BR112016024534B1 - Métodos para produzir de forma recombinante um polipeptídeo de interesse, para produzir uma célula de vertebrado isolada, e para selecionar uma célula, bem como uso de uma célula de vertebrado - Google Patents

Abstract

CÉLULAS DE VERTEBRADO INOVADORAS E MÉTODOS PARA EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE. O presente pedido refere-se, entre outros, a uma célula de vertebrado isolada adequada para a expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse, em que a célula de vertebrado é alterada para enfraquecer a função da protease matriptase endógena e em que a dita célula compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse e em que o polipeptídeo de interesse é secretado pela célula. Concluiu-se que usar as respectivas células de vertebrado para produzir um polipeptídeo recombinante de interesse reduz significativamente o corte do polipeptídeo de interesse que é secretado no meio de cultura celular. São também fornecidos métodos melhorados de produção e de triagem.

Description

CAMPO DA REVELAÇÃO

[0001] A presente revelação refere-se ao campo de tecnologias de expressão recombinante. A mesma refere-se, entre outros, a células de vertebrado alteradas e seu uso em métodos de expressão recombinante. Ao expressar de modo recombinante um polipeptídeo de interesse nas ditas células alteradas que é, então, secretado no meio de cultura celular, o corte do polipeptídeo expresso de modo recombinante de interesse no meio de cultura celular é significativamente reduzido ou mesmo completamente impedido.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[0002] O mercado de produtos biofarmacêuticos continua a crescer a uma alta taxa conforme os produtos biofarmacêuticos se tornam mais e mais importantes para a medicina atual. Atualmente, um número crescente de produtos biofarmacêuticos é produzido em células de vertebrado, tal como em células de mamífero particulares. Os produtos biofarmacêuticos incluem, porém, sem limitação, anticorpos, fragmentos de anticorpo, ADCs (conjugado de anticorpo e fármaco), nanocorpos, proteínas de fusão de Fc, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, enzimas e outros polipeptídeos terapêuticos. Especialmente, a expressão de proteínas terapêuticas não anticorpo recombinantes é de importância crescente. Além disso, a expressão recombinante de polipeptídeos em células de mamífero é também para outros campos de uso de alto interesse. Considerando- se os custos de produção para polipeptídeos expressos de modo recombinante, é importante ter linhagens de células de mamífero de alta expressão. O polipeptídeo de interesse é expresso e secretado pelas células de mamífero no meio de cultura celular do qual o mesmo é, então, colhido.

[0003] Um problema principal que é encontrado ao usar células de vertebrado, tais como células de mamífero, como células hospedeiras para expressão recombinante é a degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse expresso e secretado no meio de cultura celular, também referida como "corte". As proteases que se originam das células de vertebrado usadas para a produção são ativas no meio de cultura celular cuja atividade proteolítica pode degradar o polipeptídeo de interesse secretado e expresso de modo recombinante, produzindo, assim, um polipeptídeo de interesse alterado, por exemplo, não ou menos funcional. Essa degradação proteolítica relacionada à célula hospedeira é um dos principais obstáculos na expressão recombinante de polipeptídeos. Embora anticorpos IgG possam ser também afetados, por exemplo, devido ao fato de que anticorpos IgG podem ser cortados em regiões variáveis, a degradação proteolítica, isto é, o corte, ocorre em uma frequência muito maior com polipeptídeos não IgG. Tais polipeptídeos não IgG, em particular glicopolipeptídeos, devido a sua estrutura tridimensional relativamente exposta, podem ser muito sensíveis à degradação proteolítica. O corte de polipeptídeos não IgG expressos de modo recombinante pode atingir valores de até 100%. O corte pode levar a polipeptídeos inativos e/ou imunogênicos que não são úteis para o propósito ao qual se destina. Além disso, mesmo se a degradação proteolítica ocorrer apenas em certa porcentagem, o polipeptídeo cortado não pode ser usado para o propósito ao qual se destina e, portanto, reduz o rendimento de polipeptídeo recombinante útil de interesse. Adicionalmente, para muitas aplicações, o polipeptídeo cortado tem que ser removido durante a purificação. Isso pode exibir o desenvolvimento específico de métodos de purificação que permitem separar o polipeptídeo cortado do intacto, o que pode ser trabalhoso e dispendioso e algumas vezes não são, ainda, bem-sucedidos, de modo que a proteína cortada permanece como impureza. Portanto, a degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse expresso no meio de cultura celular é uma questão principal ao produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse em células de vertebrado.

[0004] Diversos estudos têm investigado o fenômeno de corte a fim de fornecer soluções para esse problema. O corte se mostrou ser dependente do tempo e da temperatura e poderia ser inativado por tratamento térmico. No entanto, até o momento pouco é conhecido sobre as proteases expressas pelas células hospedeiras de vertebrado usadas para a expressão recombinante e sobre as proteases responsáveis pelo corte. Um dos desafios principais é o número de proteases expressas por células hospedeiras de vertebrado. Por exemplo, sabe-se que mais de 700 proteases estão presentes em genomas de células de roedor, muitas as quais poderiam estar envolvidas no corte.

[0005] Diversas abordagens foram sugeridas na técnica anterior para superar os problemas de corte. Uma abordagem para evitar o corte é a reengenharia da proteína afetada a fim de eliminar motivos de aminoácido que são propensos ao corte. Entretanto, essa abordagem é demorada, precisa de testes extensivos sobre se a abordagem escolhida foi bem-sucedida e não garante que a proteína remanipulada seja ainda funcional, não mostra corte em outros sítios e não é imunogênica. Uma forma diferente de controlar a atividade de protease na cultura celular é adicionar inibidores ou substratos substitutos no meio de cultura. Entretanto, em processo de fabricação de grande escala, tais aditivos são dispendiosos e têm que ser removidos durante a purificação, o que pode exigir o desenvolvimento específico de métodos de purificação e ensaios sensíveis para monitores se nenhum aditivo permanece. Outras formas de reduzir a degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse expresso no meio de cultura celular incluem temporização da coleta (coleta precoce) para limitar a exposição dos polipeptídeos de interesse às proteases no meio de cultura celular, reduzir a temperatura da cultura, otimizar as condições de pH ou aprimorar a viabilidade celular para reduzir a liberação de proteases intracelulares no meio de cultura celular. Além disso, concluiu-se que a escolha da linhagem de células de vertebrado usada como a célula hospedeira de produção pode ter uma influência sobre o corte dependente das proteases que são expressas pela respectiva linhagem de células e o polipeptídeo individual de interesse a ser expresso. Portanto, uma opção é triar diferentes linhagens de células para identificar uma linhagem de células em que o corte do polipeptídeo de interesse não ocorra ou ocorra e uma extensão menor, o que, no entanto, é demorado e pode exigir a adaptação do processo de produção à linhagem de células escolhida. Embora essas diferentes opções possam reduzir o corte, as mesmas raramente eliminarão por completo a degradação proteolítica. Além disso, em muitos casos, adaptações do processo de expressão e produção ao polipeptídeo individual de interesse a ser expresso são necessárias a fim de desenvolver um método de produção que evite ou pelo menos reduza os problemas de corte e forneça o polipeptídeo intacto de interesse com rendimento e pureza suficientes. Tais adaptações são, no entanto, demoradas e dispendiosas. Portanto, são necessárias formas aprimoradas de lidar com o problema de corte.

[0006] Portanto, é um objetivo da invenção fornecer um método aprimorado para a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse em células de vertebrado em que o corte do polipeptídeo de interesse expresso e secretado no meio de cultura celular é reduzido ou eliminado. Em particular, é um objetivo da presente invenção fornecer células de vertebrado inovadoras, em que o corte de um polipeptídeo de interesse expresso e secretado por ditas células seja reduzido ou eliminado.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[0007] A presente revelação está, entre outros, baseada na conclusão inesperada de que alterar uma célula de vertebrado para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena, por exemplo, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase, diminui significativamente a degradação proteolítica ("corte") de um polipeptídeo recombinante de interesse que é expresso e secretado pela dita célula no meio de cultura celular. Assim, enfraquecer o efeito de matriptase na dita célula reduz o corte do polipeptídeo recombinante secretado de interesse em comparação a uma célula de vertebrado correspondente em que o efeito de matriptase não é enfraquecido. Com a matriptase, uma protease importante responsável pelo corte de polipeptídeos secretados e expressos de modo recombinante foi identificada. Alterar a célula de vertebrado para enfraquecer o efeito de matriptase permite aprimorar significativamente a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse reduzindo-se ou eliminando-se o corte do polipeptídeo secretado e expresso de modo recombinante de interesse no meio de cultura celular. Assim, o rendimento de polipeptídeo de interesse intacto é aumentado. Conforme é demonstrado pelos exemplos, esses efeitos vantajosos não são vistos ao enfraquecer a função de outras proteases, o que confirmar que a matriptase é a protease principal responsável pelo corte. As células de vertebrado inovadoras fornecidas pela presente revelação obviam a necessidade de remanipular o polipeptídeo de interesse para ser expresso a fim de eliminar sítios proteolíticos ou adaptar laboriosamente o processo de produção para reduzir ou impedir o corte ou projetar processos de purificação específicos para remover proteína cortada. Vantajosamente, essas células de vertebrado alteradas descritas no presente documento podem ser usadas como células hospedeiras universais para expressas diferentes polipeptídeos de interesse, incluindo polipeptídeos de interesse que são particularmente propensos a corte. As alterações específicas do polipeptídeo a ser expresso ou o sistema de expressão tornam-se obsoletos, o que economiza tempo e custos. Além disso, conforme é demonstrado pelos exemplos, a célula de vertebrado alterada fornecida pela presente revelação mostra boas características de proliferação e expressão. Portanto, enfraquecer o efeito de matriptase fornece ainda células hospedeiras com características de expressão favoráveis que são importantes para a expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse. Portanto, a presente invenção faz uma contribuição importante para a técnica anterior.

[0008] De acordo com um primeiro aspecto, a presente revelação fornece uma célula de vertebrado isolada adequada para expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse, em que a célula de vertebrado é alterada para enfraquecer o efeito de matriptase e compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse, em que a célula de vertebrado secreta o polipeptídeo de interesse. A célula de vertebrado é alterada para enfraquecer o efeito de matriptase, por exemplo, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase na dita célula de vertebrado, por exemplo, por silenciamento de gene, deleção de gene, ou realizando-se mutação do gene de matriptase de modo que uma proteína não ou menos funcional seja expressa. Enfraquecer o efeito de matriptase na célula de vertebrado reduz o corte do polipeptídeo recombinante secretado de interesse em comparação a uma célula de vertebrado correspondente em que o efeito de matriptase não é enfraquecido. Conforme é mostrado pelos exemplos, entre outros, com base em experimentos de incorporação, no sobrenadante do meio de cultura celular que é obtido ao se cultivar respectivamente células de vertebrado alteradas em que o efeito de matriptase é enfraquecido, o corte de polipeptídeos recombinantes de interesse é reduzido de modo supreendentemente alto mesmo que outras proteases estejam ainda ativas no sobrenadante. Esses resultados foram confirmados expressando-se diversos polipeptídeos de interesse em células respectivamente alteradas, em que o efeito de matriptase está enfraquecido. Esses resultados confirmam que a matriptase é uma protease importante responsável pelo corte de um polipeptídeo secretado e expresso de modo recombinante de interesse. Assim, as células de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto são particularmente adequadas como células hospedeiras para tecnologias de produção recombinante e podem ser usadas para a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que é secretado pela célula de vertebrado no meio de cultura celular a partir do qual a mesma pode ser, então, colhida.

[0009] De acordo com um segundo aspecto, a presente revelação fornece um método para produzir uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto que compreende alterar uma célula de vertebrado para enfraquecer o efeito de matriptase e introduzir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse a ser expresso, em que o dito polipeptídeo de interesse é secretado pela célula de vertebrado. O enfraquecimento do efeito pode ser atingido, por exemplo, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase na dita célula, por exemplo, por silenciamento de gene, deleção de gene, ou realizando-se mutação do gene de matriptase de modo que uma proteína não ou menos funcional seja expressa.

[0010] De acordo com um terceiro aspecto, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende utilizar uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto como a célula hospedeira para expressão recombinante do polipeptídeo de interesse. Conforme descrito acima, devido ao nível reduzido atingido de corte de polipeptídeo no meio de cultura celular, essas células de vertebrado alteradas são particularmente adequadas como células hospedeiras para a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse, em particular de polipeptídeos que são propensos a corte, tais como glicopolipeptídeos. Como uma modalidade preferencial, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende: (a) cultivar células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto sob condições que permitem a expressão e a secreção do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular; (b) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular; e (c) processar opcionalmente o polipeptídeo de interesse isolado.

[0011] De acordo com um quarto aspecto, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende: (a) cultivar células hospedeiras de vertebrado que compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse sob condições que permite a expressão e a secreção do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular, em que o meio de cultura celular compreende um inibidor de protease que é seletivo para matriptase; (b) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular; e (c) processar opcionalmente o polipeptídeo de interesse isolado.

[0012] De acordo com um quinto aspecto, é fornecido um método para selecionar uma célula hospedeira que expressa de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende: (a) fornecer células de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto como células hospedeiras; e (b) selecionar uma ou mais células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de interesse.

[0013] De acordo com um sexto aspecto, a presente revelação refere-se ao uso de uma célula de vertebrado para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que é secretado da célula de vertebrado, em que a célula usada é alterada para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena. As células respectivamente alteradas podem ser, por exemplo, transfectadas com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse que se supõe que seja expresso e secretado pela dita célula. Ao usar as respectivas células de vertebrado em que o efeito da protease matriptase endógena está enfraquecido, quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional estão ativas no meio de cultura celular. Isso reduz significativamente ou até mesmo elimina a degradação proteolítica do polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado pelas células no meio de cultura celular. Portanto, é vantajoso usar tal célula de vertebrado alterada para expressão de proteína recombinante.

[0014] De acordo com um sétimo aspecto, a presente revelação refere-se a um método para selecionar uma célula de vertebrado para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que compreende analisar se a protease matriptase endógena é expressa funcionalmente na célula de vertebrado e selecionar uma célula de vertebrado em que o efeito de tal matriptase endógena é enfraquecido para produção recombinante do polipeptídeo de interesse. Esse processo de seleção permite identificar células de vertebrado que têm capacidade para produzir um polipeptídeo recombinante de interesse, em que o corte do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular é reduzido. As respectivas células de vertebrado são particularmente adequadas para a produção de proteína recombinante.

[0015] Outros objetivos, recursos, vantagens e aspectos do presente pedido se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição a seguir e das reivindicações anexas. Deve-se compreender, no entanto, que a descrição a seguir, as reivindicações anexas e os exemplos específicos, apesar de indicarem as modalidades preferenciais do pedido, são dados a título de ilustração apenas. Várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção revelada serão facilmente percebidas por aqueles versados na técnica a partir da leitura do seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Figura 1 mostra um Western Blot para duas proteínas terapêuticas (painel superior: IgG (mAb), painel inferior: proteína de fusão de Fc) incubadas por diversos dias em meio condicionado obtido cultivando-se células CHO transfectadas com siRNAs direcionadas contra diferentes genes-alvo de protease (incubação de 7 dias para mAb, incubação de 3 dias para a proteína de fusão de Fc). O primeiro controle "(+)" representa uma amostra do polipeptídeo de interesse incubado pelo mesmo tempo em um meio de cultura quimicamente definido que não estava em contato com as células. O meio de cultura quimicamente definido usado como controle foi o mesmo meio de cultura que o meio de cultura em que as células foram cultivadas para obter o meio condicionado. O segundo controle "(-)" representa uma amostra do polipeptídeo de interesse incubada no meio condicionado obtido a partir de células CHO transfectadas com um siRNA não eficaz (125 pmol) que serviu como controle negativo de siRNA. Os nomes das serina proteases semelhantes à tripsina alvo e homólogo cuja expressão foi silenciada por transfecção de siRNA são dados acima do painel superior (MT-SP1 (matriptase, também referida no presente documento como St14), C1r (também referida como C1ra), C1s (também referida como Gm5077), Plat e Prss35). Para cada uma das combinações "polipeptídeo de interesse/meio condicionado de células com expressão de protease silenciada", resultados de duas configurações experimentais com diferentes concentrações de siRNA são mostrados. É também determinada e indicada na Figura 1 abaixo entre parênteses a porcentagem de expressão gênica de protease residual em relação à expressão gênica de protease nas células de controle negativo de siRNA que foi definida como 100%. Isso significa, por exemplo, em relação a MT-SP1 (18,6%) que houve 18,6% de expressão gênica residual mediante silenciamento. MT-SP1: 125 pmol (18,6%) e 150 pmol (18.2%), C1r (C1ra): 125 pmol (6,3%) e 150 pmol (6,7%), C1s (Gm5077): 100 pmol (11,9%) e 125 pmol (14,4%), Plat: 125 pmol (8,3%) e 150 pmol (5,1%) e Prss35: 100 pmol (18,4%) e 125 pmol (14,8%). Os resultados demonstram que, quando o nível de mRNA de MT-SP1 é regulado de modo descendente por interferência de RNA, significativamente menos corte ocorreu no meio condicionado (detectado para mAb e proteína de fusão de Fc). Quando outras serina proteases semelhantes à tripsina expressas foram reguladas de modo descendente, o corte permanece o mesmo. Os resultados, assim, demonstram que a matriptase é a protease principal responsável pelo corte.

[0017] A Figura 2 mostra a sequência de éxon 2 do gene de matriptase mais regiões de íntron de flanqueamento em células derivadas de CHO-K1. Iniciadores de sequenciamento (cursivo, negrito e sublinhado) foram projetados para direcionar íntrons de flanqueamento para confirmar a sequência de éxon 2 de MT-SP1 derivado de CHO-K1 (sombreado em cinza). Os sítios de ligação de domínios de ligação ao DNA de TALENs usados para obter células knockout de matriptase são representados em negrito e sublinhado, e a região alvo para mutação knockout é mostrado em negrito e com sublinhado duplo.

[0018] A Figura 3 mostra um diagrama de coluna que representa a expressão de mRNA de matriptase relativa medida nos clones de célula knockout de matriptase derivada de CHO-K1 dKO-1 a KO-9 e o clone Δ7/Δ15 e uma linhagem de células do tipo selvagem derivada de CHO-K1 (WT). A expressão de mRNA de matriptase na linhagem de células derivada de CHO-K1 do tipo selvagem foi definida como 100%. Conforme pode ser visto, a expressão de mRNA de matriptase foi reduzida em todos os clones knockout e no clone Δ7/Δ15.

[0019] A Figura 4 mostra um Western Blot de três diferentes polipeptídeos de interesse que são propensos a corte incubados no sobrenadante de meio de cultura celular de células CHO-K1 do tipo selvagem (WT) e uma variedade de diferentes clones de célula derivados de CHO-K1 em que a matriptase sofreu knockout por diferentes mutações (consultar o Exemplo 2, em particular, a Tabela 5). Os polipeptídeos de interesse (concentração de 0,7 μM cada) foram incubados em meio condicionado obtido a partir de células CHO-K1 do tipo selvagem (WT), os clones knockout KO-1 a KO-9 mostrados na Tabela 5 (indicados na Figura 4 pelos números 1 a 9, respectivamente) ou um meio quimicamente definido que não estava em contato com as células (+). O polipeptídeo de interesse na Figura 4A é uma IgG (mAb), e o tempo de incubação foi 48 h. O polipeptídeo de interesse na Figura 4B é uma proteína de fusão de Fc, o tempo de incubação foi 24 h. O polipeptídeo de interesse na Figura 4C é uma proteína recombinante adicional com duas glicovariantes, o tempo de incubação foi 1 h. Ambas as glicovariantes foram cortadas em meio condicionado obtido a partir de células CHO-K1 do tipo selvagem (WT). As proteínas intactas e cortadas são indicadas pelas setas. A Figura 4D mostra o resultado de uma repetição do experimento com o mAb com o uso de meio condicionado obtido a partir das respectivas células que foram cultivadas por três meses. As condições de incubação foram idênticas àquelas na Figura 4A. Os resultados demonstram que o corte é eficazmente impedido no meio condicionado obtido a partir dos clones de célula knockout de matriptase KO-1 a KO-9 e que esses resultados vantajosos são mantidos durante cultura prolongada.

[0020] As Figuras 5A e B mostram Western Blots de duas glicoproteínas virais diferentes (polipeptídeos de interesse) que s]ao propensas a corte. Os polipeptídeos de interesse foram incubados em meio condicionado obtido a partir de uma linhagem de células derivada de CHO-K1 que expressa matriptase (WT) e diferentes clones de célula em que a matriptase sofreu knockout (KO-1 a KO-3). Os polipeptídeos de interesse foram incubados em uma concentração de 0,7 μM em meio condicionado obtido a partir de células do tipo selvagem (WT), meio condicionado a partir de clones knockout KO-1 a KO-3 mostrados na Tabela 5 (indicados pelos números 1 a 3, respectivamente) ou um meio de cultura quimicamente definido que não estava em contato com as células (+). D1 indica um tempo de incubação de 24 h e D2 um tempo de incubação de 48 h. As proteínas intactas e cortadas são indicadas por setas (setas brancas e pretas). Os números no lado esquerdo do Western Blot na Figura 5B representam o peso molecular em kDa, conforme determinado. Os resultados novamente demonstram que o corte é significativamente reduzido no meio condicionado obtido a partir de clones KO de matriptase.

[0021] A Figura 6 mostra um Western Blot de uma proteína de fusão de Fc (Figura 6A) e uma IgG (mAb) (Figura 6B) incubada no sobrenadante de meio de cultura celular obtido a partir de células CHO que expressam matriptase do tipo selvagem ("WT1" e "WT2") e um clone de CHO em que a matriptase sofreu mutação ("Δ7/Δ15") de modo que a expressão funcional de matriptase fosse reduzida. Um meio de cultura definido quimicamente correspondente ("(+)") que não estava em contato com as células serviu como controle positivo. A proteína de fusão de Fc e o mAb (concentração de 0,7 μM cada) foram incubados por 2 h e 24 h, respectivamente. Os números ao lado do Western Blot representam o peso molecular aproximado em kDa, conforme determinado no gel. Os resultados demonstram que o corte é reduzido no meio condicionado obtido a partir do clone de célula mutante Δ7/Δ15 em que a expressão funcional de matriptase ativa é reduzida.

[0022] A Figura 7 mostra os resultados de uma coincubação de diferentes polipeptídeos de interesse com duas proteases semelhantes à tripsina diferentes, a saber matriptase de camundongo (MT-SP1) e Htra1 de ser humano. A Figura 7A mostra uma análise Western Blot de mAb (tempo de incubação 24 h), a Figura 7B, uma análise por eletroforese em gel capilar (Caliper LabChip®) de uma proteína de fusão de Fc (tempo de incubação 2 h) e a Figura 7C, uma análise por Western Blot de uma proteína recombinante adicional (tempo de incubação 1 h). A concentração do polipeptídeo de interesse foi 0,7 μM em todas as configurações experimentais. Cada polipeptídeo de interesse foi testada com quantidades decrescentes da MT-SP1 e da Htra1: As razões molares entre protease e polipeptídeo de interesse da esquerda para a direita são 1/10, 1/100 e 1/1.000 para MT-SP1 e 1/3, 1/10 e 1/100 para Htra1. Os polipeptídeos de interesse foram também incubados pelo mesmo tempo em um meio de cultura quimicamente definido "(+)" e em meio condicionado (sobrenadante) obtido a partir de células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 "(-)". As proteínas intactas (maiores) e as proteínas cortadas (menores) são indicadas pelas setas na Figura 7A e 7C. Na Figura 7B, há dois tipos de polipeptídeos cortados além do polipeptídeo intacto (todos marcados com uma seta e ilustrado ao lado). A Figura 7A a Figura 7C demonstra que o corte ocorre na presença de matriptase, conformando, assim, que a matriptase é uma protease importante para o corte.

[0023] A Figura 8 mostra uma análise por Western Blot de dois polipeptídeos de interesse, um anticorpo IgG monoclonal (painel superior, tempo de incubação 24 h) e uma proteína recombinante (painel inferior, tempo de incubação 1 h). Os polipeptídeos de interesse (concentração de 0,7 μM cada) foram incubado em um meio de cultura quimicamente definido "(+)", em meio condicionado obtido a partir de células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 "(-)" ou em um meio de cultura quimicamente definido com matriptase recombinante de Mus Musculus adicionado ((+) + MT-SP1). A diversas amostras, um fragmento Fab inibidor anti-MT-SP1 foi adicionado conforme indicado ("+ Fab"). A concentração do Fab na amostra é mostrada acima da raia (1 μM, 10 μM ou 50 μM). As setas indicam bandas de proteína que representam a proteína intacta ou cortada. A banda de proteína a aproximadamente 25 kD nas raias em que o fragmento Fab foi adicionado representa o fragmento Fab. Os resultados demonstram que a adição do fragmento Fab anti-MT-SP1 (que é um inibidor seletivo de matriptase) a um meio de cultura celular em que a matriptase está ativa reduz ou mesmo impede completamente o corte. Os resultados confirmam, ainda, que a matriptase é a protease principal responsável pelo corte.

[0024] A Figura 9 mostra o resultado de uma eletroforese capilar de microcircuito (Caliper LabChip®). Um mAb recombinante foi expresso em células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 (WT) ou em células knockout de matriptase (KO-4, consultar também a Tabela 5) e foi purificado com o uso de cromatografia de afinidade (proteína A). Os números acima das raias apresentam diferentes agrupamentos de células de produção de mAb obtidos a partir de processos de transfecção e seleção paralelos. Em cada raia, três bandas de proteína são visíveis, conforme indicado pelas setas. A banda de proteína superior representa a cadeia pesada de mAb intacto, a segunda banda (diretamente abaixo da primeira) representa a cadeia pesada de anticorpo cortado e a banda na parte inferior representa a cadeia leve do mAb. Os resultados mostram que o corte é significativamente reduzido quando é expresso um polipeptídeo de interesse em células knockout de matriptase.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0025] A presente revelação é, entre outras, baseada na conclusão inesperada de que uma célula de vertebrado alterada, em que o efeito da protease matriptase endógena é enfraquecido, por exemplo, reduzindo- se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase, tem capacidade de expressar e triar um polipeptídeo recombinante de interesse no meio de cultura celular, em que, no entanto, o corte do polipeptídeo recombinante de interesse no meio de cultura celular é significativamente reduzido. Assim, a protease principal responsável pelo corte de polipeptídeos secretados e expressos de modo recombinante foi identificada dentre centenas de diferentes proteases. Foi também altamente surpreendente que direcionar e enfraquecer a atividade de uma única protease fosse suficiente para reduzir significativamente ou mesmo eliminar o corte no meio de cultura celular. Usar, por exemplo, células de vertebrado, respectivamente alteradas de acordo com a invenção permite aprimorar significativamente a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse aumentando-se o rendimento de polipeptídeo intacto de interesse que pode ser obtido após a expressão e a secreção do meio de cultura celular. Portanto, ao usar a célula de vertebrado alterada de acordo com a invenção para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse, não é necessário realizar medidas adicionais para reduzir a degradação proteolítica e, portanto, impedir o corte do polipeptídeo de interesse. Portanto, a presente invenção faz uma contribuição importante para a técnica anterior.

[0026] Os aspectos individuais e as modalidades preferenciais e adequadas da presente revelação serão agora descritos em detalhes.

A. CÉLULAS DE VERTEBRADO ALTERADAS

[0027] De acordo com um primeiro aspecto, a presente revelação fornece uma célula de vertebrado isolada adequada para expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse, em que a célula de vertebrado é alterada para enfraquecer o efeito de matriptase e compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse, em que a célula de vertebrado secreta o polipeptídeo de interesse. Enfraquecer o efeito de matriptase na célula de vertebrado reduz o corte do polipeptídeo recombinante secretado de interesse em comparação a uma célula de vertebrado correspondente em que o efeito de matriptase não é enfraquecido.

[0028] A matriptase foi descrita pela primeira vez em 1993 como uma nova atividade gelatinolítica em células de câncer de mama cultivadas. A matriptase pertence à família de serina proteases transmembrânicas do tipo II (TTSPs). Ortólogos de matriptase estão presentes em diferentes espécies de vertebrados, incluindo espécies de mamíferos, e foram identificados, por exemplo, em ser humano, chimpanzé, cão, camundongo, rato, galinha, peixe paulistinha, baiacu- verde-pintado e baiacu-tigre, o que sugere uma função evolucionária conservada. A matriptase é listada na nomenclatura de enzimas IUBMB como EC 3.4.21.109. A matriptase é também conhecida como serina protease 1 do tipo membrana (MT-SP1) e supressor de tumorigenicidade-14 (ST14) (consultar Chen et al, The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097 a 108). A mesma é uma proteína membrânica integral com um domínio transmembranar de amplitude única, próximo ao N-Terminal citoplásmico. A parte extracelular consiste em uma região de tronco (incluindo um único SEA, 2 domínios CUB e 4 LDLRA) e o domínio de serina protease C-terminal que é estruturalmente bastante similar a outras TTSPs e inclui uma tríade catalítica conservada de histidina/ácido aspártico/serina (HDS) essencial para atividade catalítica (consultar, por exemplo, List et al, Matriptase: Potent Proteolysis on the cell Surface; MOL MED 12 (1 a 3) 1 a 7, JANEIRO a MARÇO de 2006 e Chen et al, The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097 a 108). A matriptase é descrita como sendo expressa nos epitélios e muitos sistemas de órgãos, tal como pele, mama, pulmão, epiderme, córnea, glândula salivar, cavidades oral e nasal, tireoide, timo, esôfago, traqueia, bronquíolos, alvéolos, estômago, pâncreas, vesícula biliar, duodeno, intestino fino, cólon, reto, rim, adrenais, bexiga urinária, uretra, vesículas seminais, epidídimo, próstata, ovários, útero e vagina (consultar List et al, 2006 e Chen et al, 2012). A matriptase é sintetizada como um zimogênio inativo e é convertida em sua forma ativa por meio de um processo complicado. Os detalhes relacionados ao processo de ativação que envolve clivagens endoproteolíticas são descritos para matriptase humana em List et al 2006 e Chen et al 2012. A matriptase está ligada à membrana como proteína transmembranar tipo II com o domínio catalítico orientado no espaço extracelular. Além disso, é descrito na literatura que uma disseminação significativa de matriptase, respectivamente sua parte extracelular, ocorre in vivo (consultar List et al, 2006 e Chen et al 2012). É descrito na literatura que a matriptase é disseminada na forma de um complexo, por exemplo, formando um complexo com o inibidor de serina protease do tipo Kunitz HAI-1. Diferentes estudos sugerem que em células de ser humano o inibidor específico HAI-1 facilita o transporte da matriptase para a membrana celular já que foi mostrado que a remoção ou mesmo mutações pontuais únicas em HAI-1 levam a um acúmulo da matriptase no compartimento de Golgi. Na literatura, diversos inibidores endógenos diferentes de matriptase além de HAI-1 foram descritos, tal como HAI-2, antitrombina, antitripsina alfa-1 e antitripsina alfa-2. Além disso, também outros inibidores de matriptase foram descritos (consultar, por exemplo, Chen et al, 2012). É descrito na literatura que a matriptase pode exercer inúmeros papéis na fisiologia normal, tal como função de barreira da pele, integridade epitelial, desenvolvimento de folículo capilar e homeostase do timo, e em patologias humanas, tal como osteoartrite, aterosclerose, e progressão, invasão e metástase de tumor.

[0029] Contra esses antecedentes científicos que não estão relacionados à produção recombinante de um polipeptídeo de interesse, a presente conclusão de que a matriptase é uma protease importante responsável pelo corte de polipeptídeos produzidos de modo recombinante de interesse que são secretados pelas células hospedeiras no meio de cultura celular foi altamente surpreendente. Considerando o grande número e a variedade de proteases expressas em células de vertebrado, tal como, em particular, células de mamíferos, foi ainda mais surpreendente que enfraquecer a função dessa única protease - matriptase - seja suficiente para reduzir significativamente ou até mesmo eliminar o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular. Esses efeitos vantajosos não são vistos com outras proteases, mesmo proximamente relacionadas, o que apoia a importância da conclusão de que a matriptase é a enzima chave responsável pelo corte de polipeptídeos recombinantes secretados no meio de cultura celular. Conforme é mostrado pelos exemplos, ao usar células de vertebrado alteradas, em que o efeito da protease matriptase endógena é enfraquecido, o corte de um polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado pela célula no meio de cultura celular é significativamente reduzido. Por exemplo, enfraquecer a função da matriptase por silenciamento de gene (por exemplo, RNAi, conforme mostrado no Exemplo 1) ou mutação do gene de matriptase endógena (por exemplo, knockout de um ou ambos os alelos de matriptase, conforme mostrado no Exemplo 2 e 5) leva a uma redução significativa ou mesmo à completa eliminação de corte do polipeptídeo secretado e expresso de modo recombinante de interesse no meio de cultura celular. Uma redução significativa de corte foi encontrada para todos os polipeptídeos testados que são propensos a corte, tais como anticorpos IgG, proteínas de fusão de Fc, proteínas virais glicosiladas e outras proteínas terapeuticamente ativas. Portanto, usar uma linhagem de células com deficiência de matriptase para produzir um polipeptídeo de interesse por expressão recombinante é vantajoso. É, ainda, evidente a partir dos exemplos que a matriptase cliva diretamente o polipeptídeo de interesse que é secretado no meio de cultura celular. Assim, qualquer enfraquecimento do efeito da matriptase reduz o corte do polipeptídeo expresso de modo recombinante que é secretado no meio de cultura celular. Além disso, conforme é demonstrado pelos exemplos, adicionar um inibidor seletivo de matriptase ao meio de cultura celular pode também reduzir o corte.

[0030] Devido ao fato de que o efeito da protease matriptase endógena está enfraquecido na célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto da presente revelação, matriptase não ou pouco funcionalmente ativa está presente no meio de cultura celular em que as ditas células são cultivadas, por exemplo, de vido ao fato de que tais células apresentam quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional na superfície celular e/ou liberam (por exemplo, devido à disseminação) quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional no meio de cultura celular. Assim, a degradação proteolítica do polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado no meio de cultura celular é reduzida significativamente ou até mesmo eliminada, o que é uma vantagem importante ao produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse. Devido ao fato de que o corte é reduzido significativamente, o rendimento de polipeptídeo intacto de interesse é aumentado. Um subproduto com menos ou até mesmo não sem funcionalidade e potencialmente imunogênico é produzido. Adicionalmente, concluiu-se que essas células hospedeiras de vertebrado inovadoras, de modo geral, mostram bons rendimentos de expressão e têm boas característica de proliferação, o que as torna particularmente adequadas como linhagens de células de produção. Vantagens adicionais são descritas a seguir e são evidentes a partir dos exemplos. Assim, essas células de vertebrado vantajosas permitem produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse com qualidade e rendimento de produto aprimorado. Além disso, usar as células de vertebrado de acordo com a invenção, que, de preferência, são células de mamífero, reduz o tempo exigido para desenvolver uma linhagem de células de produção para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse. Menos ou até mesmo nenhuma otimização do polipeptídeo de interesse é necessária a fim de evitar ou reduzir o corte, por exemplo, alterando-se a sequência de aminoácidos. Em particular, a remoção de sítios de corte se torna obsoleta. Além disso, processos de purificação demorados para remover proteína cortada podem ser evitados ao usar essas células como linhagem de células de produção. Assim, essas células de vertebrado têm vantagens importantes ao serem usadas como linhagens de células hospedeiras para tecnologias de produção recombinante.

[0031] A listagem de sequências mostra sequências de aminoácidos exemplificativas de matriptase de diferentes espécies de vertebrados, tal como hamster (SEQ ID NO: 1 - sequência de referência NCBI: XP_003495890), ser humano (SEQ ID NO: 2 - sequência de referência NCBI: NP_068813), camundongo (SEQ ID NO: 3 - sequência de referência NCBI: NP_035306), rato (SEQ ID NO: 4 - sequência de referência NCBI: NP_446087) e chimpanzé (SEQ ID NO: 5 - sequência de referência NCBI: NP_001189434). Conforme é evidenciado a partir da Tabela 1, a matriptase é atualmente também referida como "proteína supressora de tumorigenicidade 14" (por exemplo, para ser humano) e "homólogo de proteína supressora de tumorigenicidade 14" (por exemplo, em camundongo e hamster chinês). O termo "matriptase", conforme usado no presente documento, em particular abrange qualquer proteína que compartilhe pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com uma ou mais das proteínas mostradas na SEQ ID NO: 1 a 5 como a proteína de referência de matriptase e que tenha a mesma atividade proteolítica que a dita proteína de referência de matriptase. A identidade, conforme usado no presente documento, é calculada por todo o comprimento da proteína de referência. A matriptase é distinguida de outras proteases. Na literatura, a matriptase recebeu uma variedade de nomes, uma seleção dos quais é fornecida na Tabela 1. Os genes correspondentes que codificam a enzima matriptase também receberam uma variedade de nomes, uma seleção dos quais é fornecida na Tabela 1. No contexto da invenção, a protease é referida como "matriptase", "MT- SP1", "proteína supressora de tumorigenicidade 14" ou "homólogo de proteína supressora de tumorigenicidade 14" por questões de simplicidade. Entretanto, o termo "matriptase" também se refere e abrange quaisquer nomes alternativos da dita proteína ou do gene correspondente, por exemplo, usado para caracterizar a proteína ou o gene correspondente em diferentes espécies. Os homólogos e ortólogos de matriptase que têm a mesma função estão incluídos no termo "matriptase". Nesse contexto, é mencionado que matriptase-2 e matriptase-3 referem-se a proteases que são distintas da matriptase (embora estruturalmente relacionadas) e, assim, são abrangidas pelo termo "matriptase", conforme usado no presente documento. TABELA 1: NOMES ALTERNATIVOS EXEMPLIFICATIVOS DE GENE DE MATRIPTASE E/OU DA MATRIPTASE DE PRODUTO DE PROTEÍNA CODIFICADA NA LITERATURA (ORDEM ALFABÉTICA)

[0032] Um gene que codifica uma proteína matriptase é também referido como "gene de matriptase" no presente documento. A sequência de genes genômica de diferentes espécies de mamíferos é conhecida e é, por exemplo, descrita em hamster chinês (NCBI Gene- ID: 100755225); Homo sapiens (NCBI Gene-ID: 6768); Mus musculus (NCBI Gene-ID: 19143); Rattus norvegicus (NCBI Gene-ID: 114093); Pan Troglodytes (NCBI Gene-ID: 100188950) e outros. Os sinônimos para o gene de matriptase são listados na Tabela 1, comumente é usado "ST14" ou "St14". O termo "gene de matriptase", conforme usado no presente documento, em particular abrange qualquer gene endógeno de uma célula de vertebrado que codifica uma proteína matriptase, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 a 5 ou que codifica uma proteína matriptase que compartilha pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com uma ou mais das proteínas matriptase mostradas na SEQ ID NO: 1 a 5 como a proteína de referência de matriptase e que tenha a mesma atividade proteolítica que a dita proteína de referência de matriptase. A identidade, conforme usado no presente documento, é calculada por todo o comprimento da proteína de referência.

[0033] A presente revelação, entre outros, refere-se a uma célula de vertebrado modificada, tal como, de preferência, uma célula de mamífero, em que o efeito da matriptase endógena, que é usualmente expressa de modo endógeno por uma célula de vertebrado não modificada, é enfraquecido na dita célula. Devido a essa alteração que enfraquece o efeito da protease matriptase endógena, a célula de vertebrado alterada descrita no presente documento apresenta ou libera quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional no meio de cultura celular, segundo o qual o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular é reduzido ou até mesmo completamente impedido. Conforme é demonstrado pelos exemplos, essa alteração, que pode ser temporária ou permanente, reduz significativamente a demonstrações proteolítica de um polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado pela dita célula alterada no meio de cultura celular.

[0034] Há diversas possibilidades de alterar e, portanto, modificar uma célula de vertebrado para enfraquecer o efeito da matriptase endógena na dita célula. O efeito da matriptase pode ser enfraquecido, por exemplo, no gene ou no nível da proteína. O efeito da matriptase pode ser enfraquecido, por exemplo, por modificação da estrutura/sequência de matriptase, transcrição, tradução e/ou tráfego celular de matriptase. As opções não limitantes são descritas a seguir.

[0035] De acordo com uma modalidade, o efeito de matriptase é enfraquecido devido ao fato de que a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada na dita célula. Conforme é mostrado pelos exemplos, alterar a expressão do gene de matriptase reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase, por exemplo, por silenciamento de gene ou por knockout de gene, é uma medida muito eficaz para fornecer uma célula de vertebrado que é adequada para expressar um polipeptídeo recombinante de interesse, em que, no entanto, o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular é reduzido ou até mesmo completamente evitado. Concluiu-se que, quando a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada em uma célula de vertebrado, o corte de um polipeptídeo recombinante de interesse secretado no meio de cultura celular é similarmente diminuído. Essa correlação é uma conclusão inesperada.

[0036] A redução ou a eliminação de expressão funcional da matriptase pode ser atingida por vários meios. A expressão funcional pode ser reduzida, por exemplo, reduzindo-se o nível de expressão da matriptase ou reduzindo-se a atividade catalítica da matriptase ou por uma combinação de ambos. De acordo com uma modalidade, a célula é alterada de modo que a expressão funcional do gene de matriptase seja reduzida ou eliminada por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. De acordo com uma modalidade, o genoma da célula de vertebrado é alterado para enfraquecer o efeito da matriptase.

[0037] De acordo com uma modalidade, a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada na célula por knockout de gene. Um knockout de gene é uma técnica genética através da qual um gene se torna inoperante interrompendo-se sua função. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser inserido na sequência de codificação, interrompendo, assim, a função do gene. Além disso, o gene de matriptase completo ou uma porção do mesmo pode ser deletado, segundo o qual nenhuma ou nenhuma proteína funcional é expressa pela célula respectivamente alterada. Outra opção é introduzir uma ou mais mutações knockout na sequência de codificação, o que gera um produto com expressão menos ou não funcional. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais mutações da fase de leitura que resultam em uma proteína não ou menos funcional. Alternativa ou adicionalmente, um ou mais códons de parada podem ser introduzidos na sequência de codificação de modo que uma proteína não ou menos funcional truncada seja obtida. Portanto, de acordo com uma modalidade, o gene de matriptase compreende uma ou mais mutações que fornecem um produto com expressão não ou menos funcional. De acordo com uma modalidade, as ditas uma ou mais mutações são mutações da fase de leitura ou de códon de parada. De acordo com uma modalidade, todo ou parte do domínio de protease localizado no C- terminal de matriptase não está presente devido às uma ou mais mutações introduzidas. Outras opções incluem, porém, sem limitação, introduzir uma ou mais mutações no promotor, na 5’UTR, na 3’ UTR e/ou outros elementos reguladores. De acordo com uma modalidade, a função promotora do gene de matriptase é interrompida, por exemplo, introduzindo-se uma deleção de promotor ou introduzindo-se um construto entre o promotor e o início da transcrição. Os métodos para atingir um knockout de gene para suprimir ou eliminar a expressão funcional de um gene alvo são também bem conhecidos pela pessoa versada e, assim, não precisam de qualquer descrição detalhada no presente documento. Alguns exemplos não limitantes são, no entanto, descritos abaixo.

[0038] De acordo com uma modalidade, o gene de matriptase sofre knockout funcional por engenharia genética. Os exemplos incluem, porém, sem limitação, edição de genoma, tal como edição com nucleases manipuladas (GEEN). Esse é um tipo de engenharia genética em que DNA é inserido, substituído ou removido de um genoma com o uso de nucleases artificialmente manipuladas, ou "tesouras moleculares". As nucleases criam quebras de fita dupla específicas (DSBs) nos locais desejados no genoma e atrelam os mecanismos endógenos da célula para reparar a quebra induzida por processos naturais de recombinação homóloga (HR) e junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Há pelo menos quatro famílias de nucleases manipuladas que podem ser usadas para esse propósito: Nucleases de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALENs), uma nuclease que reconhece Repetições Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente Agrupadas (CRISPR) e endonucleases homing remanipuladas por meganuclease manipulada. A tecnologia TALEN também foi usada nos exemplos para fornecer células de mamífero alteradas, em que o gene de matriptase sofreu knockout completo ou parcial, enfraquecendo, assim, o efeito da matriptase nas ditas células.

[0039] De acordo com uma modalidade, uma ou mais cópias do gene de matriptase presente no genoma da célula de vertebrado são alteradas, por exemplo, sofreram knockout ou foram deletadas, para reduzir ou eliminar e, portanto, enfraquecer o efeito da matriptase na célula de vertebrado. Assim, de acordo com uma modalidade, pelo menos uma cópia do gene de matriptase é deletada ou inativada funcionalmente no genoma da célula de vertebrado. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado compreende uma ou mais mutações em pelo menos uma cópia do gene de matriptase para fornecer um produto de expressão menos ou não funcional. Em geral, uma célula de vertebrado compreende duas cópias alélicas do gene de matriptase. Uma ou mais mutações podem ser inseridas em uma ou ambas as cópias do gene de matriptase. De preferência, uma ou mais mutações são inseridas em ambas, respectivamente todas as cópias do gene de matriptase, para fornecer um produto com expressão não ou menos funcional e, portanto, enfraquecer o efeito da matriptase na célula de vertebrado. Assim, todas as cópias do gene de matriptase são basicamente enfraquecidas ou inativadas no genoma. Conforme é mostrado nos exemplos, diferentes mutações podem ser introduzidas nos diferentes alelos do gene de matriptase para atingir o enfraquecimento.

[0040] De acordo com uma modalidade, as ditas uma ou mais mutações estão compreendidas em uma região de codificação do gene de matriptase e resultam em um produto de expressão não ou menos funcional. Por exemplo, a função da matriptase pode ser enfraquecida devido ao fato de que a célula de vertebrado alterada compreende uma ou mais mutações em uma região do gene de matriptase que codifica uma sequência de aminoácidos presente em mais de uma variante de splicing cataliticamente ativa e, portanto, funcional de matriptase. Diversas variantes de splicing de matriptase foram identificadas em diferentes espécies. Diversos desses éxons de matriptase são encontrados na maioria ou mesmo em todas as variantes de splicing funcionais. É vantajoso introduzir uma ou mais mutações em uma região do gene de matriptase que codifica um éxon que está presente em mais de uma, de preferência, na maioria, ou mesmo em todas as variantes de splicing de matriptase funcionais da respectiva célula de vertebrado.

[0041] De acordo com uma modalidade, uma ou mais mutações estão compreendidas em uma sequência de polinucleotídeos que codifica o éxon 2 de matriptase. Escolher o éxon 2 como alvo para alteração para enfraquecer a função da protease matriptase endógena na célula de vertebrado alterada tem a vantagem de que essa abordagem abrange diversas variantes de splicing funcionais diferentes. Os éxons próximos ao N-terminal de matriptase, tal como, por exemplo, éxon 1, éxon 2 e éxon 3, são alvos vantajosos para introduzir uma ou mais mutações, em particular uma ou mais mutações da fase de leitura. Uma mutação da fase de leitura em um desses éxons mais provavelmente leva a um códon de parada precoce na sequência. A proteína truncada codificada pelo gene com mutação é mais provavelmente curto e assume-se que esteja localizado de modo intracelular e/ou seja não ativo. Uma proteína truncada inativa é vantajosa visto que se pode assumir que sua expressão não é tóxica para as células. Entretanto, uma ou mais mutações podem ser também introduzidas em um dos éxons subsequentes, por exemplo, selecionados dentre os éxons 4 a 19.

[0042] Nos exemplos, células CHO que compreendem diferentes mutações da fase de leitura no éxon 2 foram geradas. Os exemplos mostram que células respectivamente alteradas mantiveram a proliferação celular. Portanto, a versão (ou versões) truncada codificada da matriptase testada nos exemplos não foi aparentemente tóxica para as células. Além disso, concluiu-se que a expressão de mRNA geral do gene de matriptase com mutação respectiva era inferior, de modo que níveis inferiores da versão truncada fossem obtidos (consultar a Figura 3). Portanto, os exemplos demonstram que uma respectiva alteração é eficaz a fim de enfraquecer a função da matriptase em uma célula de vertebrado, tal como, de preferência, uma célula de mamífero enquanto mantém outras características que são importantes para a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse. Assim, de acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado isolada compreende pelo menos uma mutação da fase de leitura no éxon 2 do gene de matriptase que resulta em que um polipeptídeo trucado não ou menos funcional seja expresso. De acordo com uma modalidade preferencial, a célula de vertebrado é uma célula CHO que compreende um ou mais mutações da fase de leitura no éxon 2 de um ou, de preferência, ambos os alelos do gene de matriptase, segundo o qual o efeito da matriptase é enfraquecido na dita célula CHO.

[0043] De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado compreende uma ou mais mutações em uma sequência de polinucleotídeos do gene de matriptase que codifica pelo menos parte do domínio catalítico da matriptase, segundo o qual um produto com expressão não ou menos funcional é obtido. O domínio catalítico é a região de uma enzima que interage com seu substrato para causar a reação enzimática. Uma ou mais mutações podem ser introduzidas nesse domínio de modo que a atividade catalítica da proteína seja reduzida ou eliminada. O domínio catalítico é codificado pelos aminoácidos nos éxons 16, 17, 18 e 19. Assim, de acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado compreende uma ou mais mutações em um ou mais éxons selecionados dentre éxon 16, éxon 17, éxon 18 e éxon 19. De acordo com uma modalidade, as uma ou mais mutações no domínio catalítico levam a uma redução ou eliminação da atividade catalítica da matriptase. Isso pode ser atingido, por exemplo, por uma mutação da fase de leitura, por uma mutação pontual específica, uma mutação de códon de parada e/ou uma deleção ou inserção no domínio catalítico. De acordo com uma modalidade, uma ou mais mutações são introduzidas de modo que a tríade catalítica de matriptase seja alterada, fornecendo, assim, uma proteína não ou menos funcional. Os mutantes inativos catalíticos de matriptase, tal como, por exemplo, G827R-matriptase ou S805A- matriptase também foram descritos na literatura (consultar Désilets et al, The Journal of Biological Chemistry Volume 283, n° 16, páginas 10.535 a 10.542, 2008). Além disso, a estrutura de cristal do domínio catalítico de uma matriptase recombinante é conhecida. A partir desses dados de estrutura e sequência, a pessoa versada pode derivar alvos específico adicionais para mutações para enfraquecer a função catalítica da matriptase.

[0044] As células alteradas em que a expressão funcional da matriptase é enfraquecida podem ser também obtidas com o uso de mutagênese aleatória ou abordagens de triagem. Os respectivos métodos são conhecidos na técnica anterior e, portanto, não precisam ser descritos em detalhes. As células alteradas em que a expressão funcional da matriptase está enfraquecida podem ser, então, identificadas com o uso, por exemplo, do método de acordo o sétimo aspecto.

[0045] A expressão funcional da matriptase pode ser também influenciada alterando-se o promotor e/ou o intensificador do gene de matriptase de modo que menos ou nenhum transcrito seja produzido, ou por tecnologias de silenciamento de gene, tal como silenciamento de gene transcricional ou pós-transcricional. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado isolada compreende uma ou mais mutações na região promotora do gene de matriptase. Por exemplo, a região promotora pode ser alterada para fornecer um promotor menos funcional ou não funcional, o promotor pode ser também completamente eliminado. Alternativa ou adicionalmente a isso, é possível adicionar uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que inclui um códon de parada entre o promotor e o códon inicial do gene de matriptase que leva à expressão de outro polipeptídeo em vez da matriptase. O polipeptídeo codificado pela sequência de polinucleotídeos inserido entre o promotor e o códon inicial pode ser, por exemplo, um polipeptídeo repórter, tal como proteína verde fluorescente (GFP). O sinal do repórter indicará que o polinucleotídeo heterólogo que codifica o repórter é expresso em vez da matriptase, permitindo, assim, identificar facilmente as células em que a expressão funcional da matriptase está enfraquecida.

[0046] A redução da expressão gênica funcional pode atingir um nível em que a expressão funcional é até mesmo eliminada.

[0047] O silenciamento de gene pós-transcricional pode ser atingido, por exemplo, com o uso de moléculas antissenso ou moléculas que mediam a interferência de RNA. Os exemplos não limitantes serão brevemente descritos a seguir.

[0048] As polinucleotídeos antissenso podem ser projetadas para ligar-se especificamente a RNA, resultando na formação de híbridos de RNA-DNA ou RNA-RNA, com uma suspensão de transcrição reversa ou tradução de RNA mensageiro. Muitas formas de antissenso foram desenvolvidas e podem ser amplamente categorizadas em antissenso dependente de enzima ou antissenso de bloqueio estérico. O antissenso dependente de enzima inclui formas dependentes da atividade de RNase H para degradar o mRNA alvo, incluindo DNA de fita simples, RNA e antissenso de fosforotioato. Os polinucleotídeos antissenso são tipicamente gerados dentro da célula pela expressão de construtos antissenso que contêm a dita antissenso como a fita transcrita. RNAs catalíticos de clivagem trans (ribozimas) são moléculas de RNA que possuem atividade de endorribonuclease. As ribozimas podem ser especificamente projetadas para um alvo particular e podem ser manipuladas para clivar qualquer sítio de espécie de RNA especificamente no fundamento de RNA celular. O evento de clivagem torna o mRNA instável e impede a expressão de proteína. O genoma da célula de vertebrado pode ser alterado de modo que uma respectiva molécula antissenso seja, por exemplo, expressa permanentemente.

[0049] Outra opção adequada para reduzir a expressão funcional do gene de matriptase em um nível pós-transcricional é baseada na interferência de RNA (RNAi). Conforme é mostrado pelos exemplos com base em experimentos de incorporação, reduzir a expressão de matriptase por RNAi é eficaz a fim de diminuir o grau de corte de polipeptídeos recombinantes de interesse que são expressos e secretados no meio de cultura celular pelas células de vertebrado respectivamente alteradas. O polipeptídeo significativamente mais recombinante permanece intacto no sobrenadante/meio de cultura celular mediante o silenciamento do gene de matriptase por RNAi e, portanto, pode ser coletado do mesmo. Em contraste, a redução dos níveis de expressão de outras proteases, mesmo serina proteases proximamente relacionadas, teve pouco ou nenhum efeito sobre o corte. Isso enfatiza a importância de ter identificado com a matriptase a protease principal responsável pelo corte ao expressar um polipeptídeo recombinante de interesse em uma célula de vertebrado, tal como, de preferência, em uma célula de mamífero. Os métodos para silenciar um gene alvo por RNAi são bem conhecidos pela pessoa versada e, assim, não precisa de qualquer descrição detalhada aqui. Os exemplos de compostos de indução de RNAi que podem ser usados para silenciar a expressão do gene de matriptase, fornecendo, assim, uma célula alterada em que o efeito da matriptase está enfraquecido, incluem, porém, sem limitação, ácidos nucleicos interferentes curtos (siNA), RNA interferente curto (siRNA), microRNA (miRNA), RNAs em forma de grampo curtos (shRNA) assim como precursores dos mesmos que são processados na célula no composto de indução de RNAi de fato. De acordo com uma modalidade, um siRNA é usado para silenciamento. O siRNA pode ser fornecido como molécula com fita dupla que tem projeções de 3’ em cada fita. Moléculas com extremidade cega podem ser também usadas. O dito siRNA pode compreender desoxirribonucleotídeos assim como ribonucleotídeos e, além disso, pode compreender nucleotídeos modificados. Diversas modalidades e variações de compostos de siRNA são conhecidas na técnica anterior e podem ser usadas para reduzir a expressão da matriptase. Os siRNAs adequados que direcionam as sequências alvo escolhidas/identificadas dos genes alvo no nível do RNA podem ser identificados com o uso de métodos computacionais adequados, aplicando-se certos algoritmos de projeto. A fim de obter um siRNA contra o transcrito alvo, a molécula com fita dupla pode ser diretamente transfectada na célula. Conforme é mostrado pelos exemplos, mesmo tais métodos temporários que reduzem a expressão da matriptase são eficazes para impedir o corte de um polipeptídeo de interesse no meio condicionado obtido a partir de tais células de vertebrado. Alternativamente, o siRNA pode resultar do processamento por dicer, uma enzima que converter dsRNAs longos ou RNAs em forma de grampo pequenos (shRNAs) em siRNAs. Esses precursores ou moléculas de siRNA finais podem ser produzidos de modo exógeno (artificialmente) e podem ser, então, introduzidos nas células de vertebrado por vários métodos de transfecção. De acordo com uma modalidade adicional, o composto de indução de RNAi é expresso por um vetor que é transfectado na célula de vertebrado. Para siRNA, isso pode ser feito, por exemplo, pela introdução de um laço entre as duas fitas, produzindo, assim, um único transcrito, que pode ser, então, processado em um siRNA funcional na célula de vertebrado. Tais cassetes de transcrição tipicamente usam um promotor de RNA polimerase III (por exemplo, U6 ou H1) que usualmente direciona a transcrição de RNAs nucleares pequenas (por exemplo, para expressar shRNAs). Assume-se que o transcrito de shRNA resultante do vetor seja, então, processado por dicer, produzindo, assim, as moléculas de siRNA com fita dupla, que têm, de preferência, as projeções de 3’ características. De acordo com uma modalidade, tal vetor de fornecimento de shRNA é estavelmente integrado no genoma da célula de vertebrado. Essa modalidade é vantajosa visto que a regulação descendente do gene de matriptase se deve ao siRNA produzido de modo constante, de preferência estável e não temporário. Por exemplo, as células que compreendem o respectivo vetor de fornecimento de shRNA podem ser, então, transfectadas com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse que deve ser expresso e secretado pela célula de vertebrado. Além disso, estratégias de cotransfecção podem ser usadas, em que o vetor que gera o shRNA é cotransfectado com o vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse.

[0050] O silenciamento de gene transcricional pode incluir, por exemplo, modificações epigenéticas. Além disso, a sequência do gene de matriptase pode ser alterada para reduzir a meia-vida do mRNA. Isso pode também atingir uma redução na expressão funcional da matriptase.

[0051] De acordo com uma modalidade, a expressão de matriptase é reduzida ou eliminada alvejando-se um elemento regulador envolvido na regulação da expressão do gene de matriptase. Por exemplo, um fator de transcrição, promotor (consultar também acima), intensificador, UTRs ou outro elemento regulador pode ser alvejado, por exemplo, por knockout, deleção, mutação, regulação descendente ou qualquer outra alteração que inative ou reduza a atividade do dito elemento regulador, impedindo ou reduzindo, assim, a expressão funcional do gene de matriptase e enfraquecendo, assim, o efeito da matriptase nas ditas células.

[0052] De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é alterada para enfraquecer a função da matriptase por expressão heteróloga de uma matriptase mutante que é não ou menos funcional em relação à matriptase endógena. Nessa modalidade, a célula de vertebrado isolada compreende, adicionalmente ao polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse, um polinucleotídeo heterólogo adicional que codifica uma matriptase mutante. A matriptase mutante tem uma atividade catalítica diminuída ou até mesmo nula em comparação à matriptase endógena. Expressando-se excessivamente uma respectiva matriptase mutante, a probabilidade é aumentada de que a forma inativa mutante seja inserida na membrana plasmática em vez da matriptase endógena, a fim de criar um fenótipo negativo dominante. Uma opção adicional para enfraquecer e, portanto, reduzir o efeito da matriptase que é normalmente expressa pela célula é a expressão heteróloga de uma proteína, tal como um anticorpo ou um inibidor de matriptase, que neutraliza e/ou inibe a matriptase e, portanto, enfraquece o efeito da matriptase.

[0053] De acordo com uma modalidade, o efeito da matriptase é enfraquecido na célula alterando-se a expressão funcional das moléculas que interagem funcionalmente com a matriptase na célula.

[0054] De acordo com uma modalidade, a função da matriptase é enfraquecida na célula enfraquecendo-se o tráfego intracelular da matriptase.

[0055] De acordo com outra modalidade, a função da matriptase é enfraquecida enfraquecendo-se a ativação do zimogênio de matriptase. De acordo com uma modalidade, a função da matriptase é enfraquecida por regulação ascendente de um ou mais inibidores de matriptase celular endógena e/ou por coexpressão de um inibidor de matriptase. Diversos inibidores endógenos da matriptase foram descritos até o momento em diferentes células de vertebrado, tal como HAI-1, HAI-2, antitripsina alfa1, antiplasmina alfa2, antitrombina (consultar a análise por Chen et al, 2012). Se expressa pela célula de vertebrado a ser alterada, uma regulação ascendente da expressão desses inibidores e/ou uma coexpressão desses inibidores pode também enfraquecer a função da protease matriptase endógena, reduzindo, assim, o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular.

[0056] De acordo com uma modalidade, a expressão funcional da matriptase é enfraquecida por expressão recombinante de um antagonista, tal como um anticorpo ou um domínio de ligação do mesmo. Por exemplo, um respectivo antagonista pode ser superexpresso pela célula de vertebrado.

[0057] De acordo com uma modalidade, a sequência de codificação da matriptase é alterada de modo que a proteína permaneça no ER. Por exemplo, a proteína matriptase pode ser alterada para inclui um motivo KDEL que tem o efeito de que a matriptase permanece no ER. Abordagens similares podem ser também usadas.

[0058] Enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena resulta em uma célula alterada, em que o corte do polipeptídeo recombinante de interesse que é expresso e secretado pela dita célula alterada é reduzido ou até mesmo ausente em comparação a uma célula de vertebrado correspondente em que a função da protease matriptase endógena não está enfraquecida. Conforme descrito no presente documento, ao usar células respectivamente alteradas em que o efeito da matriptase está enfraquecido como células hospedeiras para expressão recombinante, a matriptase não ou menos funcional está ativa no meio de cultura celular contendo as ditas células hospedeiras e em que o polipeptídeo de interesse é secretado.

[0059] De acordo com uma modalidade, a expressão do gene de matriptase é 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 12,5% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 2,5% ou menos, 1,5% ou menos, 1% ou menos ou 0,05% ou menos em comparação à expressão do gene de matriptase em uma célula de vertebrado de referência correspondente inalterada em que o efeito da matriptase não está enfraquecido (definido como 100%). De acordo com uma modalidade, na célula alterada de acordo com o primeiro aspecto, a expressão do gene de matriptase é 0,1% ou menos, ou menos, 0,075% ou menos, 0,05% ou menos, 0,045% ou menos, 0,04% ou menos, 0,035% ou menos, 0,03% ou menos, 0,025% ou menos, 0,02% ou menos, 0,015% ou menos, 0,01% ou menos, 0,0075% ou menos, 0,005% ou menos, 0,0045% ou menos, 0,004% ou menos, 0,0035% ou menos, 0,003% ou menos, 0,0025% ou menos, 0,002% ou menos, 0,0015% ou menos ou 0,001% ou menos em comparação à expressão do 18S RNA (definido como 100%) na dita célula. De acordo com uma modalidade, a expressão do gene de matriptase é 0,00075% ou menos, 0,0005% ou menos ou 0,0004% ou menos em comparação à expressão do 18S RNA (definido como 100%) na dita célula. A expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada, de modo que o corte de um polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado pela dita célula no meio de cultura celular seja reduzido em comparação a uma célula de vertebrado de referência correspondente (da qual a célula alterada derivou), em que a expressão funcional do gene de matriptase não é reduzida ou eliminada. Por exemplo, uma célula CHO alterada em que a expressão funcional da matriptase é reduzida é comparada a uma célula CHO do tipo selvagem como a célula de vertebrado de referência a fim de analisar a dita característica. Como polipeptídeo de teste, um polipeptídeo que é propenso a corte quando expresso pela célula de vertebrado de referência é usado. De acordo com uma modalidade, o corte é reduzido em pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes ou pelo menos 10 vezes em comparação a uma célula de vertebrado de referência correspondente em que a expressão funcional do gene de matriptase não é reduzida ou eliminada. Isso pode ser testado com o uso, por exemplo, dos ensaios descritos nos exemplos.

[0060] A célula de vertebrado alterada é derivada de uma espécie e um tipo de célula que expressam de modo endógeno a matriptase. A célula de vertebrado, de preferência, é uma célula de mamífero. Assim, todas as modalidades descritas no presente documento para uma célula de vertebrado em geral se aplicam e se referem especificamente à modalidade preferencial em que uma célula de mamífero é usada. O termo "isolado" é meramente usado para deixar claro que a célula de vertebrado não está contida em um organismo vivo, tal como um animal ou ser humano. Conforme descrito no presente documento, a célula de vertebrado pode ser fornecida na forma de uma cultura celular, linhagem de células, clone de célula e similares. Os exemplos são também descritos abaixo. Conforme é descrito acima, a dita célula de vertebrado é alterada para enfraquecer o efeito da matriptase em comparação a uma célula de vertebrado inalterada correspondente que expressa de modo endógeno a matriptase. O enfraquecimento é, de preferência, atingido reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase. As modalidades são descritas acima. A fim de fornecer uma linhagem de células de produção com características estáveis, uniformes e, assim, previsíveis, é preferencial alterar o genoma da célula de vertebrado para atingir enfraquecimento de matriptase. As modalidades adequadas são descritas acima. A célula de vertebrado respectivamente alterada pode ser, então, transfectada com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse para fornecer as células hospedeiras de acordo com a presente revelação que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse e que secretam o polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular. A célula de vertebrado, de preferência, é uma célula de mamífero e pode ser, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste em células de roedor, células de ser humano e células de macaco. As células de vertebrado preferenciais são células de roedor, tal como, por exemplo, células derivadas de hamster ou camundongo. A célula de roedor pode ser uma linhagem de células selecionada a partir do grupo que consiste em uma linhagem de células de hamster chinês (tal como, por exemplo, uma linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)), uma linhagem de células BHK, uma linhagem de células NS0, uma linhagem de células C127, uma linhagem de células de fibroblasto 3T3 de camundongo e uma linhagem de células SP2/0. É particularmente preferencial uma célula CHO, tal como uma célula CHO derivada de CHO-K1. Conforme é mostrado nos exemplos, reduzir ou eliminar a expressão funcional da matriptase em uma célula CHO fornece um meio de cultura celular condicionado em que o corte do polipeptídeo de interesse secretado é significativamente diminuído ou mesmo eliminado. A matriptase é também expressa em células de ser humano. Assim, de acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é derivada de uma célula de ser humano, que pode ser, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula HEK293, uma célula MCF-7, uma célula PerC6, uma célula CAP, células hematopoiéticas e uma célula HeLa. Outra alternativa são células de macaco, que, por exemplo, podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em células COS, COS-1, uma célula a COS-7 e uma célula Vero. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é fornecida como um clone de célula, uma linhagem de células ou uma cultura celular.

[0061] O "polipeptídeo de interesse" é o polipeptídeo recombinante que se supõe que seja expresso e secretado pela célula de vertebrado em grande quantidade. O polipeptídeo de interesse é codificado por um polinucleotídeo heterólogo compreendido na dita célula. A dita célula hospedeira pode compreender mais de um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse. O polipeptídeo de interesse é secretado pela célula de vertebrado no meio de cultura celular do qual o mesmo pode ser coletado, por exemplo, isolado e purificado.

[0062] Um "polinucleotídeo heterólogo" ou "ácido nucleico heterólogo" e expressões similares usadas no presente documento em particular se referem a uma sequência de polinucleotídeos que foi introduzida na célula de vertebrado, por exemplo, pelo uso de técnicas recombinantes, tal como transfecção. Um "polinucleotídeo" em particular refere-se a um polímero de nucleotídeos que estão usualmente ligados de uma desoxirribose ou ribose a outra e refere-se a DNA assim como RNA, dependendo do contexto. O termo "polinucleotídeo" não compreende quaisquer restrições de tamanho.

[0063] A célula de vertebrado pode compreender um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável e/ou um polinucleotídeo heterólogo que codifica um repórter adicionalmente ao pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse. Isso simplifica a seleção de células hospedeiras que são transfectadas com sucesso e, assim, expressam o polipeptídeo de interesse. Além disso, a célula de vertebrado pode compreender diversos polinucleotídeos que codificam diferentes marcadores selecionáveis e/ou polipeptídeos repórter.

[0064] Um "marcador selecionável" permite, sob condições de cultivo seletivas adequadas, a seleção de células hospedeiras que expressam o dito marcador selecionável. Um marcador selecionável fornece o carreador do dito marcador sob condições seletivas com uma vantagem de sobrevivência e/ou proliferação. Tipicamente, um gene marcador selecionável a conferirá resistência a um agente de seleção, tal como um fármaco, por exemplo, um antibiótico ou agente tóxico, ou compensará um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. O mesmo pode ser um marcador de seleção positivo ou negativo. De acordo com uma modalidade, o marcador selecionável é um marcador de resistência a fármaco que codifica uma proteína que confere resistência a condições de seleção que envolvem o dito fármaco. Uma variedade de genes marcadores selecionáveis foi descrita (consultar, por exemplo, os documentos nos WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240). Por exemplo, pode ser usado pelo menos um marcador selecionável que confere resistência contra um ou mais agentes antibióticos. O marcador selecionável, de acordo com uma modalidade, pode ser um marcador selecionável amplificável. Um marcador selecionável amplificável permite a seleção de células hospedeiras contendo vetor e pode promover a amplificação de gene do dito vetor nas células hospedeiras. Os genes marcadores selecionáveis comumente usados com células de vertebrado incluem os genes para aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (hyg), di- hidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (tk), glutamina sintetase, asparagina sintetase e genes que codificam resistência a neomicina (G418), puromicina, higromicina, zeocina, ouabaina, blasticidina, histidinol D, bleomicina, fleomicina e ácido micofenólico. De acordo com uma modalidade, um receptor de folato é usado como marcador selecionável em conjunto com as células de vertebrado inovadoras descritas no presente documento (consultar, por exemplo, o documento WO2009/080759), que, de preferência, são células de mamífero. O receptor de folato pode ser também usado em combinação com DHFR como marcador selecionável conforme é descrito no documento WO10/097240. Um "polipeptídeo repórter" permite a identificação de uma célula que expressa o dito polipeptídeo repórter com base nas características de repórter (por exemplo, fluorescência). Os genes repórter usualmente não fornecem às células hospedeiras uma vantagem de sobrevivência. Entretanto, a expressão do polipeptídeo repórter pode ser usada para diferenciar entre células que expressam o polipeptídeo repórter e aquelas células que não expressam. Portanto, também um gene repórter possibilita a seleção de células hospedeiras transfectadas com sucesso. Os polipeptídeos repórter adequados incluem, porém, sem limitação, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP), YFP, CFP e luciferase. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo repórter tem características que possibilitam a seleção por citometria de fluxo.

[0065] De acordo com uma modalidade, o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse está integrado no genoma da dita célula e em que, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter está adicionalmente integrado no genoma da dita célula.

[0066] Um vetor de expressão pode ser usado para introduzir um polinucleotídeo heterólogo na célula hospedeira. Os polinucleotídeos podem ser compreendidos em um cassete de expressão. O polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica o polipeptídeo de interesse e o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter pode estar localizado em vetores de expressão iguais ou diferentes. Se estiverem localizados em vetores de expressão diferentes, os vetores de expressão são cotransfectados na célula hospedeira. Tais estratégias de cotransfecção possibilitam similarmente a seleção conforme é bem conhecido na técnica anterior. A introdução na célula de vertebrado pode ser atingida, por exemplo, transfectando-se um vetor de expressão adequado que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse nas células hospedeiras. O vetor de expressão, de preferência, se integra no genoma da célula hospedeira (transfecção estável). No caso em que o ácido nucleico heterólogo não é inserido no genoma, o ácido nucleico heterólogo pode ser perdido no estágio posterior, por exemplo, quando as células sofrem mitose (transfecção temporária). A transfecção estável é preferencial para gerar clones de célula de alta expressão para produzir um polipeptídeo de interesse em escala industrial. Isso é particularmente importante para polipeptídeos terapeuticamente ativos e diagnósticos de interesse. Diversos métodos adequados são conhecidos na técnica para introduzir um ácido nucleico heterólogo, tal como um vetor de expressão em células hospedeiras de vertebrado, que são, de preferência, células hospedeiras de mamífero, e, assim, não precisam de qualquer descrição detalhada no presente documento. Os respectivos métodos incluem, porém, sem limitação, transfecção com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, transferência de genes mediada por polímero e biobalística e similares. Além dos métodos baseados em integração aleatória tradicionais, também abordagens mediadas por recombinação podem ser usadas para transferir o polinucleotídeo heterólogo para o genoma da célula hospedeira. Como os respectivos métodos são bem conhecidos na técnica anterior, os mesmos não precisam de qualquer descrição detalhada aqui. As modalidades não limitantes de projetos de vetor adequados são também descritas subsequentemente e se referem à respectiva revelação.

[0067] Os vetores de expressão usados para atingir a expressão de um polipeptídeo de interesse na célula hospedeira usualmente contêm elementos de controle transcricional adequados para acionar a transcrição, tal como, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sinais de pausa ou término de transcrição usualmente como elemento de um cassete de expressão. Os elementos de controle de tradução adequados estão, de preferência, incluídos no vetor, tal como, por exemplo, as regiões não traduzidas 5’ que levam a estruturas de cap 5’ adequadas para recrutar ribossomas e códons de parada para terminar o processo de tradução. Os transcritos resultantes abrigam elementos funcionais de tradução que facilitam a expressão de proteína (isto é, a tradução) e término adequado da tradução. Uma unidade de expressão funcional, que tem capacidade de acionar adequadamente a expressão de um polinucleotídeo incorporado, é também referida como um "cassete de expressão". É bem conhecido pela pessoa versada como um cassete de expressão deve ser projetado a fim de permitir a expressão e a secreção de um polipeptídeo de interesse em uma célula de vertebrado.

[0068] Para atingir a secreção do polipeptídeo recombinante de interesse no meio de cultura celular, um peptídeo de iniciação adequado é fornecido no polipeptídeo de interesse. As sequências de iniciação e os projetos de cassete de expressão para atingir a secreção do polipeptídeo de interesse são bem conhecidos na técnica anterior e, portanto, não precisam ser descritos no presente documento.

[0069] Qualquer polipeptídeo de interesse pode ser expresso na célula de vertebrado de acordo com a invenção. O termo "polipeptídeo" refere-se a uma molécula que compreende um polímero de aminoácidos ligados em conjunto por uma ligação peptídica (ou ligações peptídicas). Os polipeptídeos incluem polipeptídeos de qualquer comprimento, incluindo proteínas (por exemplo, que têm mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, 2 a 49 aminoácidos). Os polipeptídeos incluem proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade, função ou tamanho, e podem incluir, por exemplo, enzimas (por exemplo, quinases, fosfatases), receptores, transportadores, proteínas bactericidas e/ou de ligação à endotoxina, polipeptídeos estruturais, polipeptídeos ligados à membrana, glicopolipeptídeos, proteínas globulares, polipeptídeos imunológicos, toxinas, antibióticos, hormônios, fatores de crescimento, fatores sanguíneos, vacinas, glicopolipeptídeos virais e similares. O polipeptídeo de interesse que é expresso de acordo com os ensinamentos descritos no presente documento pode ser também uma subunidade ou domínio de um polipeptídeo, tal como, por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo. O termo "polipeptídeo de interesse" pode se referir a tal subunidade ou domínio individual ou à proteína final que é composta pelas respectivas subunidades ou domínios, dependendo do contexto.

[0070] De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse é selecionado a partir de um polipeptídeo terapêutico ou diagnóstico. Os polipeptídeos terapêuticos e, portanto, terapeuticamente ativos, são particularmente importantes. O termo polipeptídeos terapêuticos também abrange polipeptídeos profiláticos, por exemplo, usados para vacinação. O polipeptídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em hormônios peptídicos, interleucinas, ativadores de plasminogênio de tecido, citocinas, fatores de crescimento, imunoglobulinas, em particular anticorpos ou fragmentos funcionais de anticorpo ou variantes ou derivados dos mesmos e proteínas de fusão de Fc. Em uma modalidade, o polipeptídeo de interesse é uma molécula de imunoglobulina, tal como um anticorpo. O termo "anticorpo", conforme usado no presente documento, refere-se particularmente a uma proteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves conectadas por ligações de dissulfeto. O termo "anticorpo" inclui anticorpos de ocorrência natural assim como formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos completamente humanos e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é usualmente compreendida por uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). Cada cadeia leve é usualmente compreendida por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). O termo "anticorpo", no entanto, também inclui outros tipos de anticorpos, tal como anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia pesada, isto é, anticorpos compostos apenas por uma ou mais, em particular duas, cadeias pesadas, e nanocorpos, isto é, anticorpos compostos apenas por um domínio variável monomérico único. Os nanocorpos podem estar também ligados para formar estruturas multivalentes. Conforme discutido acima, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse pode também codificar uma ou mais subunidades ou domínios de um anticorpo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo, como o polipeptídeo de interesse. As ditas subunidades ou domínios podem ser expressos a partir de cassetes de expressão iguais ou diferentes.

[0071] Um "fragmento ou derivado funcional" de um anticorpo, em particular, refere-se a um polipeptídeo que é derivado de um anticorpo e tem capacidade de ligação ao mesmo antígeno, em particular ao mesmo epítopo que o anticorpo. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo ou derivados do mesmo. Os exemplos de fragmentos ou derivados de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem na região variável e no primeiro domínio constante de cada cadeia pesada e leve; (ii) fragmentos F(ab)2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) fragmentos Fd que consistem na região variável e no primeiro domínio constante CH1 da cadeia pesada; (iv) fragmentos Fv que consistem na região variável de cadeia pesada e cadeia leve de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos scFv, fragmentos Fv que consistem em uma única cadeia de polipeptídeos; (vi) fragmentos (Fv)2 que consistem em dois fragmentos Fv ligados covalentemente juntos; (vii) um domínio variável de cadeia pesada; e (viii) multicorpos que consistem em uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve ligadas covalentemente juntas de tal maneira que a associação das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve possa apenas ocorrer de modo intermolecular, mas não intramolecular.

[0072] De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse que é expresso pela célula de vertebrado alterada é suscetível a corte por proteases. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse compreende pelo menos um sítio de corte que é reconhecido por matriptase. Foram identificados diversos polipeptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, fragmentos Fab, complexos proteicos, peptidases, peptídeos de sinalização, proteínas de fusão de Fc, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, glicopolipeptídeos virais, fatores sanguíneos e enzimas que são propensos a corte. Muitos desses polipeptídeos contêm mais de um sítio de corte e são particularmente sensíveis ao corte. Expressar um polipeptídeo que é propenso a corte como polipeptídeo de interesse em uma célula de vertebrado alterada de acordo com a presente revelação é vantajoso devido ao fato de que o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular é significativamente reduzido ou mesmo eliminado conforme é demonstrado pelos exemplos.

[0073] A célula de vertebrado pode ou não compreender um polinucleotídeo endógeno correspondente a, que é respectivamente idêntico ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado não compreende um gene endógeno correspondente ao polipeptídeo de interesse.

[0074] De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse não é ou não compreende matriptase. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse não é ou não compreende HAI-1.

[0075] O vetor de expressão da combinação de vetores de expressão que estão compreendidos na célula de vertebrado pode compreender adicionalmente elementos de vetor adicionais. Por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo adicional que codifica um produto adicional de interesse pode estar compreendido. Conforme explicado acima e conforme se torna evidente a partir dos exemplos descritos acima de polipeptídeos que podem ser expressos de acordo com os presentes ensinamentos, o polipeptídeo final que deve ser produzido e secretado pela célula hospedeira pode ser também uma proteína que é composta por diversas subunidades ou domínios individuais. Um exemplo de uma respectiva proteína é uma molécula de imunoglobulina, em particular um anticorpo que compreende, por exemplo, cadeias pesadas e leves. Há diversas opções para produzir uma respectiva proteína que é composta por diferentes subunidades ou domínios individuais e projetos de vetor adequados que são conhecidas na técnica. De acordo com uma modalidade, duas ou mais subunidades ou domínios da dita proteína são expressas a partir de um cassete de expressão. Nessa modalidade, um transcrito longo é obtido a partir do respectivo cassete de expressão que compreende as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais da proteína. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento de IRES (sítio interno de entrada ribossomal) está funcionalmente localizado entre as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais, e cada região de codificação é precedida por uma sequência de iniciação secretória. Assim, garante-se que produtos de tradução separados sejam obtidos a partir do dito transcrito e que a proteína final possa ser montada e secretada corretamente. As respectivas tecnologias são conhecidas na técnica anterior e, assim, não precisam de qualquer descrição detalhada no presente documento. Para algumas modalidades, tal como a expressão de anticorpos, é até mesmo preferencial expressar as subunidades ou domínios individuais a partir de diferentes cassetes de expressão. De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão usado para expressar o produto de interesse é um cassete de expressão monocistrônico. Todos os cassetes de expressão compreendidos no vetor de expressão ou combinação de vetores de expressão podem ser monocistrônicos. De acordo com uma modalidade, de modo correspondente, cada cassete de expressão projetado para expressar um produto de interesse compreende um polinucleotídeo que codifica uma subunidade ou domínio da proteína a ser expressa como o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, no caso de anticorpos, um cassete de expressão pode codificar a cadeia leve de um anticorpo e outro cassete de expressão pode codificar a cadeia pesada do anticorpo. Após a expressão das subunidades ou domínios individuais a partir dos cassetes de expressão individuais, a proteína final, tal como um anticorpo, é montada a partir das ditas subunidades ou domínios e secretada pela célula hospedeira. Essa modalidade é particularmente adequada para expressar moléculas de imunoglobulina, tais como anticorpos.

[0076] Conforme descrito acima, o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica o polipeptídeo de interesse e os polinucleotídeos que codificam o marcador selecionável (ou marcadores selecionáveis) e/ou polipeptídeo (ou polipeptídeos) de iniciação está de preferência compreendido em cassetes de expressão. Diversas modalidades são adequadas. Por exemplo, cada um dos ditos polinucleotídeos pode estar compreendido em um cassete de expressão separado. O mesmo é também referido como configuração monocistrônica. Entretanto, está também dentro do escopo da presente invenção que pelo menos dois dos respectivos polinucleotídeos estejam compreendidos em um cassete de expressão. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento de sítio interno de entrada ribossomal (IRES) está funcionalmente localizado entre os polinucleotídeos que são expressos a partir do mesmo cassete de expressão. As respectivas tecnologias de expressão baseadas em IRES e outros sistemas bi e policistrônicos são bem conhecidos e, assim, não precisam de descrição adicional aqui.

B. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CÉLULA DE VERTEBRADO DE ACORDO COM O PRIMEIRO ASPECTO

[0077] De acordo com um segundo aspecto, é fornecido um método para produzir uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto, em que o dito método compreende alterar uma célula de vertebrado para enfraquecer o efeito da matriptase e introduzir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse na dita célula, em que o dito polipeptídeo de interesse é então, secretado pela célula de vertebrado.

[0078] As modalidades adequadas e preferenciais para enfraquecer a função da protease matriptase endógena são descritas acima em conjunto com as células de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto e se referem à revelação acima, que também se aplica aqui. Portanto, o método pode compreender enfraquecer o efeito da matriptase, conforme descrito acima, em conjunto com as células de vertebrado alteradas de acordo com o primeiro aspecto. As modalidades não limitantes são agora novamente descritas de modo breve a seguir.

[0079] De acordo com uma modalidade, o método compreende reduzir ou eliminar a expressão funcional do gene de matriptase, enfraquecendo, assim, o efeito da matriptase. Conforme descrito acima, esse enfraquecimento tem o efeito de que quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional estão presentes na forma ativa no meio de cultura celular contendo as células alteradas, por exemplo, devido ao fato de quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional estão presentes na superfície celular e/ou são liberadas, por exemplo, disseminadas, pela célula alterada. Assim, nenhuma no ou menos matriptase está presente na forma proteoliticamente ativa no meio de cultura celular em que o polipeptídeo recombinante de interesse é secretado. Como a presente revelação mostra que a matriptase é uma protease importante responsável pelo corte do polipeptídeo de interesse secretado, essa alteração da célula reduz vantajosamente ou mesmo elimina o corte do polipeptídeo de interesse. As formas adequadas para reduzir ou eliminar a expressão funcional da matriptase são descritas acima em conjunto com as células de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto e referem-se ao mesmo. De acordo com uma modalidade, o genoma da célula de vertebrado é alterado para reduzir ou eliminar a expressão funcional do gene de matriptase. Por exemplo, um knockout de gene pode ser introduzido no gene de matriptase. De acordo com uma modalidade, tal knockout de gene é introduzido em todas as cópias do gene de matriptase. De acordo com uma modalidade, o gene de matriptase é deletado ou sofre knockout introduzindo-se uma ou mais mutações, tal como, por exemplo, mutações da fase de leitura e/ou códon de parada. Todas as cópias do gene de matriptase podem ser, respectivamente, alteradas no genoma.

[0080] De acordo com uma modalidade, as ditas uma ou mais mutações estão compreendidas em uma região de codificação do gene de matriptase e resultam em um produto de expressão não ou menos funcional. Os detalhes são descritos acima em conjunto com as células de vertebrado alteradas de acordo com o primeiro aspecto e se referem à respectiva revelação que também se aplica aqui. De acordo com uma modalidade, uma ou mais mutações são introduzidas em uma região do gene de matriptase que codifica uma sequência de aminoácidos presente em uma ou mais de uma variante de splicing cataliticamente ativa de matriptase. Diversos desses éxons de matriptase são encontrados na maioria ou mesmo em todas as variantes de splicing cataliticamente ativas. Conforme descrito acima e demonstrado nos exemplos, a sequência de polinucleotídeos do gene de matriptase que codifica o éxon 2 da matriptase é um alvo adequado para introduzir uma ou mais mutações, tal como, por exemplo, mutações da fase de leitura, devido ao fato de que o éxon 2 é expresso na maioria das variantes de splicing da matriptase e uma respectiva mutação gera um produto com expressão não ou menos funcional. Além disso, os éxons próximos ao N-terminal da matriptase, tal como o éxon 2, são alvos vantajosos para introduzir uma ou mais mutações da fase de leitura que levam à expressão de uma proteína truncada não ou menos funcional. Além disso, uma ou mais mutações podem ser introduzidas no domínio catalítico a fim de interromper a função da matriptase.

[0081] De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é uma célula de mamífero. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é uma célula de roedor. De preferência, a célula de roedor é uma célula de hamster, tal como uma célula CHO. De acordo com uma modalidade, uma célula CHO, de preferência, derivada da linhagem de células K1, é usada a fim de fornecer uma linhagem de células de vertebrado alterada, em que o efeito da protease matriptase endógena está enfraquecido, de preferência, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase.

[0082] Se o genoma da célula hospedeira for alterado para atingir o enfraquecimento, é preferencial primeiramente alterar a célula de vertebrado para enfraquecer de modo basicamente permanente o efeito e, portanto, a função da protease matriptase endógena e, então, introduzir polinucleotídeo heterólogos que codificam o polipeptídeo de interesse. No caso em que a alteração não é permanente, como é, por exemplo, o caso em que se silencia temporariamente o gene de matriptase, por exemplo, por meio de RNAi, pode-se introduzir primeiramente o polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse e, então, alterar a célula de vertebrado para enfraquecer a função da protease matriptase endógena, por exemplo, por silenciamento de gene pós-transcricional. Os métodos adequados foram descritos acima e são conhecidos pela pessoa versada. Conforme descrito acima, de acordo com uma modalidade preferencial, o genoma da célula de vertebrado é alterado para atingir o enfraquecimento. O método de acordo com o sétimo aspecto pode ser usado a fim de identificar e selecionar uma célula hospedeira em que o efeito da matriptase está enfraquecido.

[0083] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o segundo aspecto compreende, ainda, introduzir em uma célula de vertebrado, que é alterada de modo que a expressão funcional do gene de matriptase seja reduzida ou eliminada, pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e, de preferência, pelo menos um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável. De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e o polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável estão localizados em vetores de expressão iguais ou diferentes. As modalidades adequadas e preferenciais são descritas acima e se referem à respectiva revelação, que também se aplica aqui. A introdução pode ser atingida por transfecção, em que a transfecção estável é preferencial. Uma célula hospedeira de vertebrado que expressa com sucesso o polipeptídeo de interesse pode ser selecionada com o uso, por exemplo, do método de acordo com o quinto aspecto. O mesmo é referido na revelação subsequente.

C. MÉTODOS PARA PRODUZIR DE MODO RECOMBINANTE UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE

[0084] De acordo com um terceiro aspecto, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende utilizar uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto como a célula hospedeira para expressão recombinante do polipeptídeo de interesse. Conforme descrito acima, devido ao nível diminuído de degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular que é atingido ao usar essas células de vertebrado inovadoras para expressão recombinante, essas células de vertebrado inovadoras, que, de preferência, são células de mamífero, são particularmente adequadas como células hospedeiras para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse. Os exemplos adequados e preferenciais da célula hospedeira de vertebrado, que é alterada para enfraquecer o efeito da matriptase, de preferência, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase, assim como exemplos adequados e preferenciais do polipeptídeo de interesse são descritos em detalhes acima e se referem à revelação acima, que também se aplica aqui.

[0085] De acordo com uma modalidade, o método compreende introduzir em uma célula hospedeira de vertebrado, que é alterada de modo que o efeito da protease matriptase endógena seja enfraquecido, pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e selecionar uma célula hospedeira de vertebrado que expressa de modo recombinante o polipeptídeo de interesse. A introdução pode ser atingida por transfecção, como é bem conhecido e também descrito no presente documento. A seleção pode ocorrer com o uso do método de acordo com o primeiro aspecto da presente revelação. De preferência, são selecionadas células hospedeiras em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse está estavelmente integrado no genoma da célula hospedeira.

[0086] De acordo com uma modalidade, o método compreende: (a) cultivar células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto sob condições que permitem a expressão e a secreção do polipeptídeo de interesse; (b) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular; e (c) processar opcionalmente o polipeptídeo de interesse isolado.

[0087] Portanto, como modalidade preferencial do método de acordo com o terceiro aspecto, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende (a) cultivar células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto sob condições que permitem a expressão e a secreção do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular; (d) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular; e (e) processar opcionalmente o polipeptídeo de interesse isolado.

[0088] As ditas células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições isentas de soro. O polipeptídeo é expresso e secretado no meio de cultura e pode ser obtido a partir do mesmo. Para o propósito de secreção, um peptídeo de iniciação adequado é fornecido de modo que o polipeptídeo de interesse seja secretado. As sequências de iniciação e os projetos de cassete de expressão para atingir a secreção são bem conhecidos na técnica anterior e, portanto, não precisam ser descritos no presente documento.

[0089] Conforme descrito acima, ao usar as células de vertebrado alteradas de acordo com o primeiro aspecto para produção de células hospedeiras, quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional são eficazes no meio de cultura celular que contém tais células, segundo o qual a degradação proteolítica do polipeptídeo recombinante de interesse que é secretado no mesmo meio de cultura celular é significativamente reduzida ou é mesmo completamente evitada. Isso se deve ao fato de que foi surpreendentemente concluído que, dentre as centenas de diferentes proteases expressas pelas células de vertebrado, a matriptase é a protease chave que causa o corte de polipeptídeos expressos de modo recombinante no meio de cultura celular. Portanto, ao usar as células hospedeiras de vertebrado inovadoras de acordo com a presente revelação como células hospedeiras e produção, não é necessário realizar medidas adicionais para reduzir ou evitar a degradação proteolítica e, portanto, o corte do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular. Portanto, de acordo com uma modalidade, nenhum inibidor de protease é adicionado ao meio de cultura celular. De acordo com uma modalidade, a temperatura de cultivo não é abaixada para reduzir a atividade proteolítica no meio de cultura celular. A presente revelação abrange métodos em que o polipeptídeo de interesse é remanipulado para remover um ou mais motivos propensos a corte por proteases. Entretanto, de acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse não é remanipulado a fim de remover um ou mais motivos de aminoácido que são propensos a corte por matriptase a fim de reduzir ou impedir o corte. De acordo com essa modalidade, uma respectiva reengenharia pode ser realizada se desejado a fim de remover um ou mais motivos de aminoácido que são propensos a corte por uma protease diferente da matriptase. Entretanto, de acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse não é remanipulado de qualquer modo a fim de remover um ou mais motivos de aminoácido que são propensos a corte por uma protease a fim de reduzir ou impedir o corte. Conforme é mostrado pelos exemplos, o corte é reduzido de modo eficaz ou mesmo completamente eliminado ao usar as células alteradas descritas no presente documento de modo que a respectiva reengenharia abordada se torne basicamente obsoleta.

[0090] Os exemplos de polipeptídeos de interesse que podem ser produzidos com a célula de vertebrado alterada são descritos acima em conjunto com o primeiro aspecto da invenção e se referem à respectiva revelação, que também se aplica aqui. De acordo com uma modalidade, o método de produção é usado para produzir um polipeptídeo de interesse que tem uma ou mais das seguintes características: a) é um polipeptídeo terapêutico ou diagnóstico; b) é suscetível a corte por proteases; c) compreende pelo menos um sítio de corte para matriptase; d) é um glicopolipeptídeo; e) é selecionada a partir do grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, fragmentos Fab, complexos proteicos, peptidases, peptídeos de sinalização, proteínas de fusão de Fc, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas; f) não é ou não compreende matriptase; e/ou g) não é ou não compreende HAI-1.

[0091] O polipeptídeo de interesse que é produzido é isolado do meio de cultura celular e, ainda, processado adicionalmente pelos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutritivo por procedimentos convencionais, incluindo, porém, sem limitação, centrifugação, filtração, ultrafiltração, extração ou precipitação. Etapas de processamento adicionais, tais como etapas de purificação, podem ser realizadas por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, porém, sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, cromatografia de proteína A ou proteína G e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio) ou extração. Além disso, o polipeptídeo isolado e purificado de interesse pode ser, ainda, processado, tal como, por exemplo, modificado e/ou formulado em uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica.

[0092] De acordo com um quarto aspecto, é fornecido um método para produzir de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende: (a) cultivar células hospedeiras de vertebrado que compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse sob condições que permite a expressão e a secreção do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular, em que o meio de cultura celular compreende um inibidor de protease que é seletivo para matriptase; (b) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular; e (c) processar opcionalmente o polipeptídeo de interesse isolado.

[0093] O método de acordo com o quarto aspecto é também baseado na conclusão importante descrita no presente documento de que a matriptase é a protease chave responsável pela degradação proteolítica do polipeptídeo recombinante de interesse secretado no meio de cultura celular. No método de acordo com o quarto aspecto, a degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular, também referida como "corte" (consultar acima) é evitada adicionando-se um inibidor de protease que é seletivo para matriptase ao meio de cultura celular. Um inibidor de protease que é seletivo para matriptase é também referido no presente documento como inibidor seletivo de matriptase. Obviamente, também mais de um inibidor seletivo de matriptase pode ser adicionado. Conforme é demonstrado pelo Exemplo 4, adicionar um inibidor seletivo de matriptase ao meio de cultura celular permite reduzir significativamente ou mesmo abolir o corte do polipeptídeo de interesse mesmo quando são usadas células de vertebrado que expressam normalmente a matriptase. Assim, essa modalidade permite o uso de células de vertebrado inalteradas, em que, de modo correspondente, o efeito da matriptase não é enfraquecido devido ao fato de que o enfraquecimento é atingido no meio de cultura celular.

[0094] O inibidor seletivo de matriptase presente no meio de cultura celular leva a uma diminuição ou abolição da atividade proteolítica da matriptase no meio de cultura celular. O inibidor de matriptase pode ser, por exemplo, um inibidor competitivo que compete com o substrato quanto ao sítio ativo da matriptase ou um inibidor alostérico que modifica a estrutura da matriptase para reduzir sua atividade. Um inibidor de matriptase é considerado seletivo se sua atividade inibitória contra matriptase for mais alta que sua atividade inibitória contra outras serina proteases, em particular outras serina proteases transmembrânicas do tipo II.

[0095] O inibidor seletivo de matriptase pode ser de qualquer tipo contanto que não mostre efeitos nocivos sobre a célula hospedeira que é usada para produzir o polipeptídeo recombinante de interesse. O inibidor seletivo de matriptase pode ser selecionado dentre i) inibidores biológicos de matriptase que incluem, porém, sem limitação, inibidores de matriptase seletivos derivados de anticorpo ou à base de anticorpo, peptídeos ou proteínas ii) inibidores químicos de matriptase, tais como moléculas pequenas.

[0096] De acordo com uma modalidade, o inibidor seletivo de matriptase é pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes ou pelo menos 250 vezes mais seletivo e, assim, específico para matriptase do que outras proteases. Entretanto, a seletividade pode ser também substancialmente mais alta, tal como, por exemplo, pelo menos 500 vezes, pelo menos 5000 vezes, pelo menos 10.000 vezes, pelo menos 50.000 vezes, pelo menos 500.000 vezes e pelo menos 5.000.000 vezes. As faixas incluem, porém, sem limitação, 5 vezes a 10.000.000 vezes, 10 vezes a 5.000.000 vezes, 25 vezes a 1.000.000 vezes, 50 vezes a 5.000.000 vezes. Uma seletividade mais alta de, por exemplo, pelo menos 5.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes e mais alta, pode ser atingida, por exemplo, com inibidores biológicos seletivos de matriptase, tal como, por exemplo, anticorpos específicos de matriptase ou fragmentos Fab.

[0097] A seletividade pode ser determinada, por exemplo, com base no valor ki, que é, para um inibidor seletivo de matriptase, mais baixo que para outras proteases testadas. De acordo com uma modalidade, o inibidor de matriptase inibe matriptase seletiva com um valor ki de 200 nM ou menos, 150 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 25 nM ou menos, 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 10 nM ou menos, 7,5 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2,5 nm ou menos, 1 nM ou menos ou 0,75 nM ou menos.

[0098] Conforme mencionado acima, diversos inibidores seletivos de matriptase são descritos na técnica anterior. Por exemplo, Faraday et al descreve diferentes inibidores seletivos de matriptase à base de anticorpo, a saber, um fragmento Fab (Farady et al., 2008 J.Mol.Biol. (2008) 380, 351 a 360) e dois inibidores de anticorpo scFv (J Mol Biol. 15 de junho de 200715; 369 (4): 1.041 a 1.051). Os inibidores de anticorpo de fragmento variável de cadeia única (scFv) E2 e S4 com valores Ki de 12 pM e 160 pM foram descritos como particularmente seletivos. Um inibidor seletivo de matriptase à base de anticorpo pode ser ativo contra matriptase derivada de diferentes espécies. Conforme é demonstrado pelo Exemplo 4, por exemplo, o fragmento Fab contra matriptase humana foi também eficaz contra matriptase derivada de camundongo e hamster. Entretanto, os respectivos inibidores seletivos de matriptase à base de anticorpo podem ser também gerados contra a matriptase específica expressa pela célula hospedeira considerada para garantir um efeito inibitório máximo e permitir o uso de concentrações mais baixas do inibidor seletivo de matriptase no meio de cultura celular. Além disso, os anticorpos específicos para o sítio catalítico da matriptase foram descritos (US 2006/171884 A1). Os inibidores seletivos de matriptase de molécula peptomimética, tal como as moléculas do tipo 3-amidinofenil-alanina CJ-730 e CJ-697, têm valores ki para matriptase de 46 nM e 26 nM, respectivamente (descrito em Forbs et al. International Journal of Oncology 27: 1.061 a 1.070, 2005). Conforme é descrito em Forbs, a adição desses compostos à cultura celular de linhagens de células tumorais reduz a atividade de matriptase significativamente sem influenciar a proliferação das células. Os inibidores seletivos de matriptase são também descritos em Steinmetzer et al, J. Med. Chem. 2006, 49, 4.116 a 4.126 e Goswami et al, ACS Med. Chem. Lett., 2013 4 (12) páginas 1.152 a 1.157. Além disso, as variantes estruturais da eglina c, uma proteína monomérica pequena que é um inibidor de serina protease, foram identificadas como os respectivos inibidores de matriptase (Desilets et al. FEBS Letters 580 (2006) 2.227 a 2.232). Aqui, em um ensaio de triagem, diferentes variantes estruturais de eglina c foram criadas e testadas quanto à sua especificidade para matriptase. Uma única troca de aminoácido (L45R) no laço de sítio reativo torna eglina c matriptase específica (ki = 18 nM). Assim, são conhecidos muitos inibidores seletivos de matriptase que podem ser usados para o propósito da presente revelação a fim de inibir seletivamente a matriptase no meio de cultura celular, reduzindo ou impedindo, assim, o corte do polipeptídeo de interesse que é concomitantemente expresso e secretado no meio de cultura celular pela célula hospedeira de vertebrado.

[0099] Para enfraquecer o efeito da matriptase no meio de cultura celular, o inibidor seletivo de matriptase pode ser adicionado ao meio de cultura celular em que as células hospedeiras de expressão são cultivadas. A concentração de um inibidor seletivo de matriptase individual exigida para atingir inibição de matriptase suficiente no meio de cultura celular de modo que a degradação proteolítica do polipeptídeo de interesse seja reduzida pode ser determinada com base nos experimentos de rotina. O inibidor seletivo de matriptase pode ser adicionado ao meio de cultura celular antes ou após a adição das células hospedeiras. De acordo com uma modalidade, o inibidor seletivo de matriptase é adicionado no início do cultivo celular. De acordo com uma modalidade, o inibidor seletivo de matriptase é adicionado em um ponto no tempo em que as células hospedeiras começam a secreção do polipeptídeo de interesse. O inibidor seletivo de matriptase pode ser adicionado continuamente. Por exemplo, em cultivo em batelada- alimentada, o inibidor seletivo de matriptase pode estar incluído na alimentação.

[00100] Os detalhes em relação ao polipeptídeo de interesse, ao isolamento do polipeptídeo de interesse do meio de cultura celular assim como ao processamento subsequente são descritos acima, por exemplo, em conjunto com o método de acordo com o terceiro aspecto e se referem à revelação acima, que também se aplica aqui.

[00101] Considerando-se o volume de cultura celular exigido para produção em grande escala, quantidades grandes do (um ou mais) inibidor seletivo de matriptase precisam ser adicionadas ao meio de cultura celular mesmo se um inibidor de matriptase com uma alta seletividade for usado afim de reduzir ou impedir eficazmente o corte do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular. Isso pode ser dispendioso. Adicionalmente, para muitos polipeptídeos de interesse, tais como produtos biofarmacêuticos, o inibidor seletivo de matriptase adicionado precisa ser eliminado durante o isolamento e a purificação subsequentes do polipeptídeo de interesse para evitar contaminações do polipeptídeo final de interesse com o inibidor de matriptase. Tal etapa de remoção pode compreender qualquer etapa de purificação conhecida, tal como cromatografia por troca iônica, afinidade, exclusão de tamanho ou fase reversa. O método elegível de remoção depende do tipo de inibidor seletivo de matriptase usado. Como tais etapas podem ser trabalhosas e podem aumentar o custo, o método de acordo com o terceiro aspecto que envolve o uso de células de vertebrado alteradas de acordo com o primeiro aspecto é preferencial.

D. MÉTODO DE SELEÇÃO

[00102] De acordo com um quinto aspecto, é fornecido um método para selecionar uma célula hospedeira que expressa de modo recombinante um polipeptídeo de interesse que compreende: (a) fornecer células de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto da invenção como células hospedeiras; e (b) selecionar uma ou mais células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de interesse.

[00103] As células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto, incluindo modalidades adequadas e preferenciais, assim como suas vantagens, são descritas em detalhes acima e se referem à respectiva revelação, que também se aplica aqui. De preferência, a célula de vertebrado é uma célula de mamífero. De acordo com uma modalidade, o estágio (a) do método de seleção de acordo com o quinto aspecto compreende transfectar células de vertebrado, que são aletradas para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena com pelo menos um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse, para fornecer as células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto. De acordo com uma modalidade, as células não compreendem um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse antes da transfecção do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse a ser expresso e secretado pela célula hospedeira. Conforme descrito, as células de mamífero são, de preferência, usadas como células hospedeiras de vertebrado. O polinucleotídeo que codifica o produto de interesse pode estar compreendido pode estar compreendido em um vetor de expressão que é, então, transfectado na célula de vertebrado.

[00104] De acordo com uma modalidade, as ditas células hospedeiras fornecidas no estágio (a) compreendem adicionalmente pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável, e o estágio (b) compreende cultivar a dita pluralidade de células hospedeiras sob condições seletivas para o marcador selecionável. O estágio de seleção (b) pode ser um processo de seleção com múltiplas etapas que compreende diversas etapas de seleção a fim de selecionar e, assim, identificar células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de interesse. Assim, de acordo com uma modalidade, o estágio de seleção (b) pode compreender diversas etapas de seleção. Por exemplo, o estágio (b) pode incluir uma ou mais etapas de seleção para selecionar células que foram transfectadas com sucesso, assim como uma ou mais etapas de seleção subsequentes para selecionar células de alta expressão a partir do agrupamento de células transfectadas com sucesso. A estratégia de seleção adequada depende do projeto do vetor de expressão que é usado para introduzir o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse e, em particular, depende do marcador (ou marcadores) de seleção e/ou repórter (ou repórteres) usado. As modalidades não limitantes serão descritas a seguir.

[00105] Conforme descrito acima, as células hospedeiras de vertebrado podem compreender pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável. O polinucleotídeo que codifica o marcador selecionável pode ser introduzido na célula hospedeira juntamente com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse com o uso de um vetor de expressão cotransfectado igual ou diferente. O estágio (b), então, compreende cultivar a dita pluralidade de células hospedeiras sob condições que fornecem uma pressão de seleção às células hospedeiras para selecionar células hospedeiras transfectadas com sucesso, por exemplo, com o uso de um meio de seleção adequado. Conforme usado no presente documento, um "meio de seleção", em particular, refere-se a um meio de cultura celular útil para a seleção de células hospedeiras que expressam o marcador selecionável. O mesmo pode incluir, por exemplo, um agente de seleção, tal como um agente tóxico que permite selecionar células hospedeiras transfectadas com sucesso. Alternativamente, um composto essencial pode estar ausente ou sua concentração pode ser reduzida no meio de seleção. De acordo com uma modalidade, as células hospedeiras que não foram transfectadas com sucesso e, portanto, não expressam o marcador selecionável (ou marcadores selecionáveis) ou em que a expressão é baixa podem não proliferar ou morrem sob as condições de cultivo seletivo. Em contraste, as células hospedeiras que foram transfectadas com sucesso com o vetor (ou vetores) de expressão e que expressam o marcador (ou marcadores) de seleção (e, de modo correspondente, o polipeptídeo de interesse cointroduzido) com rendimento suficiente são resistentes à ou são menos afetadas pela pressão de seleção e, portanto, podem proliferar, superando, assim, as células hospedeiras que não foram transfectadas com sucesso ou em que o sítio de integração no genoma da célula não é favorável. O marcador selecionável pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em marcadores de resistência a antibióticos, marcadores de resistência a fármacos e marcadores metabólicos. Os exemplos adequados para marcadores selecionáveis e princípios de seleção são descritos acima em conjunto com o primeiro aspecto, e as condições de seleção adequadas para os marcadores selecionáveis individuais são também bem conhecidas pela pessoa versada. Conforme descrito acima, alternativa ou adicionalmente, uma seleção baseada em polipeptídeo repórter pode ser realizada.

[00106] De acordo com uma modalidade, as células de vertebrado fornecidas no estágio (a) são células de mamífero. De acordo com uma modalidade, as células de mamífero são células de roedor, de preferência, células de hamster, tais como células CHO. As modalidades adequadas e preferenciais são descritas acima em conjunto com o primeiro aspecto e referem-se à revelação acima. As modalidades preferenciais adicionais, em particular em relação às células hospedeiras de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto, o vetor de expressão ou a combinação de vetores de expressão são similarmente descritos em detalhes acima. O mesmo é referido na revelação acima.

[00107] As células obtidas como resultado do método de seleção de acordo com o quinto aspecto podem ser isoladas e cultivadas como células individuais. É, no entanto, também possível usar uma população enriquecida de células hospedeiras geneticamente diferentes, isto é, um agrupamento de células, no processo a jusante. As células hospedeiras obtidas podem ser também submetidas à análise qualitativa ou quantitativa adicional, ou podem ser usadas, por exemplo, no desenvolvimento de uma linhagem de células clonais para produção de proteína. Uma linhagem de células clonais pode ser estabelecida a partir de uma célula hospedeira selecionada que expressa estavelmente o polipeptídeo de interesse com alto rendimento.

[00108] De acordo com uma modalidade, as células selecionadas são cultivadas para fornecer clones de células, em particular na forma de culturas de células clonais. Uma cultura de células clonais é uma cultura celular derivada de uma única célula ancestral. Em uma cultura de células clonais, todas as células são clones umas das outras. De preferência, todas as células em uma cultura celular contêm as mesmas ou substancialmente as mesmas informações genéticas. Em certas modalidades, a quantidade ou a concentração do polipeptídeo de interesse na cultura celular é determinada para avaliar a produtividade. Por exemplo, o título pode ser medido analisando-se o sobrenadante de cultura. Além disso, um estudo de estabilidade pode ser realizado com os clones de célula obtidos.

E. USO DE CÉLULAS DE VERTEBRADO ALTERADAS PARA PRODUÇÃO RECOMBINANTE

[00109] De acordo com um sexto aspecto, é fornecido o uso de uma célula de vertebrado para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que é secretado da célula de vertebrado, em que a célula usada é alterada para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena. De acordo com uma modalidade do sexto aspecto, o efeito da matriptase e enfraquecido conforme é descrito em detalhes acima em conjunto com o primeiro aspecto, de preferência, reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase conforme é descrito acima em mais detalhes. A célula de vertebrado é, de preferência, uma célula de mamífero. Assim, de acordo com uma modalidade, o efeito da protease matriptase endógena é enfraquecido conforme descrito acima em conjunto com as células de vertebrado alteradas de acordo com o primeiro aspecto. De acordo com uma modalidade, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse é introduzido na dita célula. Após a introdução, é fornecida uma célula de vertebrado que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse que é, então, secretado a partir da célula de vertebrado no meio de cultura celular. Assim, o uso pode compreender introduzir um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse na dita célula de vertebrado, em que o dito polipeptídeo de interesse é secretado pela célula de vertebrado. Os detalhes em relação ao polipeptídeo de interesse são similarmente descritos em detalhes acima e se referem à respectiva revelação, que também se aplica aqui. Os métodos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula de vertebrado são conhecidos pela pessoa versada e são também descritos brevemente acima.

[00110] De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado não compreende um polipeptídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse antes de introduzir o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse a ser expresso. De acordo com uma modalidade, a dita célula adicionalmente não compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável e/ou um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo repórter. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado não compreende qualquer polinucleotídeo heterólogo antes da introdução do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse. Uma respectiva célula de vertebrado "vazia" que é alterada para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena pode ser usada, por exemplo, como linhagem de células de clonagem para tecnologias de produção recombinante. Uma respectiva linhagem de células pode ser transfectada com um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse, por exemplo, com o uso de um vetor de expressão adequado. Tais células de vertebrado "vazias" que ainda não expressam e secretam um produto recombinante pode, assim, ser transfectadas com diferentes vetores de expressão, dependendo do polipeptídeo de interesse desejado que se supões ser produzido de modo recombinante. Assim, tal linhagem de células de vertebrado pode ser usada para diferentes projetos, isto é, para a produção de diferentes polipeptídeos de interesse. De acordo com uma modalidade, a célula de vertebrado é uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto. Os detalhes são descritos acima e referem-se à revelação acima.

F. MÉTODO PARA SELECIONAR CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE VERTEBRADO COM FUNÇÃO DE MATRIPTASE ENFRAQUECIDA

[00111] De acordo com um sétimo aspecto, a presente revelação refere-se a um método para selecionar uma célula de vertebrado para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que compreende analisar se a protease matriptase endógena é expressa funcionalmente na célula de vertebrado e selecionar uma célula de vertebrado em que o efeito de tal matriptase endógena é enfraquecido para produção recombinante do polipeptídeo de interesse. Esse processo de seleção permite identificar uma célula hospedeira que tem capacidade para expressar e secretar um polipeptídeo recombinante de interesse, em que o corte do polipeptídeo de interesse secretado no meio de cultura celular é reduzido. As respectivas células hospedeiras são particularmente adequadas para a produção recombinante.

[00112] Esse método analítico pode ser vantajosamente usado, por exemplo, em combinação com o método de acordo com o segundo aspecto da presente revelação a fim de identificar se foi produzida uma célula de vertebrado em que o efeito do gene de matriptase foi enfraquecido. De acordo com uma modalidade preferencial, o método compreende analisar se a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada das ditas células. As modalidades não limitantes são descritas a seguir. Qual método analítico é adequado também depende de como as células são alteradas para atingir uma redução ou eliminação da expressão funcional da matriptase.

[00113] Por exemplo, ao introduzir um knockout de gene no gene de matriptase a fim de reduzir ou eliminar a expressão funcional de matriptase, pode-se amplificar a seção de DNA correspondente e sequenciar o DNA amplificado a fim de confirmar que o knockout de gene foi introduzido no gene de matriptase. A introdução de uma ou mais mutações pode ser detectada, por exemplo, por sequenciamento. Se a expressão funcional da matriptase for reduzida ou eliminada deletando-se completa ou parcialmente o dito gene, pode-se detectar a deleção no nível de DNA, por exemplo, com o uso de métodos baseados em amplificação adequados para detectar a deleção (tais métodos são conhecidos pela pessoa versada).

[00114] Além disso, o método pode ser usado a fim de selecionar uma linhagem de células adequada em que a expressão naturalmente funcional da matriptase é reduzida ou eliminada, por exemplo, devido ao fato de que a expressão geral é reduzida ou eliminada e/ou devido ao fato de que a atividade da matriptase expressa é reduzida ou eliminada, por exemplo, devido a pelo menos uma mutação. As respectivas células podem ser identificadas com o uso do método de acordo com o sétimo aspecto conforme é descrito no presente documento. Por exemplo, a expressão de matriptase pode ser analisada com o uso de técnicas baseadas em PCR, tal como RT-PCR e/ou sequenciamento. Alternativa ou adicionalmente, a atividade de matriptase pode ser analisada com o uso de meio condicionado obtido a partir das células a serem analisadas.

[00115] De acordo com uma modalidade, as células com quantidade nula ou reduzida de matriptase na superfície celular são selecionadas por citometria de fluxo. Por exemplo, um anticorpo ou outro agente de detecção que liga a matriptase pode ser usado para marcar as células que expressam a matriptase. As respectivas células podem ser, então, identificadas adicionando-se um agente identificado que liga o anticorpo ou outro agente de detecção, ou o anticorpo ou outro agente de detecção pode ser identificado diretamente. De acordo com uma modalidade, a identificação e uma identificação fluorescente. Assim, as células são marcadas de acordo com seu nível de expressão de matriptase que permite, então, identificar e selecionar as células que mostram expressão reduzida ou ausente de matriptase, por exemplo, por seleção de células ativadas por fluorescência (FACS).

[00116] De acordo com uma modalidade, o perfil de expressão das células de vertebrado é analisado para determinar se a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada. Por exemplo, a análise pode compreender realizar uma PCR por RT (transcrição reversa) quantitativa ou qualitativa a fim de detectar a presença, ausência, quantidade ou comprimento do mRNA de matriptase. Adicional ou alternativamente à análise de expressão de matriptase funcional na célula, o processo de seleção pode compreender uma etapa de testar se há atividade de matriptase no meio condicionado obtido a partir da célula. Por exemplo, experimentos de incorporação, conforme descrito nos exemplos, podem ser realizados. De modo correspondente, o meio de cultura celular pode ser coletado de uma variedade de linhagens celulares potenciais a fim de analisar se há atividade de matriptase no meio condicionado respectivamente obtido. Por exemplo, o meio condicionado pode ser testado quanto à sua atividade de corte em um polipeptídeo que é propenso a corte. Com o uso de um ou mais polipeptídeos que são conhecidos pode serem cortados como padrão para testar a atividade de corte, é possível qualificar ou quantificar a atividade de corte das linhagens celulares potenciais uma em relação a outra ou a uma linhagem de células padrão.

[00117] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o sétimo aspecto é para selecionar células de mamífero, em particular células de roedores, tais como células de hamster, de preferência, células CHO.

[00118] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o sétimo aspecto compreende selecionar pelo menos uma célula em que a função da matriptase está enfraquecida, de preferência, por redução ou eliminação de expressão funcional do gene de matriptase para expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse. As células que têm as respectivas características são particularmente adequadas para expressão recombinante, conforme mostrado pelos exemplos. As modalidades adicionais das respectivas células são também descritas em detalhes acima e referem-se à respectiva revelação.

[00119] As faixas numéricas descritas no presente documento são inclusivas em relação aos números que definem a faixa. Os cabeçalhos fornecidos no presente documento não são limitações dos vários aspectos ou modalidades dessa revelação que podem ser lidos em referência ao relatório descritivo como um todo. De acordo com uma modalidade, a matéria descrita no presente documento como compreendendo certos elementos também se refere à matéria que consiste nos respectivos elementos. Em particular, os polinucleotídeos descritos no presente documento como compreendendo certas sequências podem também consistir nas respectivas sequências. É preferencial selecionar e combinar as modalidades preferenciais descritas no presente documento e a matéria específica que surge de uma respectiva combinação de modalidades preferenciais também pertence à presente revelação. Todos os documentos citados no presente documento são incorporados a título de referência.

EXEMPLOS

[00120] Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção sem limitar de qualquer forma o escopo da mesma. Em particular, os exemplos referem-se às modalidades preferenciais da presente invenção.

1. MATERIAIS E MÉTODOS 2. CULTURA CELULAR

[00121] A menos que seja descrito de outro modo no presente documento, como cultura celular, células CHO que proliferam em suspensão derivadas de CHO-K1 foram cultivadas em frascos de agitação em um meio padrão e processos de cultura celular conforme revelados, por exemplo, no documento WO2011/134920. As células foram subcultivadas 2 vezes por semana em meios frescos e foram mantidas em fase de crescimento logarítmico por todo o estudo.

[00122] O mesmo meio de cultura que foi usado para cultivar as células foi usado como controle positivo nos exemplos.

2. EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO COM O USO DE MEIO CONDICIONADO

[00123] As células que não compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse foram subcultivadas a uma densidade de 2 x 105 células viáveis/ml em meio padrão (30 ml de cultura) e proliferadas a 37 °C. No pico de densidade de células viáveis (usualmente 7 ou 8 dias após o subcultivo; viabilidade ainda acima de 95%), as células foram removidas do meio. Sob essas condições e nesse estágio de proliferação celular, espera- se que as quantidades máximas de proteases secretadas estejam ativas no meio de cultura celular sem liberação de proteases intracelulares devido à morte celular. Além disso, espera-se a quantidade máxima de polipeptídeo de interesse secretado sob essas condições, se as células forem transfectadas para expressar um polipeptídeo recombinante de interesse. Para obter meio condicionado, as culturas celulares foram centrifugadas por 15 min a 90 g (suave o suficiente para que as células não liberem proteases intracelulares devido ao estresse de centrifugação). Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido e passado através de um filtro de 0,22 μm para remover as partículas de célula remanescentes do meio condicionado.

[00124] O polipeptídeo de interesse foi adicionado ao meio condicionado assim obtido com uma concentração final de 0,7 μM e incubado a 37 °C com agitação contínua a 500 rpm. O tempo de incubação para cada polipeptídeo de interesse foi previamente determinado removendo-se alíquotas periodicamente na amostra do tipo selvagem e analisando-se as mesmas com o uso de SDS-PAGE e Western Blot. Um ponto no tempo em que pelo menos 50% de degradação foi observada no meio condicionado do tipo selvagem foi escolhido para cada polipeptídeo de interesse. Após a incubação, todas as amostras do polipeptídeo de interesse foram analisadas por SDS-PAGE usualmente seguido por análise por Western Blot para determinar a quantidade de corte. Nos exemplos, diferentes polipeptídeos terapêuticos foram usados como polipeptídeo de interesse a fim de analisar o corte.

3. SDS-PAGE E WESTERN BLOT

[00125] Amostras de proteína foram diluídas em Tampão de Amostra de Redução de Marcador Pierce Lane (10 mM de DTT, cat. 39000) e fervidas por 5 min a 95 °C. Cerca de 0,1 a 0,6 μg de proteína/raia foi carregado em um pré-molde 4 a 12% de Bis-Tris Gel (Invitrogen, cat. NP0322BOX). Após a eletroforese, os géis foram transferidos em membrana de nitrocelulose (Invitrogen, LC2001) com o uso de um sistema de eletro-blot úmido Bio-Rad. O polipeptídeo de interesse foi detectado com o uso de um anticorpo específico acoplado a HRP e ECL (Pierce, cat. 32109).

II. EXEMPLO 1: CORTE DE DIFERENTES POLIPEPTÍDEOS DE INTERESSE AO SILENCIAR A EXPRESSÃO DE DIFERENTES PROTEASES POR INTERFERÊNCIA DE RNA (RNAi)

[00126] Primeiramente, o sítio (ou sítios) de clivagem proteolítica de diferentes proteínas recombinantes que são propensas a corte foi analisado com o uso de diferentes técnicas, incluindo análise por CE- SDS, espectrometria de massa e análise em silício (dados não mostrados). Essa análise combinada com análises adicionais com o uso de diferentes inibidores de protease revelou que a maioria das proteínas testadas que são propensas a corte são clivadas por proteases semelhantes a tripsina, que é uma subfamília das serina proteases. O experimento de RNAi do exemplo 1 foi configurado para demonstrar que a matriptase é a protease chave responsável para corte e que o silenciamento do gene de matriptase reduz significativamente o corte, enquanto o silenciamento de outros genes que codificam diferentes proteases não reduz o corte do polipeptídeo de interesse. Os siRNAs foram projetados contra os mRNAs alvo a seguir expressos em células CHO: 1. Matriptase (MT-SP1; também referida no presente documento como St14), 2. C1r (C1r ativada por componente complementar; também referido como Ctra), 3. C1s (C1sB de componente complementar; também referido como Gm5077), 4. Plat (ativador de t-plasminogênio) e 5. Prss35 (protease, serina, 35). Esses genes alvo codificam proteases semelhantes à tripsina que são secretadas ou proteínas transmem- branares e, assim, poderiam estar envolvidas no corte de proteínas expressas de modo recombinante que são secretadas no meio de cultura celular. Foi confirmado antecipadamente que essas proteínas são expressas pelas células CHO. A Tabela 2 fornece uma visão geral sobre os respectivos genes alvo: TABELA 2

[00127] A sequência senso e antissenso do siRNA contra matriptase e as outras proteases alvo são listadas na Tabela 3. TABELA 3

[00128] A configuração detalhada do experimento é descrita a seguir.

1.1. Transfecção de siRNA

[00129] A transfecção com RNAi de células derivadas de CHO-K1 foi realizada com o uso de Reagente Lipofectamine® RNAiMAX (Life Technology, cat. 13778), seguindo o "Reverse Transfection Protocol" do manual MAN0001182, com escala aumentada para placas de 6 cavidades. Para cada alvo de mRNA, as duas concentrações mais eficazes de moléculas bidirecionais de RNAi foram usadas dentre 100, 125 e 150 pmol: 125 e 150 pmol para MT-SP1 (St14), 125 e 150 pmol para C1r (C1ra), 100 e 125 pmol para C1s (Gm5077), 125 e 150 pmol para Plat e 100 e 125 pmol para Prss35. As moléculas bidirecionais de RNAi das duas concentrações selecionadas foram diluídas em 1 ml de Opti-MEM® (Gibco, cat. 31985-062). Como controle negativo de RNAi (controle negativo de siRNA), o Controle Negativo Silencer® n°.1 siRNA (AM4611) foi usado (a 125 pmol). 5 μl de Reagente Lipofectamine® RNAiMAX foram adicionados em cada cavidade. 2 ml de uma suspensão de células com uma concentração de 0,5 x 106 células/ml foram adicionados, e as placas foram incubadas a 37 °C e 10% de CO2. Três dias após a transfecção, a densidade celular foi medida, RNA total de 3 x 106 células viáveis foram extraídas com o uso do Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen, cat. 74134), e o meio condicionado foi coletado de cada cavidade. Para controlar o efeito de silenciamento nos genes alvo, a expressão de mRNA foi determinada por RT-PCR em tempo real. TABELA 4: INICIADORES E SEQUÊNCIAS DE SONDA PARA DETERMINAR A EXPRESSÃO DE MRNAS DE PROTEASE

[00130] A expressão de gene d e protease residual em relação à expressão de gene de protease nas células de controle negativo de siRNA, que foi definida como 100%, foi conforme segue: MT-SP1: 125 pmol (18,6%) e 150 pmol (18.2%), C1r (C1ra): 125 pmol (6,3%) e 150 pmol (6,7%), C1s (Gm5077): 100 pmol (11,9%) e 125 pmol (14,4%), Plat: 125 pmol (8,3%) e 150 pmol (5,1%) e Prss35: 100 pmol (18,4%) e 125 pmol (14,8%).

1.2. EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO EM MEIO CONDICIONADO

[00131] Para coletar o meio condicionado, 200 μl de meio de cultura celular das placas de 6 cavidades foram centrifugados (300 g por 3 min), e o sobrenadante obtido foi usado como o meio condicionado para experimentos de incorporação, conforme descrito em Materiais e Métodos acima. O polipeptídeo de interesse era um anticorpo IgG monoclonal (mAb) ou uma proteína de fusão de Fc. Conforme descrito acima, um ponto no tempo em que pelo menos 50% de degradação foi observada no meio condicionado do tipo selvagem foi escolhido para cada polipeptídeo de interesse. Os resultados levam a um tempo de incubação de 3 dias para a proteína de fusão de Fc (em que, entretanto, a degradação já estava muito acima de 50%) e a um tempo de incubação de 7 dias para o mAb. Após a incubação, as amostras do polipeptídeo de interesse no meio condicionado foram analisadas por SDS-PAGE e análise por Western Blot para determinar a quantidade de corte, conforme descrito em Materiais e Métodos.

1.3. CORTE DE PROTEÍNA: RESULTADOS DE EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO

[00132] A Figura 1 mostra o Western Blot dos diferentes polipeptídeos de interesse analisados após a incubação, conforme definido acima, no painel superior, o mAb e, no painel inferior, a proteína de fusão de Fc.

[00133] A primeira raia do Western Blot no painel superior mostra o mAb após a incubação por 7 dias em meio não tratado (quimicamente definido) (o mesmo meio foi usado também para cultivar as células), em que, de modo correspondente, nenhum corte deveria ocorrer visto que o meio de cultura celular não estava em contato com as células e, portanto, nenhuma protease celular está presente no dito meio (controle positivo (+)). O mAb é exibido como uma banda de proteína forte única (marcada com uma seta) e nenhum corte ocorreu.

[00134] A segunda raia mostra a amostra de mAb após 7 dias de incubação no meio condicionado de células de controle negativo ((-)), que foram transfectadas com um controle negativo de siRNA (nenhum efeito sobre a expressão gênica). Como o controle negativo de siRNA não tem efeito sobre a expressão gênica, o meio condicionado corresponde em essência ao meio condicionado que é obtido após a incubação das células inalteradas e, portanto, células que mostram expressão de gene alvo normal e, em que, de modo correspondente, as proteases codificadas são normalmente expressas. Conforme pode ser visto, adicionalmente à banda de proteína do mAb intacto, aparece abaixo uma segunda banda de proteína forte que representa o mAb cortado (marcado com uma seta). Ambas as bandas de proteína têm uma intensidade similar, assim, pode-se assumir que cerca de 50% do mAb foram cortados. O mesmo resultado - corte significativo - é encontrado para o mAb incubado no sobrenadante celular de células em que C1r (C1ra), C1s (Gm5077), Plat e Prss35 foram silenciados por RNAi (consultar as raias 5 a 12). Foi confirmado que os genes alvo foram silenciados eficazmente por RT-PCR em tempo real. Para C1r (C1ra), a redução de mRNA mais forte foi encontrada com 93,7% e 93,3%. A redução encontrada para Plat foi 91,7% e 94,9%, para C1s (Gm5077) 88,1% e 85,6% e para Prss35 81,6% e 85,2%. De modo correspondente, todos esses genes alvo foram silenciados com sucesso em mais de 80%. No entanto, em todos esses casos, a banda de proteína do mAb cortado teve pelo menos a intensidade de sinal aproximadamente igual à banda de proteína do mAb intacto. Assim, como no controle negativo (-), pelo menos cerca de 50% do mAb foram cortados. De modo correspondente, a regulação descendente desses genes de protease não reduziu o corte do polipeptídeo de interesse no meio condicionado.

[00135] Em contraste, reduzir a expressão de matriptase (MT- SP1) nas células por RNAi (consultar as raias 3 e 4) reduziu consideravelmente o corte do mAb. Em ambas as configurações em que MT-SP1 foi suprimida em 81,4% e 81,8% em comparação com o controle negativo (expressão de MT-SP1 remanescente 18,6% e 18,2%), a banda de proteína do mAb cortado é muito mais fraca que a banda de proteína do mAb intacto. Isso demonstra que significativamente menos mAb foi cortado e mostra que alterar uma célula de vertebrado para reduzir a expressão funcional do gene de matriptase, aqui por RNAi, reduz significativamente a quantidade de corte de um polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular condicionado obtido a partir das ditas células.

[00136] Os resultados para a proteína de fusão de Fc como um exemplo adicional de um polipeptídeo de interesse são mostrados no painel inferior da Figura 1. Em contraste ao mAb, a amostra comparativa "(+)" da proteína de fusão de Fc contém, adicionalmente à banda de proteína da proteína intacta, uma segunda banda forte correspondente à porção de Fc sozinha, que é também o produto de corte principal (ambas as bandas estão marcadas como uma seta). A porção de Fc cortada é também encontrada no controla positivo, devido ao fato de que o material de partida (proteína de fusão de Fc produzida em células CHO), contém, mesmo após a purificação, uma alta porcentagem da proteína de fusão de Fc cortada. Durante o processo de purificação da proteína Fc, nem todo o material cortado pode ser removido. Portanto, a proteína de fusão de Fc usada no controle positivo como material de partida já contém quantidades significativas da porção de Fc cortada como impureza. No meio condicionado de células em que a expressão de C1r (C1ra), C1s (Gm5077), Plat ou Prss35 foi silenciada, o sinal para a proteína de fusão de Fc intacta está na faixa de fraco (Plat) a muito fraco (Prss35). De modo correspondente, o corte da proteína de fusão de Fc foi muito alto nesses casos e alcançou valores até quase 100% embora a expressão dessas tenha sido suprimida. Portanto, o silenciamento desses genes de protease foi ineficaz a fim de reduzir o corte. Em contraste, no meio condicionado obtido a partir de células em que a expressão de matriptase (MT-SP1) foi silenciada (apenas uma concentração de siRNA foi usada), cerca da mesma intensidade da proteína intacta que no controle positivo (+) é encontrada. Portanto, o corte foi significativamente reduzido. A raia que representa o controle negativo de siRNA (-) também compreende proteína intacta. Entretanto, esse resultado é uma contaminação da raia de controle negativo de siRNA pelo controle positivo que se espalhou mediante o carregamento.

[00137] Em suma, esse experimento de RNAi demostra que silenciar a expressão de matriptase nas células hospedeiras resulta em uma diminuição significativa em corte de diferentes polipeptídeos exemplificativos de interesse no meio condicionado obtido a partir das ditas células. Em contraste, silenciar a expressão de outras proteases semelhantes à tripsina expressas pelas células hospedeiras não tem qualquer efeito sobre o corte. O Exemplo 1, portanto, apoia a importância da conclusão de que a matriptase é a protease principal responsável pelo corte de polipeptídeos de interesse secretados e expressos de modo recombinante. Além disso, concluiu-se que as células em que a matriptase foi regulada descendentemente por RNAi tiveram as mesmas características de proliferação que as células do controle negativo de siRNA. Portanto, a regulação descendente da expressão de matriptase não afetou a proliferação celular.

III. EXEMPLO 2: Knockout de gene de matriptase (KO) em células CHO leva a uma diminuição em corte A. KO REALIZADO COM TECNOLOGIA TALEN

[00138] Nove clones de célula knockout de matriptase (MT-SP1) com base em células derivadas de CHO-K1 foram geradas com o uso de tecnologia TALEN (Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição). Para o knockout, o éxon 2 de matriptase foi alvejado em uma região localizada antes da região de codificação do domínio transmembranar. O éxon 2 foi escolhido devido ao fato de que o mesmo abrange diferentes variantes de splicing alternativas. Adicionar mutações da fase de leitura no éxon 2 tem a vantagem de que a proteína truncada será curta e estará localizada de modo intracelular e, além disso, será instável e não tóxica para as células.

2.A.1. PROJETO/PRODUÇÃO E USO DE TALENS QUE SÃO ESPECÍFICOS PARA O ÉXON 2 DE MATRIPTASE

[00139] O éxon 2 de matriptase e os íntrons de flanqueamento foram sequenciados na linhagem de células progenitoras derivadas de CHO-K1 (consultar a Figura 2, SEQ ID NO: 31).

[00140] Dois TAL FokI truncados que alvejam o éxon 2 de matriptase foram projetados. Cada TALEN está alvejando e ligando-se a 19 nucleotídeos na fita de DNA 5’ (no direto) ou 3’ (no reverso) DNA, respectivamente. Os dois sítios de ligação são separados pelos cinco nucleotídeos do sítio de corte. Cada TAL projetado foi sintetizado e clonado em vetor de entrada Gateway® e subclonado e um vetor de destino pEXP3-DEST_A302. A descrição do produto e os métodos estão disponíveis junto à Life Technology/GeneArt. Os plasmídeos que codificam o TALEN de reconhecimento de fita 5’ (esquerda) ou 3’ (direita) (subclonado no vetor de cadeia principal pEXP3-DEST) foram produzidos. pEXP3-DEST contém um promotor T7 a montante da sequência de codificação de TALEN, permitindo a transcrição in vitro (IVT) de mRNA que codifica TAL-FokI.

2.A.2. TRANSCRIÇÃO IN VITRO DOS VETORES DE TALEN

[00141] O mRNA de TALEN foi produzido por transcrição in vitro (IVT) dos vetores de TALEN. Os vetores de TALEN foram previamente linearizados com enzima de restrição HindIII (Roche, cat. 10656321001) e purificados com o uso de isopropanol seguido por precipitações de etanol a 70%. mRNA foi gerado com o uso dos procedimentos conhecidos pela pessoa versada na técnica. O produto de IVT com cap foi purificado com precipitação de NH4-Ac, e o mRNA gerado (contendo cauda poliA e cap com cinco plicas) foi purificado com o uso do Micro kit Qiagen RNeasy (cat. 74004).

2.A.3. TRANSFECÇÃO DE MRNA DE TALEN

[00142] As células CHO-K1 progenitoras em fase de proliferação exponencial com viabilidade acima de 95% foram usadas para transfecção. Eletroporação (nucleofecção) foi realizada com o uso da Tecnologia Amaxa™, Nucleofector™ de acordo com as instruções do fabricante (Lonza). As células transfectadas foram expandidas no dia 4 após a transfecção, e as células únicas foram separadas no dia 7 em placas de 30 x 96 cavidades. Monoclonalidade e a confluência foram controladas com o Imageador CloneSelectTM (Genetix).

2.A.4. ENSAIO CEL-I E ESTRATÉGIA DE TRIAGEM

[00143] O ensaio Cel-I foi realizado de acordo com o manual da SAFC Biosciences. O ensaio Cel-I é um ensaio padrão a fim de determinar a eficácia de corte. Em resumo, 3 dias após a transfecção, o DNA genômico foi isolado das células, e uma PCR foi realizada com o uso dos iniciadores a seguir: Fwd: ttttttgcccagtcctggtt (SEQ ID NO: 32) Rev: ccctttggtctgtcctctga (SEQ ID NO: 33)

[00144] O produto de amplificação foi desnaturado e deixado renaturar. Então, nuclease S e intensificador de nuclease S foram adicionados e incubados. O produto digerido foi analisado. Duas bandas menores estavam presentes, indicando a atividade de TALEN dentro dessa região do genoma e, portanto, apoiando que as células em que o gene de matriptase é alterado por mutação estavam presentes nos agrupamentos celulares analisados. Dos agrupamentos celulares mais positivos (intensidade mais forte das duas bandas menores), células únicas foram separadas em placas de 96 cavidades.

[00145] O DNA genômico (gDNA) foi extraído de cada clone em placas de 96 cavidades com o uso de Kits de PCR de Sangue Extract- N-AmpTM (cat. XNAB2R, Sigma). Os extratos de gDNA foram usados para triar os clones com mutação, em um ensaio "CutSite PCR" com o uso do Iniciador Reverso (Rev) mostrado acima (SEQ ID NO: 33) em combinação com um iniciador que se liga no sítio cortante (referido como Iniciador Cut. ) que tinha a sequência a seguir: Cut. Iniciador: GTGGAGTTTCTGCCTGTGAA (SEQ ID NO: 34)

[00146] Se, na região de sítio cortante, uma mutação tiver ocorrido devido às atividades dos TALENs, o Iniciador Cut. não se ligará, resultando no fato de que nenhum produto de PCR é obtido. Clones sem nenhum produto de PCR foram analisados por meio de sequenciamento para determinar a mutação introduzida. Alternativa ou adicionalmente, o ensaio de Detecção de Mutação Surveyor (Transgenomics, cat. 706025) que usa iniciadores Direto (Fwd) e Reverso (Rev) mostrados acima foi realizado. Os clones com mutações foram transferidos em frascos de agitação de 125 ml e sequenciados. Nos ditos ensaios de triagem, o clone Δ7/Δ15 foi identificado. Além disso, após a primeira rodada de transfecção e triagem com o uso do ensaio Cel-I, um clone com o genótipo wt/Δ4 foi gerado, que teve uma mutação da fase de leitura em um alelo de matriptase.

[00147] Para obter clones knockout que compreendem mutações da fase de leitura em ambos os alelos, duas rodadas de transfecção e clonagem de mRNA de TALEN foram realizadas. Para obter clones knockout com mutações da fase de leitura em ambos os alelos de MT- SP1, o clone com o genótipo wt/Δ4 foi usado em uma segunda rodada de transfecção - clonagem de mRNA de TALEN conforme descrito acima para gerar mutações da fase de leitura também no segundo alelo. No total, nove clones knockout de matriptase (KO-1 a KO-9) contendo mutações da fase de leitura em ambos os alelos foram gerados. Os genótipos dos nove clones são revelados na Tabela 5. As sequências do éxon 2 de MT-SP1 referentes ao tipo selvagem e essas mutações são mostradas na Tabela 6. As sequências parciais do produto de MT-SP1 resultante das mutações são mostradas na Tabela 7. Os aminoácidos codificados pelo éxon 2 são destacados em negrito.

[00148] De acordo com a Tabela 5, há quatro clones, KO-1, KO-4 e KO-7 e KO-9, com o genótipo Δ4/Δ4. O genótipo de matriptase desses clones é idêntico. KO-1, KO-4 e KO-7 são derivados do mesmo agrupamento retransfectado de TALEN, KO-9 é derivado de um diferente. A análise FISH de clones mostrou que há algumas diferenças no cariograma de KO-1, KO-4 e KO-7. Assim, assume-se que os mesmos não são derivados da mesma célula-mãe.

[00149] Uma mutação da fase de leitura é inserida em ambos os alelos do gene de matriptase em todos os clones KO-1 a KO-9. Além disso, foi obtido o clone com mutação Δ7/Δ15 que tem o genótipo Δ7/Δ15 e tem uma mutação da fase de leitura em apenas um alelo (Δ7). No segundo alelo, a mutação Δ15, uma deleção de 15 pares de bases, resulta na deleção de cinco aminoácidos no domínio intracelular curto de matriptase. Entretanto, nenhuma fase de leitura ocorre devido à deleção de Δ15. O domínio afetado não parece ser necessário para a função catalítica, visto que o mesmo permanece fixado à membrana quando a parte extracelular que compreende o domínio de protease catalítica é disseminada. Portanto, assume-se que a matriptase expressa a partir do alelo Δ15 esteja ainda cataliticamente ativa. Portanto, no clone de célula Δ7/Δ15, a expressão funcional de matriptase é reduzida, mas não abolida. Assume-se, ainda, que aproximadamente metade do mRNA remanescente expresso pelos ditos mutantes de clone contém a mutação da fase de leitura. TABELA 5: MUTAÇÕES EM ÉXON 2 DE AMBOS OS ALELOS DO GENE DE MATRIPTASE TABELA 6: SEQUÊNCIAS DE GENE DE MATRIPTASE QUE CODIFICAM O ÉXON 2 DE WT DERIVADO DE CHO-K1 E CLONES KO DIFERENTES. Δ INDICA UMA DELEÇÃO. O NÚMERO APÓS O Δ INDICA QUANTOS NUCLEOTÍDEOS FORAM DELETADOS. ENTRE PARÊNTESES E MARCADO EM NEGRITO, OS NUCLEOTÍDEOS DELETADOS SÃO MOSTRADOS. TABELA 7: SEQUÊNCIAS PARCIAIS DE AMINOÁCIDOS DE MATRIPTASE DE CLONES CHO, WT e KO incluindo os éxons 1, 2 e 3 com os aminoácidos do éxon 2 em negrito. Uma estrela * representa um códon de parada na Tabela 7.

2.A.5. EXPRESSÃO DE MRNA DE MATRIPASE

[00150] A fim de testar o efeito das mutações introduzidas na transcrição reversa quantitativo de expressão de matriptase, PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada. A expressão de mRNA de matriptase medida nos clones individuais por qRT-PCR foi comparada à expressão de mRNA em uma célula derivada de CHO-K1 do tipo selvagem. O resultado desse experimento é mostrado na Figura 3. De acordo com a Figura 3, nos clones de célula com matriptase com mutação, o mRNA é apenas expresso na faixa de 5 a 40% em comparação ao tipo selvagem. Esse resultado sugere que a expressão da matriptase com mutação é reduzida. Assim, menos proteína matriptase (não funcional) é expressa pelas células. Além disso, o clone de célula Δ7/Δ15 mostra apenas baixa expressão de mRNA de matriptase nas células.

2.A.6. EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO COM SOBRENADANTE CELULAR DOS NOVE CLONES knockout de matriptase (MT-SP1)

[00151] Para avaliar o efeito do knockout de matriptase, experimentos de incorporação foram realizados com cinco polipeptídeos de interesse diferentes, que são propensos a corte. O meio condicionado de culturas celulares dos clones knockout CHO foi obtido de acordo com o protocolo descrito e Material e Métodos. Para os experimentos de incorporação, o polipeptídeo de interesse foi adicionado ao meio condicionado com uma concentração final de 0,7 μM e incubado a 37 °C com agitação contínua a 500 rpm. O tempo de incubação dependeu do tipo de polipeptídeo de interesse testado. Após a incubação, as amostras do polipeptídeo de interesse no meio condicionado foram analisadas por SDS-page e análise por Western Blot, conforme descrito em Materiais e Métodos.

[00152] A Figura 4A mostra a análise por Western Blot de um experimento de incorporação (spike-in) com um anticorpo IgG monoclonal (mAb) como o polipeptídeo de interesse. Como controle de referência, a primeira raia a partir da esquerda do Western Blot (indicado por "(+)") mostra o mAb após incubação em meio quimicamente definido (o mesmo meio de cultura foi também usado para obter o meio condicionado). Nenhum corte do produto é detectado; a proteína intacta é marcada com uma seta. A segunda raia (WT) mostra o anticorpo monoclonal após 48 h de incubação em meio condicionado obtido a partir de células derivadas de CHO-K1 que expressam normalmente a matriptase. Aqui, uma segunda banda forte é detectada, representando o anticorpo cortado (marcado por uma seta). Como a banda de proteína do anticorpo cortado é mais forte que a banda de proteína da proteína intacta, mais de 50% da proteína são cortados. Em contraste, após a incubação do anticorpo monoclonal no meio condicionado obtido a partir das nove linhagens de células knockout KO-1 a KO-9 (1 a 9 na Figura 4), respectivamente, nenhum produto cortado é detectado. Portanto, um knockout do gene de matriptase na célula hospedeira de vertebrado é um aprimoramento significativo, devido ao fato de que o corte do mAb no meio de cultura celular poderia ser impedido de modo eficaz.

[00153] Os resultados de um experimento de incorporação correspondente com uma proteína de fusão de Fc são mostrados na Figura 4B. O tempo de incubação foi de 24 h. Em contraste ao anticorpo monoclonal, o controle positivo em meio químico definido (+) já continha uma grande quantidade de proteína cortada (marcado com uma seta). Ou seja, devido ao fato de que a proteína de fusão de Fc que foi adicionada como polipeptídeo de interesse foi produzida em células CHO e é intensamente cortada no meio de cultura do qual a mesma é coletada. Nem toda proteína cortada poderia ser removida durante o processo de purificação, de modo que o material de partida já continha alguma contaminação por proteína cortada. Embora, nos experimentos com clones knockout de matriptase (1 a 9), as quantidades de proteína intacta e proteína cortada sejam comparáveis ao material de partida incubado no controle positivo (+), a incubação no meio condicionado das células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 inalteradas (WT) aboliu completamente e, portanto, degradou, a proteína intacta. Assim, basicamente 100% de corte foi observado no meio condicionado de células que não foram alteradas para enfraquecer a função de matriptase.

[00154] Um resultado comparável é encontrado para uma proteína terapêutica recombinante adicional que foi incubada nos meios condicionados por 1 h (Figura 4C). Duas glicovariantes da proteína estão presentes. Novamente, no meio condicionado das células CHO- K1 do tipo selvagem (WT), mais de 50% de ambas as glicovariantes de proteína são cortados (marcado por setas), durante a incubação nos meios condicionados das células KO-1 a KO-9 (1 a 9), em que a função da protease matriptase endógena é enfraquecida devido ao knockout de gene, preservado o estado da proteína intacta conforme observado após a incubação em um meio químico definido (controle positivo (+)).

[00155] Os clones KO foram também analisados ao longo dos meses a fim de analisar se o impedimento, respectivamente, a redução de corte é uma característica estável das células de vertebrado alteradas em que o gene de matriptase sofreu knockout. De modo correspondente, o experimento de incorporação com o mAb foi repetido com o meio condicionado obtido a partir dos clones de célula knockout de matriptase que foram cultivados por 3 meses. O resultado do experimento, novamente comparado com o meio condicionado de célula do tipo selvagem CHO como o controle negativo "(WT)" e meio quimicamente definido como o controle positivo "(+)", é mostrado na Figura 4D. O Western Blot revela o mesmo padrão exato de banda de proteína conforme visto na Figura 4A. O mesmo resultado foi também visto após 3 meses para a proteína de fusão de Fc (dados não mostrados). Portanto, foi confirmado que, com os clones KO, nenhum corte apareceu após diversos meses. Além disso, concluiu-se que as linhagens de células KO proliferaram bem e a proliferação celular até mesmo melhorou durante a cultura por 3 meses.

[00156] Os resultados dos experimentos de incorporação com duas proteínas virais glicosiladas com o uso de meio condicionado dos clones knockout de matriptase KO-1 a KO-3 (1 a 3) são mostrados na Figura 5 após 24 h (D1) e 48 h de incubação (D2). Na primeira raia do Western Blot (Figura 5A) que representa a proteína após a incubação em meio químico definido (+), duas bandas de proteína são visíveis. A banda superior representa a proteína intacta, a banda inferior é uma versão cortada da proteína que constituiu cerca de 5% da proteína total na amostra. No meio condicionado de tipo selvagem CHO-K1 (raias WT), uma quantidade fortemente reduzida de proteína intacta está presente após 24 h (D1) de incubação. Após 48 h (D2), a banda de proteína é quase invisível, isto é, quase toda a proteína foi cortada. Adicionalmente, a banda de proteína da proteína cortada desapareceu completamente, sugerindo que a proteína foi adicionalmente degradada. Em contraste, nenhuma diferença no padrão de banda de proteína é encontrada para proteínas incubadas por 24 h ou 48 h nos meios condicionados dos clones knockout de matriptase KO-1 a KO-3 (consultar 1 a 3). De modo correspondente, com o meio condicionado obtido a partir das linhagens de células knockout de matriptase, uma degradação proteolítica nula ou significativamente reduzida das proteínas terapêuticas foi detectada. A segunda proteína viral mostra um resultado comparável (Figura 5B). Aqui, a proteína intacta é representada pela banda de proteína única mostrada na raia "(+)". Já após 24 h de incubação em meio condicionado de células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 (WT, D1) quase nenhum traço da proteína intacta pode ser detectado. Em vez disso, duas bandas de proteína inferiores aparecem, representando versões cortadas da proteína. Essas bandas de proteína são também vistas no experimento com o meio obtido a partir de clones knockout de matriptase KO-1 a KO-3. Entretanto, a maioria da proteína viral é preservada com todos os clones knockout testados mesmo após 48 h de incubação.

[00157] Confirmando os experimentos acima, o experimento de incorporação com cinco proteínas de fusão de Fc adicionais, que são propensas a corte, foi realizada conforme descrito acima. O sobrenadante de coleta isento de célula foi capturado por cromatografia líquida de afinidade de Proteína A com o uso de 1 ml de HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare). Um tempo de permanência de 2 minutos foi aplicado para equilíbrio, carga e lavagem. Para a eluição, um tempo de permanência de 4 minutos foi aplicado. O eluído foi titulado a pH 5 com 1 M de Tris antes da filtração estéril com uma Unidade de Filtro de Seringa Millex-GV (0,22 μm, PVDF, 13 mm; Millipore). A concentração de proteína foi determinada com o uso de um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) em comprimento de onda de 280 nm. Todas as etapas foram realizadas à temperatura ambiente. A Tabela 8 mostra os dados da análise por espectrometria de massa. Conforme pode ser visto, todas as proteínas de fusão de Fc testadas foram completamente ou quase completamente cortadas quando expressas nas células progenitoras. Em contraste a isso, o corte foi consideravelmente reduzido quando foram expressas em linhagem de células knockout. TABELA 8: ANÁLISE DE CORTE DE DIFERENTES PROTEÍNAS DE FUSÃO DE FC

[00158] Esses exemplos demonstram que as células de vertebrado alteradas de acordo com a presente revelação, em que a função da protease matriptase endógena é enfraquecida, apresentam ou liberam quantidades nulas ou reduzidas de matriptase funcional no meio de cultura celular. Portanto, a degradação proteolítica do polipeptídeo recombinante de interesse que está presente (normalmente secretado) no meio de cultura celular é significativamente reduzida quando são usadas essas células alteradas para produzir um polipeptídeo de interesse.

2.A.7. EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO COM SOBRENA- DANTE CELULAR DO CLONE MUTANTE DE MATRIPTASE Δ7/Δ15

[00159] Para avaliar o efeito de expressão reduzida de matriptase funcional, os experimentos de incorporação com a proteína de fusão de Fc e o anticorpo IgG monoclonal (mAb) foram repetidos com meio condicionado obtido a partir do clone Δ7/Δ15. O meio condicionado da cultura celular foi obtido de acordo com o protocolo descrito em Material e Métodos. Para o experimento de incorporação, o polipeptídeo de interesse foi adicionado ao meio condicionado com uma concentração final de 0,7 μM e incubado a 37 °C com agitação contínua a 500 rpm. A proteína de fusão de Fc foi incubada por 2 h, o mAb por 24 h. Após a incubação, as amostras dos polipeptídeos de interesse no meio condicionado foram analisadas por SDS-PAGE e análise por Western Blot, conforme descrito em Materiais e Métodos.

[00160] Os resultados do experimento de incorporação com a proteína de fusão de Fc são mostrados na Figura 6A. Como referência, a primeira raia do Western Blot mostra a proteína de fusão de Fc após a incubação em meio quimicamente definido (indicado por "(+)"). A segunda e a terceira raias ("WT1" e "WT2") mostram a proteína de fusão de Fc após a incubação em meio condicionado de duas linhagens de células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1, que normalmente expressam a matriptase funcional não modificada. Conforme discutido acima, o material de partida continha a proteína de fusão de Fc intacta assim como proteína de fusão de Fc cortada como impureza. Nas amostras de proteína derivadas de incubação com meio condicionado de células CHO com matriptase do tipo selvagem ("WT1" e "WT2"), basicamente nenhuma proteína de fusão de Fc intacta é observada. Em contraste, a incubação em meio condicionado obtido a partir do clone de célula Δ7/Δ15 ("Δ7/Δ15") em que a expressão funcional de matriptase é significativamente reduzida (para detalhe em relação ao clone, consultar o Exemplo 2.4), o corte é significativamente reduzido conforme pode ser concluído a partir da banda de proteína forte que representa a proteína de fusão de Fc intacta.

[00161] A Figura 6B mostra a análise por Western Blot de um experimento de incorporação com o mAb IgG como o polipeptídeo de interesse. Como referência, a primeira raia do Western Blot (indicada por "(+)") mostra o mAb após a indicação em meio quimicamente definido. Uma banda de proteína forte que representa o anticorpo intacto é visível. A segunda e a terceira raias ("WT1" e "WT2") mostram o anticorpo monoclonal após a incubação em meio condicionado de duas linhagens celulares do tipo selvagem derivadas de CHO-K1, que expressam a matriptase não modificada. Na segunda e na terceira raias, uma banda de proteína forte adicional que tem um peso molecular mais baixo aparece representando o anticorpo cortado. De acordo com a força do sinal, mais de 50% do anticorpo parece estar cortado. Na quarta raia ("Δ7/Δ15") que mostra o mAb após a incubação em meio condicionado do clone de célula Δ7/Δ15, as intensidades dos sinais são revertidas. Assim, embora o corte não seja completamente abolido, o mesmo é fortemente reduzido em comparação aos clones de célula do tipo selvagem de matriptase. Esse resultado confirmar que reduzir a expressão funcional de matriptase, reduz significativamente o corte do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular.

[00162] Esses experimentos mostram que usar um clone de célula em que apenas um alelo de matriptase sofreu knockout e em que a expressão funcional de matriptase é reduzida também leva a um corte reduzido do polipeptídeo de interesse no meio de cultura celular. Assim, pode-se concluir que a atividade de corte é proporcional ao grau de expressão funcional de matriptase.

B. KO REALIZADO COM TECNOLOGIA ZFN

[00163] Um clone de célula knockout de ZFN (MT-SP1) com base em células progenitoras CHO foi gerado com o uso de tecnologia ZFN (Nucleases de Dedo de Zinco). Para o knockout, o éxon 2 de matriptase foi alvejado em uma região localizada antes da região de codificação do domínio transmembranar (conforme descrito no Exemplo 2A).

2.B.1. PROJETO/PRODUÇÃO E USO DE TALENS QUE SÃO ESPECÍFICOS PARA O ÉXON 2 DE MATRIPTASE

[00164] Um par de ZFNs que alveja o éxon 2 de matriptase foi projetado. Um ZFN está alvejando e ligando-se a 12 nucleotídeos, o outro está alvejando 18 nucleotídeos. Os dois sítios de ligação são separados pelos cinco nucleotídeos do sítio cortante.

2.B.2. TRANSCRIÇÃO IN VITRO DOS VETORES DE TALEN

[00165] O mRNA de ZFN foi produzido por transcrição in vitro (IVT) dos vetores de ZFN. O mRNA foi gerado com o uso de procedimentos conhecidos pela pessoa versada na técnica. O produto de IVT com cap foi purificado com precipitação de NH4-Ac, e o mRNA gerado (contendo cauda poliA e cap com cinco plicas) foi purificado com o uso do Micro kit Qiagen RNeasy (cat. 74004).

2.B.3. TRANSFECÇÃO DE MRNA DE ZFN

[00166] As células CHO progenitoras em fase de proliferação exponencial com viabilidade acima de 95% foram usadas para transfecção. Eletroporação (nucleofecção) foi realizada com o uso da Tecnologia Amaxa™, Nucleofector™ de acordo com as instruções do fabricante (Lonza).

2.B.4. ENSAIO CEL-I E ESTRATÉGIA DE TRIAGEM

[00167] O ensaio Cel-I foi realizado de acordo com o manual da SAFC Biosciences e uma triagem similar à descrita no exemplo 2A.4 foi realizada.

[00168] Para obter um clone knockout que compreende mutações da fase de leitura em ambos os alelos, duas rodadas de transfecção e clonagem de mRNA de ZFN foram realizadas. Um clone knockout de matriptase (KO-10) contendo mutações da fase de leitura em ambos os alelos foi gerado (Δ13/Δ13).

2.B.5. EXPERIMENTOS DE INCORPORAÇÃO COM SOBRENADANTE CELULAR DO CLONE KNOCKOUT DE MATRIPTASE (MT-SP1)

[00169] Para avaliar o efeito do knockout de matriptase, experimentos de incorporação foram realizados com dois polipeptídeos de interesse diferentes, que são ambos propensos a corte. O meio condicionado de culturas celulares dos clones knockout CHO foi obtido de acordo com o protocolo descrito e Material e Métodos. Para os experimentos de incorporação, os polipeptídeos de interesse (uma proteína de fusão de Fc e uma proteína terapêutica recombinante) foi adicionado ao meio condicionado com uma concentração final de 0,7 μM e incubado a 37 °C com agitação contínua a 500 rpm. O tempo de incubação dependeu do tipo de polipeptídeo de interesse testado. Após a incubação, as amostras do polipeptídeo de interesse no meio condicionado foram analisadas por SDS-page, conforme descrito em Materiais e Métodos.

[00170] Os resultados são correspondentes aos experimentos de incorporação realizados com clones KO gerados com tecnologia TALEN. Uma proteína de fusão de Fc e uma proteína terapêutica recombinante, conforme descrito na seção de exemplo 2.A.6, foram usadas. Embora, nos experimentos com o clone knockout de matriptase, as quantidades de proteínas intactas e proteínas cortadas sejam comparáveis ao material de partida incubado no controle positivo (+), a incubação no meio condicionado das células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1 inalteradas (WT) aboliu completamente e, portanto, degradou, as proteínas intactas.

[00171] Os clones KO foram também analisados ao longo de diversos meses a fim de analisar se o impedimento, respectivamente, a redução de corte é uma característica estável das células de vertebrado alteradas em que o gene de matriptase sofreu knockout. De modo correspondente, o experimento de incorporação com a proteína de fusão de Fc foi repetido com o meio condicionado obtido a partir dos clones de célula knockout de matriptase que foram cultivados por 6 meses. O resultado do experimento confirmou que com o clone KO, nenhum corte apareceu mesmo após diversos meses. Além disso, concluiu-se que a linhagem celular KO proliferou bem e a proliferação celular até mesmo melhorou durante o tempo de cultura.

IV. EXEMPLO 3: PROTEÍNAS RECOMBINANTES SÃO CLIVADAS DIRETAMENTE PELA MATRIPTASE

[00172] A fim de demonstrar adicionalmente que a matriptase cliva diretamente proteínas secretas e expressas de modo recombinante (alvos de corte), proteases comercialmente disponíveis foram usadas, a saber, MT-SP1 de camundongo e Htra1 de ser humano. Um anticorpo IgG monoclonal mAb (Figura 7A), uma proteína de fusão de Fc (Figura 7B) e uma proteína recombinante adicional (Figura 7C) foram incubados por 24 h, 2 h e 1 h, respectivamente, com as proteases semelhantes à tripsina MT-SP1 de camundongo e Htra1 de ser humano, que foram adicionadas ao meio de cultura quimicamente definido. A coincubação foi realizada a 37 °C com agitação contínua a 500 rpm. Os polipeptídeos de interesse foram usados a uma concentração de 0,7 μM cada. Cada polipeptídeo de interesse foi testada com quantidades decrescentes das proteases MT-SP1 e da Htra1: As razões molares entre protease e polipeptídeo de interesse da esquerda para a direita são 1/10, 1/100, 1/1.000 para MT-SP1 e 1/3, 1/10 e 1/100 para Htra1. Como controles, amostras adicionais do polipeptídeo de interesse são incubadas com meio condicionado de células derivadas do tipo selvagem CHO-K1 como controle negativo (raia "(-)") e um meio quimicamente definido que não estava em contato com as células como controle positivo (raia "(+)").

[00173] A partir dos Western Blots na Figura 7A a C, é evidente que a Htra1 recombinante que foi adicionada ao meio de cultura celular não cliva nenhum dos polipeptídeos de interesse testados. Mesmo em concentrações mais altas de Htra1, as bandas de proteína parecem exatamente como no controle positivo ("(+)"). Em contraste, todos os polipeptídeos recombinantes de interesse foram significativamente cortados mesmo na concentração mais baixa de MT-SP1 adicionada. A banda de proteína ou se assemelhou àquela do controle negativo ("- ") ou foi ainda pior. Portanto, graus significativos de corte ocorreram sob todas as condições testadas quando MT-SP1 foi adicionada.

[00174] No experimento com a proteína de fusão de Fc, um efeito dependente de concentração da protease MT-SP1 foi observado (Figura 7B). Embora na concentração mais baixa de matriptase/MT-SP1 a banda de proteína da proteína de fusão de Fc intacta a cerca de 85 kDa seja apenas ligeiramente reduzida em comparação ao controle positivo, em concentrações mais altas de MT-SP1 a banda de proteína a aproximadamente 85 kDa desaparece completamente. Consequente-mente, o grau de corte da proteína de fusão de Fc se correlaciona com a concentração de matriptase/MT-SP1 no meio de cultura celular.

[00175] Para determinar o sítio de corte induzido pela MT-SP1 de camundongo comercial usada nesse exemplo, a amostra de anticorpo (mAb) com concentração de MT-SP1 1/100 foi submetida à espectrometria de massa. O sítio de corte identificado foi igual a quanto o mAb foi produzido pela linhagem de células CHO do tipo selvagem. Isso mostra que o sítio de corte de matriptase de camundongo no mAb é igual ao sítio de corte da protease responsável pelo corte ao produzir o mAb em células CHO. Esses resultados confirmam, ainda, que a matriptase é a protease de corte.

V. EXEMPLO 4: INIBIÇÃO DE AÇÃO DE CORTE DE MATRIPTASE POR UM INIBIDOR SELETIVO DE MATRIPTASE

[00176] Para confirmar, ainda, que o corte do polipeptídeo recombinante de interesse é causado por matriptase como a protease chave responsável pelo corte, experimentos de incorporação foram realizados com um fragmento Fab anti-MT-SP1 específico que inibe especificamente a matriptase/MT-SP1 de ser humano. A estrutura Fab inibitória e os detalhes de ligação sobre a MT-SP1 de ser humano são publicados em Farady et al., 2008 J. Mol. Biol. (2008) 380, 351 a 360).

[00177] Os polipeptídeos terapêuticos de interesse como alvos de corte eram, nesse caso, um anticorpo IgG monoclonal (mAb) e uma glicoproteína não anticorpo com duas glicovariantes. O polipeptídeo de interesse foi adicionado em uma concentração de 0,7 μM em cada caso. A Tabela 9 descreve detalhes adicionais de configuração experimental correspondente aos resultados de Western Blot mostrados na Figura 8 para o mAb (Figura 8, painel superior) e a proteína recombinante (Figura 8, painel inferior): TABELA 9

[00178] O meio condicionado foi preparado conforme descrito em Materiais e Métodos. O tempo de incubação foi de 24 h no caso do anticorpo IgG monoclonal e 1 h para a proteínas não anticorpo recombinante.

[00179] A Figura 8 (consultar o painel superior) mostra que uma banda de proteína forte do mAb intacto está presente no controle positivo (+) (consultar a raia 2). Nenhum mAb cortado é observado. No controle negativo (-) (consultar as raias 3 e 8), uma segunda banda de proteína de intensidade mais alta aparece ligeiramente abaixo da proteína intacta, indicando que o anticorpo monoclonal é significativamente cortado no meio condicionado de células do tipo selvagem derivadas de CHO-K1. Os mAb intacto e cortado são marcados com setas. O mesmo padrão que no controle negativo (-) é visto no meio quimicamente definido em que MT-SP1 de camundongo foi adicionada (consultar a raia 4). Em relação às proteínas não anticorpo recombinante (consultar a Figura 8, painel inferior), no controle positivo (+) (consultar a raia 2), uma banda forte é vista para as duas glicovariantes de proteína intacta em cerca de 37 kDa. Essas bandas de proteína para as glicovariantes de proteína intacta vistas no controle positivo desapareceram no controle negativo (-) e novas bandas de proteína para as glicovariantes de proteína cortada apareceram (consultar as raias 3 e 8).

[00180] Em relação às amostras que foram incubadas na presença de Fab anti-MT-SPI, 1 μM do Fab já foi suficiente para abolir completamente a degradação do mAb pela MT-SP1 de camundongo (Figura 8, painel superior, raia 5). 1 μM do Fab anti-MT-SP1 também reduziu, mas não pôde impedir completamente, o corte do mAb no meio condicionado (consultar o painel superior, raia 9). O corte do mAb foi abolido no meio condicionado a uma concentração de Fab de 10 μM e 50 μM (Figura 8, painel superior, raias 10 e 11). Para a proteína recombinante incubada com MT-SP1 de camundongo recombinante em meio quimicamente definido, o corte foi reduzido já a uma concentração de 1 μM de Fab (consultar a Figura 8, painel inferior, raia 5). Uma redução adicional do corte foi vista a 10 μM de Fab e uma interrupção completa de corte foi vista com 50 μM de Fab no meio quimicamente definido com MT-SP1 de camundongo recombinante adicionada assim como no meio condicionado (consultar a Figura 8, painel inferior, raias 6, 7 e 10 e 11). Portanto, o Fab elevado contra matriptase de ser humano também inibiu eficazmente matriptase de camundongo assim como de hamster. Entretanto, concentrações mais altas foram necessárias para observar a inibição completa da matriptase de camundongo e hamster. Assume-se que isso seja atribuível às diferenças de aminoácido entre a matriptase de ser humano e a de camundongo e hamster dentro do sítio de ligação a epítopo de modo que o Fab inibitório contra a matriptase de ser humano seja menos potente sobre a matriptase de camundongo e hamster de modo que concentrações mais altas do Fab sejam necessárias para inibir as mesmas.

VI. EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE PROTEÍNA EM LINHAGENS DE CÉLULAS knockout de matriptase

[00181] A fim de conformar os resultados dos experimentos de incorporação, diversos polipeptídeos de interesse foram expressos em um clone de célula knockout de matriptase e cultivo em batelada alimentada, e o corte do polipeptídeo de interesse expresso e secretado foi analisado e comparado com os resultados obtidos com uma linhagem de células do tipo selvagem CHO correspondente que expressa de modo endógeno matriptase intacta.

5.1. TRANSFECÇÃO DO VETOR DE CODIFICAÇÃO DE MAB

[00182] Uma linhagem de células do tipo selvagem CHO que expressa matriptase (derivada de CHO-K1) e o clone 4 de célula CHO knockout de matriptase (KO-4, consultar a tabela 5) foram transfectados com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um anticorpo monoclonal (mAb) e dois genes marcadores selecionáveis, a saber, neo e DHFR. Para transfecção, as células foram proliferadas até fase exponencial, e 5 x 106 células foram transfectadas com 3 μg DNA de vetor. Cinco réplicas de transfecção foram realizadas com o uso da linhagem de células do tipo selvagem e quatro réplicas de transfecção foram realizadas com o uso da linhagem de células KO-4. A seleção de células transfectadas estavelmente com o vetor que codifica a proteína de interesse foi realizada com G418 (concentração de G418 0,8 mg/ml) seguido por duas etapas consecutivas de seleção de MTX (500 nM e 1 μM de MTX). As condições de seleção foram idênticas para todos os agrupamentos e ambas as linhagens de células. Ao final da seleção (viabilidade celular > 95%), as células foram congeladas. Durante o processo de seleção, os títulos de mAb expresso no meio foram determinados. O título no sobrenadante das células knockout de matriptase foi comparado ao título das células do tipo selvagem CHO. Os resultados demonstraram que o knockout de matriptase não tem efeito negativo sobre a capacidade de produção das células, mas tem até mesmo uma tendência de aumentar o título.

5.2. PROCEDIMENTO DE PRODUÇÃO EM BATELADA A ALIMENTADA

[00183] Para produção em batelada alimentada, todos os quatro agrupamentos do clone knockout de matriptase KO-4 e os três agrupamentos de linhagem de células do tipo selvagem CHO com o título de anticorpo mais alto foram selecionados. As células congeladas dos sete agrupamentos foram descongeladas ao mesmo tempo e subcultivadas uma vez antes da inoculação nos reatores em batelada alimentada.

[00184] As células foram cultivadas em agitadores em batelada a alimentada contendo um meio químico definido enriquecido em aminoácidos, vitaminas e elementos residuais (Meio de Batelada Alimentada). O cultivo em batelada alimentada foi realizado à temperatura de 37 °C e agitação. Durante o cultivo em batelada alimentada, uma alimentação contendo glicose e aminoácidos (Alimentação de Batelada Alimentada) foi regularmente adicionada ao longo do processo. Durante o processo de cultivo em batelada alimentada, as amostras do material de cultura em batelada alimentada foram coletadas regularmente para determinar a densidade de células viáveis (vcd) com o uso de um analisador de viabilidade celular Vi-Cell (Beckman Coulter) e para determinar os títulos de proteína no meio de cultura celular. Ao final da batelada alimentada (dia 13 ou 14), o processo de cultivo foi interrompido. O meio condicionado do frasco de agitação (100 ml de cultura) foi coletado e filtrado com o uso de um filtro Steriflip de 0,22 μm. O anticorpo monoclonal foi purificado do meio condicionado filtrado com o uso de cromatografia líquida de afinidade de proteína A (Mini Colunas de Proteína A, Proteus, cat. PUR008). A purificação foi realizada com o uso do protocolo do fornecedor. A concentração de proteína das amostras após a purificação de proteína A foi determinada com o uso do sistema NanoDropTM (Thermo Scientific) de acordo com o protocolo do fornecedor. A análise das culturas em batelada alimentada revelou que, durante o período de cultivo de 14 dias, o título de mAb expresso no meio de cultura dos agrupamentos de KO-4 foi similar ou mesmo mais alto que no meio de cultura de agrupamentos de células do tipo selvagem CHO. Além disso, a viabilidade celular foi similar ou mesmo mais alta para os agrupamentos de células KO-4. As células KO também proliferaram em densidades celulares similares ou mesmo melhores. Esses resultados indicam que o knockout de matriptase não influencia negativamente a taxa de expressão de proteína e pode até mesmo intensificá-la. Adicionalmente, a proliferação celular não foi afetada negativamente, mas foi até mesmo aprimorada.

5.3. ANÁLISE DE CORTE

[00185] Para análise de corte, duas abordagens paralelas foram usadas: Eletroforese de microcircuito (ME) - SDS e espectrometria de massa.

ELETROFORESE DE MICROCIRCUITO

[00186] 5 μl da proteína purificada são usados para a preparação de amostra. Dependendo da concentração das amostras, a quantidade de proteína é diferente. Para a preparação de amostra de ensaio de microcircuito de redução, 5 μl são misturados com 35 μl de tampão de amostra de redução. Então, a solução misturada é incubada no bloco de calor por 15 min a 70 °C. Após o resfriamento da mesma, 70 μl de água MilliQ foram adicionados a um volume final de 110 μl. O instrumento LabChip® GX II da PerkinElmer foi usado como sistema. O protocolo usado é uma versão revisada do protocolo do fornecedor. A diferença principal é a razão entre amostra/tampão de amostra de redução, que é 1:7 no presente protocolo para melhor desnaturação em vez de 1:3,5 no protocolo do fornecedor.

[00187] A Figura 9 mostra o resultado da eletroforese de microcircuito. As primeiras três raias a partir da esquerda (identificadas como WT 1, 2 e 3) representam a composição de amostra de proteína da cultura celular purificada com proteína A das três produções com agrupamentos de célula do tipo selvagem CHO. Em cada amostra, o mesmo padrão de banda de proteína é observado. Uma banda ampla de proteína que representa a cadeia pesada intacta (HC) do anticorpo monoclonal foi observada (o tamanho do ensaio Labchip não é preciso e é usualmente superestimado). Diretamente abaixo dessa banda de proteína, uma segunda banda de proteína mais fina que representa a cadeia pesada cortada é observada. A espécie de HC cortada comigra com HC não glicolisada. Adicionalmente, uma terceira banda de proteína que representa a cadeia leve é observada a cerca de 29 kDa. Nas amostras de proteína do anticorpo monoclonal produzido nos agrupamentos de célula knockout de matriptase (identificados como KO-4 1, 2, 3 e 4), tanto a banda de proteína da cadeia pesada como da cadeia leve são pelo menos comparáveis se não mais fortes que as bandas de proteína encontradas nas amostras produzidas pelas linhagens de células do tipo selvagem CHO. Entretanto, a banda da cadeia pesada cortada identificada pela segunda seta a partir da parte superior da Figura 9 é dificilmente visível em todas as quatro amostras de anticorpo KO4-1, KO4-2, KO4-3 e KO4-4. Isso demonstra que o corte do mAb é quase abolido quando o mesmo é produzido em linhagens de células knockout de matriptase.

[00188] A fim de quantificar o resultado, a intensidade das bandas de proteína de cadeia pesada de anticorpo cortada e cadeia pesada de anticorpo intacta foi determinada, e, a partir disso, a porcentagem de corte foi calculada. O resultado dessa análise é resumido na Tabela 10. Isso mostra que a quantidade de corte do anticorpo monoclonal é drasticamente reduzida quando é usado o clone knockout de matriptase como linhagem de células de produção. De acordo com a análise, em média 16,1% da cadeia pesada de anticorpo monoclonal produzida pelos três agrupamentos de células do tipo selvagem CHO foram cortados. Em contraste, apenas 1% ou menos de corte ocorreu em média para a HC de mAb produzida nos quatro cultivos em batelada alimentados por knockout de matriptase. Devido à migração da HC não glicosilada, os valores exatos não podem ser determinados com base na análise LabChip®. TABELA 10: ANÁLISE DE CORTE COM BASE NA INTENSIDADE DE BANDA DE PROTEÍNA

[00189] Assim, com o uso de eletroforese de microcircuito, meramente 1% ou menos de corte é detectado em mAb expresso por célula com KO de matriptase, enquanto 12% a 20% de corte são detectados em células WT que expressam o mesmo mAb (corte detectado em HC).

ANÁLISE DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

[00190] As amostras foram desglicosiladas e reduzidas antes da análise por espectrometria de massa. De cada uma das sete amostras de proteína purificadas por proteína A, uma alíquota com uma proteína total de 50 μg foi incubada de um dia para o outro a 37 °C com 1,25 μl de PNGase F a uma concentração de 0,3 mg/ml em 50 mM de Tris/HCl pH 7,5. A concentração final da amostra foi cerca de 0,5 mg/ml. Após a desglicosilação, 88 μl das amostras digeridas com PNGase F foram reduzidos adicionando-se 112 μl de tampão de redução (8 M de GuHCl, 10 μl de Tris/HCl a 1M pH 7,5 e 2 μl DTT a 1M) e incubação por uma hora a 37 °C. A redução foi arrefecida bruscamente por adição de 2 μl de ácido trifluoroacético a 10%.

[00191] As amostras assim obtidas com um volume total de 202 μl e uma concentração de cerca de 0,22 mg/ml de proteínas foram, então, usadas para análise por cromatografia líquida e espectroscopia de massa combinadas. O instrumento de LC/MS foi o sistema Waters Synapt G2 acoplado a UPLC (software: MassLynx 4.1). O método de LC usou uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min e os tampões MPA (0,1% de TFA em água) e MPB (0,09% de TFA em acetonitrila). A detecção de UV foi realizada a 214 nm e 280 nm. A temperatura de amostra foi aproximadamente 5 °C. 14 μl da amostra desglicosilada e reduzida (quantidade de proteína 3 μg) foram carregados em uma coluna BEH C4 1,7 μm, 2,1 X 100 mm (Waters). A temperatura da coluna foi de 80 °C. Antes do carregamento de amostra, a coluna foi equilibrada com o tampão MPA. A eluição foi realizada com tampão MPB.

[00192] A proteína eluída foi, então, analisada adicionalmente por espectrometria de massa. Com o uso dos dados de LC/MS, os sítios de corte foram identificados e a porcentagem de espécies quantificada. A Tabela 11 mostra a porcentagem de cadeias pesadas de anticorpo cortadas com base em ensaio LC/MS em cada amostra de proteína. Enquanto nas amostras do tipo selvagem 20 a 29% de corte foram observados, apenas 2% ou menos da cadeia pesada do anticorpo foram cortados quando usadas as células knockout de matriptase para produção. Os resultados calculados com base em dados de UV 214 nm são ligeiramente mais altos em comparação àqueles obtidos a partir do ensaio LabChip de redução (consultar a Tabela 10). Entretanto, a redução forte que é atingida ao se aplicar os ensinamentos da presente revelação é novamente confirmada. Os resultados de LC/MS demonstram uma diminuição de 15 vezes no corte para os mAbs produzidos em linhagens de células knockout de matriptase. A análise do sítio de corte revelou que a cadeia pesada de mAb produzida nas células knockout de matriptase é cortada na mesma posição que a HC de mAb produzida nas linhagens de células do tipo selvagem CHO. A modelagem de proteína revelou, ainda, que o sítio de corte está localizado em uma área muito flexível do mAb que é exposta ao meio de cultura celular. Assim, mesmo proteases com uma baixa afinidade a esse sítio de corte podem facilmente acessar e clivar o mesmo. Essas conclusões podem explicar os eventos de corte residuais em cepas knockout de matriptase. TABELA 11: ANÁLISE DE CORTE COM BASE EM ENSAIO LC/MS

5.4. TRANSFECÇÃO DE WT E KO-4 COM GLICOPROTEÍNAS ADICIONAIS

[00193] Exemplos adicionais foram realizados para demonstrar novamente que o knockout de matriptase introduzido não afeta negativamente o nível de produção e a qualidade do produto de glicoproteínas recombinantes. Duas glicoproteínas diferentes de um anticorpo (aqui uma proteína de fusão de Fc assim como uma proteína terapêutica recombinantes) foram expressas. A linhagem de células knockout de matriptase KO-4 e a linhagem de células do tipo selvagem CHO da qual o clone KO-4 foi derivado foram transfectadas com vetores de expressão adequados. Após a transfecção e a seleção, título e analítica de proteína (por exemplo, conforme descrito acima no capítulo 5.3) foram realizados.

[00194] Os títulos de proteína atingidos pela linhagem de células com KO de matriptase KO-4 estavam na mesma faixa ou eram superiores àqueles na linhagem de células WT correspondente da qual o clone KO-4 foi derivado (consultar também a Tabela 12). O corte foi mais uma vez reduzido significativamente nas proteínas tais como a proteína de fusão de Fc obtida a partir das células KO vs. as proteínas tal como a proteína de fusão de Fc obtida a partir das células WT (consultar também a Tabela 13). Isso mostra claramente que um KO do gene de matriptase reduziu a degradação proteolítica para uma variedade de polipeptídeos adicionais. TABELA 12: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DE FC E UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA RECOMBINANTE TABELA 13: ANÁLISE DE CORTE DE UMA PROTE NA DE FUSÃO DE FC E UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA RECOMBINANTE

[00195] Em geral, a linhagem de células com KO de matriptase mostrou características similares ou mesmo aprimoradas para a produção de glicoproteínas. Portanto, as respectivas linhagens de células são adequadas para a produção de polipeptídeos proteolíticos sensíveis, assim como para a produção de polipeptídeos proteolíticos insensíveis. Assim, é fornecida uma linhagem de células universal que simplifica a produção de diferentes polipeptídeos de interesse.

VII. EXEMPLO 6: ADEQUABILIDADE DE PROCESSO A MONTANTE E AUMENTO EM ESCALA DE BIORREATOR

[00196] A fim de mostrar a adequabilidade da linhagem de células knockout de matriptase a sofrer aumento em escala para produção terapêutica em grande escala, 12 clones progenitores derivados de duas abordagens de KO de matriptase diferentes (tecnologia ZFN e TALEN) foram avaliados em uma abordagem de triagem de três estágios. A linhagem de células do tipo selvagem CHO foi usada para comparação.

6.1. AVALIAÇÃO DE DESEMPENHO DE CLONE PROGENITOR 6.1.1. COMPARAÇÃO DE DESEMPENHO DE CLONE PROGENITOR DURANTE EXPANSÃO CELULAR

[00197] A fim de avaliar o desempenho de 12 clones com KO não transfectadas (sete subclones de ZFN (gerados através de seleção de célula única do cone com KO de ZFN descrito no Exemplo 2b) e cinco derivados de TALEN) e da linhagem de células do tipo selvagem do comparador durante a expansão para produção em grande escala, a série de sementes foi avaliada em frascos de agitação com o uso de dois meios de expansão de cultura, que diferiram na concentração de uma vitamina essencial. Portanto, os clones foram inoculados para ambos os meios de expansão em densidade de células viáveis definida e cultivados por quatro dias a 36,5 °C. Os clones foram analisados em relação às densidades de células viáveis finais, taxas de proliferação médias, conforme descrito na Tabela 14. Juntamente com os resultados de uma avaliação de adequabilidade dos clones progenitores com o uso de meio de estágio de produção (Capítulo 6.1.2), os sete clones com melhor desempenho foram selecionados para comparação adicional em relação às capacidades de produção (consultar o Capítulo 6.2). TABELA 14: RESULTADOS DE DESEMPENHOS DE CLONE PROGENITOR DURANTE EXPANSÃO CELULAR

6.1.2. COMPARAÇÃO DE DESEMPENHO DE CLONE PROGENITOR SOB CONDIÇÕES DE PRODUÇÃO

[00198] Os 12 clones progenitores e a linhagem de células do tipo selvagem de referência foram, ainda, comparados em um processo de produção em batelada alimentada em frasco de agitação. As células do estudo de expansão no capítulo 6.1.1. foram cultivadas a 36,5 °C por 14 dias com o uso de duas condições de cultivo diferentes (dois meios de produção quimicamente definidos diferentes, densidades de células de inoculação e regimes de alimentação). A alimentação com duas soluções de alimentação independentes foi executada por todo o processo em perfil predefinido e um desvio de temperatura foi aplicado. As densidades celulares, as viabilidades e os metabólitos chave foram monitorados em diariamente e usados para comparar os clones KO aos clones WT em relação à adequabilidade para produção. Foram identificados sete clones que atingiram um desempenho de proliferação similar ou superior à linhagem de células do tipo selvagem, enquanto os perfis de metabólito foram comparáveis.

6.2. TRIAGEM EM FRASCO DE AGITAÇÃO DE AGRUPAMENTOS TRANSFECTADOS

[00199] Os 7 melhores clones progenitores conforme identificados no Capítulo 6.1 e o tipo selvagem CHO foram transfectados em triplicata com um anticorpo IgG monoclonal como o polipeptídeo de interesse que se sabia ser sensível à degradação proteolítica no fundamento da linhagem de células do tipo selvagem. As células transfectadas foram avaliadas com o uso de cultivo em frasco de agitação e duas condições diferentes conforme descrito no Capítulo 6.1.2. A proliferação de células (densidades de células viáveis, viabilidades celulares) e a formação de produto foram monitoradas durante o cultivo. As células derivadas da abordagem de knockout por TALEN mostraram proliferação celular similar ou aumentada em comparação com as células do tipo selvagem CHO, segundo o qual agrupamentos derivados de ZFN mostraram proliferação celular ligeiramente mais baixa durante a fase exponencial em comparação aos agrupamentos derivados de TALEN. Entretanto, a viabilidade celular ao final do cultivo foi comparável para todos os clones. A produtividade volumétrica ao final do cultivo foi em média 19% mais alta para TALEN e 9% mais alta para agrupamentos de nuclease de dedo de zinco em comparação à produtividade dos agrupamentos do tipo selvagem CHO.

[00200] Ao final do cultivo (dia 14), o anticorpo IgG monoclonal foi analisado quanto à integridade. Portanto, os sobrenadantes foram coletados por centrifugação e sofreram filtragem estéril. O anticorpo IgG monoclonal foi capturado a partir dos sobrenadantes e analisado por CE-SDS (Eletroforese Capilar-Dodecil Sulfato de Sódio) para degradação proteolítica e por CEC (cromatografia de troca de cátions) para avaliar a distribuição variante de carga. Todos os agrupamentos derivados dos clones knockout mostraram um nível similarmente baixo de aproximadamente 1% de corte de polipeptídeo, enquanto o produto derivado do tipo selvagem CHO foi clivado em torno de 21%.

6.3. TRIAGEM EM BIORREATOR DE SUBCLONES PROGENITORES E AGRUPAMENTOS TRANSFECTADOS

[00201] Os quatro clones progenitores e agrupamentos transfec- tados de melhor desempenho conforme identificados nos capítulos 6.1. e 6.2. foram selecionados para caracterização em profundidade com o uso das condições de cultivo controladas de biorreatores de vidro de 7 l. O processo de cultivo foi essencialmente conforme descrito no Capítulo 6.1.2., embora apenas as condições de cultivo preferenciais conforme identificadas no Capítulo 6.2 tenham sido usadas. Uma proliferação ligeiramente mais baixa foi vista para os agrupamentos transfectados em relação aos clones progenitores não transfectados, o que é um fenômeno conhecido atribuído à carga metabólica causada pela expressão de polipeptídeo. Entretanto, nenhuma diferença significativa em comportamento de proliferação celular foi encontrada em comparação com a linhagem de células WT. Metabólitos, tal como lactato e amônio, estavam dentro das faixas comuns e similares à linhagem de células do tipo selvagem.

[00202] A qualidade do produto foi analiticamente avaliada quanto à pureza por SEC, CEC e CE-SDS e N-glicosilação por um método patenteado. Os resultados mostraram que todos os clones KO atingiram qualidade do produto comparável em termos de produtos de agregação e desagregação, distribuição de variante de carga e padrão de glicosilação. Os resultados reduzidos de CE-SDS mostraram que as espécies cortadas estão presentes para todos os subclones KO a um nível baixo de 0,7%. Todos os clones KO não apenas mostraram características de proliferação similares ou preferenciais em comparação à linhagem de células do tipo selvagem de referência como também produziram polipeptídeo de qualidade consistentemente melhor.

Claims (30)

1. Método para produzir de forma recombinante um polipep- tídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar células hospedeiras de vertebrados sob condições que permitem a expressão e secreção do polipeptídeo de interesse no meio de cultura de células; (b) isolar o polipeptídeo de interesse do meio de cultura de células; em que as células hospedeiras de vertebrado são células de vertebrado isoladas adequadas para expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse, em que as células de vertebrado são alteradas para enfraquecer o efeito de matriptase, em que o efeito de matriptase é enfraquecido em razão da expressão funcional do gene de matriptase ser reduzida ou eliminada nas ditas células por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores, e em que as células de vertebrado compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão, em que as células de vertebrado secretam o polipeptídeo de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (c) processar o polipeptídeo de interesse isolado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o genoma das células de vertebrado é alterado para enfraquecer a função da protease matriptase endógena, e/ou em que pelo menos uma ou todas as cópias do gene de matriptase são deletadas ou funcionalmente inativadas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que apresenta uma ou mais das características a seguir: (a) as células de vertebrado compreendem uma ou mais mutações em pelo menos uma cópia ou todas as cópias do gene de matriptase para fornecer um produto de expressão menos ou não funcional; e/ou (b) as células de vertebrado compreendem uma ou mais mutações no promotor, na 5'UTR, na 3'UTR e/ou outros elementos reguladores do gene de matriptase.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais mutações estão compreendidas em uma região de codificação do gene de matriptase e resultam em um produto de expressão menos ou não funcional.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações estão compreendidas em uma sequência de polinucleotídeos do gene de matriptase que codifica o éxon 2 de matriptase ou que as uma ou mais mutações estão compreendidas em uma sequência de polinucleotídeos do gene de matriptase que codifica pelo menos parte do domínio catalítico de matriptase, segundo o qual um produto de expressão menos ou não funcional é obtido.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que (i) a matriptase endógena inalterada apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 5; e/ou (ii) enfraquecer o efeito da matriptase nas referidas células reduz ou elimina o corte do polipeptídeo de interesse secretado.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as células de vertebrado apresentam uma ou mais das características a seguir: (a) as células de vertebrado são células de mamífero; (b) as células de vertebrado são células humanas; (c) as células de vertebrado são células de roedor; (d) as células de vertebrado são célula de hamster; (e) as células de vertebrados são: (i) células de roedor, (ii) células humanas selecionadas dentre o grupo que consiste em células HEK293, células MCF-7, células PerC6, células CAP, células hematopoiéticas humanas e células HeLa, ou (iii) células de macaco selecionadas dentre o grupo que consiste em células COS, células COS-1, células COS-7 e células Vero, (f) as células de vertebrado são célula CHO; e/ou (g) as células de vertebrado são células de mamífero fornecidas como clone de célula ou linhagem de células.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de vertebrado são células CHO que compreendem uma ou mais mutações da fase de leitura no éxon 2 de um ou ambos os alelos do gene de matriptase.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse tem uma ou mais das características a seguir: (a) é um polipeptídeo terapeuticamente ativo ou diagnóstico; (b) é suscetível a corte por proteases; (c) compreende pelo menos um sítio de corte para matriptase; (d) é um glicopolipeptídeo; e/ou (e) é selecionado dentre o grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, proteínas de fusão de Fc, fragmentos Fab, complexos proteicos, peptidases, peptídeos de sinalização, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse está integrado no genoma das células de vertebrado isoladas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter está adicionalmente integrado ao genoma das referidas células.

13. Método para produzir uma célula de vertebrado isolada adequada para a expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse e alterada para enfraquecer o efeito da matriptase, em que o efeito da matriptase é enfraquecido porque a expressão funcional do gene da matriptase é reduzida ou eliminada na referida célula por knockout do gene, mutação do gene, deleção do gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores, e em que a célula de vertebrado compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão, em que a célula de vertebrado secreta o polipeptídeo de interesse, o método caracterizado pelo fato de que compreende alterar uma célula de vertebrado para enfraquecer o efeito de matriptase reduzindo-se ou eliminando-se a expressão funcional do gene de matriptase na dita célula por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores e introduzindo-se o polinucleotídeo compreendido em um cassete de expressão e que codifica o polipeptídeo de interesse.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula de vertebrado tem uma ou mais das seguintes características: (a) a célula de vertebrado é uma célula de mamífero; (b) a célula de vertebrado é uma célula humana; (c) a célula de vertebrado é uma célula de roedor; (d) a célula de vertebrado é uma célula CHO; e/ou (e) a célula de vertebrado é uma célula de mamífero fornecida como clone de célula ou linhagem celular.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, carac-terizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse tem uma ou mais das seguintes características: (a) é um polipeptídeo terapeuticamente ativo ou de diagnóstico; (b) é suscetível ao corte por proteases; (c) compreende pelo menos um sítio de corte para matriptase; (d) é um glicopolipeptídeo; e/ou (e) é selecionado dentre o grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, proteínas de fusão Fc, fragmentos Fab, complexos de proteínas, peptidases, peptídeos de sinalização, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse está integrado no genoma da célula de vertebrado.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou o polipéptido repórter é adicionalmente integrado no genoma da referida célula.

18. Método para selecionar uma célula hospedeira, que expressa de modo recombinante um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer células de vertebrado isoladas como células hospedeiras, em que as células de vertebrados são adequadas para a expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse, em que as células de vertebrados são alteradas para enfraquecer o efeito da matriptase, em que o efeito da matriptase é enfraquecido porque a expressão funcional do gene da matriptase é reduzida ou eliminada nas referidas células por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores, e em que as células de vertebrado compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão, em que as células de vertebrados secretam o polipeptídeo de interesse; e (b) selecionar uma ou mais células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de interesse.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o estágio (a) compreende transfectar as células de vertebrado em que a função da protease matriptase endógena está enfraquecida com o pelo menos um polinucleotídeo compreendido em um cassete de expressão e que codifica o polipeptídeo de interesse para fornecer as células hospedeiras de vertebrado.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que apresenta uma ou mais das características a seguir: (a) as células de vertebrado são células de mamífero; (a) as células de vertebrado são células CHO; (c) as referidas células hospedeiras fornecidas no estágio (a) compreendem ainda pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável, e o estágio (b) compreende cultivar a referida pluralidade de células hospedeiras sob condições seletivas para o marcador selecionável; (d) polinucleotídeos são introduzidos nas células de vertebrado transfectando-se um ou mais vetores de expressão; (e) o estágio (b) compreende uma ou múltiplas etapas de seleção; (f) o estágio (b) compreende realizar uma seleção baseada em citometria de fluxo; (g) o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse é integrado no genoma das células de vertebrado isoladas; e/ou (h) o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse é integrado no genoma das células de vertebrado isoladas e em que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter é ainda integrado no genoma das referidas células.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse tem uma ou mais das seguintes características: (a) é um polipeptídeo terapeuticamente ativo ou de diagnóstico; (b) é suscetível ao corte por proteases; (c) compreende pelo menos um sítio de corte para matriptase; (d) é um glicopolipeptídeo; e/ou (e) é selecionado dentre o grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, proteínas de fusão Fc, fragmentos Fab, complexos de proteínas, peptidases, peptídeos de sinal, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas.

22. Método para selecionar uma célula de vertebrado para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse secretado, caracterizado pelo fato de que compreende analisar se a protease matriptase endógena é funcionalmente expressa na célula de vertebrado e selecionar uma célula de vertebrado na qual o efeito de tal matriptase endógena é enfraquecido por redução ou eliminação de expressão funcional do gene de matriptase por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores para a produção recombinante do polipeptídeo de interesse secretado.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula de vertebrado tem uma ou mais das seguintes características: (a) a célula de vertebrado é uma célula de mamífero; (b) a célula de vertebrado é uma célula humana; (c) a célula de vertebrado é uma célula de roedor; (d) a célula de vertebrado é uma célula de hamster; (e) a célula de vertebrado é: (i) uma célula de roedor, (ii) uma célula humana selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula HEK293, uma célula MCF-7, uma célula PerC6, uma célula CAP, células hematopoiéticas humanas e uma célula HeLa, ou (iii) uma célula de macaco selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula COS, uma célula COS-1, uma célula COS-7 e uma célula Vero, (f) a célula de vertebrado é uma célula CHO; e/ou (g) a célula de vertebrado é uma célula de mamífero fornecida como clone celular ou linhagem celular.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, carac-terizado pelo fato de que a célula selecionada compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão, em que a célula de vertebrado secreta o polipeptídeo de interesse.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse está integrado no genoma da célula selecionada.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter é ainda integrado no genoma da referida célula.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse tem uma ou mais das seguintes características: (a) é um polipeptídeo terapeuticamente ativo ou de diagnóstico; (b) é suscetível ao corte por proteases; (c) compreende pelo menos um local de corte para matriptase; (d) é um glicopolipeptídeo; e/ou (e) é selecionado dentre o grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, proteínas de fusão Fc, fragmentos Fab, complexos de proteínas, peptidases, peptídeos de sinalização, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas.

28. Uso de uma célula de vertebrado, caracterizado pelo fato de que é para produção recombinante de um polipeptídeo de interesse que é secretado da célula de vertebrado, em que a célula usada é alterada para enfraquecer o efeito da protease matriptase endógena, em que o efeito de matriptase é enfraquecido devido ao fato de que a expressão funcional do gene de matriptase é reduzida ou eliminada na dita célula por knockout de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula de vertebrado tem uma ou mais das seguintes características: (a) a célula de vertebrado é uma célula de mamífero; (b) a célula de vertebrado é uma célula CHO; (c) a célula de vertebrado compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse compreendido em uma cassete de expressão; (d) a célula de vertebrado compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão integrado no genoma da célula; (e) a célula de vertebrado compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o polipeptídeo de interesse compreendido em um cassete de expressão integrado no genoma da célula e em que pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter é integrado adicionalmente no genoma da referida célula.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracte-rizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse tem uma ou mais das seguintes características: (a) é um polipeptídeo terapeuticamente ativo ou de diagnóstico; (b) é suscetível ao corte por proteases; (c) compreende pelo menos um sítio de corte para matriptase; (d) é um glicopolipeptídeo; e / ou (e) é selecionado dentre o grupo que consiste em glicoproteínas, anticorpos, proteínas não IgG, proteínas de fusão Fc, fragmentos Fab, complexos de proteínas, peptidases, peptídeos de sinalização, nanocorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, fatores sanguíneos e enzimas.