬 r-해독제 단백질(서열 번호 3)로 전구체를 효과적으로 개열한다. 더욱이, r-해독제 전구체 단백질 및 퓨린 둘 다의 생체내 동시발현은 세포로부터 r-해독제 단백질의 기능을 증가시키고 발현을 증가시킨다. 특정한 실시형태에서, r-해독제 전구체 중 약 70%는 개열된다. 다른 실시형태에서, r-해독제 전구체 중 약 75%, 80% 또는 85%는 개열된다. 바람직한 실시형태에서, 약 90% 이상은 개열된다. 더 바람직한 실시형태에서, 약 95% 이상은 개열된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 약 99% 이상은 개열된다. 세포에서 발현된 퓨린의 양은 2-사슬 폴리펩타이드로의 단일 사슬 폴리펩타이드의 적어도 약 70%의 개열을 허용하는 양이다. 대안적으로, 퓨린의 발현 수준은 단일 사슬 폴리펩타이드의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 개열을 허용하는 것이다. 개열은 링커뿐만 아니라 링커를 둘러싸는 서열에 따라 달라진다. 실시예 3(도 4)은 모든 fX 유도체가 링커 개열의 효율을 개선하는 것은 아니라는 것을 나타낸다.
fXa 유도체를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 일 양태에서, 상기 방법은 본 개시내용의 세포에서 fXa 유도체 및 퓨린 단백질을 발현시키는 것을 수반한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 추가로 발현된 fXa 유도체가 세포에서 퓨린 단백질에 의해 개열되도록 한다.
개열로 인해, 프로세싱되지 않은 단일 사슬 fXa 단백질은 2-사슬 폴리펩타이드가 된다. 이 단백질은 퓨린에 의해 개열되고, 이는 또한 PACE(쌍을 이룬 기본 아미노산 개열 효소)로 공지되어 있다. 퓨린은 기본 아미노산 표적 서열(전형적으로, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg; 서열 번호 6)의 바로 하류에서 단백질을 개열한다.
서열 번호 3의 폴리펩타이드 또는 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 fXa의 억제제에 대한 해독제로서 작용하는 개열된 2개 사슬 fXa 유도체 단백질이라 칭한다. 이 단백질은 프로세싱되고 개열되어, -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커 서열을 제거한다. 링커 서열은 서열 번호 1의 106-111번 아미노산에 해당한다. 특정한 실시형태에서, 개열은 링커 서열의 완전한 제거 없이 발생할 수 있다. 따라서, 개열된 2-사슬 폴리펩타이드는 서열 번호 3의 105번 아미노산 후 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 링커 아미노산을 갖는 서열 번호 3을 포함할 수 있다. 개열 시, 2개 사슬 fXa 유도체는 2개 사슬 사이의 이황화 결합으로 인해 연결된 채 있는다.
다른 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 Xa 인자와 비교하여 응고촉진 활성이 감소한다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 프로트롬비나제 복합체로 조립되지 않는다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 Xa 인자와 비교하여 응고촉진 활성이 감소한다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 3과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 프로트롬비나제 복합체로 조립되지 않는다.
본 명세서에 개시된 방법 양태의 추가의 실시형태는 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 분획을 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 단리된 단백질 분획은 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 서열 번호 3, 서열 번호 3과 80%의 상동성 또는 링커 잔기를 함유하는 서열 번호 3을 갖는 폴리펩타이드는 작용성 단백질인 개열된 2-사슬 폴리펩타이드를 나타낸다. 펩타이드의 비효과적 개열은 서열 번호 1의 단일 사슬 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 생성시킨다. 본 명세서에 기재된 방법 및 단리된 세포는 fXa 유도체의 개열의 효율 개선을 제공한다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 서열 번호 3, 서열 번호 3과 80%의 상동성 또는 링커 잔기를 함유하는 서열 번호 3을 갖는 2-사슬 폴리펩타이드 대 서열 번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 9:1일 수 있다. 대안적으로, 이 비는 적어도 약 7:3, 8:2, 95:5 또는 99:1일 수 있다.
본 명세서에 기재된 세포에서, 퓨린은 세포의 내생 발현 수준보다 높은 발현 수준으로 제조된다. 본 개시내용의 실시형태는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 본 명세서에 기재된 단리된 세포에 관한 것이다. 관련 실시형태에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 3배이다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배 또는 적어도 10배이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 세포, 작제물 또는 방법에 의해 제조된 2개 사슬 fXa 유도체의 제조를 제공한다.
개열된 fXa 유도체는 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 이 기법은, 일 수준에서, 폴리펩타이드 및 비폴리펩타이드 분획으로의 세포 환경의 대략적인 분별화를 수반한다. 다른 단백질로부터 폴리펩타이드를 분리하면, 관심 있는 폴리펩타이드는 크로마토그래피 및 전기영동 기법을 이용하여 추가로 정제되어 부분 또는 완전 정제(또는 동질성으로의 정제)를 성취할 수 있다. 순수한 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식 수지, 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동이다. 특히 효과적인 펩타이드 정제 방법은 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 또는 심지어 HPLC이다.
일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하도록 분별화 처리되고 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 단백질 또는 펩타이드 조성물을 의미한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용될 때, 이 지칭은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예컨대 조성물 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 의미한다.
단백질 또는 펩타이드의 정제의 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시내용의 견지에서 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이는 예를 들면 활성 분획의 비활성(specific activity)을 결정하는 것 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 비활성을 계산하는 것, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하는 것 및 따라서 본 명세서에서 "배수 정제 수"에 의해 평가되는 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내도록 사용되는 실제 단위는 물론 정제 후에 선택되는 특정한 검정 기법 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출 가능한 활성을 나타내는지에 따라 달라진다.
단백질 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이는 예를 들면 황산암모늄, PEG(폴리에틸렌 글라이콜), 항체 등에 의한 침전 또는 열 변성 이후의 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화도 크로마토그래피; 등전점 전기영동; 겔 전기영동; 및 이러한 기법과 다른 기법의 조합을 포함한다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바대로, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변할 수 있거나, 특정한 단계가 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조에 적합한 방법을 여전히 생성시킨다고 생각된다.
실시예 1
r-해독제 단백질을 발현하는 안정한 부모 세포주의 개발
r-해독제 생성 세포주는 r-해독제 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 처음에 안정하게 형질감염되어 부모 클론을 생성시키는 중국 햄스터 난소(CHO) 클론이다. 부모 클론은 별개의 벡터("퓨린 슈퍼형질감염")에서 전장 인간 퓨린 cDNA로 추가로 형질감염되어 r-해독제 전구체에서 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커의 프로세싱을 개선한다. r-해독제의 아미노산 서열 및 발현 벡터의 DNA 서열이 기재되어 있다.
r-해독제 단백질을 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포주는 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 결핍 CHO-DUX B11 세포주이다. 양이온 리포솜 형질감염 물질(리포펙타민(Lipofectamine) 2000)을 사용하여 r-해독제 코딩 발현 벡터로 이를 형질감염시킨다. 형질감염 풀의 "하위풀"을 메토트렉세이트(0, 50, 250 및 500nM)의 단계별 증가로 배양하고; 500nM 메토트렉세이트에 조정된 하위풀은 상업용 혈청 비함유 배지(CDM4CHO, 미국 유타주 로간에 소재하는 하이클론(Hyclone)으로부터 구입 가능)에서 현탁 배양에 조정된다. 최고의 성장 및 생성물 발현을 나타내는 하위풀을 서브클로닝한다. 성장 및 생산성에 대해 클론을 스크리닝한다. 조사 세포 뱅크(research cell bank: RCB)를 최고의 3개의 하위클론(13F5-3C11, 14G1-3A4, 14G1-6A8)으로부터 CDM4CHO 배지에서 만들고 마이코플라즈마의 부재 및 무균성을 시험한다.
초기 세포 배양 개발 및 퓨린 슈퍼형질감염에 13F5-3C11 및 14G1-6A8 세포주를 선택한다. 전장 인간 퓨린 cDNA로 안정하게 형질감염된 클론 14G1-6A8은 결국 r-해독제 제조를 위한 최종 세포주로서 선택된다.
실시예 2
퓨린-함유 벡터에 의한 일시적 형질감염
r-해독제 발현 및 프로세싱에 대한 세포 인자의 효과를 평가하기 위해, ProCHO 배지에서의 14G1 클론(14G1-6A8)을 퓨린, Rbm3(추정상 RNA-결합 단백질 3), XBP1(X-박스 결합 단백질 1), ATF6(활성화 전사 인자 6) 또는 TCTP(번역상 제어되는 종양 단백질) cDNA(상보성 데옥시리보핵산)를 함유하는 벡터로 일시적으로 형질감염시킨다. 몇몇 경우에, 이의 조합 효과를 시험하기 위해 이 벡터 중 2개를 동시형질감염시킨다. 3일, 5일, 7일 및 10일에 일시적 형질감염 후 r-해독제 발현 수준 및 품질을 시험한다. 흥미롭게도, 오직 퓨린에 의한 형질감염이, 가능하게는 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커의 프로세싱 증대, 또는 프로세싱 및 분비에 대한 세포내 병목의 완화로 인해, 작용성 단백질의 전체 백분율을 개선한다. 도 1은 최적화된 전장 인간 퓨린 cDNA 및 번역된 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2는 단백질 발현 수준 및 기능적 활성을 나타낸다. 도 3은 웨스턴 블롯에 의해 평가된 단백질 품질을 나타내고, 이는 퓨린의 형질감염이 단일 사슬 r-해독제 전구체를 완전히 제거하고, 시험된 다른 실시예는 존재하는 단일 사슬 r-해독제 전구체의 양에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
놀랍게도, 이전에 개시된 대안적인 fX 유도체 des-Gla Xi에 의한 퓨린의 동시형질감염(미국 특허 출원 제2010-0255000호)은 도 4에 도시된 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커 개열을 개선하지 않는다. 이 결과는 퓨린에 의한 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커의 개열이 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커 및 링커를 플랭킹하는 아미노산 서열의 2개의 인자에 따라 달라진다는 것을 나타낸다. 더욱이, 동일한 fXa 유도체 작제물에서 -RKRRKR-(서열 번호 5) 링커를 -RKR-로 대체하는 것이 적절히 프로세싱된 2개 사슬 분자를 제조하지 않는다(예를 들면, 미국 특허 제5,968,897호 참조)는 것이 이전에 밝혀졌다. 이 사전 발견에 기초하여, 14G1 클론은 안정한 세포주의 생성을 위해 퓨로마이신 선택 하에 퓨린-벡터에 의한 형질감염으로 추가로 처리된다.
실시예 3
안정하게 형질감염된 인간 퓨린 cDNA 를 갖는 r-해독제 생성 세포주
14G1-6A8 세포주를 전장 인간 퓨린 cDNA를 함유하는 벡터로 형질감염함으로써 r-해독제 생성 세포주를 생성한다. 클론 선택을 위해 퓨로마이신 선택 마커를 함유하는 제2 벡터를 동시형질감염시킨다.
간단히 말하면, r-해독제 발현 벡터를 함유하고 CDM4CHO 배지에서 생성된 안정한 부모 세포주(14G1-6A8)를 처음에 초기 세포 배양 개발 과정 동안 ProCH05 배지(론자(Lonza)로부터 상업적으로 구입 가능, 카탈로그 BE12-766Q호)에 조정한다. 클론 14G1-6A8을 MTX(메토트렉세이트, 500nM)를 갖는 ProCH05 배지에서 유지시킨 후 최적화된 전장 인간 퓨린 cDNA를 함유하는 벡터를 형질감염시킨다.
퓨린-함유 벡터를 퓨로마이신 선택 벡터로 동시형질감염시킨다. 중합체에 기초한 화학 방법(다중감염)에 의해 MTX가 없는 ProCH05 배지 중에 동시형질감염을 수행한다. 화학 형질감염에 사용된 플라스미드 DNA의 최적 비율(w/w)은 10%의 퓨린-벡터 플라스미드: 10%의 퓨리마이신-벡터 플라스미드: 80%의 운반체 DNA이다.
동시형질감염 세포를 10일 동안 퓨로마이신(15㎍/㎖) 중에 유지시킨다. 선택 과정 종료 시, 선택적 물질의 존재 하에 우수한 성장 성능을 갖는 형질감염 세포의 풀을 얻는다. 각각의 풀로부터의 세포를 백업용으로 동결시킨다.
퓨로마이신이 없는 100㎕의 ProCH05 배지 중에 96웰 플레이트로 풀의 희석(1개 세포/웰)을 제한함으로써 단일-세포 클로닝을 수행한다. r-해독제 발현 수준, 기능적 활성 및 웨스턴 블롯에 기초하여 개별 클론을 선택한다.
이후, 후보물질 클론을 증식시키고 소형 스핀-튜브 배양물에서 스크리닝하고 ProCH05 중에 6일 동안 배양한다. 단백질 발현 수준 및 품질에 기초하여, 10개 클론의 서브세트를 매트릭스 연구에 선택하여 4개의 후보물질 클론(클론 #92, #94, #126 및 #127)이 선택되고 RCB이 생성되는 상이한 배양 조건을 시험한다. 클론 #92 및 #94의 성장을 매트릭스 실험(도 5) 및 1.5ℓ의 생물반응기(도 6a 및 도 6b)에서 추가로 시험한다. 클론 #94는 결국 r-해독제 제조를 위한 최종 클론으로서 선택된다.
96웰 플레이트에서 후보물질 클론으로부터 초기 세포 증식 후 MTX 또는 퓨로마이신이 없는 ProCH05 배지에서 클론 #92, #94, #126 및 #127에 대한 전체 10회 계대 배양 후 RCB을 생성한다. RCB(l㎖/바이알, 30x106개 세포/㎖)에 대한 냉동 배지로서 MTX 또는 퓨로마이신이 없는 10%의 DMSO+90%의 ProCH05 배지를 사용한다.
논문, 특허 및 특허 출원의 내용 및 본 명세서에 언급되거나 인용된 모든 다른 문헌 및 전기적으로 이용 가능한 정보는, 각각의 개별 공보가 참조문헌으로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 출원인은 임의의 이러한 논문, 특허, 특허 출원 또는 다른 물리적 및 전자적 문서로부터의 임의의 및 모든 자료 및 정보를 본원에 물리적으로 통합할 권한을 유보한다.
본 개시내용은 본 명세서에 광범위하게 및 일반적으로 기재되어 있다. 일반적 개시내용 내에 해당하는 더 좁은 종 및 아속 그룹화는 각각 또한 본 개시내용의 일부를 형성한다. 이는 발췌된 자료가 본 명세서에 구체적으로 인용되었는지와 무관하게 속으로부터 임의의 발명대상을 제거하는 단서 또는 소극적 제한을 갖는 본 개시내용의 일반적 설명을 포함한다.
다른 실시형태는 하기 특허청구범위 내에 있다. 또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹의 측면에서 기재된 경우, 당해 분야의 당업자는 본 개시내용이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 부재 또는 부재들의 하위그룹의 측면에서 본 명세서에 또한 기재된다는 것을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> PORTOLA PHARMACEUTICALS, INC. <120> PROCESS FOR MAKING RECOMBINANT ANTIDOTE TO FACTOR XA INHIBITOR <130> 070545-4010 <140> PCT/US2013/025985 <141> 2013-02-13 <150> 61/598,694 <151> 2012-02-14 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys 1 5 10 15 Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly 20 25 30 Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln 50 55 60 Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr 85 90 95 Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ile 100 105 110 Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu 115 120 125 Leu 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Leu Val Leu Tyr Gly Thr 565 570 575 Ala Pro Glu Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr 580 585 590 Leu Thr Ser Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu 595 600 605 His Gln Lys Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln 610 615 620 Val Leu Asp Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg 625 630 635 640 Ala Ser Val Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly 645 650 655 Pro Ala Leu Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp 660 665 670 Pro Val Glu Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser 675 680 685 Pro Pro Gln Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly 690 695 700 Gln Arg Leu Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val 705 710 715 720 Ala Gly Leu Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe 725 730 735 Leu Val Leu Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val 740 745 750 Tyr Thr Met Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu 755 760 765 Ala Trp Gln Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg 770 775 780 Gly Glu Arg Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala Leu 785 790 795 <210> 3 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys 1 5 10 15 Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly 20 25 30 Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln 50 55 60 Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr 85 90 95 Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys 100 105 110 Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn 115 120 125 Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr 130 135 140 Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly 145 150 155 160 Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val 165 170 175 Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe 180 185 190 Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn 195 200 205 Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu 210 215 220 Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu 225 230 235 240 Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val 245 250 255 Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn 260 265 270 Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly 275 280 285 Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val 290 295 300 Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr 305 310 315 320 Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser 325 330 335 Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val 340 345 350 Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 355 <210> 4 <211> 2401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(2391) <400> 4 gcg gcc gcc atg gaa ttg cgt cct tgg ctt ttg tgg gtt gtt gca gct 48 Ala Ala Ala Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala 1 5 10 15 aca ggt act ctt gtt ctg ctg gct gct gac gcc cag gga cag aag gtc 96 Thr Gly Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val 20 25 30 ttt act aac aca tgg gca gtc cgg att ccc ggt gga ccc gct gta gca 144 Phe Thr Asn Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala 35 40 45 aac tcc gtg gct agg aaa cac ggg ttt ctc aac ctg ggc cag att ttc 192 Asn Ser Val Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe 50 55 60 ggt gac tac tac cac ttt tgg cat aga ggg gtg acc aag cgg tcc ctc 240 Gly Asp Tyr Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu 65 70 75 80 tct ccc cat aga ccc aga cac agc cga ctg cag cgg gaa ccc cag gtc 288 Ser Pro His Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val 85 90 95 cag tgg ttg gaa cag cag gtg gcc aag agg aga acc aag cgg gac gtg 336 Gln Trp Leu Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val 100 105 110 tat cag gag cct acc gat ccc aaa ttt cca cag cag tgg tat ctc tct 384 Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser 115 120 125 ggg gtg act caa cgt gat ctg aac gtg aag gcc gct tgg gct cag ggc 432 Gly Val Thr Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly 130 135 140 tac acc ggt cat gga atc gtg gtg agc ata ttg gac gac gga ata gaa 480 Tyr Thr Gly His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu 145 150 155 160 aag aat cac ccc gac ttg gct gga aac tac gat cca ggc gca tcc ttt 528 Lys Asn His Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe 165 170 175 gat gtc aat gat caa gat cca gac cca cag cct cgg tac acc cag atg 576 Asp Val Asn Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met 180 185 190 aac gac aac cgt cat gga acc agg tgt gcc ggc gaa gtg gca gcc gtc 624 Asn Asp Asn Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val 195 200 205 gcc aat aac ggt gtt tgc gga gtg ggc gtt gcc tac aac gcc cga atc 672 Ala Asn Asn Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile 210 215 220 gga ggt gtg agg atg ctg gat ggt gaa gtg acc gat gcc gtc gaa gct 720 Gly Gly Val Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala 225 230 235 240 cgg tcc ttg gga ctg aac ccc aat cat ata cac ata tat tca gcc agt 768 Arg Ser Leu Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser 245 250 255 tgg ggt cct gag gat gac ggc aag aca gtg gat gga cct gca cga ctc 816 Trp Gly Pro Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu 260 265 270 gcc gag gag gct ttc ttc cgc ggc gtc tct caa ggt cgc gga ggg ctg 864 Ala Glu Glu Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu 275 280 285 ggc agc ata ttt gtc tgg gcc agt ggc aac ggt ggc cgt gaa cat gac 912 Gly Ser Ile Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp 290 295 300 tca tgt aac tgt gat ggc tat aca aat agc atc tat acc ctg agc atc 960 Ser Cys Asn Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile 305 310 315 320 agt tcc gca act caa ttt ggt aac gtg ccc tgg tac tca gag gcc tgc 1008 Ser Ser Ala Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys 325 330 335 tca agc acc ctc gct act acc tat tca tct gga aat cag aac gag aag 1056 Ser Ser Thr Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys 340 345 350 cag atc gtc aca acc gac ctg aga cag aag tgt acc gaa tct cat aca 1104 Gln Ile Val Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr 355 360 365 ggc acc tct gcc tct gcc cct ctg gct gcc ggc atc atc gct ctg act 1152 Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Leu Thr 370 375 380 ctt gaa gct aac aag aat ctt aca tgg cgg gat atg caa cac ctg gta 1200 Leu Glu Ala Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val 385 390 395 400 gta cag act agt aaa cca gcc cat ctt aac gca aac gac tgg gca aca 1248 Val Gln Thr Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr 405 410 415 aac ggg gtc gga cgt aaa gta tct cat tct tac gga tac gga ctg ctg 1296 Asn Gly Val Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu 420 425 430 gat gca gga gcc atg gtg gcc ctc gcc caa aac tgg acc act gtc gct 1344 Asp Ala Gly Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala 435 440 445 ccc caa agg aag tgc ata att gat atc ctc act gaa cca aaa gac ata 1392 Pro Gln Arg Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile 450 455 460 ggc aag cgg ttg gag gtc aga aag acc gtg acc gcc tgc ctg ggg gag 1440 Gly Lys Arg Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu 465 470 475 480 ccc aat cac atc aca cga ctc gag cac gca caa gcc cga ctg act ctg 1488 Pro Asn His Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu 485 490 495 agt tat aat cga cgg ggc gat ctg gct atc cat ctc gtc agc ccc atg 1536 Ser Tyr Asn Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met 500 505 510 gga acc aga tcc aca ttg ttg gct gct agg ccc cac gac tac agt gct 1584 Gly Thr Arg Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala 515 520 525 gat ggg ttt aac gat tgg gct ttt atg act act cac tcc tgg gat gag 1632 Asp Gly Phe Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu 530 535 540 gac cca agc gga gag tgg gtg ctg gag att gaa aat act tca gaa gcc 1680 Asp Pro Ser Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala 545 550 555 560 aat aat tac ggc act ctg acc aaa ttt acc ctg gtg ttg tac ggg aca 1728 Asn Asn Tyr Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr 565 570 575 gca ccc gag ggt ctg cca gtg cct cca gag tca tcc ggt tgc aag act 1776 Ala Pro Glu Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr 580 585 590 ctc acc agc tcc cag gcc tgc gta gtg tgc gag gaa ggc ttc tcc ttg 1824 Leu Thr Ser Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu 595 600 605 cat cag aag tct tgt gtc cag cat tgc cca ccc ggg ttt gca cct caa 1872 His Gln Lys Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln 610 615 620 gtg ctt gat acc cac tac agt aca gag aat gat gtt gaa aca att cgg 1920 Val Leu Asp Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg 625 630 635 640 gca tcc gtg tgt gcc cct tgt cat gca tcc tgc gcc act tgc cag ggc 1968 Ala Ser Val Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly 645 650 655 cca gca ttg acc gat tgt ctc agc tgc cca tca cac gcc agc ctg gac 2016 Pro Ala Leu Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp 660 665 670 cca gtt gaa cag acc tgt agc cgc cag tcc caa tcc tca cga gaa agc 2064 Pro Val Glu Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser 675 680 685 cca ccc cag cag cag cca cca aga ctg ccc cca gaa gtg gag gcc ggc 2112 Pro Pro Gln Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly 690 695 700 cag cgc ctc agg gca ggc ttg ctg cct tca cac ctg cca gaa gta gtg 2160 Gln Arg Leu Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val 705 710 715 720 gct ggt ttg agc tgt gct ttc atc gtt ctt gta ttt gtc act gtt ttt 2208 Ala Gly Leu Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe 725 730 735 ctg gtt ctg cag ctg cgg agc gga ttt tct ttc cgg ggc gtg aag gtg 2256 Leu Val Leu Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val 740 745 750 tac act atg gac cgt ggg ctc atc tcc tac aaa ggt ctg cca ccc gaa 2304 Tyr Thr Met Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu 755 760 765 gcc tgg cag gaa gag tgc ccc agc gat tcc gaa gag gat gaa ggg cgt 2352 Ala Trp Gln Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg 770 775 780 ggg gaa agg act gcc ttc att aag gat caa tct gct ctc tgataagctt 2401 Gly Glu Arg Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala Leu 785 790 795 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Lys" <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> /note="Variant residue given in the sequence has no preference with respect the residue in the annotation for the variant position" <400> 6 Arg Xaa Arg Arg 1

Claims (53)

  1. 단리된 세포로서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및
    서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 비내생 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것인 단리된 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO, COS, BHK 및 HEK 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포형인 것인 단리된 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포형은 CHO인 것인 단리된 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 K, M 및 DG44로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포 아형인 것인 단리된 세포.
  7. 제2항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인 것인 단리된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli)인 것인 단리된 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 가능한 마커를 추가로 포함하는 단리된 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 퓨로마이신, 메토트렉세이트, 네오마이신 및 히그로마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 내성을 제공하는 것인 단리된 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 메토트렉세이트에 내성을 제공하는 것인 단리된 세포.
  12. 제10항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 퓨로마이신에 내성을 제공하는 것인 단리된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 상기 세포에 항생제 내성을 제공하는 것인 단리된 세포.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드는 염색체외 DNA 작제물 상에 있는 것인 단리된 세포.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드는 상기 단리된 세포의 염색체 DNA로 통합된 DNA 작제물 상에 있는 것인 단리된 세포.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 1개의 DNA 플라스미드 상에 있는 것인 단리된 세포.
  17. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 상이한 DNA 플라스미드 상에 있는 것인 단리된 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및
    서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 단리된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 대 상기 제1 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 8:2인 것인 단리된 세포.
  20. 제18항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 대 상기 제1 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 9:1인 것인 단리된 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 단리된 세포.
  22. 제21항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 3배인 것인 단리된 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 단리된 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
  24. 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 개열된 2-사슬 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및
    서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 비내생 폴리뉴클레오타이드를 단리된 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO, COS, BHK 및 HEK 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포형인 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 세포형은 CHO인 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 세포는 K, M 및 DG44로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포 아형인 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 이. 콜라이인 것인 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서 선택 가능한 마커 유전자를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 퓨로마이신, 메토트렉세이트, 네오마이신 및 히그로마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 내성을 제공하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 메토트렉세이트에 내성을 제공하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 퓨로마이신에 내성을 제공하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 상기 세포에 항생제 내성을 제공하는 것인 방법.
  37. 제24항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 뉴클레오타이드는 염색체외 DNA 작제물로부터 발현되는 것인 방법.
  38. 제24항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드는 상기 단리된 세포의 염색체 DNA로 통합된 DNA 작제물로부터 발현되는 것인 방법.
  39. 제24항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 1개의 DNA 플라스미드 상에 있는 것인 방법.
  40. 제24항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 상이한 DNA 플라스미드 상에 있는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드는 다중감염(polyfection)에 의해 상기 단리된 세포로 형질감염된 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 전체 형질감염된 DNA 중 약 1% 내지 약 50%인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 전체 형질감염된 DNA 중 약 1% 내지 약 30%인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 전체 형질감염된 DNA 중 약 3%인 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 전체 형질감염된 DNA 중 약 10%인 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 전체 형질감염된 DNA 중 약 30%인 방법.
  47. 제24항에 있어서, 서열 번호 3과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 분획을 상기 세포로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 단백질 분획은 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 서열 번호 3의 개열된 2-사슬 폴리펩타이드 대 서열 번호 1의 비개열된 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 8:2인 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 서열 번호 3의 개열된 2-사슬 폴리펩타이드 대 서열 번호 1의 비개열된 폴리펩타이드의 비는 적어도 약 9:1인 것인 방법.
  51. 제24항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 폴리펩타이드의 발현 수준은 내생 퓨린의 발현 수준의 적어도 3배인 것인 방법.
  52. 제1항의 단리된 세포 또는 제24항의 방법에 의해 제조된 2개 사슬 fXa 유도체의 제제.
  53. 폴리뉴클레오타이드 작제물로서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 1과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물.
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