KR102307278B1 - 신규 척추동물 세포 및 관심 폴리펩티드의 재조합적 발현 방법 - Google Patents
신규 척추동물 세포 및 관심 폴리펩티드의 재조합적 발현 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 특히, 관심 폴리펩티드의 재조합 발현에 적합한 단리된 척추동물 세포에 관한 것인데, 이러한 척추동물 세포는 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변경시키고, 상기 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 관심 폴리펩티드가 상기 세포에 의해 분비된다. 관심 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위하여 각각의 척추동물 세포를 사용하면, 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 개선된 생성 및 스크리닝 방법이 제공된다.
Description
본 개시내용은 재조합 발현 기술 분야에 관한 것이다. 이는 특히, 변경된 척추동물 세포 및 재조합 발현 방법에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 관심 폴리펩티드가 상기 변경된 세포에서 재조합적으로 발현된 다음 세포 배양 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 세포 배양 배지에서 재조합적으로 발현된 관심 폴리펩티드의 클리핑(clipping)이 상당히 저하되거나 또는 심지어 완전히 방지된다.
바이오의약품에 대한 시장은 빠른 속도로 성장을 지속하고 있는데, 이는 바이오의약품이 현재의 의약에 점점 더 중요해지기 때문이다. 현재, 상당 수의 바이오의약품이 척추동물 세포, 예컨대 특히 포유류 세포에서 생산된다. 바이오의약품은 항체, 항체 단편, ADC (항체 약물 접합체), 나노보디(nanobody), Fc-융합 단백질, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 효소 및 기타 치료 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 재조합 비-항체 치료 단백질의 발현에 대한 중요성이 더 증가하고 있다. 더욱이, 폴리펩티드를 포유류 세포에서 재조합 발현시키는 것이 또한, 높은 관심을 보이는 기타 사용 분야이다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드의 생산 비용을 고려해 볼 때, 고 발현성 포유류 세포주를 확보하는 것이 중요하다. 관심 폴리펩티드는 포유류 세포에서 발현되고 이러한 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되고, 그로부터 상기 폴리펩티드가 수거된다.
재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 척추동물 세포, 예컨대 포유류 세포를 이용하는 경우에 직면하게 되는 한 가지 주요 문제점은 세포 배양 배지에서 상기 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드가 단백질 분해적으로 분해된다는 것이다 ("클리핑"으로서 지칭되기도 함). 생산을 위해 사용된 척추동물 세포로부터 유래되는 프로테아제가 상기 세포 배양 배지에서 활성이고, 그의 단백질 분해적 활성이, 재조합적으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드를 분해시킴으로써, 변경된, 예를 들어 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 관심 폴리펩티드가 되도록 할 수 있다. 이러한 숙주 세포 관련 단백질 분해적 분해는 폴리펩티드의 재조합 발현에 있어서의 주요 장애물 중 하나이다. 예를 들어 IgG 항체는 가변 영역에서 클리핑될 수 있기 때문에, IgG 항체도 영향을 받을 수 있지만, 단백질 분해적 분해, 즉 클리핑은 비-IgG 폴리펩티드를 이용하는 경우에 훨씬 더 높은 빈도로 일어난다. 이러한 비-IgG 폴리펩티드, 특히 글리코폴리펩티드는 상대적으로 노출된 3차원적 구조로 인해, 단백질 분해적 분해에 대해 매우 감수성일 수 있다. 재조합적으로 발현된 비-IgG 폴리펩티드의 클리핑은 100% 값까지 도달할 수 있다. 클리핑은 의도하는 목적에 유용하지 않은 불활성 및/또는 면역원성 폴리펩티드를 초래할 수 있다. 더욱이, 단백질 분해적 분해가 특정 비율로만 일어나는 경우일지라도, 클리핑된 폴리펩티드는 의도하는 목적에 사용될 수 없으므로, 유용한 관심 재조합 폴리펩티드의 수율을 저하시킨다. 부가적으로, 많은 적용에 대하여, 상기 클리핑된 폴리펩티드는 정제 동안 제거되어야 한다. 이를 위해서는, 클리핑된 폴리펩티드를 무손상 폴리펩티드로부터 분리시킬 수 있는 정제 방법을 구체적으로 개발할 필요가 있는데, 이는 노동 집약적이고 비용이 많이 들 수 있으며, 종종 성공적이지 못할 수도 있어 클리핑된 단백질이 여전히 불순물로서 존재하기도 한다. 따라서, 세포 배양 배지에서 발현된 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해는, 관심 폴리펩티드를 척추동물 세포에서 재조합적으로 생성하는 경우에 주요 쟁점 사항이다.
몇 가지 연구는 이러한 문제에 대한 해결책을 제공하기 위해 클리핑 현상을 조사하였다. 클리핑은 시간 및 온도 의존적인 것으로 밝혀졌고, 열 처리에 의해 불활성화될 수 있었다. 그러나, 지금까지 재조합 발현을 위해 사용된 척추동물 숙주 세포에 의해 발현된 프로테아제와, 클리핑에 대해 책임이 있는 프로테아제에 관해서는 거의 공지되어 있지 않다. 주요 문제 중 하나는 척추동물 숙주 세포에 의해 발현된 프로테아제의 수이다. 예를 들어, 700개 초과의 프로테아제가 설치류 세포 게놈에 존재하는 것으로 공지되어 있는데, 그들 중 상당수가 클리핑에 관여할 수 있었다.
클리핑의 문제점을 극복하기 위한 몇 가지 접근 방식이 선행 기술분야에서 제안되었다. 클리핑을 피하기 위한 한 가지 접근 방식은 클리핑되기 쉬운 아미노산 모티프를 제거하기 위해 이미 영향받은 단백질을 재조작하는 것이다. 그러나, 이러한 접근 방식은 시간 소모적이고; 선택된 접근 방식이 성공적이었는지를 광범위하게 시험할 필요가 있으며; 상기와 같이 재조작된 단백질이 여전히 기능적이고, 다른 부위에서는 클리핑이 나타나지 않으며 면역원성이 아니라는 사실을 보장해주지 못한다. 세포 배양물에서 프로테아제 활성을 제어하기 위한 상이한 방식은 억제제 또는 대체 기질을 배양 배지에 부가하는 것이다. 그러나, 대규모 제조 공정에서는 이러한 첨가제가 비용이 많이 들고, 정제 동안 이를 제거해야한 하는데, 이를 위해서는 첨가제가 전혀 남아있지 않다는 것을 모니터링하기 위한 감수성 검정과 정제 방법을 구체적으로 개발할 필요가 있다. 세포 배양 배지에서 발현된 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해를 저하시키기 위한 다른 방식은 세포 배양 배지 중의 프로테아제에 대한 관심 폴리펩티드의 노출을 제한하기 위해 수거 시간을 선택하거나 (조기 수거), 배양물의 온도를 강하하거나, pH 조건을 최적화하거나, 또는 세포내 프로테아제가 세포 배양 배지 내로 방출되는 것을 저하시키기 위해 세포 생존능력을 개선시키는 것을 포함한다. 더욱이, 생산 숙주 세포로서 사용된 척추동물 세포주를 선택하는 것이, 각각의 세포주에 의해 발현되는 프로테아제 및 발현시키고자 하는 개개의 관심 폴리펩티드에 따라서 클리핑에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 한 가지 옵션은 관심 폴리펩티드의 클리핑이 일어나지 않거나 또는 덜한 정도로 일어나는 세포주를 확인하기 위하여 상이한 세포주들을 스크리닝하는 것이지만, 이는 시간 소모적이고 생산 공정을 상기 선택된 세포주에 적응시킬 필요가 있을 수 있다. 비록 이들 상이한 옵션이 클리핑을 저하시킬 수는 있지만, 단백질 분해적 분해를 거의 완전히 제거하지는 못할 것이다. 더욱이, 클리핑의 문제를 피하거나 또는 적어도 감소시켜 주고 무손상 관심 폴리펩티드를 충분한 수율과 순도로 제공해 주는 생성 방법을 개발하기 위해서는, 많은 경우에 있어서 발현 및 생산 공정을, 발현시키고자 하는 개개의 관심 폴리펩티드에 대해 적응시키는 것이 필요하다. 그러나, 이러한 적응은 시간 소모적이고 비용이 많이 든다. 따라서, 클리핑 문제를 해결하기 위한 개선된 방식이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 배양 배지에서 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키거나 또는 제거시킨 척추동물 세포에서 관심 폴리펩티드를 재조합 생성하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 척추동물 세포에 의해 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하되거나 또는 제거되는, 신규 척추동물 세포를 제공하는 것이다.
본 개시내용은 특히, 예를 들어 매트립타제(matriptase) 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써, 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시키면, 이러한 세포에서 발현되고 이에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해 ("클리핑")가 상당히 저하된다는 예상치 못한 발견에 근거한다. 따라서, 상기 세포에서 매트립타제의 효과를 손상시키면, 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 상응하는 척추동물 세포와 비교해서 상기 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다. 매트립타제를 이용하여, 재조합적으로 발현되고 분비된 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제를 확인하였다. 매트립타제의 효과를 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시키면, 세포 배양 배지에서 재조합적으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키거나 또는 제거함으로써 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 상당히 개선시킬 수 있다. 이로써, 무손상 관심 폴리펩티드의 수율이 증가된다. 본 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 이들 유리한 효과는 다른 프로테아제의 기능을 손상시킨 경우에는 관찰되지 않는데, 이는 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 확증시켜 준다. 본 개시내용에 의해 제공된 신규 척추동물 세포는 단백질 분해적 부위를 제거하기 위해 또는 클리핑을 저하 또는 방지하도록 생산 공정을 힘들게 적응시키기 위해 또는 클리핑된 단백질을 제거하도록 특이적 정제 공정을 설계하기 위해, 발현시키고자 하는 관심 폴리펩티드를 재조작할 필요성을 없애준다. 유리하게, 본원에 기재된 이들 변경된 척추동물 세포는, 특히 클리핑되기 쉬운 관심 폴리펩티드를 포함한, 상이한 관심 폴리펩티드를 발현시키기 위한 만능 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 발현시키고자 하는 폴리펩티드 또는 발현 시스템을 특이적으로 적응시키는 것은 더 이상 쓸모가 없게 되어, 시간과 비용이 절약된다. 더욱이, 본 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 개시내용에 의해 제공된 상기 변경된 척추동물 세포는 우수한 성장과 발현 특징을 나타낸다. 따라서, 매트립타제의 효과를 손상시키는 것이 또한, 관심 폴리펩티드의 재조합 발현에 중요한 유리한 발현 특징을 숙주 세포에 제공해 준다. 따라서, 본 발명은 선행 기술분야에 중요한 기여를 한다.
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은 관심 폴리펩티드의 재조합 발현에 적합한 단리된 척추동물 세포를 제공하는데, 이러한 척추동물 세포는 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경되고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 관심 폴리펩티드를 분비한다. 상기 척추동물 세포는, 예를 들어 유전자 침묵, 유전자 결실시키거나 또는 매트립타제 유전자를 돌연변이시켜 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 발현되도록 함으로써, 상기 척추동물 세포에서의 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨다. 상기 척추동물 세포에서의 매트립타제의 효과를 손상시키면, 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 상응하는 척추동물 세포와 비교해서 상기 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다. 특히 스파이크-인(spike-in) 실험에 근거한 실시예에 의해 제시된 바와 같이, 매트립타제의 효과를 손상시킨 각각의 변경된 척추동물 세포를 배양하는 경우에 수득되는 세포 배양 배지의 상등액에서는, 비록 다른 프로테아제는 이러한 상등액에서 여전히 활성일지라도, 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑은 놀랍게도 고도로 저하된다. 이들 결과는 매트립타제의 효과를 손상시킨 각각의 변경된 세포에서 몇 가지 관심 폴리펩티드를 발현시킴으로써 확증되었다. 이들 결과는 매트립타제가 재조합적으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 사실을 확증시켜 준다. 따라서, 제1 측면에 따르는 척추동물 세포는 재조합 생성 기술에 대한 숙주 세포로서 특히 적합하고, 척추동물 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 폴리펩티드 (이어서, 상기 세포 배양 배지로부터 이러한 관심 폴리펩티드를 수거할 수 있다)를 재조합 생성하는 데 사용할 수 있다.
제2 측면에 따르면, 본 개시내용은 매트립타제의 효과를 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시키는 단계; 및 발현시키고자 하는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 (여기서, 상기 관심 폴리펩티드는 상기 척추동물 세포에 의해 분비된다)를 포함하는, 제1 측면에 따르는 척추동물 세포의 생성 방법을 제공한다. 상기 효과를 손상시키는 것은, 예를 들어 유전자 침묵, 유전자 결실시키거나 또는 매트립타제 유전자를 돌연변이시켜 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 발현되도록 함으로써, 상기 세포에서의 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 달성될 수 있다.
제3 측면에 따르면, 관심 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 제1 측면에 따르는 척추동물 세포를 활용하는 단계를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다. 상기 언급된 바와 같이, 세포 배양 배지에서의 폴리펩티드 클리핑의 수준 저하가 달성되었기 때문에, 이들 변경된 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드, 특히 클리핑되기 쉬운 폴리펩티드, 예컨대 글리코폴리펩티드의 재조합 생성을 위한 숙주 세포로서 특히 적합하다. 바람직한 실시양태로서,
(a) 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 세포 배양 배지 내로의 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계;
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 상기와 같이 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다.
제4 측면에 따르면,
(a) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 세포 배양 배지 내로의 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계 (여기서, 세포 배양 배지는 매트립타제에 대해 선택적인 프로테아제 억제제를 포함한다);
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 상기와 같이 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다.
제5 측면에 따르면,
(a) 숙주 세포로서 제1 측면에 따르는 척추동물 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 관심 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 숙주 세포를 선별하는 방법이 제공된다.
제6 측면에 따르면, 본 개시내용은 특정 척추동물 세포로부터 분비되는 관심 폴리펩티드를 재조합 생성하기 위한, 상기 척추동물 세포의 용도에 관한 것인데, 이와 같이 사용된 세포는 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경된다. 각각의 변경된 세포는, 예를 들어 이러한 세포에 의해 발현되고 분비될 것으로 추정되는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있다. 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시킨 각각의 척추동물 세포를 사용하는 경우, 세포 배양 배지에서 활성인 기능적 매트립타제는 전혀 없거나 그 양은 감소된다. 이는 상기 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해를 상당히 저하시키거나 또는 심지어 없애준다. 따라서, 재조합 단백질 발현을 위해 상기 변경된 척추동물 세포를 사용하는 것이 유리하다.
제7 측면에 따르면, 본 개시내용은 내인성 프로테아제 매트립타제가 척추동물 세포에서 기능적으로 발현되는 지를 분석하는 단계; 및 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여, 상기 내인성 매트립타제의 효과를 손상시킨 척추동물 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여 척추동물 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다. 이러한 선별 공정은 관심 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있는 척추동물 세포를 확인시켜 줄 수 있는데, 여기서 세포 배양 배지 내에서의 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다. 각각의 척추동물 세포가 재조합 단백질 생성에 특히 적합하다.
본 출원의 다른 목적, 특색, 이점 및 측면은 다음 설명 및 첨부된 청구범위로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 그러나, 다음의 설명, 첨부된 청구범위, 및 구체적 실시예가 본원의 바람직한 실시양태를 표시하긴 하지만, 단지 한 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 개시된 발명의 요지 및 범위 내에서의 각종 변화 및 변형이 다음 설명의 판독으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1은 상이한 프로테아제 표적 유전자에 대항하여 유도된 siRNA로 형질감염시킨 CHO 세포를 배양함으로써 수득된 조건화 배지(conditioned medium)에서 수일 동안 인큐베이션한 2개의 치료 단백질 [상부 패널: IgG (mAb), 하부 패널: Fc-융합 단백질]에 대한 웨스턴 블롯을 도시한 것이다 (mAb의 경우에는 7일 동안 인큐베이션하고, Fc-융합 단백질의 경우에는 3일 동안 인큐베이션하였다). 제1 대조군 "(+)"은 세포와 접촉되지 않았던 화학적으로 규정된 배양 배지에서 상기와 동일한 시간 동안 인큐베이션한 관심 폴리펩티드의 샘플을 나타낸다. 대조군으로서 사용된 상기 화학적으로 규정된 배양 배지는 조건화 배지를 수득하기 위하여 세포를 배양하였던 배양 배지와 동일한 배양 배지였다. 제2 대조군 "(-)"은 siRNA 음성 대조군으로서 제공된 비-유효한 siRNA (125 pmol)로 형질감염시킨 CHO 세포로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션한 관심 폴리펩티드의 샘플을 나타낸다. 그들의 발현이 siRNA 형질감염에 의해 침묵된, 표적 트립신-유사 세린 프로테아제 및 상동체의 명칭은 상부 패널 위에 제공된다 [MT-SP1 (매트립타제; 본원에서 St14로서 지칭되기도 함), C1r (C1ra로서 지칭되기도 함), C1s (Gm5077로서 지칭되기도 함), Plat, 및 Prss35]. 조합물 "관심 폴리펩티드/침묵시킨 프로테아제 발현을 수반한 세포의 조건화 배지" 각각에 대하여, 상이한 siRNA 농도를 이용하는 2가지 실험 설정의 결과가 제시된다. 또한, 결정되어 도 1 아래의 괄호에 표시된 것은, 100%로서 설정된 siRNA 음성 대조군 세포 내에서의 프로테아제 유전자-발현과 비교한 잔류 프로테아제 유전자-발현의 비율 (%)이다. 이는, 예를 들어 MT-SP1 (18.6%)에 대해서는, 침묵시 잔류 유전자-발현이 18.6%였다는 것을 의미한다. MT-SP1: 125 pmol (18.6%) 및 150 pmol (18.2%), C1r (C1ra): 125 pmol (6.3%) 및 150 pmol (6.7%), C1s (Gm5077): 100 pmol (11.9%) 및 125 pmol (14.4%), Plat: 125 pmol (8.3%) 및 150 pmol (5.1%) 및 Prss35: 100 pmol (18.4%) 및 125 pmol (14.8%). 이들 결과는 MT-SP1 mRNA 수준이 RNA 간섭에 의해 하향 조절되는 경우에는, 조건화 배지에서 클리핑이 상당히 덜 발생되었다는 사실을 입증해준다 (mAb 및 Fc-융합 단백질에 대하여 검출됨). 발현된 다른 트립신-유사 세린 프로테아제가 하향 조절된 경우에는, 클리핑이 여전히 그대로였다. 따라서 상기 결과는 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 입증해준다.
도 2는 CHO-K1 유래 세포에서 매트립타제 유전자의 엑손 2 + 플랭킹 인트론 영역의 서열을 도시한 것이다. 서열 분석용 프라이머 (흘림체, 볼드체 및 밑줄침)는 플랭킹 인트론을 표적으로 하여 CHO-K1-유래 MT-SP1 엑손 2 서열 (회색으로 음영처리됨)을 확증하도록 설계되었다. 매트립타제 녹아웃(knock-out) 세포를 수득하기 위해 사용된 TALEN의 DNA 결합성 도메인의 결합 부위는 볼드체로 밑줄이 그어져 있고, 녹아웃 돌연변이에 대한 표적 영역은 볼드체로 이중 밑줄이 그어져 있다.
도 3은 CHO-K1 유래 매트립타제 녹아웃 세포 클론 KO-1 내지 KO-9 및 클론 Δ7/Δ15 및 CHO-K1 유래 야생형 세포주 (WT)에서 측정된 상대적 매트립타제 mRNA 발현을 나타내는 칼럼 다이아그램을 도시한 것이다. 야생형 CHO-K1 유래 세포주에서의 매트립타제 mRNA 발현을 100%로 규정하였다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 매트립타제 mRNA 발현은 모든 녹아웃 클론 및 클론 Δ7/Δ15에서 저하되었다.
도 4는 매트립타제를 상이한 돌연변이에 의해 녹아웃시킨 각종 상이한 CHO-K1 유래 세포 클론 (실시예 2, 특히 표 5 참조) 및 야생형 CHO-K1 세포 (WT)의 세포 배양 배지 상등액에서 인큐베이션한, 클리핑되기 쉬운 3가지 상이한 관심 폴리펩티드의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드 (각각 농도 0.7 μM)를, 야생형 CHO-K1 세포 (WT), 표 5에 제시된 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-9 (도 4에서 각각 숫자 1 내지 9로써 표시됨) 또는 세포와 접촉되지 않은 화학적으로 규정된 배지 (+)로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션하였다. 도 4A에서의 관심 폴리펩티드는 IgG (mAb)이고 인큐베이션 시간은 48h이었다. 도 4B에서의 관심 폴리펩티드는 Fc-융합 단백질이고, 인큐베이션 시간은 24h이었다. 도 4C에서의 관심 폴리펩티드는 2개의 당변이체를 수반한 추가의 재조합 단백질이고, 인큐베이션 시간은 1h이었다. 당변이체 둘 다는 야생형 CHO-K1 세포 (WT)로부터 수득된 조건화 배지에서 클리핑되었다. 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질이 화살표로써 표시된다. 도 4D는 3개월 동안 배양시킨 각각의 세포로부터 수득된 조건화 배지를 이용하여 상기 mAb로의 실험을 반복한 결과를 도시한 것이다. 인큐베이션 조건은 도 4A에서와 동일하였다. 그 결과는 클리핑이 매트립타제 녹아웃 세포 클론 KO-1 내지 KO-9로부터 수득된 조건화 배지에서 효율적으로 방지되었다는 것과, 이들 유리한 결과가 장기간 배양 동안 유지된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 5A 및 B는 클리핑되기 쉬운 2가지 상이한 바이러스 당단백질 (관심 폴리펩티드)의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드를, 매트립타제를 발현하는 CHO-K1 유래 세포주 (WT) 및 매트립타제를 녹아웃시킨 상이한 세포 클론 (KO-1 내지 KO-3)으로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션하였다. 관심 폴리펩티드를 0.7 μM의 농도로, 야생형 세포 (WT)로부터 수득된 조건화 배지, 표 5에 제시된 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-3 (각각 숫자 1 내지 3으로써 표시됨)으로부터의 조건화 배지 또는 세포와 접촉되지 않은 화학적으로 규정된 배양 배지 (+)에서 인큐베이션하였다. D1은 24h의 인큐베이션 시간을 표시하고, D2는 48h의 인큐베이션 시간을 표시한다. 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질이 화살표로써 표시된다 (백색 및 흑색 화살표). 도 5B에서 웨스턴 블롯의 좌측 상의 숫자는 결정된 바와 같은 분자량 (kDa)을 나타낸다. 그 결과는 또한, 클리핑이 매트립타제 KO 클론으로부터 수득된 조건화 배지에서 상당히 저하된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 6은 야생형 매트립타제를 발현하는 CHO 세포 ("WT1" 및 "WT2") 및 매트립타제를 돌연변이시켜 매트립타제의 기능적 발현이 저하되도록 한 CHO 클론 ("Δ7/Δ15")으로부터 수득된 세포 배양 배지 상등액에서 인큐베이션한 Fc-융합 단백질 (도 6A) 및 IgG (mAb) (도 6B)의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 세포와 접촉되지 않은, 상응하는 화학적으로 규정된 배양 배지 ("(+)")가 양성 대조군으로서 제공되었다. 상기 Fc-융합 단백질 및 mAb (각각 0.7 μM의 농도)를 각각 2h 및 24h 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯의 측면에 있는 숫자는 겔 상에서 결정된 바와 같은 대략적인 분자량 (kDa)을 나타낸다. 그 결과는 클리핑이, 활성 매트립타제의 기능적 발현을 저하시킨 돌연변이체 세포 클론 Δ7/Δ15로부터 수득된 조건화 배지에서 저하된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 7은 상이한 관심 폴리펩티드를, 2가지 상이한 트립신-유사 프로테아제, 즉 마우스로부터의 매트립타제 (MT-SP1) 및 인간 Htra1과 공동 인큐베이션한 결과를 도시한 것이다. 도 7A는 mAb (인큐베이션 시간 24h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이고, 도 7B는 Fc-융합 단백질 (인큐베이션 시간 2h)의 모세관 겔 전기영동 분석 [캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip®)]을 도시한 것이며, 도 7C는 추가 재조합 단백질 (인큐베이션 시간 1h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드의 농도는 모든 실험 설정에서 0.7 μM이었다. 각각의 관심 폴리펩티드를, 감소량의 MT-SP1 및 Htra1을 이용하여 시험하였다: 관심 폴리펩티드에 대한 프로테아제의 몰 비는 MT-SP1의 경우에 왼쪽에서 오른쪽으로 1/10, 1/100 및 1/1,000이고, Htra1의 경우에 1/3, 1/10 및 1/100이다. 관심 폴리펩티드를 또한, 화학적으로 규정된 배양 배지 "(+)"에서, 및 CHO-K1 유래 야생형 세포로부터 수득된 조건화 배지 (상등액) "(-)"에서 동일한 시간 동안 인큐베이션하였다. 무손상 단백질 (더 큼) 및 클리핑된 단백질 (더 작음)이 도 7A 및 7C에서 화살표로써 표시된다. 도 7B에서, 무손상 폴리펩티드 옆에 2가지 유형의 클리핑된 폴리펩티드가 존재한다 (모두 화살표로 표시되고 측면에 예시된다). 도 7A 내지 도 7C는 클리핑이 매트립타제의 존재하에 발생됨으로써, 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 확증시켜 준다는 사실을 명확하게 보여준다.
도 8은 2가지 관심 폴리펩티드, 즉 모노클로날 IgG-항체 (상부 패널, 인큐베이션 시간 24h) 및 재조합 단백질 (하부 패널, 인큐베이션 시간 1h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드 (각각 0.7 μM 농도)를 화학적으로 규정된 배양 배지 "(+)"에서, CHO-K1 유래 야생형 세포로부터 수득된 조건화 배지 "(-)"에서, 또는 무스 무스쿨루스(Mus musculus)로부터의 재조합 매트립타제가 부가된 화학적으로 규정된 배양 배지 [(+) + MT-SP1]에서 인큐베이션하였다. 몇 가지 샘플에 항-MT-SP1 억제성 Fab 단편을 표시된 바와 같이 부가하였다 ("+ Fab"). 샘플 중의 Fab의 농도는 레인 위에 제시된다 (1 μM, 10 μM 또는 50 μM). 화살표는 무손상 또는 클리핑된 단백질을 나타내는 단백질 밴드를 표시한다. Fab 단편이 부가된 레인 내의 대략 25 kD 하의 단백질 밴드는 Fab 단편을 나타낸다. 그 결과는 항-MT-SP1 Fab 단편 (이는 선택적 매트립타제 억제제이다)을, 매트립타제가 활성인 세포 배양 배지에 부가하는 것이 클리핑을 저하시키거나 또는 심지어 완전히 방지시킨다는 것을 입증시켜 준다. 그 결과는 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 추가로 확증시켜 준다.
도 9는 마이크로칩 모세관 전기영동 (캘리퍼 랩칩®)의 결과를 도시한 것이다. 재조합 mAb를 CHO-K1 유래 야생형 세포 (WT) 또는 매트립타제 녹아웃 세포 (KO-4; 또한 표 5 참조)에서 발현시키고, 친화 크로마토그래피 (단백질 A)를 이용하여 정제하였다. 레인 위의 숫자는 병렬 형질감염 및 선별 공정으로부터 수득된 상이한 mAb 생산 세포 풀을 제시한다. 각 레인에서, 3개의 단백질 밴드가 화살표로써 표시된 바와 같이 가시적이다. 상부 단백질 밴드는 무손상 mAb 중쇄를 나타내고, 제2 밴드는 (제1 밴드 바로 아래)는 클리핑된 항체 중쇄를 나타내며, 맨 아래에 있는 밴드는 mAb의 경쇄를 나타낸다. 그 결과는 관심 폴리펩티드가 매트립타제 녹아웃 세포에서 발현되는 경우에, 클리핑이 상당히 저하된다는 사실을 보여준다.
도 2는 CHO-K1 유래 세포에서 매트립타제 유전자의 엑손 2 + 플랭킹 인트론 영역의 서열을 도시한 것이다. 서열 분석용 프라이머 (흘림체, 볼드체 및 밑줄침)는 플랭킹 인트론을 표적으로 하여 CHO-K1-유래 MT-SP1 엑손 2 서열 (회색으로 음영처리됨)을 확증하도록 설계되었다. 매트립타제 녹아웃(knock-out) 세포를 수득하기 위해 사용된 TALEN의 DNA 결합성 도메인의 결합 부위는 볼드체로 밑줄이 그어져 있고, 녹아웃 돌연변이에 대한 표적 영역은 볼드체로 이중 밑줄이 그어져 있다.
도 3은 CHO-K1 유래 매트립타제 녹아웃 세포 클론 KO-1 내지 KO-9 및 클론 Δ7/Δ15 및 CHO-K1 유래 야생형 세포주 (WT)에서 측정된 상대적 매트립타제 mRNA 발현을 나타내는 칼럼 다이아그램을 도시한 것이다. 야생형 CHO-K1 유래 세포주에서의 매트립타제 mRNA 발현을 100%로 규정하였다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 매트립타제 mRNA 발현은 모든 녹아웃 클론 및 클론 Δ7/Δ15에서 저하되었다.
도 4는 매트립타제를 상이한 돌연변이에 의해 녹아웃시킨 각종 상이한 CHO-K1 유래 세포 클론 (실시예 2, 특히 표 5 참조) 및 야생형 CHO-K1 세포 (WT)의 세포 배양 배지 상등액에서 인큐베이션한, 클리핑되기 쉬운 3가지 상이한 관심 폴리펩티드의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드 (각각 농도 0.7 μM)를, 야생형 CHO-K1 세포 (WT), 표 5에 제시된 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-9 (도 4에서 각각 숫자 1 내지 9로써 표시됨) 또는 세포와 접촉되지 않은 화학적으로 규정된 배지 (+)로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션하였다. 도 4A에서의 관심 폴리펩티드는 IgG (mAb)이고 인큐베이션 시간은 48h이었다. 도 4B에서의 관심 폴리펩티드는 Fc-융합 단백질이고, 인큐베이션 시간은 24h이었다. 도 4C에서의 관심 폴리펩티드는 2개의 당변이체를 수반한 추가의 재조합 단백질이고, 인큐베이션 시간은 1h이었다. 당변이체 둘 다는 야생형 CHO-K1 세포 (WT)로부터 수득된 조건화 배지에서 클리핑되었다. 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질이 화살표로써 표시된다. 도 4D는 3개월 동안 배양시킨 각각의 세포로부터 수득된 조건화 배지를 이용하여 상기 mAb로의 실험을 반복한 결과를 도시한 것이다. 인큐베이션 조건은 도 4A에서와 동일하였다. 그 결과는 클리핑이 매트립타제 녹아웃 세포 클론 KO-1 내지 KO-9로부터 수득된 조건화 배지에서 효율적으로 방지되었다는 것과, 이들 유리한 결과가 장기간 배양 동안 유지된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 5A 및 B는 클리핑되기 쉬운 2가지 상이한 바이러스 당단백질 (관심 폴리펩티드)의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드를, 매트립타제를 발현하는 CHO-K1 유래 세포주 (WT) 및 매트립타제를 녹아웃시킨 상이한 세포 클론 (KO-1 내지 KO-3)으로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션하였다. 관심 폴리펩티드를 0.7 μM의 농도로, 야생형 세포 (WT)로부터 수득된 조건화 배지, 표 5에 제시된 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-3 (각각 숫자 1 내지 3으로써 표시됨)으로부터의 조건화 배지 또는 세포와 접촉되지 않은 화학적으로 규정된 배양 배지 (+)에서 인큐베이션하였다. D1은 24h의 인큐베이션 시간을 표시하고, D2는 48h의 인큐베이션 시간을 표시한다. 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질이 화살표로써 표시된다 (백색 및 흑색 화살표). 도 5B에서 웨스턴 블롯의 좌측 상의 숫자는 결정된 바와 같은 분자량 (kDa)을 나타낸다. 그 결과는 또한, 클리핑이 매트립타제 KO 클론으로부터 수득된 조건화 배지에서 상당히 저하된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 6은 야생형 매트립타제를 발현하는 CHO 세포 ("WT1" 및 "WT2") 및 매트립타제를 돌연변이시켜 매트립타제의 기능적 발현이 저하되도록 한 CHO 클론 ("Δ7/Δ15")으로부터 수득된 세포 배양 배지 상등액에서 인큐베이션한 Fc-융합 단백질 (도 6A) 및 IgG (mAb) (도 6B)의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 세포와 접촉되지 않은, 상응하는 화학적으로 규정된 배양 배지 ("(+)")가 양성 대조군으로서 제공되었다. 상기 Fc-융합 단백질 및 mAb (각각 0.7 μM의 농도)를 각각 2h 및 24h 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯의 측면에 있는 숫자는 겔 상에서 결정된 바와 같은 대략적인 분자량 (kDa)을 나타낸다. 그 결과는 클리핑이, 활성 매트립타제의 기능적 발현을 저하시킨 돌연변이체 세포 클론 Δ7/Δ15로부터 수득된 조건화 배지에서 저하된다는 것을 명확하게 보여준다.
도 7은 상이한 관심 폴리펩티드를, 2가지 상이한 트립신-유사 프로테아제, 즉 마우스로부터의 매트립타제 (MT-SP1) 및 인간 Htra1과 공동 인큐베이션한 결과를 도시한 것이다. 도 7A는 mAb (인큐베이션 시간 24h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이고, 도 7B는 Fc-융합 단백질 (인큐베이션 시간 2h)의 모세관 겔 전기영동 분석 [캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip®)]을 도시한 것이며, 도 7C는 추가 재조합 단백질 (인큐베이션 시간 1h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드의 농도는 모든 실험 설정에서 0.7 μM이었다. 각각의 관심 폴리펩티드를, 감소량의 MT-SP1 및 Htra1을 이용하여 시험하였다: 관심 폴리펩티드에 대한 프로테아제의 몰 비는 MT-SP1의 경우에 왼쪽에서 오른쪽으로 1/10, 1/100 및 1/1,000이고, Htra1의 경우에 1/3, 1/10 및 1/100이다. 관심 폴리펩티드를 또한, 화학적으로 규정된 배양 배지 "(+)"에서, 및 CHO-K1 유래 야생형 세포로부터 수득된 조건화 배지 (상등액) "(-)"에서 동일한 시간 동안 인큐베이션하였다. 무손상 단백질 (더 큼) 및 클리핑된 단백질 (더 작음)이 도 7A 및 7C에서 화살표로써 표시된다. 도 7B에서, 무손상 폴리펩티드 옆에 2가지 유형의 클리핑된 폴리펩티드가 존재한다 (모두 화살표로 표시되고 측면에 예시된다). 도 7A 내지 도 7C는 클리핑이 매트립타제의 존재하에 발생됨으로써, 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 확증시켜 준다는 사실을 명확하게 보여준다.
도 8은 2가지 관심 폴리펩티드, 즉 모노클로날 IgG-항체 (상부 패널, 인큐베이션 시간 24h) 및 재조합 단백질 (하부 패널, 인큐베이션 시간 1h)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 관심 폴리펩티드 (각각 0.7 μM 농도)를 화학적으로 규정된 배양 배지 "(+)"에서, CHO-K1 유래 야생형 세포로부터 수득된 조건화 배지 "(-)"에서, 또는 무스 무스쿨루스(Mus musculus)로부터의 재조합 매트립타제가 부가된 화학적으로 규정된 배양 배지 [(+) + MT-SP1]에서 인큐베이션하였다. 몇 가지 샘플에 항-MT-SP1 억제성 Fab 단편을 표시된 바와 같이 부가하였다 ("+ Fab"). 샘플 중의 Fab의 농도는 레인 위에 제시된다 (1 μM, 10 μM 또는 50 μM). 화살표는 무손상 또는 클리핑된 단백질을 나타내는 단백질 밴드를 표시한다. Fab 단편이 부가된 레인 내의 대략 25 kD 하의 단백질 밴드는 Fab 단편을 나타낸다. 그 결과는 항-MT-SP1 Fab 단편 (이는 선택적 매트립타제 억제제이다)을, 매트립타제가 활성인 세포 배양 배지에 부가하는 것이 클리핑을 저하시키거나 또는 심지어 완전히 방지시킨다는 것을 입증시켜 준다. 그 결과는 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 추가로 확증시켜 준다.
도 9는 마이크로칩 모세관 전기영동 (캘리퍼 랩칩®)의 결과를 도시한 것이다. 재조합 mAb를 CHO-K1 유래 야생형 세포 (WT) 또는 매트립타제 녹아웃 세포 (KO-4; 또한 표 5 참조)에서 발현시키고, 친화 크로마토그래피 (단백질 A)를 이용하여 정제하였다. 레인 위의 숫자는 병렬 형질감염 및 선별 공정으로부터 수득된 상이한 mAb 생산 세포 풀을 제시한다. 각 레인에서, 3개의 단백질 밴드가 화살표로써 표시된 바와 같이 가시적이다. 상부 단백질 밴드는 무손상 mAb 중쇄를 나타내고, 제2 밴드는 (제1 밴드 바로 아래)는 클리핑된 항체 중쇄를 나타내며, 맨 아래에 있는 밴드는 mAb의 경쇄를 나타낸다. 그 결과는 관심 폴리펩티드가 매트립타제 녹아웃 세포에서 발현되는 경우에, 클리핑이 상당히 저하된다는 사실을 보여준다.
본 개시내용은 특히, 예를 들어 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시킨 변경된 척추동물 세포가, 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하고 이를 세포 배양 배지 내로 분비할 수 있지만, 이러한 세포 배양 배지 내에서의 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하된다는 예상치 못한 발견에 근거한다. 따라서, 재조합적으로 발현되고 분비된 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제가 수백 개의 상이한 프로테아제 중에서 확인되었다. 또한, 단일 프로테아제의 활성을 표적화하고 손상시키는 것이 세포 배양 배지 내에서의 클리핑을 상당히 저하시키거나 또는 심지어 제거하는 데 충분하다는 사실은 상당히 놀라운 것이었다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 각각의 변경된 척추동물 세포를 이용하여, 세포 배양 배지로부터의 발현 및 분비 후에 수득될 수 있는 무손상 관심 폴리펩티드의 수율을 증가시킴으로써 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 상당히 개선시킬 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하기 위하여 본 발명에 따르는 변경된 척추동물 세포를 이용하는 경우에는, 단백질 분해적 분해를 저하시키기 위한 부가의 조치 및 이에 따라 관심 폴리펩티드의 클리핑을 방지하기 위한 부가의 조치를 수행할 필요가 없다. 따라서, 본 발명은 선행 기술분야에 중요한 기여를 한다.
본 개시내용의 개개의 측면 및 적합하고 바람직한 실시양태가 다음에 상세히 기재될 것이다.
A. 변경된 척추동물 세포
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은 관심 폴리펩티드의 재조합 발현에 적합한 단리된 척추동물 세포를 제공하는데, 이러한 척추동물 세포는 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경되고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 관심 폴리펩티드를 분비한다. 상기 척추동물 세포에서의 매트립타제의 효과를 손상시키면, 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 상응하는 척추동물 세포와 비교해서 상기 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다.
매트립타제는 배양된 유방암 세포에서 새로운 젤라틴용해 활성으로서 1993년에 처음으로 보고되었다. 매트립타제는 유형 II 막투과 세린 프로테아제 (TTSP)의 계열에 속한다. 매트립타제의 오르소로그(ortholog)는 포유류 종을 포함한 상이한 척추동물 종에 존재하고, 예를 들어 인간, 침팬지, 개, 마우스, 래트, 치킨, 제브라피시(zebrafish), 반점 그린 푸퍼피시(spotted green pufferfish) 및 타이거 푸퍼피시(tiger pufferfish)에서 확인되었는데, 이는 보존된 진화 기능을 암시한다. 매트립타제는 IUBMB 효소 명명법에서 EC 3.4.21.109로서 열거된다. 매트립타제는 또한, 막-유형 세린 프로테아제 1 (MT-SP1) 및 종양발생성-14의 억제인자 (ST14)로서 공지되어 있다 (문헌 [Chen et al., The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097-108] 참조). 이는 세포질성 N-말단과 인접한 단일 스팬 막투과 도메인을 수반한 필수 막 단백질이다. 세포외 부분은 줄기 영역 (단일 SEA, 2 CUB 및 4 LDLRA 도메인 포함), 및 다른 TTSP와 구조상 고도로 유사한 C-말단 세린 프로테아제로 이루어지고, 촉매 활성에 필수적인 보존된 히스티딘/아스파르트산/세린 (HDS) 촉매적 3원소(triad)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [List et al., Matriptase: Potent Proteolysis on the cell Surface; MOL MED 12 (1-3) 1-7, JANUARY-MARCH 2006] 및 [Chen et al., The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097-108] 참조). 매트립타제는 많은 기관 시스템, 예컨대 피부, 유방, 폐, 표피, 각막, 타액선, 구강 및 비강, 갑상선, 흉선, 식도, 기관, 기관지, 폐포, 위, 췌장, 담낭, 십이지장, 소장, 결장, 직장, 신장, 부신, 방광, 수뇨관, 정낭, 부고환, 전립선, 난소, 자궁 및 질 내의 상피에서 발현되는 것으로 기재되어 있다 (문헌 [List et al., 2006 and Chen et al., 2012] 참조). 매트립타제는 불활성 지모겐으로서 합성되고, 복잡한 과정을 통하여 그의 활성 형태로 전환된다. 세포내 단백질 분해적 절단을 포함하는 활성화 과정에 관한 세부 사항이 문헌 [List et al. 2006 and Chen et al. 2012]에서 인간 매트립타제에 대하여 기재되어 있다. 매트립타제는 세포외 공간 내로 배향된 촉매적 도메인을 수반한 유형 II 막투과 단백질로서 막과 결합되어 있다. 더욱이, 각각 그의 세포외 부분으로의 매트립타제의 상당한 유출이 생체 내에서 일어난다고 상기 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [List et al., 2006 and Chen et al. 2012] 참조). 매트립타제가 복합체의 형태, 예를 들어 쿠니츠(Kunitz)-유형 세린 프로테아제 억제제 HAI-1과 복합체를 형성한 형태로 유출되는 것으로 상기 문헌에 기재되어 있다. 상이한 연구들은, 인간 세포에서는 특이적 억제제 HAI-1이 매트립타제를 세포막으로 수송하는 것을 촉진시켜 준다고 제안하는데, 이는 HAI-1에서의 제거 또는 심지어 단일 점 돌연변이로 인해, 골지(Golgi) 구획 내에 매트립타제가 축적된다고 밝혀졌기 때문이다. 상기 문헌에는, HAI-1 이외의 매트립타제의 몇 가지 상이한 내인성 억제제, 예컨대 HAI-2, 항트롬빈, 알파-1 항트립신 및 알파-2-항플라스민이 보고되었다. 더욱이, 또한 매트립타제의 다른 억제제가 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., 2012] 참조). 상기 문헌에는 매트립타제가 정상적 생리학, 예컨대 피부 장벽 기능, 상피 완전성, 모낭 발생, 및 흉선 생체항상성에 있어서, 및 인간 병리학, 예컨대 골관절염, 아테롬성 경화증, 및 종양 진행, 침습 및 전이에 있어서 수많은 역할을 할 수 있다고 기재되어 있다.
관심 폴리펩티드의 재조합 생성과 무관한 상기 과학적 배경에 대항하여, 매트립타제가 숙주 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는, 재조합적으로 생성되는 관심 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 본 발명의 발견은 상당히 놀라운 것이었다. 척추동물 세포, 예컨대 특히 포유류 세포에서 발현된 다수의 각종 프로테아제를 고려해 볼 때, 상기 단일 프로테아제 - 매트립타제의 기능을 손상시키는 것이, 세포 배양 배지에서 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 상당히 저하시키거나 또는 심지어 제거하는 데 충분하다는 사실은 훨씬 더 놀라운 것이었다. 이들 유리한 효과는 다른 프로테아제, 심지어 밀접하게 관련된 프로테아제를 이용한 경우에는 관찰되지 않는데, 이는 매트립타제가 세포 배양 배지에서 분비된 재조합 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 효소라는 발견의 중요성을 뒷받침해준다. 본 실시예에 의해 제시되는 바와 같이, 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경된 척추동물 세포를 사용하는 경우에는, 이러한 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하된다. 예를 들어, 매트립타제의 기능을 유전자 침묵 (예를 들어, 실시예 1에 제시된 바와 같은 RNAi)에 의해 또는 내인성 매트립타제 유전자의 돌연변이 (예를 들어, 실시예 2 및 5에 제시된 바와 같은 2개의 매트립타제 대립유전자 중 하나 또는 둘 다의 녹아웃)에 의해 손상시키면, 세포 배양 배지에서 재조합적으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하되거나 또는 심지어 완전히 제거된다. 클리핑의 상당한 저하는 클리핑되기 쉬운 시험된 모든 폴리펩티드, 예컨대 IgG 항체, Fc-융합 단백질, 글리코실화 바이러스 단백질 및 기타 치료상 활성 단백질에 대하여 밝혀졌다. 따라서, 재조합 발현에 의해 관심 폴리펩티드를 생산하기 위하여 매트립타제 결핍성 세포주를 이용하는 것이 유리하다. 매트립타제가 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 폴리펩티드를 직접적으로 절단한다는 것이 본 실시예로부터 추가로 명백하다. 따라서, 매트립타제의 효과의 어떠한 손상도, 세포 배양 배지 내로 분비되는 재조합적으로 발현된 폴리펩티드의 클리핑을 저하시킨다. 더욱이, 본 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 선택적 매트립타제 억제제를 세포 배양 배지에 부가하는 것이 또한, 클리핑을 저하시킬 수 있다.
내인성 프로테아제 매트립타제의 효과가 본 개시내용의 제1 측면에 따르는 척추동물 세포에서 손상되기 때문에, 상기 세포를 배양하는 세포 배양 배지에는 기능적으로 활성인 매트립타제가 전혀 존재하지 않거나 덜 존재하는데, 이는 예를 들어, 상기 세포는 세포 표면 상에 기능적 매트립타제가 전혀 없거나 감소된 양으로만 존재하고/하거나 기능적 매트립타제를 세포 배양 배지 내로 전혀 방출 (예를 들어, 유출에 기인함)시키지 않거나 또는 감소된 양으로 방출시키기 때문이다. 이로써, 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해가 상당히 저하되거나 또는 심지어 제거되는데, 이는 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 경우에 중요한 이점이다. 클리핑이 상당히 저하되기 때문에, 무손상 관심 폴리펩티드의 수율이 증가된다. 비-기능적이고 잠재적으로 면역원성인 클리핑된 부산물이 덜 생성되거나 또는 심지어 전혀 생성되지 않는다. 또한, 이들 신규 척추동물 숙주 세포는 일반적으로, 우수한 발현 수율을 나타내고 우수한 성장 특징을 지니므로, 이들은 생산 세포주로서 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 추가의 이점이 다음에 기재되어 있고, 이는 또한 실시예로부터 명백하다. 따라서, 이들 유리한 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 개선된 생성물 질과 수율로 재조합적으로 생성할 수 있게 해준다. 더욱이, 바람직하게 포유류 세포인, 본 발명에 따르는 척추동물 세포를 이용하는 것이, 관심 폴리펩티드를 재조합 생성하기 위한 생산 세포주를 개발하는 데 필요한 시간을 단축시켜 준다. 클리핑을 피하거나 또는 저하시키기 위해, 예를 들어 아미노산 서열을 변화시킴으로써 관심 폴리펩티드를 최적화하는 것이 덜 필요하거나 심지어 전혀 필요하지 않다. 특히, 클리핑 부위를 제거하는 것은 더 이상 쓸모가 없다. 더욱이, 클리핑된 단백질을 제거하기 위한 시간 소모적 정제 공정은 이들 세포를 생산 세포주로서 이용하는 경우에 피할 수 있다. 따라서, 이들 척추동물 세포는 재조합 생성 기술을 위한 숙주 세포주로서 사용되는 경우에 중요한 이점을 갖는다.
서열 목록은 상이한 척추동물 종, 예컨대 햄스터 [서열식별번호 (SEQ ID NO): 1 - NCBI 참조 서열: XP_003495890], 인간 (서열식별번호: 2 - NCBI 참조 서열: NP_068813), 마우스 (서열식별번호: 3 - NCBI 참조 서열: NP_035306), 래트 (서열식별번호: 4 - NCBI 참조 서열: NP_446087) 및 침팬지 (서열식별번호: 5 - NCBI 참조 서열: NP_001189434)의 매트립타제의 예시되는 아미노산 서열을 나타낸다. 표 1로부터 명백한 바와 같이, 매트립타제는 현재, "종양발생성 14 단백질의 억제인자" (예를 들어, 인간의 경우) 및 "종양발생성 14 단백질 상동체의 억제인자" (예를 들어, 마우스 및 차이니즈 햄스터의 경우)로서 지칭되기도 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "매트립타제"는 특히, 매트립타제 참조 단백질로서 서열식별번호: 1 내지 5에 제시된 단백질 중 하나 이상과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 공유하고 상기 매트립타제 참조 단백질과 동일한 단백질 분해적 활성을 갖는 임의의 단백질을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은 동일성은 참조 단백질의 전체 길이 전반에 걸쳐 계산된다. 매트립타제는 다른 프로테아제와 구별된다. 문헌에서, 매트립타제는 각종 명칭으로 배정되어 왔는데, 그 중 특정 선택이 표 1에 제공된다. 효소 매트립타제를 코딩하는 상응하는 유전자가 또한 각종 명칭으로 배정되어 왔는데, 그 중 특정 선택이 표 1에 제공된다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 프로테아제는 편의상 용이하게 하기 위해 "매트립타제", "MT-SP1", "종양발생성 14 단백질의 억제인자" 또는 "종양발생성 14 단백질 상동체의 억제인자"로서 지칭된다. 그러나, 용어 "매트립타제"는 또한, 예를 들어 상이한 종에서 상응하는 단백질 또는 유전자를 명확히 규명하기 위해 사용된 상기 단백질 또는 상응하는 유전자의 임의의 대체 명칭을 지칭하고 이를 포괄한다. 동일한 기능을 갖는 매트립타제의 상동체 및 오르소로그가 용어 "매트립타제"에 포함된다. 이러한 맥락에서, 매트립타제-2 및 매트립타제-3은 매트립타제와 별개인 (구조상 관련이 있긴 하지만) 프로테아제에 관한 것이므로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "매트립타제"에 의해 포괄되지 않는 것으로 언급된다.
<표 1>
문헌에 사용된 매트립타제 유전자 및/또는 코딩된 단백질 생성물 매트립타제의 예시되는 대체 명칭 (알파벳 순서)
매트립타제 단백질을 코딩하는 유전자가 본원에서 "매트립타제 유전자"로서 지칭되기도 한다. 상이한 포유류 종의 게놈 유전자 서열이 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 차이니즈 햄스터 (NCBI 유전자-ID: 100755225); 호모 사피엔스(Homo sapiens) (NCBI 유전자-ID: 6768); 무스 무스쿨루스 (NCBI 유전자-ID: 19143); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) (NCBI 유전자-ID: 114093); 팬 트로글로디테스(Pan Troglodytes) (NCBI 유전자-ID: 100188950) 및 기타에 기재되어 있다. 매트립타제 유전자에 대한 동의어가 표 1에 열거되어 있고, 흔히 사용되는 것이 "ST14" 또는 "St14"이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "매트립타제 유전자"는 특히, 서열식별번호: 1 내지 5에 제시된 바와 같은 매트립타제 단백질을 코딩하거나; 또는 매트립타제 참조 단백질로서 서열식별번호: 1 내지 5에 제시된 매트립타제 단백질 중 하나 이상과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 공유하고 상기 매트립타제 참조 단백질과 동일한 단백질 분해적 활성을 갖는 매트립타제 단백질을 코딩하는 척추동물 세포의 임의의 내인성 유전자를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은 동일성은 참조 단백질의 전체 길이 전반에 걸쳐 계산된다.
본 개시내용은 특히, 통상적으로 상응하는 비-변형된 척추동물 세포에 의해 내생적으로 발현되는 내인성 매트립타제의 효과를 손상시킨, 변형된 척추동물 세포, 예컨대 바람직하게 포유류 세포에 관한 것이다. 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키는 상기 변경으로 인해, 본원에 기재된 변경된 척추동물 세포는 기능적 매트립타제를 세포 배양 배지 내로 전혀 제시 또는 방출시키지 않거나 또는 감소된 양으로 제시 또는 방출시킴으로써, 이러한 세포 배양 배지 내에서 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하되거나 또는 심지어 완전히 방지된다. 본 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 일시적 또는 영구적일 수 있는 상기 변경이, 상기 변경된 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해를 상당히 저하시켜 준다.
특정 척추동물 세포에서 내인성 매트립타제의 효과를 손상시키도록 이러한 척추동물 세포를 변경시키고 이에 따라 변형시킬 수 있는 몇 가지 가능성이 있다. 매트립타제의 효과는, 예를 들어 유전자 수준 또는 단백질 수준으로 손상시킬 수 있다. 매트립타제의 효과는, 예를 들어 매트립타제의 구조/서열, 매트립타제의 전사, 번역 및/또는 세포성 수송의 변형에 의해 손상시킬 수 있다. 비-제한적 옵션이 다음에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 효과는 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 상기 세포에서 저하되거나 또는 제거되기 때문에 손상된다. 본 실시예에 의해 제시된 바와 같이, 예를 들어 유전자 침묵에 의해 또는 유전자 녹아웃에 의해 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하 또는 제거함으로써 매트립타제의 발현을 변경시키는 것은, 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 데 적합하긴 하지만, 세포 배양 배지 내에 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하되거나 또는 심지어 완전히 회피되는 척추동물 세포를 제공하기 위한 매우 효율적인 조치이다. 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 특정 척추동물 세포에서 저하되거나 또는 제거되는 경우에, 세포 배양 배지 내에 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑 역시 감소되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상관 관계는 예상치 못한 발견이다.
매트립타제의 기능적 발현을 저하 또는 제거하는 것은 각종 수단에 의해 달성될 수 있다. 기능적 발현은, 예를 들어 매트립타제의 발현 수준을 저하시키거나 또는 매트립타제의 촉매 활성을 저하시키거나 또는 이들 둘 다를 조합함으로써 저하시킬 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 유전자 녹아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵 또는 전술된 것 중 임의의 조합에 의해 저하되거나 또는 제거되도록 세포를 변경시킨다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 효과를 손상시키도록 척추동물 세포의 게놈을 변경시킨다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 기능적 발현은 유전자 녹아웃에 의해 상기 세포에서 저하시키거나 또는 제거한다. 유전자 녹아웃은 특정 유전자의 기능을 붕괴시킴으로써 이러한 유전자가 작동하지 않도록 만드는 유전 기술이다. 예를 들어, 핵산을 코딩 서열 내로 삽입함으로써, 유전자 기능을 붕괴시킬 수 있다. 더욱이, 완전한 매트립타제 유전자 또는 그의 특정 부분을 결실시킴으로써, 각각의 변경된 세포에 의해 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 발현된다. 또 다른 옵션은 하나 이상의 녹아웃 돌연변이를 코딩 서열 내로 도입하여, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 되도록 하는 것이다. 예를 들어 하나 이상의 프레임시프트 돌연변이를 도입할 수 있는데, 이로써 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 생성된다. 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 하나 이상의 정지 코돈을 코딩 서열 내로 도입하여, 말단절단된, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 수득되도록 한다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자는 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 돌연변이는 프레임-시프트 또는 정지 코돈 돌연변이이다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 C-말단에 위치한 프로테아제 도메인의 전부 또는 일부는 상기 도입된 하나 이상의 돌연변이로 인해 존재하지 않는다. 다른 옵션은 하나 이상의 돌연변이를 프로모터, 5' UTR, 3' UTR 및/또는 다른 조절성 요소에 도입하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 프로모터 기능은, 예를 들어 프로모터 결실을 도입함으로써 또는 프로모터와 전사 출발 사이에 특정 구축물을 도입함으로써 붕괴된다. 표적 유전자의 기능적 발현을 억제 또는 제거하는 유전자 녹아웃을 달성하는 방법이 또한, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으므로, 본원에서는 어떠한 상세한 설명도 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 일부 비-제한적 예가 다음에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자는 유전 공학에 의해 기능적으로 녹아웃시킨다. 그 예는 게놈 편집, 예컨대 조작된 뉴클레아제를 이용한 게놈 편집 (GEEN)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이는 인공적으로 조작된 뉴클레아제 또는 "분자 가위"를 이용하여 DNA를 삽입하거나, 대체하거나 또는 이를 게놈으로부터 제거하는 특정 유형의 유전 공학이다. 상기 뉴클레아제는 게놈 내의 목적하는 위치에 특이적 이중 가닥 절단물 (DSB)을 창출시키고, 상동 재조합 (HR) 및 비-상동 말단 결합 (NHEJ)의 자연 프로세스에 의해 상기 유도된 절단물을 복구하기 위하여 세포의 내인성 기전을 활용한다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는, 적어도 4가지 계열의 조작된 뉴클레아제가 있다: 아연 핑거(Zinc finger) 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터(Effector) 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복 서열 (CRISPR)을 인식하는 뉴클레아제, 및 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제. TALEN 기술을 또한 본 실시예에 사용하여, 변경된 포유류 세포를 제공하였는데, 여기서는 매트립타제 유전자를 완전히 또는 부분적으로 녹아웃시킴으로써, 상기 세포에서의 매트립타제의 효과를 손상시켰다.
한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포의 게놈에 존재하는 매트립타제 유전자의 하나 이상의 카피를 변경, 예를 들어 녹아웃 또는 결실시켜, 상기 척추동물 세포에서의 매트립타제의 효과를 저하 또는 제거시키고, 이에 따라 이러한 효과를 손상시킨다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 적어도 하나의 카피를 척추동물 세포의 게놈 내에서 결실시키거나 또는 기능적으로 불활성화시킨다. 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 매트립타제 유전자의 적어도 하나의 카피 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하여 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물을 제공한다. 일반적으로, 특정 척추동물 세포는 매트립타제 유전자의 2개의 대립유전자성 카피를 포함한다. 하나 이상의 돌연변이를 매트립타제 유전자의 하나의 카피 또는 둘 다의 카피 내로 삽입할 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 돌연변이를 매트립타제 유전자의 모든 카피인 양 카피 내로 각각 삽입하여, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물을 제공하고 이에 따라 척추동물 세포에서의 매트립타제의 효과를 손상시킨다. 이로써, 매트립타제 유전자의 모든 카피는 게놈 내에서 기본적으로 손상되거나 또는 불활성화된다. 본 실시예에 제시된 바와 같이, 상이한 돌연변이를 매트립타제 유전자의 상이한 대립유전자 내로 도입하여 손상을 달성시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 돌연변이가 매트립타제 유전자의 코딩 영역 내에 포함되고, 이로써 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 초래된다. 예를 들어, 상기 변경된 척추동물 세포가, 촉매적으로 활성이므로 기능적인 매트립타제의 2개 이상의 스플라이스 변이체에 존재하는 아미노산 서열을 코딩하는 매트립타제 유전자의 특정 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함하기 때문에, 매트립타제의 기능이 손상될 수 있다. 매트립타제의 몇 가지 스플라이스 변이체가 상이한 종에서 확인되었다. 매트립타제 엑손 중 몇 가지가, 확인된 기능적 스플라이싱 변이체 대다수에서 또는 심지어 모두에서 발견된다. 하나 이상의 돌연변이를, 각각의 척추동물 세포의 기능적 매트립타제 스플라이싱 변이체 중 2개 이상, 바람직하게 대다수, 또는 심지어 모두에 존재하는 엑손을 코딩하는 매트립타제 유전자의 특정 영역 내로 도입하는 것이 유리하다.
한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 돌연변이가 매트립타제의 엑손 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 포함된다. 변경된 척추동물 세포 내에서 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시키는 변경을 위한 표적으로서 엑손 2를 선택하는 것은, 이러한 접근 방식이 몇 가지 상이한 기능적 스플라이싱 변이체를 포함시킨다는 이점을 갖고 있다. 매트립타제의 N-말단에 근접한 엑손, 예컨대 예를 들어 엑손 1, 엑손 2 및 엑손 3은 하나 이상의 돌연변이, 특히 하나 이상의 프레임시프트 돌연변이를 도입하는 데 유리한 표적이다. 이들 엑손 중 하나에서의 프레임시프트 돌연변이로 인해, 아마도 상기 서열 내의 초기에 정지 코돈이 초래된다. 이와 같이 돌연변이된 유전자에 의해 코딩된 말단절단된 단백질은 아마도 짧고, 세포내에 위치하고/하거나 불활성인 것으로 추정된다. 불활성의 말단절단된 단백질이 유리한데, 이는 그의 발현이 상기 세포에 대하여 무독성인 것으로 추정될 수 있기 때문이다. 그러나, 하나 이상의 돌연변이가 후속 엑손, 예를 들어 엑손 4 내지 19로부터 선택된 엑손 중 하나에 도입될 수도 있다.
본 실시예에서, 엑손 2에 상이한 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 CHO 세포를 생성시켰다. 본 실시예는 각각의 변경된 세포가 세포 성장을 지속하였다는 것을 보여준다. 따라서, 본 실시예에서 시험된 매트립타제의 코딩된 말단절단된 버전(들)은 상기 세포에 대하여 외견상 무독성이었다. 더욱이, 각각의 돌연변이된 매트립타제 유전자의 전반적인 mRNA 발현이 보다 낮기 때문에, 보다 저 수준의 말단절단된 버전이 수득된 것으로 밝혀졌다 (도 3 참조). 따라서, 본 실시예는 관심 폴리펩티드의 재조합 생성에 중요한 다른 특징은 유지하면서도, 척추동물 세포, 예컨대 바람직하게 포유류 세포에서 매트립타제의 기능을 손상시키기 위해서는 각각의 변경이 효율적이란 사실을 명확하게 보여준다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 단리된 척추동물 세포는 매트립타제 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 프레임시프트 돌연변이를 포함하는데, 이로써 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 말단절단된 폴리펩티드가 발현된다. 바람직한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 매트립타제 유전자의 하나의 대립유전자 또는 바람직하게 양 대립유전자의 엑손 2에 하나 이상의 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 CHO 세포인데, 이로써 매트립타제의 효과가 상기 CHO 세포에서 손상된다.
한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 매트립타제의 촉매적 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 매트립타제 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는데, 이로써 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 수득된다. 상기 촉매적 도메인은 효소적 반응을 유발시키기 위해 그의 기질과 상호 작용하는 효소의 영역이다. 하나 이상의 돌연변이를 이러한 도메인 내로 도입하여, 단백질의 촉매 활성이 저하되거나 또는 제거되도록 할 수 있다. 촉매적 도메인은 엑손 16, 17, 18 및 19 내의 아미노산에 의해 코딩된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및 엑손 19로부터 선택된 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 촉매적 도메인 내에서의 하나 이상의 돌연변이는 매트립타제의 촉매 활성의 저하 또는 제거를 초래한다. 이는, 예를 들어 프레임시프트 돌연변이, 특이적 점 돌연변이, 정지 코돈 돌연변이 및/또는 촉매적 도메인 내에서의 결실 또는 삽입에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 촉매적 3원소를 변경시킴으로써, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 단백질이 제공되도록 하나 이상의 돌연변이를 도입한다. 매트립타제의 촉매적 불활성 돌연변이체, 예컨대 예를 들어 G827R-매트립타제 또는 S805A-매트립타제가 다음 문헌에 또한 기재되었다 (문헌 [Desilets et al., The Journal of Biological Chemistry Vol. 283, No. 16, pp. 10535-10542, 2008] 참조). 더욱이, 재조합 매트립타제의 촉매적 도메인의 결정 구조가 공지되어 있다. 이러한 구조 및 서열 데이터로부터, 통상의 기술자는 매트립타제의 촉매적 기능을 손상시키는 돌연변이에 대한 추가의 특이적 표적을 유도할 수 있다.
매트립타제의 기능적 발현을 손상시키도록 변경된 세포는 또한, 무작위 돌연변이 유발 또는 스크리닝 접근 방식을 이용하여 수득할 수 있다. 각각의 방법이 선행 기술분야에 공지되어 있으므로, 상세히 기재할 필요가 없다. 이어서, 예를 들어 제7 측면에 따르는 방법을 이용하여, 매트립타제의 기능적 발현을 손상시키도록 변경된 세포를 확인할 수 있다.
매트립타제의 기능적 발현은 또한, 매트립타제 유전자의 프로모터 및/또는 증강인자를 변경시켜 전사체가 덜 생성되거나 또는 전혀 생성되지 않도록 함으로써 영향을 받을 수 있거나, 또는 유전자 침묵 기술, 예컨대 전사 또는 전사 후 유전자 침묵에 의해 영향을 받을 수 있다. 한 실시양태에 따르면 단리된 척추동물 세포는 매트립타제 유전자의 프로모터 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이러한 프로모터 영역은 덜 기능적이거나 또는 비-기능적인 프로모터를 제공하도록 변경될 수 있고, 상기 프로모터는 완전히 제거될 수도 있다. 또 다른 한편으론 또는 이에 덧붙여, 매트립타제 유전자의 프로모터와 출발 코돈 사이에 정지 코돈을 포함한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 부가하는 것이 가능한데, 이로써 매트립타제 대신 다른 폴리펩티드의 발현이 초래된다. 상기 프로모터와 출발 코돈 사이에 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는, 예를 들어 리포터 폴리펩티드, 예컨대 그린 형광 단백질 (GFP)일 수 있다. 이러한 리포터의 시그널은 리포터를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드가 매트립타제 대신 발현됨으로써, 매트립타제의 기능적 발현이 손상된 세포를 용이하게 확인할 수 있게 해준다는 것을 표시할 것이다.
기능적 유전자 발현의 저하는 기능적 발현이 심지어 제거되는 수준으로 달성될 수 있다.
전사 후 유전자 침묵은, 예를 들어 안티센스 분자 또는 RNA 간섭을 매개하는 분자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 비-제한적 예가 다음에 간략하게 기재될 것이다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 RNA와 특이적으로 결합하여, 역전사 또는 메신저 RNA 번역의 저지를 수반하면서 RNA-DNA 또는 RNA-RNA 혼성체를 형성시키도록 설계될 수 있다. 많은 형태의 안티센스가 개발되었고, 이는 광범위하게, 효소-의존성 안티센스 또는 입체 차단성 안티센스로 분류될 수 있다. 효소-의존성 안티센스는 단일 가닥 DNA, RNA, 및 포스포로티오에이트 안티센스를 포함한, 표적 mRNA를 분해시키는 RNase H 활성에 의존적인 형태를 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 전사된 가닥으로서 안티센스 가닥을 함유하는 안티센스 구축물로부터의 발현에 의해 세포 내에서 생성된다. 트랜스-절단성 촉매적 RNA (리보자임)은 엔도리보뉴클레아제 활성을 보유하고 있는 RNA 분자이다. 리보자임은 특별한 표적에 대하여 특이적으로 설계될 수 있고, 세포성 RNA의 배경에서 임의의 RNA 종을 부위-특이적으로 절단하도록 조작될 수 있다. 이러한 절단 현상으로 인해, mRNA는 불안정해지고 단백질 발현이 방지된다. 각각의 안티센스 분자가, 예를 들어 영구적으로 발현되도록 척추동물 세포의 게놈을 변경시킬 수 있다.
매트립타제 유전자의 기능적 발현을 전사 후 수준으로 저하시키기 위한 또 다른 적합한 옵션은 RNA 간섭 (RNAi)에 근거한다. 스파이크-인 실험에 근거한 본 실시예에 의해 제시된 바와 같이, 각각의 변경된 척추동물 세포에서 발현되고 이러한 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑 정도를 감소시키기 위해서는, RNAi에 의해 매트립타제의 발현을 저하시키는 것이 효과적이다. 상당히 더 많은 재조합 폴리펩티드가, RNAi에 의한 매트립타제 유전자의 침묵시 상등액/세포 배양 배지에서 무손상인 채로 유지되므로, 그로부터 상기 재조합 폴리펩티드를 수거할 수 있다. 이와는 달리, 다른 프로테아제, 심지어 밀접하게 관련된 세린 프로테아제의 발현 수준을 저하시키는 것은 클리핑에 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않았다. 이는 관심 재조합 폴리펩티드를 척추동물 세포, 예컨대 바람직하게 포유류 세포에서 발현시키는 경우에, 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제가 매트립타제인 것으로 확인되었다는 중요한 사실을 강조한다. RNAi에 의해 표적 유전자를 침묵시키는 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으므로, 본원에서는 어떠한 상세한 설명도 필요하지 않다. 매트립타제 유전자의 발현을 침묵시킴으로써 매트립타제의 효과를 손상시킨 변경된 세포를 제공하기 위해 사용될 수 있는 RNAi 유도성 화합물의 예는 저분자 간섭 핵산 (siNA), 저분자 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 뿐만 아니라 실제적 RNAi 유도성 화합물이 되도록 세포 내에서 프로세싱되는 그의 전구체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, siRNA가 침묵에 사용된다. 이러한 siRNA는 각 가닥에 3' 오버행(overhang)을 갖는 이중 가닥 분자로서 제공될 수 있다. 평활 말단된 분자를 사용할 수도 있다. 상기 siRNA는 데스옥시- 뿐만 아니라 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 더욱이 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. siRNA 화합물의 몇 가지 실시양태 및 변동이 선행 기술분야에 공지되어 있고, 이를 사용하여 매트립타제의 발현을 저하시킬 수 있다. 표적 유전자의 선택된/확인된 표적 서열을 RNA 수준으로 표적화하는 데 적합한 siRNA는 특정의 설계-알고리즘을 적용하는 적당한 컴퓨터를 이용한 방법을 사용함으로써 확인할 수 있다. 표적 전사체에 대항한 siRNA를 수득하기 위해서는, 이중 가닥 분자를 세포 내로 직접적으로 형질감염시킬 수 있다. 본 실시예에 의해 제시된 바와 같이, 매트립타제의 발현을 저하시키는 심지어 이러한 일시적 방법도 상기 척추동물 세포로부터 수득된 조건화 배지에서 관심 폴리펩티드의 클리핑을 방지하는 데 유효하다. 또 다른 한편으론, siRNA는 긴 dsRNA 또는 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 siRNA로 전환시켜 주는 효소인 다이서(dicer)에 의한 프로세싱으로부터 비롯될 수 있다. 이들 전구체 또는 최종 siRNA 분자는 외생적으로 (인공적으로) 생성될 수 있고, 이어서 이를 각종 형질감염 방법에 의해 척추동물 세포 내로 도입할 수 있다. 추가 실시양태에 따르면, RNAi 유도성 화합물은 척추동물 세포 내로 형질감염되는 벡터에 의해 발현된다. siRNA의 경우, 이는 예를 들어, 루프를 두 가닥 사이에 도입하여, 단일 전사체를 생성시킴으로써 수행할 수 있는데, 이어서 이를 척추동물 세포에서 기능적 siRNA가 되도록 프로세싱할 수 있다. 이러한 전사 카세트는 전형적으로, 작은 핵 RNA의 전사를 통상적으로 지시하는 (예를 들어, shRNA를 발현하기 위함) RNA 중합효소 III 프로모터 (예를 들어 U6 또는 H1)를 이용한다. 이어서, 벡터로부터 생성된 shRNA 전사체를 다이서에 의해 프로세싱하면, 이로써 바람직하게 특징적 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 siRNA 분자가 생성되는 것으로 추정된다. 한 실시양태에 따르면, 이러한 shRNA 제공 벡터는 척추동물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 이러한 실시양태가 유리한데, 이는 매트립타제 유전자의 하향 조절이 꽤 안정적이고 일시적이지 않은, 지속적으로 생성된 siRNA에 기인하기 때문이다. 이어서, 예를 들어 각각의 shRNA 제공 벡터를 포함하는 세포를 척추동물 세포에서 발현되고 이에 의해 분비될 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 더욱이, shRNA를 생성하는 벡터를, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 공동-형질감염시키는 공동-형질감염 전략을 이용할 수 있다.
전사 유전자 침묵은, 예를 들어 후성적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, mRNA의 반감기를 감소시키도록 매트립타제 유전자의 서열을 변화시킬 수 있다. 이는 또한, 매트립타제의 기능적 발현 상의 저하를 달성할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제 발현은 매트립타제 유전자의 발현을 조절하는 데 관여한 조절성 요소를 표적화함으로써 저하시키거나 또는 제거된다. 예를 들어, 전사 인자, 프로모터 (또한 상기 참조), 증강인자, UTR 또는 다른 조절성 요소는, 예를 들어 녹아웃, 결실, 돌연변이, 하향 조절, 또는 상기 조절성 요소의 활성을 저하 또는 불활성화시키는 임의의 다른 변경에 의해 표적화함으로써, 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 방지 또는 저하시키고 상기 세포에서의 매트립타제의 효과를 손상시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 내인성 매트립타제보다 덜 기능적이거나 또는 비-기능적인 돌연변이체 매트립타제의 이종 발현에 의해 매트립타제의 기능을 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시킨다. 이러한 실시양태에서, 단리된 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 이외에도, 돌연변이체 매트립타제를 코딩하는 추가의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 돌연변이체 매트립타제는 내인성 매트립타제와 비교해서 감소된 촉매 활성을 갖고 있거나 심지어 촉매 활성을 전혀 갖고 있지 않다. 각각의 돌연변이체 매트립타제를 과발현시킴으로써, 내인성 매트립타제 대신 돌연변이체의 불활성 형태가 혈장 막 내로 삽입되어, 우성 음성 표현형을 창출시킬 가능성이 증가된다. 세포에 의해 정상적으로 발현되는 매트립타제의 효과를 손상시키고 이에 따라 매트립타제의 효과를 저하시키기 위한 추가 옵션은, 매트립타제를 중화시키고/시키거나 억제시키므로, 매트립타제의 효과를 손상시키는 단백질, 예컨대 항체 또는 매트립타제 억제제의 이종 발현이다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 효과는, 세포 내에서 매트립타제와 기능적으로 상호 작용하는 분자의 기능적 발현을 변경시킴으로써 상기 세포 내에서 손상시킨다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 기능은, 매트립타제의 세포내 수송을 손상시킴으로써 상기 세포 내에서 손상시킨다.
또 다른 실시양태에 따르면, 매트립타제의 기능은, 매트립타제 지모겐의 활성화를 손상시킴으로써 손상시킨다. 한 실시양태에 따르면 매트립타제의 기능은, 하나 이상의 내인성 세포성 매트립타제 억제제의 상향 조절에 의해 및/또는 매트립타제 억제제의 공동-발현에 의해 손상시킨다. 매트립타제의 몇 가지 내인성 억제제, 예컨대 HAI-1, HAI-2, 알파1-항-트립신, 알파2-항플라스민, 항트롬빈이 현재까지 상이한 척추동물 세포에서 보고되었다 (문헌 [Chen et al., 2012]에 의한 고찰 참조). 변경될 척추동물 세포에 의해 발현된 경우에는, 이들 억제제의 발현의 상향 조절 및/또는 이들 억제제의 공동-발현이 또한, 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시킴으로써, 세포 배양 배지에서 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 기능적 발현은 길항제, 예컨대 항체 또는 그의 결합성 도메인의 재조합 발현에 의해 손상시킨다. 예를 들어 각각의 길항제는 척추동물 세포에 의해 과발현될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제 단백질이 ER 내에 남아있도록 매트립타제의 코딩 서열을 변경시킨다. 예를 들어, 매트립타제가 ER 내에 남아있도록 해주는 KDEL 모티브를 포함하도록 매트립타제 단백질을 변경시킬 수 있다. 유사한 접근 방식을 이용할 수도 있다.
내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키면, 변경된 세포에서 발현되고 이러한 세포에 의해 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이, 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능이 손상되지 않은 상응하는 척추동물 세포와 비교해서 저하되거나 또는 심지어 존재하지 않는 변경된 세포가 생성된다. 본원에 기재된 바와 같이, 매트립타제의 효과를 손상시킨 각각의 변경된 세포를, 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 이용하는 경우에, 이러한 숙주 세포를 함유하고 있고 관심 폴리펩티드가 분비되는 세포 배양 배지에서는 기능적 매트립타제가 전혀 활성적이지 않거나 또는 덜 기능적인 매트립타제가 활성적이다.
한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 발현은, 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 비-변경된 상응하는 참조 척추동물 세포에서의 매트립타제 유전자의 발현 (100%로서 설정됨)과 비교해서 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 12.5% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2.5% 이하, 1.5% 이하, 1% 이하 또는 0.05% 이하이다. 한 실시양태에 따르면, 제1 측면에 따르는 변경된 세포에서, 매트립타제 유전자의 발현은 상기 세포에서의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정됨)과 비교해서 0.1% 이하, 0.075% 이하, 0.05% 이하, 0.045% 이하, 0.04% 이하, 0.035% 이하, 0.03% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.015% 이하, 0.01% 이하, 0.0075% 이하, 0.005% 이하, 0.0045% 이하, 0.004% 이하, 0.0035% 이하, 0.003% 이하, 0.0025% 이하, 0.002% 이하, 0.0015% 이하 또는 0.001% 이하이다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 발현은 상기 세포에서의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정됨)과 비교해서 0.00075% 이하, 0.0005% 이하 또는 0.0004% 이하이다. 상기 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이, 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 저하 또는 제거되지 않은 상응하는 참조 척추동물 세포 (그로부터 변경된 세포가 유래된다)와 비교해서 저하되도록, 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거한다. 예를 들어, 매트립타제의 기능적 발현을 저하시킨 변경된 CHO 세포를 참조 척추동물 세포로서 CHO 야생형 세포와 비교하여 상기 특징을 분석한다. 시험 폴리펩티드로서, 참조 척추동물 세포에 의해 발현되는 경우에 클리핑되기 쉬운 폴리펩티드를 사용한다. 한 실시양태에 따르면, 클리핑은 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 저하 또는 제거되지 않은 상응하는 참조 척추동물 세포와 비교해서 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7.5배 이상, 8배 이상 또는 10배 이상 저하된다. 이는, 예를 들어 실시예에 기재된 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
변경된 척추동물 세포는 매트립타제를 내생적으로 발현하는 종 및 세포 유형으로부터 유래된다. 척추동물 세포는 바람직하게 포유류 세포이다. 따라서, 척추동물 세포에 대하여 본원에 기재된 모든 실시양태는 일반적으로, 포유류 세포가 사용되는 바람직한 실시양태를 적용하고 구체적으로 이를 지칭한다. 용어 "단리된"은 단순히, 척추동물 세포가 살아있는 유기체, 예컨대 동물 또는 인간 내에 포함되어 있지 않다는 것을 명백하게 하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 바와 같이, 척추동물 세포는 세포 배양물, 세포주, 세포 클론 등의 형태로 제공될 수 있다. 그 예가 다음에 또한 기재되어 있다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 척추동물 세포는 매트립타제를 내생적으로 발현하는 상응하는 비-변경된 척추동물 세포와 비교해서 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨다. 손상은 바람직하게, 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 달성된다. 그 실시양태들이 상기 언급되어 있다. 안정적이고, 균일하므로 예측 가능한 특징을 지닌 생산 세포주를 제공하기 위해서는, 척추동물 세포의 게놈을 변경시켜 매트립타제 손상을 달성하는 것이 바람직하다. 적합한 실시양태가 상기 언급되어 있다. 이어서, 각각의 변경된 척추동물 세포를, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염시켜, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고 관심 폴리펩티드를 세포 배양 배지 내로 분비시키는 본 개시내용에 따르는 숙주 세포를 제공할 수 있다. 척추동물 세포는 바람직하게 포유류 세포이고, 이는 예를 들어, 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 척추동물 세포는 설치류 세포, 예컨대 예를 들어 햄스터 또는 마우스로부터 유래된 세포이다. 설치류 세포는 차이니즈 햄스터 세포주 (예컨대 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주), BHK 세포주, NS0 세포주, C127 세포주, 마우스 3T3 섬유모세포 세포주, 및 SP2/0 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 세포주일 수 있다. 특히 바람직한 것은 CHO 세포, 예컨대 CHO-K1 유래 CHO 세포이다. 본 실시예에 제시된 바와 같이, CHO 세포에서의 매트립타제의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거하면, 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 감소되거나 또는 심지어 제거되는 조건화 세포 배양 배지가 제공된다. 매트립타제는 또한 인간 세포에서 발현된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 인간 세포로부터 유래되는데, 이는 예를 들어, HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 조혈 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 대안은 원숭이 세포인데, 이는 예를 들어, COS 세포, COS-1, COS-7 세포 및 베로(Vero) 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에 따르면 척추동물 세포는 세포 클론, 세포주 또는 세포 배양물로서 제공된다.
"관심 폴리펩티드"는 척추동물 세포에 의해 다량으로 발현되고 분비될 것으로 추정되는 재조합 폴리펩티드이다. 관심 폴리펩티드는 상기 세포 내에 포함된 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 상기 숙주 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 2개 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 관심 폴리펩티드는 척추동물 세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는데, 이러한 세포 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 수거, 예를 들어 단리 및 정제할 수 있다.
본원에 사용된 "이종 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종 핵산" 및 유사 표현은 특히, 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 형질감염을 이용함으로써 척추동물 세포 내로 도입시킨 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 특히, 하나의 데옥시리보스 또는 리보스를 또 다른 것과 통상 연결시켜 주는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, 맥락에 따라서 DNA 뿐만 아니라 RNA를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 어떠한 크기 제한도 포함하지 않는다.
척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드 이외에도, 선별성 마커를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 성공적으로 형질감염되므로 관심 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포의 선별을 간소하게 해준다. 더욱이, 척추동물 세포는 상이한 선별성 마커 및/또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 몇 가지 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
"선별성 마커"는 적당한 선택적 배양 조건 하에 이러한 선별성 마커를 발현하는 숙주 세포의 선별을 허용해 준다. 선별성 마커는 선택적 조건 하에 생존 및/또는 성장 이점을 수반한 상기 마커의 캐리어를 제공한다. 전형적으로, 선별성 마커 유전자는 선별 작용제, 예컨대 약물, 예를 들어 항생제 또는 기타 독성제에 대한 내성을 부여해주거나, 또는 숙주 세포에서 대사 또는 이화 결함을 보상해줄 것이다. 이는 양성 또는 음성 선별 마커일 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선별성 마커는 특정 약물을 포함한 선별 조건에 대하여 내성을 부여해 주는 단백질을 코딩하는 약물 내성 마커이다. 각종 선별성 마커 유전자가 보고되었다 (예를 들어, WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240 참조). 예를 들어, 하나 이상의 항생제에 대항하여 내성을 부여해 주는 적어도 하나의 선별성 마커를 사용할 수 있다. 선별성 마커는 한 실시양태에 따르면, 증폭 가능한 선별성 마커일 수 있다. 증폭 가능한 선별성 마커는 벡터 함유 숙주 세포의 선별을 허용하고, 숙주 세포 내에서의 상기 벡터의 유전자 증폭을 증진시킬 수 있다. 척추동물 세포과 함께 흔히 사용되는 선별성 마커 유전자는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hyg), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (tk), 글루타민 합성효소, 아스파라긴 합성효소에 대한 유전자; 및 네오마이신 (G418), 푸로마이신, 히그로마이신, 제오신, 와베인, 플라스티시딘, 히스티딘올 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 미코페놀산에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 엽산염 수용체가 본원에 기재된 신규 척추동물 세포 (바람직하게 포유류 세포이다)와 연계해서 선별성 마커로서 사용된다 (예를 들어, WO2009/080759 참조). 엽산염 수용체는 WO10/097240에 기재되는 바와 같이, 선별성 마커로서 DHFR과 조합하여 사용될 수도 있다. "리포터 폴리펩티드"는 리포팅 특징 (예를 들어, 형광)에 근거하여 상기 리포터 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인시켜 줄 수 있다. 리포터 유전자는 통상적으로, 생존 이점을 지닌 숙주 세포를 제공하지 않는다. 그러나, 리포터 폴리펩티드의 발현을 이용하여, 이러한 리포터 폴리펩티드를 발현하는 세포와 리포터 폴리펩티드를 발현하지 않는 세포를 구별할 수 있다. 따라서, 또한 리포터 유전자는 성공적으로 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 해준다. 적합한 리포터 폴리펩티드는, 예를 들어 그린 형광 단백질 (GFP), YFP, CFP 및 루시페라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 리포터 폴리펩티드는 유동 세포계수법에 의한 선별을 가능하게 해주는 특징을 갖는다.
한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키고, 임의로, 선별성 마커 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 부가적으로 통합시킨다.
발현 벡터를 이용하여 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 선별성 마커 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 동일하거나 상이한 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 이들이 상이한 발현 벡터 상에 위치하는 경우, 이러한 발현 벡터는 숙주 세포 내로 공동-형질감염시킨다. 이러한 공동-형질감염 전략은 또한, 선행 기술분야에 널리 공지되는 바와 같이 선별을 가능하게 해준다. 척추동물 세포 내로의 도입은, 예를 들어 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시킴으로써 달성할 수 있다. 상기 발현 벡터는 바람직하게, 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다 (안정적 형질감염). 이종 핵산이 상기 게놈 내로 삽입되지 않는 경우, 이러한 이종 핵산은, 예를 들어 세포가 유사분열을 진행하는 나중 단계에서 상실될 수 있다 (일시적 형질감염). 관심 폴리펩티드를 산업 규모로 생산하기 위한 고 발현성 세포 클론을 생성하는 데에는 안정적 형질감염이 바람직하다. 이는 치료상 활성 또는 진단의 관심 폴리펩티드에 특히 중요하다. 이종 핵산, 예컨대 발현 벡터를 척추동물 숙주 세포, 바람직하게 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 데 적당한 몇 가지 방법이 선행 기술분야에 공지되어 있으므로, 본원에서는 어떠한 상세한 설명도 필요하지 않다. 각각의 방법은 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 유전자 총(biolistic)-매개된 및 중합체-매개된 유전자 전이 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전통적인 무작위 통합 기반 방법 외에도, 또한 재조합 매개된 접근 방식을 이용하여 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 전이시킬 수 있다. 각각의 방법이 선행 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에서는 어떠한 상세한 설명도 필요하지 않다. 적합한 벡터 설계의 비-제한적 실시양태가 또한 연속해서 기재되어 있고, 이는 각각의 개시내용에 언급된다.
숙주 세포에서 관심 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위해 사용되는 발현 벡터는 통상적으로, 전사를 구동시키는 데 적합한 전사 제어 요소, 예컨대 예를 들어 통상적으로 발현 카세트의 요소로서의, 프로모터, 증강인자, 폴리아데닐화 시그널, 전사 일시 중지 또는 종결 시그널을 함유한다. 적합한 번역 제어 요소, 예컨대 예를 들어 번역 프로세스를 종결시키기 위한 정지 코돈 및 리보솜을 동원하는 데 적합한 5' 캡 구조를 초래하는 5' 비번역 영역이 상기 벡터 내에 포함되는 것이 바람직하다. 이로써 생성된 전사체는 단백질 발현 (즉, 번역)과 적당한 번역 종결을 촉진시켜 주는 기능적 번역 요소를 포함하고 있다. 혼입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적당하게 구동시킬 수 있는 기능적 발현 유닛이 "발현 카세트"로서 지칭되기도 한다. 척추동물 세포에서 관심 폴리펩티드의 발현과 분비를 허용하기 위해 발현 카세트를 어떻게 설계해야 하는지가 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
관심 재조합 폴리펩티드의 세포 배양 배지 내로의 분비를 달성하기 위하여, 적당한 리더 펩티드를 관심 폴리펩티드에 제공한다. 관심 폴리펩티드의 분비를 달성하기 위한 리더 서열 및 발현 카세트 설계는 선행 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에 기재할 필요가 없다.
임의의 관심 폴리펩티드가 본 발명에 따르는 척추동물 세포에서 발현될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드는 단백질 (예를 들어, 50개 초과 아미노산을 갖는다) 및 펩티드 (예를 들어, 2 내지 49개 아미노산)를 포함한, 임의의 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성, 기능 또는 크기의 단백질 및/또는 펩티드를 포함하고, 예를 들어 효소 (예를 들어 키나제, 포스파타제), 수용체, 수송체, 살균성 및/또는 내독소-결합성 단백질, 구조적 폴리펩티드, 막-결합된 폴리펩티드, 글리코폴리펩티드, 구상 단백질, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 백신, 바이러스 글리코폴리펩티드 등을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 교시에 따라서 발현되는 관심 폴리펩티드는 또한, 폴리펩티드의 특정 서브유닛 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체일 수 있다. 용어 "관심 폴리펩티드"는 맥락에 따라서, 상기 개개의 서브유닛 또는 도메인, 또는 각각의 서브유닛 또는 도메인으로 구성되는 최종 단백질을 지칭할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 치료 또는 진단 폴리펩티드로부터 선택된다. 치료적이므로 치료상 활성인 폴리펩티드가 특히 중요하다. 용어 치료 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 백신 접종을 위해 사용된 예방 폴리펩티드를 포괄한다. 이러한 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화제, 시토카인, 성장 인자, 면역글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능적 항체 단편 또는 변이체 또는 유도체, 및 Fc-융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 면역글로불린 분자, 예컨대 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 특히, 디술피드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 단백질을 지칭한다. 용어 "항체"는 자연적으로 발생하는 항체뿐만 아니라 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각 중쇄는 통상적으로, 중쇄 가변 영역 (VH)과 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 통상적으로, 경쇄 가변 영역 (VL)과 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 그러나, 용어 "항체"는 또한, 다른 유형의 항체, 예컨대 단일 도메인 항체, 중쇄 항체, 즉 1개 이상, 특히 2개의 중쇄로만 구성된 항체, 및 나노보디, 즉 단일 단량체성 가변 도메인으로만 구성된 항체를 포함한다. 나노보디는 또한, 다가 구조를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 관심 폴리펩티드로서, 항체의 하나 이상의 서브유닛 또는 도메인, 예를 들어 그의 중쇄 또는 경쇄 또는 기능적 단편 또는 유도체를 코딩할 수 있다. 상기 서브유닛 또는 도메인은 동일하거나 상이한 발현 카세트로부터 발현될 수 있다.
항체의 "기능적 단편 또는 유도체"는 특히, 특정 항체로부터 유래되고 이러한 항체와 동일한 항원, 특히 동일한 에피토프와 결합할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 완전한 길이의 항체의 단편 또는 그의 유도체에 의해 실행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 단편 또는 유도체의 예는 (i) 각 중쇄 및 경쇄의 제1 불변 도메인 및 가변 영역으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 제1 불변 도메인 CH1 및 가변 영역으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 공유적으로 함께 연결된 2개의 Fv 단편으로 이루어진 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 회합이 분자 내에서가 아니라 분자 간에서만 일어날 수 있도록 하는 방식으로 공유적으로 함께 연결된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역으로 이루어진 멀티보디를 포함한다.
한 실시양태에 따르면, 변경된 척추동물 세포에 의해 발현되는 관심 폴리펩티드는 프로테아제에 의한 클리핑의 영향을 받기 쉽다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 매트립타제에 의해 인식되는 적어도 하나의 클리핑 부위를 포함한다. 당단백질, 항체, 비-IgG 단백질, Fab 단편, 단백질 복합체, 펩티다제, 시그널 펩티드, Fc-융합 단백질, 나노보디, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 바이러스 글리코폴리펩티드, 혈액 인자 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 몇 가지 폴리펩티드가 클리핑되기 쉬운 것으로 확인되었다. 이들 폴리펩티드 중 많은 것이 2개 이상의 클리핑 부위를 함유하고, 클리핑에 대해 특히 감수성이다. 본 개시내용에 따르는 변경된 척추동물 세포에서 관심 폴리펩티드로서 클리핑되기 쉬운 폴리펩티드를 발현하는 것이 유리한데, 이는 세포 배양 배지에서 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 본 실시예에 의해 입증되는 바와 같이 상당히 저하되거나 또는 심지어 제거되기 때문이다.
상기 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상응하는 (각각 이와 동일하다) 내인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드에 상응하는 내인성 유전자를 포함하지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 매트립타제가 아니거나 또는 이를 포함하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 HAI-1이 아니거나 또는 이를 포함하지 않는다.
척추동물 세포에 포함되는 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 추가의 벡터 요소를 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 부가 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 상기 설명된 바와 같고 본 교시에 따라서 발현될 수 있는 폴리펩티드의 상기 언급된 예로부터 명백한 바와 같이, 숙주 세포에 의해 생성되고 분비되어야 하는 최종 폴리펩티드는 또한, 몇 가지 개개의 서브유닛 또는 도메인으로 구성되는 단백질일 수 있다. 각각의 단백질의 특정 예는 면역글로불린 분자, 특히 예를 들어, 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체이다. 상이한 개개의 서브유닛 또는 도메인으로 구성되는 각각의 단백질을 생성하기 위한 몇 가지 옵션이 있으며, 적당한 벡터 설계는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 단백질의 2개 이상의 서브유닛 또는 도메인이 하나의 발현 카세트로부터 발현된다. 이러한 실시양태에서, 상기 단백질의 개개의 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역을 포함하는 각각의 발현 카세트로부터 1개의 긴 전사체가 수득된다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 IRES 요소 (내부 리보솜 진입 부위)가 개개의 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역들 사이에 기능적으로 위치하고, 각 코딩 영역 앞에 분비성 리더 서열이 있다. 이로써, 별도의 번역 생성물이 상기 전사체로부터 수득되고, 최종 단백질이 정확하게 어셈블리되며 분리될 수 있는 것으로 보장된다. 각각의 기술이 선행 기술분야에 공지되어 있으므로, 본원에서는 어떠한 상세한 설명도 필요하지 않다. 일부 실시양태, 예컨대 항체의 발현의 경우에는, 상이한 발현 카세트로부터 개개의 서브유닛 또는 도메인을 발현하는 것이 훨씬 바람직하다. 한 실시양태에 따르면, 관심 생성물을 발현하기 위해 사용된 발현 카세트는 모노시스트로닉(monocistronic) 발현 카세트이다. 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물에 포함된 모든 발현 카세트는 모노시스트로닉일 수 있다. 따라서 한 실시양태에 따르면, 관심 생성물을 발현하도록 설계된 각 발현 카세트는 관심 폴리펩티드로서 발현될 단백질의 하나의 서브유닛 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어 항체의 경우, 하나의 발현 카세트는 항체의 경쇄를 코딩할 수 있고, 또 다른 발현 카세트는 항체의 중쇄를 코딩할 수 있다. 개개의 발현 카세트로부터 개개의 서브유닛 또는 도메인을 발현한 후, 최종 단백질, 예컨대 항체가 상기 서브유닛 또는 도메인으로부터 어셈블리되고 숙주 세포에 의해 분비된다. 이러한 실시양태는 면역글로불린 분자, 예컨대 항체를 발현하는 데 특히 적합하다.
상기 언급된 바와 같이, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 선별성 마커(들) 및/또는 리포터 폴리펩티드(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하게, 발현 카세트에 포함된다. 몇 가지 실시양태가 적합하다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드(들) 각각이 별도의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 이는 모노시스트로닉 세팅으로서 지칭되기도 한다. 그러나, 각각의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 2개가 하나의 발현 카세트에 포함되는 것이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소가, 동일한 발현 카세트로부터 발현되는 폴리뉴클레오티드 사이에 기능적으로 위치한다. 각각의 IRES 기반 발현 기술 및 다른 비시스트로닉(bicistronic) 및 폴리시스트로닉 시스템이 널리 공지되어 있으므로, 본원에서는 추가의 설명이 필요하지 않다.
B. 제1 측면에 따르는 척추동물 세포의 생성 방법
제2 측면에 따르면, 제1 측면에 따르는 척추동물 세포의 생성 방법이 제공되는데, 이러한 방법은 매트립타제의 효과를 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시키는 단계; 및 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, 상기 관심 폴리펩티드는 상기 척추동물 세포에 의해 분비된다)를 포함한다.
내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시키는 데 적합하고 바람직한 실시양태가 제1 측면에 따르는 척추동물 세포와 연계해서 상기 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 상기 개시내용에 언급된다. 따라서, 상기 방법은 제1 측면에 따르는 변경된 척추동물 세포와 연계해서 상기 언급된 바와 같은, 매트립타제의 효과를 손상시키는 것을 포함할 수 있다. 비-제한적 실시양태가 다음에 간략하게 또한 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 상기 방법은 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 매트립타제의 효과를 손상시키는 것을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 예를 들어 세포 표면 상에 존재하고/하거나 상기 변경된 세포에 의해 방출되는, 예를 들어 유출되는 기능적 매트립타제가 전혀 없거나 또는 그 양이 감소되기 때문에, 상기와 같은 손상은 변경된 세포를 함유하는 세포 배양 배지 내에 활성 형태로 존재하는 기능적 매트립타제가 전혀 없거나 또는 그 양이 감소되는 효과를 갖는다. 이로써, 관심 재조합 폴리펩티드가 분비되는 세포 배양 배지 내에는 단백질 분해적으로 활성인 형태로 존재하는 매트립타제가 전혀 없거나 더 적게 존재한다. 본 개시내용은 매트립타제가 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 것을 나타내기 때문에, 이와 같이 세포를 변경시키는 것이 유리하게도, 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키거나 또는 심지어 제거시킨다. 매트립타제의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거하는 데 적합한 방식이 제1 측면에 따르는 척추동물 세포와 연계해서 상기 언급되어 있고, 그것을 참조한다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거하도록 척추동물 세포의 게놈을 변경시킨다. 예를 들어, 유전자 녹아웃을 매트립타제 유전자 내로 도입할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 이러한 유전자 녹아웃은 매트립타제 유전자의 모든 카피 내로 도입한다. 한 실시양태에 따르면, 매트립타제 유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 예를 들어 프레임시프트 및/또는 정지 코돈 돌연변이를 도입함으로써 결실시키거나 또는 녹아웃시킨다. 매트립타제 유전자의 모든 카피를 상기 게놈에서 각각 변경시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 돌연변이는 매트립타제 유전자의 코딩 영역 내에 포함되어, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물을 생성시킨다. 세부 사항은 제1 측면에 따르는 변경된 척추동물 세포와 연계해서 상기 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 각각의 개시내용에 언급된다. 한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 돌연변이는 매트립타제의 1개 또는 2개 이상의 촉매적으로 활성인 스플라이스 변이체에 존재하는 아미노산 서열을 코딩하는 매트립타제 유전자의 특정 영역 내로 도입한다. 매트립타제 엑손 중 몇 가지가, 촉매적으로 활성인 것으로 확인된 스플라이싱 변이체의 대다수에게서 또는 심지어 모두에서 발견된다. 상기 언급되고 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 매트립타제의 엑손 2를 코딩하는 매트립타제 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 예를 들어 프레임-시프트 돌연변이를 도입하는 데 적합한 표적인데, 이는 엑손 2가 매트립타제의 스플라이스 변이체의 대다수에서 발현되고 각각의 돌연변이로 인해 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 되기 때문이다. 더욱이, 매트립타제의 N-말단에 근접한 엑손, 예컨대 엑손 2가, 하나 이상의 프레임시프트 돌연변이를 도입하여 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 말단절단된 단백질의 발현을 초래하는 데 유리한 표적이다. 더욱이, 하나 이상의 돌연변이를 촉매적 도메인 내로 도입하여 매트립타제의 기능을 붕괴시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 포유류 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 설치류 세포이다. 바람직하게, 설치류 세포는 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 바람직하게 세포주 K1로부터 유래된 CHO 세포를 사용하여, 바람직하게 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시킨 변경된 척추동물 세포주를 제공한다.
손상을 달성하도록 숙주 세포의 게놈을 변경시키는 경우, 먼저 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 기본적으로 영구적 손상시키고 이에 따라 상기 매트립타제의 기능을 영구적 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시킨 다음, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이 바람직하다. 예를 들어 RNAi를 통하여 매트립타제 유전자를 일시적으로 침묵시키는 경우에 흔히 있듯이, 상기 변경이 영구적이지 않은 경우에는, 먼저 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입한 다음, 예를 들어 전사 후 유전자 침묵에 의해 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시키도록 척추동물 세포를 변경시킬 수 있다. 적합한 방법이 상기 언급되어 있고 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 상기 언급된 바와 같이, 바람직한 실시양태에 따르면, 손상을 달성하도록 척추동물 세포의 게놈을 변경시킨다. 제7 측면에 따르는 방법을 이용하여, 매트립타제의 효과가 손상된 숙주 세포를 확인하고 선별할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 제2 측면에 따르는 방법은 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 저하되거나 또는 제거되도록 변경시킨 척추동물 세포 내로, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 바람직하게 선별성 마커를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 선별성 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 발현 벡터 상에 위치한다. 적합하고 바람직한 실시양태가 상기 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 각각의 개시내용에 언급된다. 도입은 형질감염에 의해 달성될 수 있는데, 안정적인 형질감염이 바람직하다. 예를 들어 제5 측면에 따르는 방법을 이용하여, 관심 폴리펩티드를 성공적으로 발현하는 척추동물 숙주 세포를 선별할 수 있다. 이는 후속 개시내용을 참조한다.
C. 관심 폴리펩티드를
재조합적으로
생성하는 방법
제3 측면에 따르면, 관심 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 제1 측면에 따르는 척추동물 세포를 활용하는 단계를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다. 상기 언급된 바와 같이, 재조합 발현을 위하여 이들 신규 척추동물 세포를 이용하는 경우에 달성되는, 세포 배양 배지 내에서 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해의 수준 감소로 인해, 이들 신규 척추동물 세포, 바람직하게 포유류 세포가 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하기 위한 숙주 세포로서 특히 적합하다. 바람직하게 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써, 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨 척추동물 숙주 세포의 적합하고 바람직한 예뿐만 아니라 관심 폴리펩티드의 적합하고 바람직한 예가 상기에 상세히 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 상기 개시내용에 언급된다.
한 실시양태에 따르면, 상기 방법은 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과가 손상되도록 변경시킨 척추동물 숙주 세포 내로, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 척추동물 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 도입은 널리 공지되어 있는 바와 같은 형질감염에 의해 달성될 수 있고, 이는 또한 본원에 기재되어 있다. 선별은 본 개시내용의 제5 측면에 따르는 방법을 이용하여 일어날 수 있다. 바람직하게, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 숙주 세포를 선별한다.
한 실시양태에 따르면, 상기 방법은
(a) 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계;
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 상기와 같이 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함한다.
따라서, 제3 측면에 따르는 방법의 바람직한 실시양태로서,
(a) 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 세포 배양 배지 내로의 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계;
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 상기와 같이 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다.
상기 숙주 세포는 혈청-무함유 조건하에 배양할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 발현되고 배양 배지 내로 분비되며, 그로부터 수득할 수 있다. 분비를 위해서는, 관심 폴리펩티드가 분비되도록 적당한 리더 펩티드가 제공된다. 분비를 달성하기 위한 리더 서열 및 발현 카세트 설계는 선행 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에 기재할 필요가 없다.
상기 언급된 바와 같이, 숙주 세포를 생성하기 위하여 제1 측면에 따르는 변경된 척추동물 세포를 사용하는 경우, 이러한 세포를 함유하는 세포 배양 배지 내에서 유효한 기능적 매트립타제가 전혀 없거나 또는 그 양이 감소됨으로써, 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해가 상당히 저하되거나 또는 심지어 완전히 회피된다. 이는 놀랍게도, 척추동물 세포에 의해 발현된 수백 개의 상이한 프로테아제 중에서, 매트립타제가 세포 배양 배지에서 재조합적으로 발현된 폴리펩티드의 클리핑을 유발시키는 주요 프로테아제라는 사실이 밝혀졌기 때문이다. 따라서, 생산 숙주 세포로서 본 개시내용에 따르는 신규 척추동물 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 세포 배양 배지에서의 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해 및 이에 따른 클리핑을 저하시키거나 또는 회피하기 위한 부가의 조치를 수행할 필요가 없다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 프로테아제 억제제를 세포 배양 배지에 부가하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 세포 배양 배지에서의 단백질 분해적 활성을 저하시키기 위해 배양 온도를 낮추지 않는다. 본 개시내용은 프로테아제에 의해 클리핑되기 쉬운 하나 이상의 모티브를 제거하도록 관심 폴리펩티드를 재조작하는 방법을 포괄한다. 그러나, 한 실시양태에 따르면, 클리핑을 저하시키거나 또는 방지하기 위해 매트립타제에 의해 클리핑되기 쉬운 하나 이상의 아미노산 모티브를 제거하도록 관심 폴리펩티드를 재조작하지 않는다. 이러한 실시양태에 따르면, 매트립타제와 상이한 프로테아제에 의해 클리핑되기 쉬운 하나 이상의 아미노산 모티브를 제거하기 위해서는, 경우에 따라 각각의 재조작을 수행할 수 있다. 그러나, 한 실시양태에 따르면, 클리핑을 저하시키거나 또는 방지하기 위해 프로테아제에 의해 클리핑되기 쉬운 하나 이상의 아미노산 모티브를 제거하기 위해 관심 폴리펩티드를 전혀 재조작하지 않는다. 본 실시예에 의해 제시된 바와 같이, 본원에 기재된 변경된 세포를 사용하는 경우에 클리핑이 효과적으로 저하되거나 또는 심지어 완전히 제거되어, 각각의 재조작 접근 방식이 기본적으로 더 이상 쓸모가 없어진다.
변경된 척추동물 세포를 이용하여 생성될 수 있는 관심 폴리펩티드의 예가 본 발명의 제1 측면과 연계해서 상기 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 각각의 개시내용에 언급된다. 한 실시양태에 따르면, 다음 특징들 중 한 가지 이상을 갖는 관심 폴리펩티드를 생성하기 위한 생성 방법을 이용한다:
a) 치료 또는 진단 폴리펩티드이고/이거나;
b) 프로테아제에 의한 클리핑의 영향을 받기 쉽고/쉽거나;
c) 매트립타제에 대한 적어도 하나의 클리핑 부위를 포함하고/하거나;
d) 글리코폴리펩티드이고/이거나;
e) 당단백질, 항체, 비-IgG 단백질, Fab 단편, 단백질 복합체, 펩티다제, 시그널 펩티드, Fc-융합 단백질, 나노보디, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 혈액 인자 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
f) 매트립타제가 아니거나 또는 이를 포함하지 않고/않거나;
g) HAI-1이 아니거나 또는 이를 포함하지 않는다.
생성되는 관심 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 세포 배양 배지로부터 단리하고 임의로 추가로 프로세싱한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 한외 여과, 추출 또는 침전을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 통상적인 과정에 의해 영양 배지로부터 회수할 수 있다. 추가의 프로세싱 단계, 예컨대 정제 단계는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화, 소수성, 크로마토분획, 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피 및 크기 배제), 전기영동 과정 (예를 들어, 분취 등전점 전기영동법), 차등 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전) 또는 추출을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 각종 과정에 의해 수행될 수 있다. 더욱이, 단리되고 정제된 관심 폴리펩티드는 추가로 프로세싱할 수 있는데, 예컨대 예를 들어 변형시키고/시키거나 조성물, 예를 들어 제약 조성물로 제제화할 수 있다.
제4 측면에 따르면,
(a) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 세포 배양 배지 내로의 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계 (여기서, 세포 배양 배지는 매트립타제에 대해 선택적인 프로테아제 억제제를 포함한다);
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 상기와 같이 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법이 제공된다.
제4 측면에 따르는 방법은 또한, 매트립타제가 세포 배양 배지에서 분비된 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 본원에 기재된 중요한 발견에 근거한다. 제4 측면에 따르는 방법에서, "클리핑"으로서 지칭되기도 한 (상기 참조), 세포 배양 배지에서의 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해는 매트립타제에 대해 선택적인 프로테아제 억제제를 세포 배양 배지에 부가함으로써 회피된다. 매트립타제에 대해 선택적인 프로테아제 억제제는 선택적 매트립타제 억제제로서 본원에 지칭되기도 한다. 물론, 또한 2개 이상의 선택적 매트립타제 억제제를 부가할 수 있다. 실시예 4에 의해 입증되는 바와 같이, 선택적 매트립타제 억제제를 세포 배양 배지에 부가하면, 심지어 매트립타제를 정상적으로 발현하는 척추동물 세포를 이용하는 경우일지라도, 관심 폴리펩티드의 클리핑을 상당히 저하시킬 수 있거나 또는 심지어 없앨 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태는 손상이 세포 배양 배지에서 달성되기 때문에 매트립타제의 효과가 손상되지 않은 비-변경된 척추동물 세포를 사용할 수 있게 해준다.
세포 배양 배지에 존재하는 선택적 매트립타제 억제제는 이러한 세포 배양 배지에서의 매트립타제의 단백질 분해적 활성을 저하시키거나 또는 없애준다. 매트립타제 억제제는, 예를 들어 매트립타제의 활성 부위를 놓고 기질과 경쟁하는 경쟁적 억제제이거나, 또는 매트립타제의 활성을 저하시키기 위해 그의 구조를 변형시키는 알로스테릭(allosteric) 억제제일 수 있다. 매트립타제 억제제는 매트립타제에 대항한 그의 억제 활성이 다른 세린 프로테아제, 특히 다른 유형 II 막투과 세린 프로테아제에 대항한 그의 억제 활성보다 더 높은 경우에, 선택적인 것으로 간주된다.
선택적 매트립타제 억제제는 관심 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포에 대하여 해로운 효과를 나타내지 않는 한은 어떠한 종류일 수도 있다. 선택적 매트립타제 억제제는 i) 항체 기반 또는 항체 유래 선택적 매트립타제 억제제, 펩티드 또는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 생물학적 매트립타제 억제제 및 ii) 화학적 매트립타제 억제제, 예컨대 소분자로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 선택적 매트립타제 억제제는 다른 프로테아제에 대해서 보다 매트립타제에 대해 5배 이상, 10배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 100배 이상 또는 250배 이상 더 선택적이므로 매트립타제에 대해 특이적이다. 그러나, 이러한 선택성은 또한, 실질적으로 더 높을 수 있는데, 예컨대 예를 들어 500배 이상, 5,000배 이상, 10,000배 이상, 50,000배 이상, 500,000배 이상 및 5,000,000배 이상 더 높을 수 있다. 그 범위는 5배 내지 10,000,000배, 10배 내지 5,000,000배, 25배 내지 1,000,000배, 50배 내지 5,000,000배를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 5,000배 이상 또는 10,000배 이상의 더 높은 선택성은, 예를 들어 선택적 생물학적 매트립타제 억제제, 예컨대 예를 들어 매트립타제 특이적 항체 또는 Fab-단편을 이용하여 달성할 수 있다.
선택성은, 예를 들어 선택적 매트립타제 억제제에 대한 값이 시험된 다른 프로테아제에 대한 값 보다 더 낮은 ki-값에 근거하여 결정할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 매트립타제 억제제는 200 nM 이하, 150 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 25 nM 이하, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 10 nM 이하, 7.5 nM 이하, 5 nM 이하, 2.5 nm 이하, 1 nM 이하 또는 0.75 nM 이하의 ki 값으로 매트립타제를 선택적으로 억제한다.
상기 언급된 바와 같이, 몇 가지 선택적 매트립타제 억제제가 선행 기술분야에 보고되었다. 예를 들어, 파라데이(Faraday) 등은 상이한 항체 기반 선택적 매트립타제 억제제, 즉 Fab 단편 (문헌 [Farady et al., 2008 J.Mol.Biol. (2008) 380, 351-360)]) 및 2개의 scFv 항체 억제제를 기재하였다 (J Mol Biol. 2007 June 15; 369 (4): 1041-1051). 12 pM 및 160 pM의 Ki 값을 수반하는 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 항체 억제제 E2 및 S4가 특히 선택적인 것으로 보고되었다. 항체-기반 선택적 매트립타제 억제제는 상이한 종으로부터 유래된 매트립타제에 대항하여 활성일 수 있다. 실시예 4에 의해 입증되는 바와 같이, 예를 들어 인간 매트립타제에 대항한 Fab-단편이 또한, 마우스 및 햄스터로부터 유래된 매트립타제에 대항하여 유효하였다. 그러나, 최대 억제 효과를 보장하고 세포 배양 배지에서 더 낮은 농도의 선택적 매트립타제 억제제를 사용할 수 있도록 하기 위해서는, 각각의 항체-기반 선택적 매트립타제 억제제가 또한, 관련 숙주 세포에 의해 발현된 특이적 매트립타제에 대항하여 생성될 수 있다. 더욱이, 매트립타제의 촉매적 부위에 대해 특이적인 항체가 보고되었다 (US 2006/171884 A1). 펩티드 모방제 분자 선택적 매트립타제 억제제, 예컨대 3-아미디노페닐-알라닌 유형 분자 CJ-730 및 CJ-697는 각각, 46 nM 및 26 nM의 매트립타제에 대한 ki-값을 갖는다 (문헌 [Foerbs et al. International Journal of Oncology 27:1061-1070 2005]에 기재됨). 이러한 문헌에 기재되는 바와 같이, 이들 화합물을 종양 세포주의 세포 배양물에 부가하는 것은, 세포의 증식에는 상당한 영향을 미치지 않으면서 매트립타제 활성을 저하시킨다. 매트립타제의 선택적 억제제가 또한, 다음 문헌에 기재되어 있다 ([Steinmetzer et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 4116-4126] 및 [Goswami et al., ACS Med. Chem. Lett., 2013 4 (12) pp 1152-1157]). 더욱이, 세린 프로테아제 억제제인 작은 단량체성 단백질인 에글린(eglin) c의 구조적 변이체가 각각의 매트립타제 억제제로서 확인되었다 (Desilets et al. FEBS Letters 580 (2006) 2227-2232). 여기서는, 스크리닝 검정에서 에글린 c의 상이한 구조적 변이체를 창출시키고, 이를 대상으로 하여 매트립타제에 대한 특이성에 관하여 시험하였다. 반응성 부위 루프에서의 단일 아미노산 교환 (L45R)으로 인해, 에글린 c가 매트립타제 특이적이 된다 (ki = 18 nM). 따라서, 세포 배양 배지에서 매트립타제를 선택적으로 억제함으로써, 척추동물 숙주 세포에 의해 재조합적으로 발현되고 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키거나 또는 방지시키기 위해, 본 개시내용의 목적상 사용될 수 있는 많은 선택적 매트립타제 억제제가 공지되어 있다.
세포 배양 배지에서의 매트립타제의 효과를 손상시키기 위하여, 발현 숙주 세포가 배양되는 세포 배양 배지에 상기 선택적 매트립타제 억제제를 부가할 수 있다. 관심 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해가 저하되도록 세포 배양 배지에서의 충분한 매트립타제 억제를 달성하는 데 필요한 개개의 선택적 매트립타제 억제제의 농도는 일상적인 실험에 근거하여 결정할 수 있다. 선택적 매트립타제 억제제는 숙주 세포의 부가 전 또는 부가 후에 세포 배양 배지에 가할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선택적 매트립타제 억제제는 세포 배양을 시작할 때 부가한다. 한 실시양태에 따르면, 선택적 매트립타제 억제제는 숙주 세포가 관심 폴리펩티드를 분비하기 시작하는 특정 시점에 부가한다. 선택적 매트립타제 억제제는 또한, 연속적으로 부가할 수 있다. 예를 들어, 유가식 배양에서는, 선택적 매트립타제 억제제가 공급물에 포함될 수 있다.
관심 폴리펩티드, 세포 배양 배지로부터의 관심 폴리펩티드의 단리뿐만 아니라 후속 프로세싱에 관한 세부 사항은, 예를 들어 제3 측면에 따르는 방법과 연계해서 상기 언급되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 상기 개시내용에 언급된다.
대규모 생산에 필요한 세포 배양 용적을 고려해 볼 때, 세포 배양 배지에서의 관심 폴리펩티드의 클리핑을 효율적으로 저하시키거나 또는 방지시키기 위해 고 선택성의 매트립타제 억제제를 사용하는 경우일지라도, 다량의 (하나 이상의) 선택적 매트립타제 억제제를 세포 배양 배지에 부가해야만 한다. 이는 비용이 많이 들 수 있다. 부가적으로, 많은 관심 폴리펩티드, 예컨대 바이오의약품의 경우에는, 관심 폴리펩티드의 후속 단리 및 정제 동안 상기 부가된 선택적 매트립타제 억제제를 제거하여, 최종 관심 폴리펩티드가 매트립타제 억제제로 오염되는 것을 피해야만 한다. 이러한 제거 단계는 임의의 공지된 정제 단계, 예컨대 이온 교환, 친화, 크기 배제, 또는 역상 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적격한 제거 방법은 사용된 선택적 매트립타제 억제제의 유형에 의존적이다. 이러한 단계들은 힘들 수 있고 비용을 증가시킬 수 있기 때문에, 제1 측면에 따르는 변경된 척추동물 세포를 이용하는 것을 포함하는 제3 측면에 따르는 방법이 바람직하다.
D. 선별 방법
제5 측면에 따르면,
(a) 숙주 세포로서 본 발명의 제1 측면에 따르는 척추동물 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 관심 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 숙주 세포를 선별하는 방법이 제공된다.
적합하고 바람직한 실시양태 뿐만 아니라 그의 이점을 포함한, 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포가 상기에 상세히 기재되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 각각의 개시내용에 언급된다. 바람직하게, 척추동물 세포는 포유류 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 제5 측면에 따르는 선별 방법의 단계 (a)는 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨 척추동물 세포를, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시켜, 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포를 제공하는 것을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 상기 세포는 숙주 세포에 의해 발현되고 분비될 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 형질감염 이전에는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 기재된 바와 같이, 포유류 세포가 척추동물 숙주 세포로서 바람직하게 사용된다. 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터 내에 포함될 수 있고, 이어서 척추동물 세포 내로 형질감염된다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에 제공된 상기 숙주 세포는 부가적으로, 선별성 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 단계 (b)는 상기 복수 개의 숙주 세포를, 선별성 마커에 대해 선택적인 조건하에 배양하는 것을 포함한다. 선별 단계 (b)는 관심 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 선별하고 이에 따라 이를 확인하기 위해, 몇 가지 선별 단계를 포함하는 다단계 선별 공정일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 선별 단계 (b)는 몇 가지 선별 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단계 (b)는 성공적으로 형질감염된 세포를 선별해 주는 하나 이상의 선별 단계뿐만 아니라 성공적으로 형질감염된 세포의 풀로부터 고 발현성 세포를 선별해 주는 하나 이상의 후속 선별 단계를 포함할 수 있다. 적당한 선별 전략은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용되는 발현 벡터의 설계에 좌우되고, 특히 사용된 선별 마커(들) 및/또는 리포터(들)에 좌우된다. 비-제한적 실시양태가 다음에 기재될 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 척추동물 숙주 세포는 선별성 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 선별성 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 공동-형질감염된 발현 벡터를 이용하여, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 이어서, 단계 (b)는 상기 복수 개의 숙주 세포를, 예를 들어 적당한 선별 배지를 이용하여, 도태 압력을 숙주 세포에 제공하여 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 선별해 주는 조건하에 배양하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "선별 배지"는 특히, 선별성 마커를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 데 유용한 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는, 예를 들어 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 선별할 수 있게 해주는 선별 작용제, 예컨대 독성 작용제를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 필수 화합물이 선별 배지에 부재할 수 있거나 또는 선별 배지에서의 그의 농도가 감소될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 성공적으로 형질감염되지 않았으므로 선별 마커(들)를 발현하지 못하거나 또는 그 발현이 낮은 숙주 세포는 선택적 배양 조건하에서 증식하지 못하거나 또는 사망할 수 있다. 이와는 달리, 발현 벡터(들)로 성공적으로 형질감염되었고 충분한 수율로 선별 마커(들)를 발현하는 (이에 따라, 공동-도입된 관심 폴리펩티드를 발현하는) 숙주 세포는 도태 압력에 대해 저항하거나 또는 이러한 도태 압력에 의해 덜 영향을 받으므로, 증식할 수 있고, 이로써 성공적으로 형질감염되지 않았거나 또는 세포의 게놈 내로의 통합 부위가 선호되지 않은 숙주 세포는 쓸모없게 될 수 있다. 선별성 마커는 항생제 내성 마커, 약물 내성 마커 및 대사 마커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 선별성 마커 및 선별 원리에 대한 적합한 예가, 제1 측면과 연계해서 상기 언급되어 있고, 개개의 선별성 마커에 대한 적당한 선별 조건이 또한, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 상기 언급된 바와 같이, 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 리포터 폴리펩티드 기반 선별을 수행할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에 제공된 척추동물 세포는 포유류 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 포유류 세포는 설치류 세포, 바람직하게 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포이다. 적합하고 바람직한 실시양태가 제1 측면과 연계해서 상기 언급되어 있고, 이는 상기 개시내용에 언급된다. 특히 제1 측면에 따르는 척추동물 숙주 세포, 발현 벡터, 또는 발현 벡터의 조합물과 관련한 추가의 바람직한 실시양태가 또한, 상기에 상세히 기재되어 있다. 이는 상기 개시내용에 언급된다.
제5 측면에 따르는 선별 방법의 결과로서 수득된 세포는 개별 세포로서 단리 및 배양할 수 있다. 그러나, 유전적으로 상이한 숙주 세포의 강화된 집단, 즉 세포 풀을 하류 프로세스에서 사용하는 것이 가능하다. 상기와 같이 수득된 숙주 세포를 대상으로 하여 또한, 부가의 정성적 또는 정량적 분석을 수행할 수 있거나, 또는 이들 세포를, 예를 들어 단백질 생성을 위한 클로날 세포주의 개발에 사용할 수 있다. 클로날 세포주는 관심 폴리펩티드를 고 수율로 안정적으로 발현하는 것으로 선별된 숙주 세포로부터 정립될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 선별된 세포를 배양하여, 특히 클로날 세포 배양물의 형태로 세포 클론을 제공한다. 클로날 세포 배양물은 하나의 단일 조상 세포로부터 유래된 세포 배양물이다. 클로날 세포 배양물에서는, 모든 세포가 서로의 클론이다. 바람직하게, 세포 배양물 내의 세포 모두는 동일하거나 실질적으로 동일한 유전 정보를 함유한다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물 내의 관심 폴리펩티드의 양 또는 농도를 결정하여 그 생산성을 평가한다. 예를 들어, 배양 상등액을 분석함으로써 역가를 측정할 수 있다. 더욱이, 수득된 세포 클론을 이용하여 안정성 연구를 수행할 수 있다.
E. 재조합 생성을 위한 변경된 척추동물 세포의 용도
제6 측면에 따르면, 척추동물 세포로부터 분비되는 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위한, 단리된 척추동물 세포의 용도가 제공되는데, 여기서 사용된 세포는 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨다. 제6 측면의 한 실시양태에 따르면, 매트립타제의 효과는, 바람직하게 상기에 추가로 상세히 기재된 바와 같이 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거함으로써, 제1 측면과 연계해서 상기에 상세히 기재되는 바와 같이 손상시킨다. 척추동물 세포는 바람직하게 포유류 세포이다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과는, 제1 측면에 따르는 변경된 척추동물 세포와 연계해서 상기 언급된 바와 같이 손상시킨다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입한다. 도입한 후, 척추동물 세포로부터 세포 배양 배지 내로 분비되는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 척추동물 세포가 제공된다. 따라서, 상기 용도는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 척추동물 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 관심 폴리펩티드가 척추동물 세포에 의해 분비된다. 관심 폴리펩티드와 관련한 세부 사항이 또한, 상기에 상세히 기재되어 있고, 이는 이것을 또한 적용하는 각각의 개시내용에 언급된다. 폴리뉴클레오티드를 척추동물 세포 내로 도입하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 또한 상기에 간략하게 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 발현될 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 이전에는, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 상기 세포는 선별성 마커를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 이전에는 임의의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경시킨 각각의 "빈(empty)" 척추동물 세포를, 예를 들어 재조합 생성 기술을 위한 클로닝 세포주로서 사용할 수 있다. 각각의 세포주를, 예를 들어 적당한 발현 벡터를 이용하여, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있다. 따라서, 아직까지 재조합 생성물을 발현 및 분비하지 않는 상기 "빈" 척추동물 세포를, 재조합적으로 생성될 것으로 추정되는 목적하는 관심 폴리펩티드에 따라서 상이한 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 따라서, 이러한 척추동물 세포주를 상이한 프로젝트, 즉 상이한 관심 폴리펩티드의 생성에 사용할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포는 제1 측면에 따르는 척추동물 세포이다. 세부 사항이 상기 언급되어 있고, 이는 상기 개시내용에 언급된다.
F. 손상된
매트립타제
기능을 수반한 척추동물 숙주 세포의 선별 방법
제7 측면에 따르면, 본 개시내용은 내인성 프로테아제 매트립타제가 척추동물 세포에서 기능적으로 발현되는 지를 분석하는 단계; 및 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여, 상기 내인성 매트립타제의 효과를 손상시킨 척추동물 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여 척추동물 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다. 이러한 선별 공정은 관심 재조합 폴리펩티드를 발현 및 분비할 수 있는 숙주 세포를 확인시켜 줄 수 있는데, 여기서 세포 배양 배지 내에서 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다. 각각의 숙주 세포가 재조합 생성에 특히 적합하다.
이러한 분석적 방법은 유리하게, 예를 들어 본 개시내용의 제2 측면에 따르는 방법과 조합하여 사용하여, 매트립타제 유전자의 효과를 손상시킨 척추동물 세포가 생성되었는지를 확인할 수 있다. 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 방법은 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 상기 세포에서 저하 또는 제거되는지를 분석하는 것을 포함한다. 비-제한적 실시양태가 다음에 기재된다. 어떠한 분석적 방법이 적합한지는 또한, 매트립타제의 기능적 발현의 저하 또는 제거를 달성하도록 세포를 변경시키는 방법에 좌우된다.
예를 들어, 매트립타제의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거하기 위해 유전자 녹아웃을 매트립타제 유전자 내로 도입하는 경우에는, 상응하는 DNA 박편을 증폭시키고 이와 같이 증폭된 DNA를 서열 분석하여, 유전자 녹아웃이 매트립타제 유전자 내로 도입되었는지를 확증할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이의 도입은, 예를 들어 서열 분석에 의해 검출할 수 있다. 상기 유전자를 완전히 또는 부분적으로 결실시킴으로써 매트립타제의 기능적 발현을 저하시키거나 또는 제거하는 경우에는, 예를 들어 결실을 검출하는 데 적합한 증폭 기반 검출 방법 (이러한 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다)을 이용하여, 이러한 결실을 DNA 수준으로 검출할 수 있다.
더욱이, 상기 방법을 이용하여, 예를 들어 전반적인 발현이 저하 또는 제거되기 때문에 및/또는 발현된 매트립타제의 활성이, 예를 들어 적어도 하나의 돌연변이로 인해 저하 또는 제거되기 때문에, 매트립타제의 자연적으로 기능적인 발현이 저하 또는 제거되는 적합한 세포주를 선별할 수 있다. 각각의 세포는 본원에 기재되는 바와 같은 제7 측면에 따르는 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 매트립타제의 발현은 PCR 기반 기술, 예컨대 RT-PCR 및/또는 서열 분석을 이용하여 분석할 수 있다. 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 매트립타제의 활성은 분석하고자 하는 세포로부터 수득된 조건화 배지를 이용하여 분석할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 세포 표면 상에 매트립타제가 없거나 또는 그 양이 감소된 세포는 유동 세포계수법에 의해 선별한다. 예를 들어, 매트립타제와 결합하는 항체 또는 다른 검출 작용제를 이용하여, 매트립타제를 발현하는 세포를 표시할 수 있다. 이어서, 항체 또는 다른 검출 작용제와 결합하는 표지된 작용제를 부가함으로써 각각의 세포를 표지시킬 수 있거나, 또는 항체 또는 다른 검출 작용제를 직접적으로 표지시킬 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 이러한 표지는 형광성 표지이다. 이로써, 세포는 그의 매트립타제의 발현 수준에 따라서 표시되고, 이어서 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 매트립타제의 발현이 저하되거나 또는 이러한 발현이 없는 세포를 확인 및 분류할 수 있게 된다.
한 실시양태에 따르면, 척추동물 세포의 발현 프로파일을 분석하여, 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 저하되거나 또는 제거되는지를 결정한다. 예를 들어, 이러한 분석은 정성적 또는 정량적 RT (역전사) PCR을 수행하여 매트립타제 mRNA의 존재, 부재, 양 또는 길이를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 세포에서의 기능적 매트립타제 발현을 분석하는 것에 덧붙여 또는 이에 대안적으로, 선별 공정은 상기 세포로부터 수득된 조건화 배지에 매트립타제 활성이 있는지를 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 스파이크-인 실험을 수행할 수 있다. 따라서, 세포 배양 배지를 각종 잠재적 세포주로부터 수집하여, 각각 수득된 조건화 배지에 매트립타제 활성이 있는지를 분석할 수 있다. 예를 들어, 이러한 조건화 배지를 대상으로 하여, 클리핑되기 쉬운 폴리펩티드에 대한 그의 클리핑 활성에 관하여 시험할 수 있다. 클리핑 활성을 시험하기 위한 표준으로서, 클리핑될 것으로 공지되어 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 사용함으로써, 서로 비교하거나 또는 표준 세포주와 비교해서 상기 잠재적 세포주의 클리핑 활성을 정성화 또는 정량화하는 것이 가능하다.
한 실시양태에 따르면, 제7 측면에 따르는 방법은 포유류 세포, 특히 설치류 세포, 예컨대 햄스터 세포, 바람직하게 CHO 세포를 선별하기 위한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 제7 측면에 따르는 방법은, 바람직하게 관심 폴리펩티드의 재조합 발현을 위하여 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하 또는 제거함으로써 매트립타제의 기능을 손상시킨 적어도 하나의 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 각각의 특징을 갖는 세포가, 본 실시예에 의해 제시된 바와 같이 재조합 발현에 특히 적합하다. 각각의 세포의 추가 실시양태가 또한 상기에 상세히 기재되어 있고, 이는 각각의 개시내용에 언급된다.
본원에 기재된 수치 범위는 이러한 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 전체로서 본 명세서를 참조함으로써 판독될 수 있는 본 개시내용의 각종 측면 또는 실시양태를 제한하는 것이 아니다. 한 실시양태에 따르면, 특정 요소를 포함하는 것으로서 본원에 기재된 주제는 또한, 각각의 요소로 이루어진 주제를 지칭한다. 특히, 특정 서열을 포함하는 것으로서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 또한, 각각의 서열로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 바람직한 실시양태를 선택하고 이를 조합하는 것이 바람직하고, 바람직한 실시양태의 각각의 조합으로부터 비롯되는 구체적인 주제가 또한, 본 개시내용에 속한다. 본원에 인용된 모든 문헌은 참조로 포함된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하지 않고 본 발명을 예시하고자 한다. 특히, 본 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.
I. 재료 및 방법
1. 세포 배양물
본원에서 달리 기재되지 않는 한, 세포 배양물로서, CHO-K1로부터 유래된 CHO 세포가 성장하고 있는 현탁물을, 예를 들어 WO2011/134920에 개시된 바와 같은 표준 배지 및 세포 배양 공정으로 진탕 플라스크에서 배양하였다. 세포를 매주 2회 신선한 배지 내로 계대접종하고, 연구 기간 내내 대수 성장기로 유지시켰다.
세포를 배양하기 위해 사용되었던 동일한 배양 배지를 본 실시예에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
2. 조건화 배지를 이용한 스파이크-인 실험
관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않은 세포를 2 x 105개 생존 세포/ml의 밀도로 표준 배지 (30 ml 배양물) 내로 계대접종하고 37℃ 하에 성장시켰다. 생존 세포 밀도의 피크 하에서 (계대접종 후 통상적으로 7일 또는 8일; 생존 능력은 여전히 95% 이상이다), 세포를 상기 배지로부터 꺼냈다. 이들 조건 하 및 이러한 단계의 세포 성장에서는, 세포 사멸로 인한 세포내 프로테아제의 방출 없이 세포 배양 배지 내에 최대량의 분비된 프로테아제가 활성인 것으로 예상된다. 또한, 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하도록 세포를 형질감염시킨 경우에는 이들 조건하에서 최대량의 분비된 관심 폴리펩티드가 예상된다. 조건화 배지를 수득하기 위하여, 세포 배양물을 90 g로 15분 동안 원심분리시켰다 (세포가 원심분리 응력으로 인해 세포내 프로테아제를 방출하지 않기에 충분히 온화하게 원심분리시킨다). 원심분리 후, 상등액을 옮기고 0.22 μm 필터 내로 관통시켜, 조건화 배지로부터 잔여 세포 입자를 제거하였다.
관심 폴리펩티드를 상기와 같이 수득된 조건화 배지에 0.7 μM의 최종 농도로 부가하고, 500 rpm으로 지속적으로 진탕시키면서 37℃ 하에 인큐베이션하였다. 각 관심 폴리펩티드에 대한 인큐베이션 시간은 야생형 샘플 중에서 분취액을 주기적으로 꺼내고, 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 이용하여 분석함으로써 앞서 결정하였다. 야생형 조건화 배지에서 적어도 50% 분해가 관찰된 시점을, 각 관심 폴리펩티드에 대해 선택하였다. 인큐베이션 후, 관심 폴리펩티드의 모든 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, 통상적으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 클리핑의 양을 결정하였다. 본 실시예에서는, 상이한 치료 폴리펩티드를 관심 폴리펩티드로서 사용하여 클리핑을 분석하였다.
3. SDS-PAGE 및
웨스턴
블롯
단백질 샘플을 피어스(Pierce) 레인 마커 환원성 샘플 완충제 (10 mM DTT, cat. 39000)에서 희석시키고, 95℃ 하에 5분 동안 비등시켰다. 약 0.1 내지 0.6 μg 단백질/레인을 프리-캐스트(pre-cast) 4 내지 12% 비스-트리스 겔 [인비트로젠(Invitrogen), cat. NP0322BOX] 내로 부하하였다. 전기영동 후, 바이오-래드(Bio-Rad) 습윤 전기블롯팅 시스템을 이용하여 겔을 니트로셀룰로스 막 (인비트로젠, LC2001) 상으로 옮겼다. HRP-커플링된 특이적 항체 및 ECL (피어스, cat. 32109)을 이용하여, 관심 폴리펩티드를 검출하였다.
II.
실시예
1: RNA 간섭 (
RNAi
)에 의한 상이한 프로테아제의 침묵 발현시 상이한 관심 폴리펩티드의 클리핑
먼저, 클리핑되기 쉬운 상이한 재조합 단백질의 단백질 분해적 절단 부위(들)를, CE-SDS 분석, 질량 분광측정법 및 인실리코(in silico) 분석을 포함한 상이한 기술을 이용하여 분석하였다 (데이터는 제시되지 않음). 상기 분석을 상이한 프로테아제 억제제를 이용한 추가의 분석과 조합한 결과, 클리핑되기 쉬운 시험된 단백질의 대다수가, 세린 프로테아제의 서브패밀리인 트립신-유사 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 밝혀졌다. 실시예 1의 RNAi 실험을 설정하여, 매트립타제가 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 사실과, 매트립타제 유전자의 침묵이 클리핑을 상당히 저하시키는 반면, 상이한 프로테아제를 코딩하는 다른 유전자의 침묵은 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키지 않는다는 사실을 입증하였다. siRNA는 CHO 세포에서 발현된 다음 표적 mRNA에 대항하여 설계되었다: 1. 매트립타제 (MT-SP1; 본원에서 St14로서 지칭되기도 함), 2. C1r (보체 성분 활성화된 C1r; Ctra로서 지칭되기도 함), 3. C1s (보체 성분 C1sB; Gm5077로서 지칭되기도 함), 4. Plat (t-플라스미노겐 활성화제) 및 5. Prss35 (프로테아제, 세린, 35). 이들 표적 유전자는 분비된 또는 막투과 단백질이므로, 세포 배양 배지 내로 분비되는 재조합적으로 발현된 단백질의 클리핑에 관여할 수 있었던 트립신-유사 프로테아제를 코딩한다. 이들 단백질이 CHO 세포에 의해 발현된다는 것은 미리 확증되었다. 표 2는 각각의 표적 유전자 전반에 걸친 개요를 제공한다:
<표 2>
매트립타제 및 다른 표적 프로테아제에 대항한 siRNA의 센스 및 안티센스 서열이 표 3에 열거되어 있다:
<표 3>
본 실험의 상세 설정이 다음에 기재되어 있다.
1.1.
siRNA
형질감염
6-웰 판에 대하여 스케일 업시킨, 매뉴얼 MAN0001182의 '역 형질감염 프로토콜'에 따라서, 리포펙타민(Lipofectamine®) RNAiMAX 시약 [라이프 테크놀로지(Life Technology), cat. 13778]을 이용하여, CHO-K1 유래 세포의 RNAi 형질감염을 수행하였다. 각 mRNA 표적에 대하여, 100, 125 및 150 pmol 중에서 가장 효율적인 2가지 농도의 RNAi 이중체 분자를 사용하였다: MT-SP1 (St14)의 경우에는 125 및 150 pmol을 사용하였고, C1r (C1ra)의 경우에는 125 및 150 pmol을 사용하였으며, C1s (Gm5077)의 경우에는 100 및 125 pmol을 사용하였고, Plat의 경우에는 125 및 150 pmol을 사용하였으며, Prss35의 경우에는 100 및 125 pmol을 사용하였다. 이와 같이 선택된 2가지 농도의 RNAi 이중체 분자를 1 ml 옵티(Opti)-MEM® [깁코(Gibco), cat. 31985-062]에 희석시켰다. RNAi 음성 대조군 (siRNA 음성 대조군)으로서, 사일런서(Silencer®) 음성 대조군 번호 1 siRNA (AM4611)를 사용하였다 (125 pmol). 5 μl 리포펙타민® RNAiMAX 시약을 각 웰에 가하였다. 0.5 x 106개 세포/ml의 농도를 수반한 2 ml의 세포 현탁물을 가하고, 판을 37℃ 및 10% CO2 하에 인큐베이션하였다. 형질감염한지 3일 후, 세포 밀도를 측정하였고, RNeasy 플러스 미니 키트 [퀴아젠(Qiagen), cat. 74134]를 이용하여 3 x 106개 생존 세포의 총 RNA를 추출하였고, 조건화 배지를 각 웰로부터 수집하였다. 표적 유전자에 대한 침묵 효과를 제어하기 위하여, mRNA 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 결정하였다.
<표 4>
프로테아제 mRNA 발현을 결정하기 위한 프라이머 및 프로브 서열
100%로서 설정된 siRNA 음성 대조군 세포에서의 프로테아제 유전자-발현과 관련한 잔류 프로테아제 유전자-발현은 다음과 같다: MT-SP1: 125 pmol (18.6%) 및 150 pmol (18.2%), C1r (C1ra): 125 pmol (6.3%) 및 150 pmol (6.7%), C1s (Gm5077): 100 pmol (11.9%) 및 125 pmol (14.4%), Plat: 125 pmol (8.3%) 및 150 pmol (5.1%) 및 Prss35: 100 pmol (18.4%) 및 125 pmol (14.8%).
1.2. 조건화 배지에서의 스파이크-인 실험
조건화 배지를 수집하기 위하여, 6-웰 판으로부터의 200 μl 세포 배양 배지를 원심분리시키고 (300 g로 3분 동안), 이로써 수득된 상등액을, 상기 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 스파이크-인 실험을 위한 조건화 배지로서 사용하였다. 관심 폴리펩티드는 모노클로날 IgG 항체 (mAb) 또는 Fc-융합 단백질이었다. 상기 언급된 바와 같이, 야생형 조건화 배지에서 적어도 50% 분해가 관찰된 시점을, 각 관심 폴리펩티드에 대해 선택하였다. 이러한 결과로 인해, 상기 Fc-융합 단백질에 대한 인큐베이션 시간은 3일이었고 (그러나, 여기서 분해는 이미 50%를 훨씬 넘었다), mAb에 대한 인큐베이션 시간은 7일이었다. 인큐베이션 후, 조건화 배지 중의 관심 폴리펩티드의 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하여, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 클리핑의 양을 결정하였다.
1.3. 단백질
클리핑
: 스파이크-인 실험의 결과
도 1은 상부 패널 mAb 및 하부 패널 Fc-융합 단백질에서, 상기 규정된 바와 같이 인큐베이션한 후 분석된 상이한 관심 폴리펩티드의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
상부 패널에서 웨스턴 블롯의 첫 번째 레인은 처리되지 않은 (화학적으로 규정된) 배지 (이와 동일한 배지가 또한, 세포를 배양하는 데 사용되었다)에서 7일 동안 인큐베이션한 후 mAb를 나타내는데, 이에 따라서, 세포 배양 배지가 세포와 접촉되지 않았으므로, 어떠한 세포성 프로테아제도 상기 배지에 존재하지 않았기 때문에, 클리핑은 일어나지 않아야 한다 (양성 대조군 (+)). 상기 mAb는 단일의 강력한 단백질 밴드 (화살표로 표시됨)로서 디스플레이되고, 클리핑은 일어나지 않았다.
두 번째 레인은 siRNA 음성 대조군 (유전자 발현에 대한 효과가 없음)으로 형질감염시킨 음성 대조군 세포 ((-))의 조건화 배지에서 7일 인큐베이션한 후의 mAb 샘플을 나타낸다. siRNA 음성 대조군은 유전자 발현에 대한 효과를 갖고 있지 않기 때문에, 조건화 배지는 본질적으로, 비-변경된 세포 및 이에 따라, 정상적인 표적 유전자 발현을 나타내는 세포 (이에 따라서, 코딩된 프로테아제가 정상적으로 발현된다)를 인큐베이션한 후에 수득되는 조건화 배지에 상응한다. 알 수 있는 바와 같이, 무손상 mAb의 단백질 밴드 이외에도, 클리핑된 mAb를 나타내는 (화살표로 표시됨) 제2의 강력한 단백질 밴드가 아래에 나타났다. 양 단백질 밴드는 유사한 세기를 갖고 있으므로, mAb의 약 50%가 클리핑되었다는 것을 추정할 수 있다. 동일한 결과 (상당한 클리핑)는, C1r (C1ra), C1s (Gm5077), Plat 및 Prss35를 RNAi에 의해 침묵시킨 세포의 세포 상등액에서 인큐베이션된 mAb에 대하여 발견된다 (레인 5 내지 12 참조). 표적 유전자가 효과적으로 침묵되었다는 사실은 실시간 RT-PCR에 의해 확증되었다. C1r(C1ra)의 경우에는, 93.7% 및 93.3%의 가장 강력한 mRNA 감소가 밝혀졌다. Plat에 대해 밝혀진 감소는 91.7% 및 94.9%였고, C1s(Gm5077)의 경우에는 88.1% 및 85.6%였으며, Prss35의 경우에는 81.6% 및 85.2%였다. 따라서, 이들 표적 유전자 모두는 80% 초과하여 성공적으로 침묵시켰다. 그럼에도 불구하고, 이들 경우 모두에서는, 클리핑된 mAb의 단백질 밴드가 무손상 mAb의 단백질 밴드와 적어도 대략 동일한 시그널 세기를 갖고 있었다. 따라서, 음성 대조군 (-)에서와 같이, 적어도 약 50%의 mAb가 클리핑되었다. 따라서, 이들 프로테아제 유전자를 하향 조절하는 것이 조건화 배지에서 관심 폴리펩티드의 클리핑을 저하시키지 못하였다.
이와는 달리, RNAi에 의해 세포에서의 매트립타제 (MT-SP1) 발현을 저하시키면 (레인 3 및 4 참조), mAb의 클리핑이 상당히 저하되었다. 음성 대조군과 비교해서 (잔여 MT-SP1 발현 18.6% 및 18.2%) MT-SP1을 81.4% 및 81.8% 억제시킨 양 설정에서는, 클리핑된 mAb의 단백질 밴드가 무손상 mAb의 단백질 밴드보다 훨씬 더 약하다. 이는 mAb가 상당히 덜 클리핑되었다는 것을 입증해 주고, 여기서 RNAi에 의해 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 저하시키도록 척추동물 세포를 변경시키면, 상기 세포로부터 수득된 조건화 세포 배양 배지에서 관심 폴리펩티드의 클리핑 양이 상당히 감소하는 것으로 나타났다.
관심 폴리펩티드의 추가 예로서 Fc-융합 단백질에 대한 결과가 도 1의 하부 패널에 도시되어 있다. mAb와는 달리, Fc-융합 단백질의 비교 샘플 "(+)"은 무손상 단백질의 단백질 밴드 이외에도, Fc 부분 단독 (이 또한, 주요 클리핑 생성물이다)에 상응하는 제2의 강력한 밴드를 함유한다 (양 밴드에 화살표가 표시된다). 클리핑된 Fc 부분이 또한, 양성 대조군에서 발견되는데, 이는 출발 물질 (CHO 세포에서 생성된 Fc-융합 단백질)이 정제 후일지라도, 높은 비율의 클리핑된 Fc-융합 단백질을 함유하기 때문이다. Fc-단백질의 정제 공정 동안, 클리핑된 물질 모두가 제거될 수 있는 것은 아니다. 따라서, 출발 물질로서 양성 대조군에 사용된 Fc-융합 단백질은 이미, 불순물로서 상당량의 클리핑된 Fc 부분을 함유하고 있다. C1r (C1ra), C1s (Gm5077), Plat 또는 Prss35의 발현을 침묵시킨 세포의 조건화 배지에서는, 무손상 Fc-융합 단백질에 대한 시그널의 범위가 약함 (Plat) 내지 매우 약함 (Prss35)이다. 따라서, Fc-융합 단백질의 클리핑은 이들 경우에 매우 높았고, 이들 프로테아제의 발현을 억제시킨 경우일지라도 거의 100%까지의 값에 도달하였다. 따라서, 클리핑을 저하시키기 위해 이들 프로테아제 유전자를 침묵시키는 것은 효과적이지 못하였다. 이와는 달리, 매트립타제 (MT-SP1)의 발현을 침묵시킨 세포 (단지 하나의 siRNA 농도를 사용하였다)로부터 수득된 조건화 배지에서는, 양성 대조군 (+)에서와 대략 동일한 세기의 무손상 단백질이 발견되었다. 따라서, 클리핑이 상당히 저하되었다. siRNA 음성 대조군 (-)을 나타내는 레인은 또한 무손상 단백질을 포함한다. 그러나, 이러한 결과는 부하시 유출되었던 양성 대조군에 의해 siRNA 음성 대조군 레인이 오염된 것이다.
요약하면, 이러한 RNAi 실험은 숙주 세포에서 매트립타제의 발현을 침묵시키면, 상기 세포로부터 수득된 조건화 배지에서 상이한 예시적 관심 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하된다는 것을 입증해준다. 이와는 달리, 숙주 세포에 의해 발현된 다른 트립신-유사 프로테아제의 발현을 침묵시키면, 클리핑에 대한 어떠한 긍정적 효과도 나타나지 않는다. 따라서, 실시예 1은 매트립타제가, 재조합적으로 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제라는 발견의 중요성을 뒷받침해준다. 더욱이, 매트립타제를 RNAi에 의해 하향 조절시킨 세포가 siRNA 음성 대조군 세포와 동일한 성장 특징을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 매트립타제 발현의 하향 조절은 세포 성장에 영향을 미치지 못하였다.
III.
실시예
2:
CHO
세포에서의
매트립타제
유전자 녹아웃 (KO)으로 인해, 클리핑이
저하된다
A.
TALEN
기술을 이용하여 수행된 KO
TALEN (전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제) 기술을 이용하여, CHO-K1 유래 세포를 기준으로 하여 9개의 매트립타제 (MT-SP1) 녹아웃 세포 클론을 생성하였다. 이러한 녹아웃을 위하여, 매트립타제 엑손 2를 막투과 도메인의 코딩 영역 앞에 위치한 영역 상에 표적화하였다. 엑손 2가 선택되었는데, 이는 이것이 상이한 대체 스플라이싱 변이체를 포괄하기 때문이다. 엑손 2에 프레임시프트 돌연변이를 부가하는 것은, 말단절단된 단백질이 짧을 것이고 세포내 위치할 것이며, 더욱이 불안정하고 상기 세포에 대해 무독성일 것이란 이점을 갖고 있다.
2.A
.1.
매트립타제의
엑손 2에 대해 특이적인
TALEN의
설계/생성 및 사용
매트립타제의 엑손 2 및 플랭킹 인트론을 CHO-K1 유래 모 세포주 (도 2, 서열식별번호: 31 참조)에서 서열 분석하였다.
매트립타제 엑손 2를 표적화하는 2개의 말단절단된 TAL FokI를 설계하였다. 각 TALEN은 5' (정방향으로) 또는 3' (역방향으로) DNA 가닥 각각 위에 있는 19개의 뉴클레오티드를 표적으로 하고 이와 결합한다. 2개의 결합 부위는 커팅 부위의 16개 뉴클레오티드 정도 떨어져 있다. 설계된 각 TAL을 합성하고, 게이트웨이(Gateway®) 진입 벡터에서 클로닝하며, pEXP3-DEST_A302 도착 벡터에서 서브클로닝하였다. 생성물 기재 및 방법은 라이프 테크놀로지/진아트(GeneArt)로부터 입수 가능하다. 5' (왼쪽) 또는 3' (오른쪽) 가닥-인식 TALEN (골격 벡터 pEXP3-DEST에서 서브클로닝됨)을 코딩하는 플라스미드를 생성하였다. pEXP3-DEST는 TALEN 코딩 서열의 하류에 T7 프로모터를 함유하므로, TAL-FokI를 코딩하는 mRNA의 시험관내 전사 (IVT)가 허용된다.
2.A
.2.
TALEN
벡터의
시험관내
전사
TALEN mRNA를 TALEN 벡터의 시험관내 전사 (IVT)에 의해 생성하였다. TALEN 벡터를 앞서, HindIII 제한 효소 [로슈(Roche), cat. 10656321001]로 선형화하고, 이소프로판올에 이어 70% 에탄올 침전을 이용하여 정제하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 과정을 이용하여 mRNA를 생성하였다. 캡핑된(Capped) IVT 생성물을 NH4-Ac 침전으로 정제하고, 생성된 mRNA (폴리A 꼬리와 5개-프라임 캡을 함유함)를, 퀴아젠 RNeasy 마이크로 키트 (cat. 74004)를 이용하여 정제하였다.
2.A
.3.
TALEN
mRNA의
형질감염
95% 초과의 생존 능력을 지닌 지수 성장기의 모 CHO-K1 세포를 형질감염에 사용하였다. 제조업자 [론자(Lonza)]의 지시에 따라서 아막사(Amaxa™), 뉴클레오펙터(Nucleofector™) 기술을 이용하여 전기천공 [뉴클레오펙션(nucleofection)]을 수행하였다. 형질감염된 세포를 형질감염 후 제4일에 확장시키고, 단일 세포를 30 x 96-웰 판에서 제7일에 분리시켰다. 클론셀렉트(CloneSelect™) 영상기 [제네틱스(Genetix)]를 이용하여 모노클론성과 합류(confluence)를 제어하였다.
2.A
.4.
Cel
-I-검정 및 스크리닝 전략
SAFC 바이오사이언스(Biosciences)의 매뉴얼에 따라서 Cel-I-검정을 수행하였다. Cel-I-검정은 커팅 효율을 결정하기 위한 표준 검정이다. 간략하게 언급하면, 형질감염한지 3일 후에 게놈 DNA를 세포로부터 단리시키고, 다음 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다:
Fwd: ttttttgcccagtcctggtt (서열식별번호: 32)
Rev: ccctttggtctgtcctctga (서열식별번호: 33).
증폭 생성물을 변성시키고, 복원시킬 수 있었다. 이어서, 뉴클레아제 S 및 뉴클레아제 S 증강인자를 가하고 인큐베이션하였다. 소화된 생성물을 분석하였다. 2개의 보다 작은 밴드가 존재하였는데, 이는 게놈의 그 영역 내에서의 TALEN 활성을 표시하므로, 매트립타제 유전자를 돌연변이에 의해 변경시킨 세포가 상기 분석된 세포 풀에 존재하였다는 것을 뒷받침해준다. 가장 양성인 세포 풀 (2개의 보다 작은 밴드의 더 강력한 세기)로부터, 단일 세포를 96 웰 판에서 분류하였다.
게놈 DNA (gDNA)를, 엑스트렉트(Extract)-N-Amp™ 블러드 PCR 키트 [cat. XNAB2R, 시그마(Sigma)]를 이용하여 96 웰 판에서 각 클론으로부터 추출하였다. 이러한 gDNA 추출물을 이용하여, 상기 제시된 역방향 프라이머 (Rev) (서열식별번호: 33)를, 다음 서열을 갖는 커팅 부위 상에서 결합하는 프라이머 (커트. 프라이머로서 지칭됨)와 조합하여 사용하여, '커트사이트(CutSite) PCR' 검정에서 돌연변이된 클론에 관하여 스크리닝하였다:
커트. 프라이머: GTGGAGTTTCTGCCTGTGAA (서열식별번호: 34).
커팅 부위 영역에서 TALEN의 활성으로 인해 돌연변이가 발생하는 경우에는, 상기 커트. 프라이머가 결합하지 않을 것이며, 이로써 PCR 생성물은 수득되지 않는다. PCR 생성물을 전혀 수반하지 않은 클론은 서열 분석을 통하여 분석하여, 도입된 돌연변이를 결정하였다. 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 상기 제시된 정방향 (Fwd) 및 역방향 (Rev) 프라이머를 이용하여 서베이어(Surveyor) 돌연변이 검출 검정 [트랜스게노믹스(Transgenomics), cat. 706025]을 수행하였다. 돌연변이를 수반한 클론을 125 ml 진탕 플라스크에 옮기고 서열 분석하였다. 상기 스크리닝 검정에서는, 클론 Δ7/Δ15를 확인하였다. 더욱이, Cel-I 검정을 이용하는 형질감염 및 스크리닝의 제1 회전 후, 유전자형 wt/Δ4를 수반한 1개의 클론이 생성되었는데, 이는 1개의 매트립타제 대립유전자 내에 프레임시프트 돌연변이를 갖고 있었다.
양 대립유전자 내에 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 녹아웃 클론을 수득하기 위해, TALEN mRNA 형질감염 및 클로닝 2회전을 수행하였다. MT-SP1의 양 대립유전자 내에 프레임시프트 돌연변이를 수반한 녹아웃 클론을 수득하기 위해, 유전자형 wt/Δ4를 수반한 클론을, 상기 언급된 바와 같은 TALEN mRNA 형질감염 - 클로닝 제2 회전에 사용하여, 제2 대립유전자 내에 또한 프레임시프트 돌연변이를 생성시켰다. 전체로서, 양 대립유전자 내에 프레임시프트 돌연변이를 함유하는 9개의 매트립타제 녹아웃 클론 (KO-1 내지 KO-9)을 생성시켰다. 이러한 9개 클론의 유전자형이 표 5에 개시되어 있다. 야생형으로 지칭된 MT-SP1 엑손 2 서열 및 이들 돌연변이가 표 6에 제시된다. 돌연변이로부터 비롯되는 MT-SP1 생성물의 부분 서열이 표 7에 제시된다. 엑손 2에 의해 코딩된 아미노산이 볼드체로 강조된다.
표 5에 따르면, 유전자형 Δ4/Δ4를 수반한 4개의 클론, 즉 KO-1, KO-4 및 KO-7 및 KO-9가 있다. 이들 클론의 매트립타제 유전자형은 동일하다. KO-1, KO-4 및 KO-7은 동일한 TALEN 재형질감염된 풀로부터 유래되고, KO-9는 상이한 것으로부터 유래된다. 클론을 FISH 분석한 결과, KO-1, KO-4 및 KO-7의 염색체도(karyogram)에 있어서 일부 차이가 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이들은 동일한 모 세포로부터 유래되지 않은 것으로 추정된다.
프레임시프트 돌연변이를 모든 클론 KO-1 내지 KO-9에서 매트립타제 유전자의 양 대립유전자 내로 삽입한다. 더욱이, 유전자형 Δ7/Δ15를 갖고 1개의 대립유전자 (Δ7)에서만 프레임시프트 돌연변이를 갖는, 돌연변이된 클론 Δ7/Δ15를 수득하였다. 제2 대립유전자에서는, 15개 염기쌍이 결실된 돌연변이 Δ15로 인해, 매트립타제의 짧은 세포내 도메인 내에 5개의 아미노산이 결실된다. 그러나, 이러한 Δ15 결실로 인해 프레임시프트는 일어나지 않는다. 이와 같이 영향을 받은 도메인은 촉매적 기능에 필요한 것으로 여겨지지 않는데, 이는 촉매적 프로테아제 도메인을 포함하는 세포외 부분이 유출될 때 상기 도메인이 여전히 막에 부착되어 있기 때문이다. 따라서, Δ15 대립유전자로부터 발현된 매트립타제는 여전히 촉매적으로 활성인 것으로 추정된다. 따라서, 세포 클론 Δ7/Δ15에서는, 매트립타제의 기능적 발현이 저하되긴 하지만, 없어지지는 않는다. 상기 클론에 의해 발현된 나머지 mRNA의 대략 절반이 프레임시프트 돌연변이를 함유하는 것으로 추가로 추정된다.
<표 5>
매트립타제 유전자의 양 대립유전자의 엑손 2에서의 돌연변이
<표 6>
CHO-K1 유래 WT 및 상이한 KO 클론으로부터의 엑손 2를 코딩하는 매트립타제 유전자 서열. Δ는 결실을 표시한다. Δ 뒤에 오는 숫자는 몇 개의 뉴클레오티드가 결실되었는지를 표시한다. 괄호 안에 볼드체로 표시된 것은, 결실된 뉴클레오티드를 보여준다.
<표 7>
엑손 1, 2 및 3을 포함한 CHO WT 및 KO 클론의 부분 매트립타제 아미노산 서열인데, 엑손 2 아미노산이 볼드체로 표시된다. 별표 *는 표 7에서 정지 코돈을 나타낸다.
2.A
.5.
매트립타제
mRNA
발현
매트립타제 발현에 대한 상기 도입된 돌연변이의 효과를 시험하기 위해서, 정량적 역전사 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. qRT-PCR에 의해 개개의 클론에서 측정된 매트립타제 mRNA 발현을 야생형 CHO-K1 유래 세포에서의 mRNA 발현과 비교하였다. 이러한 실험의 결과가 도 3에 도시되어 있다. 도 3에 따르면, 돌연변이된 매트립타제를 수반한 세포 클론에서는, mRNA가 야생형과 비교해서 5 내지 40%의 범위로만 발현된다. 이러한 결과는 돌연변이된 매트립타제의 발현이 저하된다는 것을 제안한다. 따라서, 덜한 (비-기능적) 매트립타제 단백질이 상기 세포에 의해 발현된다. 또한 세포 클론 Δ7/Δ15는 상기 세포에서 낮은 매트립타제 mRNA 발현만을 나타낸다.
2.A
.6. 9개의
매트립타제
(MT-SP1) 녹아웃 클론으로부터의 세포 상등액을 이용한 스파이크-인 실험
매트립타제 녹아웃의 효과를 평가하기 위하여, 클리핑되기 쉬운 5개의 상이한 관심 폴리펩티드를 이용하여 스파이크-인 실험을 수행하였다. CHO 녹아웃 클론으로부터의 세포 배양물의 조건화 배지를, 재료 및 방법하에 기재된 프로토콜에 따라서 수득하였다. 스파이크-인 실험을 위해, 관심 폴리펩티드를 0.7 μM의 최종 농도로 조건화 배지에 부가하고, 500 rpm으로 연속적으로 진탕시키면서 37℃ 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간은 시험된 관심 폴리펩티드의 유형에 의존적이었다. 인큐베이션한 후, 조건화 배지 중의 관심 폴리펩티드의 샘플을, 재료 및 방법하에 기재된 바와 같은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다.
도 4A는 관심 폴리펩티드로서 모노클로날 IgG 항체 (mAb)를 이용한 스파이크-인 실험의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 참조 대조군으로서, 웨스턴 블롯의 왼쪽으로부터의 첫 번째 레인 ("(+)"로써 표시됨)은 화학적으로 규정된 배지 (이와 동일한 배양 배지가 또한, 조건화 배지를 수득하기 위해 사용되었다)에서 인큐베이션한 후의 mAb를 나타낸다. 생성물의 클리핑이 검출되지 않았고; 무손상 단백질은 화살표로 표시된다. 두 번째 레인 (WT)은 매트립타제를 정상적으로 발현하는 CHO-K1 유래 세포로부터 수득된 조건화 배지에서 48h 인큐베이션한 후의 모노클로날 항체를 나타낸다. 여기서, 제2의 강력한 밴드가 검출되는데, 이는 클리핑된 항체를 나타낸다 (화살표로 표시됨). 클리핑된 항체의 단백질 밴드가 무손상 단백질의 단백질 밴드보다 더 강력하기 때문에, 50% 초과의 단백질이 클리핑되었다. 이와는 달리, 9개의 녹아웃 세포주 KO-1 내지 KO-9 (도 4에서 1 내지 9) 각각으로부터 수득된 조건화 배지에서 모노클로날 항체를 인큐베이션한 후에는, 클리핑된 생성물이 검출되지 않는다. 따라서, 척추동물 숙주 세포 내의 매트립타제 유전자를 녹아웃시키는 것은 상당한 개선인데, 이는 세포 배양 배지 내에서의 mAb의 클리핑이 효율적으로 방지될 수 있었기 때문이다.
Fc-융합 단백질을 이용한 상응하는 스파이크-인 실험의 결과가 도 4B에 도시되어 있다. 인큐베이션 시간은 24h이었다. 모노클로날 항체와는 달리, 화학적으로 규정된 배지에서의 양성 대조군 (+)은 이미, 대부분의 클리핑된 단백질 (화살표로 표시됨)을 함유하였다. 이는, 관심 폴리펩티드로서 부가되었던 Fc-융합 단백질이 CHO 세포에서 생성되었고 배양 배지 (이로부터 상기 단백질을 수거한다)에서 심하게 클리핑되기 때문이다. 클리핑된 모든 단백질이 정제 공정 동안 반드시 제거될 수 없으므로, 출발 물질은 이미, 일부 클리핑된 단백질 오염물을 함유하였다. 매트립타제 녹아웃 클론 (1 내지 9)을 이용한 실험에서는, 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질의 양이 양성 대조군 (+)에서 인큐베이션된 출발 물질과 거의 동등한 수준이긴 하지만, 비-변경된 CHO-K1 유래 야생형 세포 (WT)를 조건화 배지에서 인큐베이션하면, 무손상 단백질이 완전히 제거되었고 이에 따라 분해되었다. 따라서, 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변경시키지 않은 세포로부터의 조건화 배지에서는 기본적으로 100% 클리핑이 관찰되었다.
조건화 배지에서 1h 동안 인큐베이션한 추가의 재조합 치료 단백질에 대해서도 거의 동등한 결과가 밝혀진다 (도 4C). 단백질의 2개의 당변이체가 존재한다. 또한, 야생형 CHO-K1 세포 (WT)의 조건화 배지에서는, 양 단백질 당변이체의 50% 초과가 클리핑되지만 (화살표로 표시됨), 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 유전자 녹아웃에 기인하여 손상시킨 KO-1 내지 KO-9 세포 (1 내지 9)의 조건화 배지에서 인큐베이션하면, 화학적으로 규정된 배지 (양성 대조군 (+))에서 인큐베이션한 후에 관찰된 바와 같이 무손상 단백질의 상태가 보존되었다.
KO 클론을 또한 수개월에 걸쳐 분석하여, 클리핑의 방지, 각각의 저하가, 매트립타제 유전자를 녹아웃시킨 변경된 척추동물 세포의 안정적 특징인지를 분석하였다. 따라서, mAb를 이용한 스파이크-인 실험을, 3개월 동안 배양시킨 매트립타제 녹아웃 세포 클론으로부터 수득된 조건화 배지로 반복하였다. 음성 대조군으로서 CHO 야생형 세포 "(WT)"로부터의 조건화 배지, 및 양성 대조군 "(+)"으로서 화학적으로 규정된 배지와 또한 비교한 상기 실험 결과가 도 4D에 도시되어 있다. 웨스턴 블롯은 도 4A에서 관찰된 바와 정확히 동일한 단백질 밴드 패턴을 나타낸다. 이와 동일한 결과가 또한, Fc-융합 단백질에 대하여 3개월 후에 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, KO 클론을 이용하면, 수개월 후에 클리핑이 전혀 나타나지 않은 것으로 확증되었다. 더욱이, KO 세포주는 잘 성장하였고, 세포 성장이 3개월 배양 전반에 걸쳐 심지어 개선된 것으로 밝혀졌다.
매트립타제 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-3 (1 내지 3)의 조건화 배지를 이용한, 2개의 글리코실화된 바이러스 단백질로의 스파이크-인 실험 결과가 24h 인큐베이션 (D1) 및 48h 인큐베이션 (D2) 후에 도 5에 도시되어 있다. 화학적으로 규정된 배지 (+)에서 인큐베이션한 후의 단백질을 나타내는 웨스턴 블롯의 첫 번째 레인에서는 (도 5A), 2개의 단백질 밴드가 가시적이다. 상부 밴드는 무손상 단백질을 나타내고, 하부 밴드는 샘플 중의 총 단백질의 약 5%를 구성하는 단백질의 클리핑된 버전을 나타낸다. CHO-K1 야생형 (WT 레인)의 조건화 배지에서는, 24h 인큐베이션 (D1) 후에 상당히 감소된 양의 무손상 단백질이 존재한다. 48h (D2) 후에는, 단백질 밴드가 거의 보이지 않는데, 즉 거의 모든 단백질이 클리핑되었다. 또한, 클리핑된 단백질의 단백질 밴드가 완전히 사라졌는데, 이는 이러한 단백질이 추가로 분해되었다는 것을 제안한다. 이와는 달리, 매트립타제 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-3 (1 내지 3 참조)의 조건화 배지에서 24h 또는 48h 동안 인큐베이션된 단백질에 대해서는 단백질 밴드 패턴 상의 차이가 발견되지 않는다. 따라서, 매트립타제 녹아웃 세포주로부터 수득된 조건화 배지를 이용하는 경우에는, 치료 단백질의 단백질 분해적 분해가 전혀 검출되지 않았거나 또는 상당히 저하된 것으로 검출되었다. 제2 바이러스 단백질은 거의 동등한 수준의 결과를 보여준다 (도 5B). 여기서, 무손상 단백질은 레인 "(+)"로 제시된 단일 단백질 밴드로써 나타낸다. 이미 CHO-K1 유래 야생형 세포의 조건화 배지에서 24h 인큐베이션한 후에는 (WT, D1), 무손상 단백질의 흔적이 거의 검출되지 않을 수 있다. 대신, 2개의 더 낮은 단백질 밴드가 출현하는데, 이는 상기 단백질의 클리핑된 버전을 나타낸다. 이들 단백질 밴드는 또한, 매트립타제 녹아웃 클론 KO-1 내지 KO-3으로부터 수득된 배지를 이용한 실험에서 관찰되었다. 그러나, 대다수의 바이러스 단백질은 심지어 48h 인큐베이션 후에도 시험된 모든 녹아웃 클론과 함께 보존된다.
상기 실험을 확증한 후, 클리핑되기 쉬운 5개의 부가 Fc-융합 단백질을 이용한 스파이크-인 실험을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 세포 무함유 수거 상등액을, 1 mL 하이트랩(HiTrap) Mab셀렉트 슈어 [GE 헬스케어(Healthcare)]를 이용하여 단백질 A 친화 액체 크로마토그래피함으로써 포획하였다. 2분의 체류 시간을 평형, 부하 및 세척을 위해 적용하였다. 용출을 위해서는, 4분의 체류 시간을 적용하였다. 용출액을, 밀렉스(Millex)-GV 주사기 필터 유닛 [0.22 μm, PVDF, 13 mm; 밀리포어(Millipore)]을 이용하여 멸균성 여과시키기 이전에 1 M 트리스를 이용하여 pH 5가 되도록 적정하였다. 280 nm 파장에서 나노드롭(NanoDrop) 2000 분광광도계 [더모 사이언티픽(Thermo Scientific)]를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 표 8은 질량 분광측정법 분석 데이터를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 시험된 모든 Fc-융합 단백질은 모 세포에서 발현된 경우에 완전히 또는 거의 완전히 클리핑되었다. 이와는 달리, 녹아웃 세포주에서 발현되는 경우에는 클리핑이 상당히 저하되었다.
<표 8>
상이한 Fc-융합 단백질의 클리핑 분석
이들 예는 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시킨, 본 개시내용에 따르는 변경된 척추동물 세포에는 기능적 매트립타제가 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재하거나, 또는 기능적 매트립타제가 세포 배양 배지 내로 방출되지 않거나 감소된 양으로 방출된다는 것을 명확하게 보여준다. 따라서, 세포 배양 배지에 존재하는 (이러한 배지 내로 정상적으로 분비되는) 관심 재조합 폴리펩티드의 단백질 분해적 분해가, 관심 폴리펩티드를 생성하기 위하여 이들 변경된 세포를 이용하는 경우에 상당히 저하된다.
2.A
.7.
매트립타제
돌연변이체 클론
Δ7
/
Δ15로부터의
세포 상등액을 이용한 스파이크-인 실험
저하된 기능적 매트립타제 발현의 효과를 평가하기 위하여, Fc-융합 단백질 및 모노클로날 IgG 항체 (mAb)를 이용한 스파이크-인 실험을, Δ7/Δ15 클론으로부터 수득된 조건화 배지로 반복하였다. 세포 배양물의 조건화 배지는 재료 및 방법하에 기재된 프로토콜에 따라서 수득하였다. 이러한 스파이크-인 실험을 위해, 관심 폴리펩티드를 0.7 μM의 최종 농도로 조건화 배지에 부가하고, 500 rpm으로 연속적으로 진탕시키면서 37℃ 하에 인큐베이션하였다. Fc-융합 단백질은 2h 동안 인큐베이션하였고, mAb는 24h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 조건화 배지 중의 관심 폴리펩티드의 샘플을, 재료 및 방법하에 기재된 바와 같은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다.
Fc-융합 단백질을 이용한 스파이크-인 실험의 결과가 도 6A에 도시되어 있다. 참조로서, 웨스턴 블롯의 첫 번째 레인 ("(+)"로써 표시됨)은 화학적으로 규정된 배지에서의 인큐베이션 후의 Fc-융합 단백질을 보여준다. 두 번째 및 세 번째 레인 ("WT1" 및 "WT2")은 변형되지 않은 기능적 매트립타제를 정상적으로 발현하는 2개의 상이한 CHO-K1 유래 야생형 세포주로부터의 조건화 배지에서 인큐베이션한 후의 Fc-융합 단백질을 보여준다. 상기 논의된 바와 같이, 출발 물질은 무손상 Fc-융합 단백질뿐만 아니라 불순물로서 클리핑된 Fc-융합 단백질을 함유하였다. 야생형 매트립타제를 수반한 CHO 세포로부터의 조건화 배지와 함께 인큐베이션한 것으로부터 유래된 단백질 샘플 ("WT1" 및 "WT2")에서는, 기본적으로 무손상 Fc-융합 단백질이 관찰되지 않는다. 이와는 달리, 매트립타제의 기능적 발현을 상당히 저하시킨 Δ7/Δ15 세포 클론 ("Δ7/Δ15") (이러한 클론에 관한 세부 사항은 실시예 2.4를 참조할 수 있다)으로부터 수득된 조건화 배지에서 인큐베이션하면, 무손상 Fc-융합 단백질을 나타내는 강력한 단백질 밴드로부터 결론을 내릴 수 있는 바와 같이, 클리핑이 상당히 저하된다.
도 6B는 관심 폴리펩티드로서 IgG mAb를 이용한 스파이크-인 실험의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 참조로서, 웨스턴 블롯의 첫 번째 레인 ("(+)"로써 표시됨)은 화학적으로 규정된 배지에서의 인큐베이션 후의 mAb를 보여준다. 무손상 항체를 나타내는 하나의 강력한 단백질 밴드가 가시적이다. 두 번째 및 세 번째 레인 ("WT1" 및 "WT2")은 변형되지 않은 매트립타제를 발현하는 2개의 상이한 CHO-K1 유래 야생형 세포주로부터의 조건화 배지에서 인큐베이션한 후의 모노클로날 항체를 보여준다. 이러한 두 번째 및 세 번째 레인에서는, 보다 저 분자량을 갖는 부가의 강력한 단백질 밴드가 클리핑된 항체를 나타내는 것으로 여겨진다. 시그널 강도에 따라서, 50% 초과의 항체가 클리핑될 것으로 여겨진다. 세포 클론 Δ7/Δ15로부터의 조건화 배지에서 인큐베이션한 후의 mAb를 보여주는 네 번째 레인 ("Δ7/Δ15")에서는, 시그널의 세기가 역전된다. 따라서, 클리핑이 완전히 제거되지는 않지만, 매트립타제 야생형 세포 클론과 비교해서 강력하게 저하된다. 이러한 결과는 매트립타제의 기능적 발현을 저하시키면, 세포 배양 배지에서 관심 폴리펩티드의 클리핑이 상당히 저하된다는 것을 확증시켜 준다.
이들 실험은 하나의 매트립타제 대립유전자만을 녹아웃시키고 기능적 매트립타제 발현을 저하시킨 세포 클론을 이용하는 경우에, 또한 세포 배양 배지에서 관심 폴리펩티드의 클리핑이 저하된다는 것을 보여준다. 따라서, 클리핑 활성은 기능적 매트립타제 발현의 정도에 비례하는 것으로 결론을 낼 수 있다.
B.
ZFN
기술을 이용하여 수행된 KO
ZFN (아연 핑거 뉴클레아제) 기술을 이용하여, CHO 모 세포를 기준으로 하여 하나의 ZFN (MT-SP1) 녹아웃 세포 클론을 생성하였다. 이러한 녹아웃을 위하여, 매트립타제 엑손 2를 막투과 도메인의 코딩 영역 앞에 위치한 영역 상에 표적화하였다 (실시예 2A에 기재된 바와 같음).
2.B
.1.
매트립타제의
엑손 2에 대해 특이적인
TALEN의
설계/생성 및 사용
매트립타제 엑손 2를 표적화하는 한 쌍의 ZFN을 설계하였다. 하나의 ZFN은 12개의 뉴클레오티드를 표적으로 하고 이와 결합하며, 다른 하나는 18개의 뉴클레오티드를 표적으로 한다. 2개의 결합 부위는 커팅 부위의 5개 뉴클레오티드 정도 떨어져 있다.
2.B
.2.
TALEN
벡터의
시험관내
전사
ZFN mRNA를 ZFN 벡터의 시험관내 전사 (IVT)에 의해 생성하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 과정을 이용하여 mRNA를 생성하였다. 캡핑된 IVT 생성물을 NH4-Ac 침전으로 정제하고, 생성된 mRNA (폴리A 꼬리와 5개-프라임 캡을 함유함)를, 퀴아젠 RNeasy 마이크로 키트 (cat. 74004)를 이용하여 정제하였다.
2.B
.3.
ZFN
mRNA의
형질감염
95% 초과의 생존 능력을 지닌 지수 성장기의 모 CHO 세포를 형질감염에 사용하였다. 제조업자 (론자)의 지시에 따라서 아막사™, 뉴클레오펙터™ 기술을 이용하여 전기천공 (뉴클레오펙션)을 수행하였다.
2.B
.4.
Cel
-I-검정 및 스크리닝 전략
SAFC 바이오사이언스의 매뉴얼에 따라서 Cel-I-검정을 수행하였고, 실시예 2.A.4에 기재된 바와 유사한 스크린을 수행하였다.
양 대립유전자에 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 녹아웃 클론을 수득하기 위해, ZFN mRNA 형질감염 및 클로닝 2회전을 수행하였다. 양 대립유전자에 프레임시프트 돌연변이를 함유하는 하나의 매트립타제 녹아웃 클론 (KO-10)을 생성하였다 (Δ13/Δ13).
2.B
.5.
매트립타제
(MT-SP1) 녹아웃 클론으로부터의 세포 상등액을 이용한 스파이크-인 실험
매트립타제 녹아웃의 효과를 평가하기 위하여, 둘 다 클리핑되기 쉬운 2개의 상이한 관심 폴리펩티드를 이용하여 스파이크-인 실험을 수행하였다. CHO 녹아웃 클론으로부터의 세포 배양물의 조건화 배지를, 재료 및 방법하에 기재된 프로토콜에 따라서 수득하였다. 이러한 스파이크-인 실험을 위하여, 관심 폴리펩티드 (하나의 Fc-융합 단백질과 하나의 재조합 치료 단백질)를 0.7 μM의 최종 농도로 조건화 배지에 부가하고, 500 rpm으로 연속적으로 진탕시키면서 37℃ 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간은 시험된 관심 폴리펩티드의 유형에 의존적이었다. 인큐베이션한 후, 조건화 배지 중의 관심 폴리펩티드의 샘플을, 재료 및 방법하에 기재된 바와 같은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
그 결과는 TALEN 기술을 이용하여 생성되었던 KO 클론으로 수행된 스파이크-인 실험에 상응한다. 실시예 섹션 2.A.6에 기재된 바와 같은 Fc-융합 단백질 및 재조합 치료 단백질을 사용하였다. 매트립타제 녹아웃 클론을 이용한 실험에서는, 무손상 단백질 및 클리핑된 단백질의 양이 양성 대조군 (+)에서 인큐베이션된 출발 물질과 거의 동등한 수준이긴 하지만, 비-변경된 CHO-K1 유래 야생형 세포 (WT)의 조건화 배지에서 인큐베이션하면, 무손상 단백질이 완전히 제거되었고 이에 따라 분해되었다.
KO 클론을 또한 수개월에 걸쳐 분석하여, 클리핑의 방지, 각각의 저하가, 매트립타제 유전자를 녹아웃시킨 변경된 척추동물 세포의 안정적 특징인지를 분석하였다. 따라서, Fc-융합 단백질을 이용한 스파이크-인 실험을, 6개월 동안 배양시킨 매트립타제 녹아웃 세포 클론으로부터 수득된 조건화 배지로 반복하였다. 이러한 실험 결과는 KO 클론을 이용하면, 심지어 수개월 후에도 클리핑이 전혀 나타나지 않았다는 것을 확증시켜 주었다. 더욱이, KO 세포주는 잘 성장하였고, 세포 성장이 배양 시간 전반에 걸쳐 심지어 개선된 것으로 밝혀졌다.
IV.
실시예
3: 재조합 단백질은
매트립타제에
의해 직접적으로
절단된다
매트립타제가 재조합적으로 발현되고 분비된 단백질 (클리핑 표적)을 직접적으로 절단한다는 것을 추가로 입증하기 위해, 시판용 프로테아제, 즉 마우스 MT-SP1 및 인간 Htra1을 사용하였다. 모노클로날 IgG 항체 mAb (도 7A), Fc-융합 단백질 (도 7B) 및 추가의 재조합 단백질 (도 7C)을, 화학적으로 규정된 배양 배지에 부가한 2개의 트립신-유사 프로테아제 마우스 MT-SP1 및 인간 Htra1과 함께, 각각 24h, 2h 및 1h 동안 인큐베이션하였다. 500 rpm으로 연속적으로 진탕시키면서 37℃ 하에 공동-인큐베이션을 수행하였다. 관심 폴리펩티드를 각각 0.7 μM의 농도로 사용하였다. 프로테아제 MT-SP1 및 Htra1의 양을 감소시키면서 각 관심 폴리펩티드를 시험하였다: 프로테아제/관심 폴리펩티드의 몰 비는 왼쪽에서 오른쪽으로, MT-SP1의 경우에는 1/10, 1/100, 1/1,000이고, Htra1의 경우에는 1/3, 1/10 및 1/100이다. 대조군으로서, 관심 폴리펩티드의 부가 샘플을 음성 대조군 (레인 "(-)")으로서 CHO-K1 야생형 유래 세포로부터의 조건화 배지, 및 양성 대조군 (레인 "(+)")으로서 세포와 접촉되지 않았던 화학적으로 규정된 배지와 함께 인큐베이션한다.
도 7A 내지 C에서의 웨스턴 블롯으로부터, 세포 배양 배지에 부가되었던 재조합 Htra1이, 시험된 관심 폴리펩티드를 전혀 절단하지 않는다는 것이 명백하다. 훨씬 더 높은 Htra1 농도에서도, 단백질 밴드는 양성 대조군 ("(+)")에서와 정확하게 유사하게 보인다. 이와는 달리, 모든 재조합 관심 폴리펩티드는 가장 낮은 농도의 MT-SP1이 부가된 경우일지라도 상당히 클리핑되었다. 단백질 밴드는 음성 대조군 ("-")의 것과 유사하거나 또는 심지어 더 악화되었다. 따라서, MT-SP1을 부가한 경우에 시험된 모든 조건하에서는 상당한 정도의 클리핑이 발생하였다.
Fc-융합 단백질을 이용한 실험에서는, 프로테아제 MT-SP1의 농도 의존적 효과가 관찰되었다 (도 7B). 가장 낮은 농도의 매트립타제/MT-SP1에서는, 약 85 kDa 하에서의 무손상 Fc-융합 단백질의 단백질 밴드가 양성 대조군과 비교해서 단지 약간만 감소되긴 하지만, 보다 높은 농도의 MT-SP1에서는, 대략 85 kDa 하에서의 단백질 밴드가 완전히 사라졌다. 그 결과로서, Fc-융합 단백질의 클리핑 정도는 세포 배양 배지 내의 매트립타제/MT-SP1의 농도와 상관이 있다.
본 실시예에서 사용된 상업용 마우스 MT-SP1에 의해 유도된 클리핑 부위를 결정하기 위해, MT-SP1 농도 1/100을 수반한 항체 샘플 (mAb)을 대상으로 하여 질량 분광측정법을 수행하였다. 이로써 확인된 클리핑 부위는 mAb를 야생형 CHO 세포주에 의해 생성시킨 경우와 동일하였다. 이는 mAb 상의 마우스 매트립타제의 클리핑 부위가, CHO 세포에서 mAb를 생성시키는 경우에 클리핑에 대해 책임이 있는 프로테아제의 클리핑 부위와 동일하다는 것을 보여준다. 이들 결과는 매트립타제 가 클리핑 프로테아제라는 것을 추가로 확증시켜 준다.
V.
실시예
4: 선택적
매트립타제
억제제에 의한
매트립타제
클리핑
작용의 억제
관심 재조합 폴리펩티드의 클리핑이, 클리핑에 대해 책임이 있는 주요 프로테아제로서의 매트립타제에 의해 유발된다는 것을 추가로 확증하기 위해, 인간 매트립타제/MT-SP1을 특이적으로 억제하는 특이적 항-MT-SP1 Fab 단편을 이용하여 스파이크-인 실험을 수행하였다. 인간 MT-SP1에 대한 억제성 Fab 구조와 결합성 세부 사항이 다음 문헌에 공개되었다 (Farady et al., 2008 J. Mol. Biol. (2008) 380, 351-360).
클리핑 표적으로서의 관심 치료 폴리펩티드은 이러한 경우에, 모노클로날 IgG 항체 (mAb), 및 2개의 당변이체를 수반한 재조합 비-항체 당단백질이었다. 관심 폴리펩티드를 각 경우에 0.7 μM의 농도로 부가하였다. 표 9에는 mAb (도 8, 상부 패널) 및 재조합 단백질 (도 8, 하부 패널)에 대하여 도 8에 도시된 웨스턴 블롯 결과에 상응하는 실험 설정의 추가의 세부 사항이 기재되어 있다:
<표 9>
조건화 배지를 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 제조하였다. 인큐베이션 시간은 모노클로날 IgG 항체의 경우에 24h이었고, 재조합 비-항체 단백질의 경우에는 1h이었다.
도 8 (상부 패널 참조)은 무손상 mAb의 강력한 단백질 밴드가 양성 대조군 (+)에 존재한다는 것으로 도시한 것이다 (레인 2 참조). 클리핑된 mAb는 관찰되지 않는다. 음성 대조군 (-)에서는 (레인 3 및 8 참조), 보다 높은 세기의 제2의 단백질 밴드가 무손상 단백질 약간 아래에 나타나는데, 이는 모노클로날 항체가 CHO-K1 유래 야생형 세포의 조건화 배지에서 상당히 클리핑된다는 것을 표시한다. 무손상 및 클리핑된 mAb는 화살표로 표시된다. 음성 대조군 (-)에서와 동일한 패턴이, 마우스 MT-SP1을 부가한 화학적으로 규정된 배지에서 관찰된다 (레인 4 참조). 재조합 비-항체 단백질 (도 8, 하부 패널 참조)과 관련하여, 양성 대조군 (+) (레인 2 참조)에서는, 약 37 kDa 하에서 2개의 무손상 단백질 당변이체에 대하여 강력한 밴드가 관찰된다. 양성 대조군에서 관찰된 무손상 단백질 당변이체에 대한 단백질 밴드는 음성 대조군 (-)에서 사라졌고, 클리핑된 단백질 당변이체에 대한 새로운 단백질 밴드가 나타났다 (레인 3 및 8 참조).
항-MT-SP1 Fab의 존재하에 인큐베이션하였던 샘플과 관련해서는, 이미 1 μM의 Fab가, 마우스 MT-SP1에 의한 mAb의 분해를 완전히 없애는 데 충분하였다 (도 8, 상부 패널, 레인 5). 1 μM의 항-MT-SP1 Fab는 조건화 배지 중의 mAb의 클리핑을 또한 저하시켰지만, 완전히 방지시킬 수는 없었다 (상부 패널, 레인 9 참조). mAb의 클리핑은 10 μM 및 50 μM의 Fab 농도 하에 조건화 배지에서 제거되었다 (도 8, 상부 패널, 레인 10 및 11). 화학적으로 규정된 배지에서 재조합 마우스 MT-SP1과 함께 인큐베이션된 재조합 단백질의 경우에는, 1 μM Fab의 농도에서 이미 클리핑이 저하되었다 (도 8, 하부 패널, 레인 5 참조). 클리핑의 추가의 저하는 10 μM Fab에서 관찰되었고, 클리핑의 완전한 중지는 재조합 마우스 MT-SP1이 부가된 화학적으로 규정된 배지에서 뿐만 아니라 조건화 배지에서 50 μM Fab를 이용하여 관찰되었다 (도 8, 하부 패널, 레인 6, 7 및 10 및 11 참조). 따라서, 인간 매트립타제에 대항하여 유발된 Fab가 또한, 마우스 뿐만 아니라 햄스터 매트립타제를 효과적으로 억제하였다. 그러나, 마우스 및 햄스터 매트립타제의 완전히 억제를 알아보기 위해서는 보다 고 농도가 필요하였다. 이는 에피토프 결합 부위 내에서 인간 매트립타제와 마우스 및 햄스터 매트립타제 간의 아미노산 차이에 기인하므로, 인간 매트립타제에 대항한 억제성 Fab가 마우스 및 햄스터 매트립타제에 대해서 보다 덜 강력하여, 이를 억제하기 위해서는 보다 고 농도의 Fab가 필요한 것으로 추정된다.
VI.
실시예
5:
매트립타제
녹아웃 세포주에서의 단백질 생성
스파이크-인 실험으로부터의 결과를 확증하기 위하여, 몇 가지 관심 폴리펩티드를 유가식 배양에서 매트립타제 녹아웃 세포 클론에 발현시켰고, 발현되고 분비된 관심 폴리펩티드의 클리핑을 분석하였으며, 이를 무손상 매트립타제를 내생적으로 발현하는 상응하는 CHO 야생형 세포주를 이용하여 수득된 결과와 비교하였다.
5.1.
mAb
코딩 벡터의 형질감염
매트립타제를 발현하는 CHO 야생형 세포주 (CHO-K1로부터 유래됨) 및 매트립타제 녹아웃 CHO 세포 클론 4 (KO-4; 표 5 참조)를, 모노클로날 항체 (mAb) 및 2개의 선별성 마커 유전자, 즉 neo 및 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염을 위하여, 세포를 지수기가 되도록 성장시켰고, 5 x 106개 세포를 3 μg 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 상기 야생형 세포주를 이용하여 5개의 형질감염 복제물을 수행하였고, KO-4 세포주를 이용하여 4개의 형질감염 복제물을 수행하였다. 관심 단백질을 코딩하는 벡터로 안정적으로 형질감염시킨 세포의 선별을 G418 (G418 농도 0.8 mg/ml)로 수행한 다음, MTX 선별의 2가지 연속적인 단계를 수행하였다 (500 nM 및 1 μM MTX). 선별 조건은 모든 풀과 양 세포주에 대하여 동일하였다. 선별이 끝날 무렵 (세포 생존 능력 > 95 %), 세포를 동결시켰다. 선별 공정 동안, 상기 배지에서 발현된 mAb의 역가를 결정하였다. 매트립타제 녹아웃 세포의 상등액 중에서의 역가를 CHO 야생형 세포의 역가와 비교하였다. 그 결과는 매트립타제 녹아웃이 세포의 생산 능력에 대한 부정적인 효과를 전혀 나타내지 않았고, 심지어 그 역가를 증가시키는 경향이 있다는 것을 명확하게 보여주었다.
5.2. 유가식 생산 과정
유가식 생산을 위하여, 가장 높은 항체 역가를 나타내는 3개의 CHO 야생형 세포주 풀과 매트립타제 녹아웃 클론 KO-4의 4개 모든 풀을 선별하였다. 이러한 7개 풀의 동결된 세포를 동시에 해동시키고, 개개의 유가식 반응기 내로 접종하기 전에 1회 계대접종하였다.
세포를, 아미노산, 비타민 및 미량 요소가 강화된 화학적으로 규정된 배지 (유가식 배지)를 함유하는 유가식 진탕기에서 배양하였다. 유가식 배양을 37℃ 하에 진탕시키면서 수행하였다. 이러한 유가식 배양 동안, 글루코스 및 아미노산을 함유하는 공급물 (유가식 공급물)을 그 공정을 따라 규칙적으로 부가하였다. 유가식 배양 공정 동안, 유가식 배양 물질의 샘플을 규칙적으로 수집하여, 바이-셀(Vi-Cell) 세포 생존 능력 분석기 [베크만 쿨터(Beckman Coulter)]를 이용하여 생존 세포 밀도 (vcd)를 결정하였고, 세포 배양 배지에서의 단백질 역가를 결정하였다. 유가 공급이 끝날 무렵 (제13일 또는 제14일), 배양 공정을 중단하였다. 진탕-플라스크로부터의 조건화 배지 (100 ml 배양물)를 수거하고, 0.22 μm 스테리플립(Steriflip) 필터를 이용하여 여과하였다. 단백질 A 친화 액체 크로마토그래피 [단백질 A 미니 칼럼; 프로테우스(Proteus), cat. PUR008]를 이용하여, 상기와 같이 여과된 조건화 배지로부터 모노클로날 항체를 정제하였다. 정제는 판매자의 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 단백질 A 정제 후 샘플의 단백질 농도는 판매자의 프로토콜에 따라서 나노드롭™ 시스템 (더모 사이언티픽)을 이용하여 결정하였다. 유가식 배양물을 분석한 결과, 14일 배양 기간 전반에 걸쳐, KO-4 풀의 배양 배지에서 발현된 mAb의 역가가 CHO 야생형 세포 풀의 배양 배지에서와 유사하거나 또는 이러한 배양 배지에서보다 훨씬 더 높은 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 세포 생존 능력은 KO-4 세포 풀에 대해서와 유사하거나 또는 이 보다 훨씬 더 높았다. KO 세포는 또한, 유사하거나 또는 심지어 더 우수한 세포 밀도하에 성장하였다. 이들 결과는 매트립타제 녹아웃이 단백질 발현율에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 심지어 이를 증강시킬 수도 있다는 것을 표시한다. 또한, 세포 성장도 부정적으로 영향을 받지 않았을 뿐만 아니라 훨씬 더 개선될 수 있다.
5.3.
클리핑
분석
클리핑 분석을 위하여, 2가지 병렬 접근 방식을 사용하였다: 마이크로칩 전기영동 (ME) - SDS 및 질량 분광측정법.
마이크로칩 전기영동
5 μL의 정제된 단백질을 샘플 제조에 사용한다. 샘플의 농도에 따라서, 단백질의 양은 상이하다. 환원성 마이크로칩 검정의 샘플 제조를 위하여, 5 μL를 35 μL의 환원성 샘플 완충제와 혼합한다. 이어서, 이와 같이 혼합된 용액을 70℃ 하에 15분 동안 열 블록에서 인큐베이션한다. 이를 냉각시킨 후, 70 μL의 밀리큐(MilliQ) 물을 가하여 110 μL의 최종 용적이 되도록 하였다. 펄킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 랩칩(LabChip®) GX II 기기를 시스템으로서 사용하였다. 사용된 프로토콜은 판매자의 프로토콜로부터의 개정된 버전이다. 주요 차이는 샘플/환원성 샘플 완충제의 비인데, 판매자의 프로토콜에서의 1:3.5 대신 더 우수한 변성을 위해 본 프로토콜에서는 1:7이다.
도 9는 마이크로칩 전기영동의 결과를 도시한 것이다. 왼쪽으로부터의 첫 번째 3개 레인 (WT1, 2 및 3으로서 확인됨)은 CHO 야생형 세포 풀을 수반한 3가지 생산으로부터의 단백질 A 정제된 세포 배양물의 단백질 샘플 조성을 나타낸다. 각 샘플에서는 동일한 단백질 밴드 패턴이 관찰된다. 모노클로날 항체의 무손상 중쇄 (HC)를 나타내는 넓은 단백질 밴드가 관찰되었다 (상기 랩칩 검정으로부터의 크기는 정확하지 않고 통상 과대평가된다). 이러한 단백질 밴드 바로 아래에, 클리핑된 중쇄를 나타내는 더 얇은 제2의 단백질 밴드가 관찰된다. 클리핑된 HC 종은 비-글리코실화 HC와 공동으로 이동한다. 또한, 경쇄를 나타내는 제3의 단백질 밴드가 약 29 kDa 하에 관찰된다. 매트립타제 녹아웃 세포 풀에서 생성된 모노클로날 항체의 단백질 샘플 (KO-4 1, 2, 3, 및 4로서 확임됨)에서는, 무손상 중쇄의 단백질 밴드와 경쇄의 단백질 밴드 둘 다가, CHO 야생형 세포주에 의해 생성된 샘플에서 발견된 단백질 밴드와 비교해서 더 강력하지 않는 경우에는 적어도 거의 동등한 수준이다. 그러나, 도 9의 상부로부터의 두 번째 화살표로써 확인된 클리핑된 중쇄의 밴드는 4개의 항체 샘플 KO4-1, KO4-2, KO4-3 및 KO4-4 모두에서 거의 가시적이지 않다. 이는 매트립타제 녹아웃 세포주에서 생성되는 경우에는 mAb의 클리핑이 거의 제거된다는 것을 명확히 보여준다.
상기 결과를 정량화하기 위하여, 클리핑된 항체 중쇄 및 무손상 항체 중쇄의 단백질 밴드의 세기를 결정하였고, 이로부터 클리핑 비율 (%)을 계산하였다. 이러한 분석 결과가 표 10에 요약되어 있다. 이는 생산 세포주로서 매트립타제 녹아웃 클론을 이용하는 경우에는, 모노클로날 항체의 클리핑 양이 현저하게 감소된다는 것을 보여준다. 이러한 분석에 따르면, 3개의 CHO 야생형 세포 풀에 의해 생성된 모노클로날 항체 중쇄의 평균 16.1%가 클리핑되었다. 이와는 달리, 4개의 매트립타제 녹아웃 유가식 배양에서 생성된 mAb HC에 대해서는 평균 1% 이하만의 클리핑이 일어났다. 비-글리코실화 HC의 공동-이동으로 인해, 랩칩® 분석에 근거해서는 정확한 값을 결정할 수 없다.
<표 10>
단백질 밴드 세기에 근거한 클리핑 분석
따라서, 마이크로칩 전기영동을 이용하여, 매트립타제 KO 세포에 의해 발현된 mAb에서는 단지 1% 이하의 클리핑이 검출되는 반면, 동일한 mAb를 발현하는 WT 세포에서는 12% 내지 20% 클리핑이 검출된다 (클리핑은 HC에서 검출되었다).
질량 분광측정법 분석
샘플을 질량 분광측정법 분석 이전에 탈글리코실화하고 환원시켰다. 7개의 단백질 A 정제된 단백질 샘플 각각으로부터, 50 μg의 총 단백질을 수반한 분취액을, 50 mM 트리스/HCl pH 7.5 중의 0.3 mg/ml의 농도하에 1.25 μl PNGase F와 함께 37℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 이 샘플의 최종 농도는 약 0.5 mg/ml였다. 탈글리코실화한 후, 112 μl 환원성 완충제 (8 M GuHCl, 10 μl 1 M 트리스/HCl pH 7.5 및 2 μl 1 M DTT)를 부가함으로써 88 μl의 PNGase F 소화된 샘플을 환원시키고, 37℃ 하에 1h 동안 인큐베이션하였다. 2 μl의 10% 트리플루오로아세트산을 부가함으로써 상기 환원물을 켄칭하였다.
이어서, 202 μl의 총 용적과 약 0.22 mg/ml 단백질의 농도를 갖는, 상기와 같이 수득된 샘플을, 조합된 액체 크로마토그래피와 질량 분광법에 의한 분석에 사용하였다. LC/MS 기기는 UPLC (소프트웨어: MassLynx 4.1)와 커플링된 워터스 시냅트(Waters Synapt) G2 시스템이었다. LC 방법은 0.2 mL/min의 유속과 완충제 MPA (수 중 0.1% TFA) 및 MPB (아세토니트릴 중 0.09% TFA)를 사용하였다. UV 검출을 214 nm 및 280 nm에서 수행하였다. 샘플 온도는 약 5℃였다. 14 μl의 탈글리코실화되고 환원된 샘플 (단백질 양 3 μg)을 BEH C4 1.7 μm, 2.1 X 100 mm 칼럼 (워터스) 상으로 부하하였다. 칼럼 온도는 80℃였다. 샘플 부하 이전에, 상기 칼럼을 완충제 MPA로 평형시켰다. 완충제 MPB를 이용하여 용출을 수행하였다.
이어서, 용출된 단백질을 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. LC/MS 데이터를 이용하여, 클리핑 부위를 확인하고, 클리핑된 종의 비율 (%)을 정량화하였다. 표 11은 각 단백질 샘플 중에서 LC/MS 검정에 근거한 클리핑된 항체 중쇄의 비율 (%)을 나타낸다. 야생형 샘플에서는 20 내지 29% 클리핑이 관찰되긴 하였지만, 생성을 위하여 매트립타제 녹아웃 세포를 이용한 경우에는 단지 2% 이하의 항체 중쇄가 클리핑되었다. UV 214 nm 데이터에 근거하여 계산된 결과는 환원성 랩칩 검정으로부터 수득된 것과 비교해서 약간 더 높다 (표 10 참조). 그러나, 본 개시내용의 교시를 적용하는 경우에 달성되는 클리핑의 강력한 저하가 또한 확증된다. LC/MS 결과는 매트립타제 녹아웃 세포주에서 생성된 mAb에 대해서는 클리핑이 15배 감소된다는 것을 명확하게 보여준다. 클리핑 부위를 분석한 결과, 매트립타제 녹아웃 세포에서 생성된 mAb 중쇄가, CHO 야생형 세포주에서 생성된 mAb HC와 동일한 위치에서 클리핑되는 것으로 밝혀졌다. 단백질 모델링 결과, 클리핑 부위가 세포 배양 배지에 노출되는 mAb의 매우 가요성인 구역에 위치하는 것으로 추가로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 클리핑 부위에 대한 친화도가 낮은 프로테아제일지라도 이에 용이하게 접근하여 이를 절단할 수 있다. 이러한 발견들은 매트립타제 녹아웃 계통에서의 잔류 클리핑 현상을 설명할 수 있다.
<표 11>
LC/MS 검정에 근거한 클리핑 분석
5.4. WT 및 KO-4를 추가의 당단백질로 형질감염시킴
추가 실시예를 수행하여, 도입된 매트립타제 녹아웃이 재조합 당단백질의 생산 수준과 생성물 품질에 불리한 영향을 미치지 않는다는 것을 다시 명확하게 보여주었다. 항체와 상이한 2개의 당단백질 (여기서는 Fc-융합 단백질 뿐만 아니라 하나의 재조합 치료 단백질)을 발현시켰다. 매트립타제 녹아웃 세포주 KO-4 및 CHO 야생형 세포주 (그로부터 클론 KO-4가 유래되었다)를 적합한 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 및 선별 후, 역가 및 단백질 분석 (예를 들어, 상기 챕터 5.3에 기재된 바와 같음)을 수행하였다.
매트립타제 KO 세포주 KO-4에 의해 달성된 단백질 역가는 상응하는 WT 세포주 (그로부터 클론 KO-4가 유래되었다)에서와 동일한 범위이거나 또는 이보다 더 높았다 (또한 표 12 참조). 클리핑은 WT 세포로부터 수득된 단백질, 예컨대 Fc-융합 단백질과 비교해서, KO 세포로부터 수득된 단백질, 예컨대 Fc-융합 단백질에서 또한 상당히 저하되었다 (또한 표 13 참조). 이는 매트립타제 유전자의 KO가 각종 추가의 폴리펩티드에 대한 단백질 분해적 분해를 저하시켰다는 것을 명백하게 보여준다.
<표 12>
Fc-융합 단백질 및 재조합 치료 단백질의 발현 분석
<표 13>
Fc-융합 단백질 및 재조합 치료 단백질의 클리핑 분석
일반적으로, 매트립타제 KO 세포주는 당단백질을 생성하기 위한 유사하거나 또는 심지어 개선된 특징을 보여주었다. 따라서, 각각의 세포주가 단백질 분해적 감수성 폴리펩티드를 생성하는 데 적합할 뿐만 아니라 단백질 분해적 비-감수성 폴리펩티드를 생성하는 데 적합하다. 따라서, 상이한 관심 폴리펩티드의 생성을 단순화시켜 주는 만능 세포주가 제공된다.
VII.
실시예
6: 상류 프로세스 적합성 및 바이오반응기 스케일 업
대규모 치료적 생성을 위하여 스케일 업시키고자 하는 매트립타제 녹아웃 세포주의 적합성을 보여주기 위하여, 2가지 상이한 매트립타제 KO 접근 방식 (ZFN 및 TALEN 기술)으로부터 유래된 12개의 모 클론을 3가지 단계 스크리닝 접근 방식에서 평가하였다. CHO 야생형 세포주를 비교용으로 사용하였다.
6.1. 모 클론 성능의 평가
6.1.1. 세포 확장 동안 모 클론 성능의 비교
대규모 생산을 위한 확장 동안 12개의 형질감염되지 않은 KO 클론 [7개의 ZFN 서브클론 (실시예 2b에 기재된 ZFN KO 클론의 단일 세포 분류를 통하여 생성됨) 및 5개의 TALEN-유래] 및 비교용 야생형 세포주의 성능을 평가하기 위하여, 필수 비타민의 농도에서 차이가 나는 2개의 세포 배양 확장 배지를 이용하여, 시드 트레인(seed train)을 진탕-플라스크에서 평가하였다. 따라서, 상기 클론을 규정된 생존 세포 밀도하에 양 확장 배지에 접종하였고, 36.5℃에서 4일 동안 배양하였다. 클론을 표 14에 기재되는 바와 같이, 최종 생존 세포 밀도, 평균 성장률에 관해서 분석하였다. 생산 단계 배지를 이용하는 모 클론의 적합성 평가로부터의 결과와 함께 (챕터 6.1.2), 생산 능력에 관해서 가장 우수한 성능의 7개 클론을 추가 비교용으로 선별하였다 (챕터 6.2 참조).
<표 14>
세포 확장 동안 모 클론 성능의 결과
6.1.2. 생산 조건하에 모 클론 성능의 비교
12개의 모 클론과 참조 야생형 세포주를 진탕 플라스크 공급-배치식 생산 공정에서 추가로 비교하였다. 챕터 6.1.1.에 기재된 확장 연구로부터의 세포를, 2가지 상이한 배양 조건 (2가지 상이한 화학적으로 규정된 생산 배지, 접종 세포 밀도 및 공급 요법)을 이용하여 14일 동안 36.5℃ 하에 배양하였다. 2개의 독립적인 공급 용액으로 공급하는 것은 미리-규정된 프로파일에서 상기 공정 내내 수행하였고, 온도 이동을 적용하였다. 세포 밀도, 생존 능력 및 주요 대사물을 매일 모니터링하였고, 이를 이용하여, 생산에 대한 적합성에 관하여 KO 클론을 WT 클론과 비교하였다. 야생형 세포주와 유사하거나 이보다 탁월한 성장 성능을 달성한 7개 클론을 확인하였는데, 그 대사물 프로파일은 거의 동등한 수준이었다.
6.2. 형질감염된 풀의 진탕 플라스크 스크리닝
챕터 6.1에서 확인된 바와 같은 가장 우수한 7개의 모 클론, 및 CHO 야생형을, 야생형 세포주의 배경에서 단백질 분해적 분해에 대해 감수성인 것으로 공지되어 있는 관심 폴리펩티드로서 모노클로날 IgG 항체로 삼중으로 형질감염시켰다. 이와 같이 형질감염된 세포를, 챕터 6.1.2.에 기재된 바와 같은 2가지 상이한 조건 및 진탕 플라스크 배양을 이용하여 평가하였다. 세포 성장 (생존 세포 밀도, 세포 생존 능력) 및 생성물 형성을 배양 동안 모니터링하였다. TALEN-녹아웃 접근 방식으로부터 유래된 세포는 CHO 야생형 세포와 비교해서 유사하거나 또는 증가된 세포 성장을 보여줌으로써, ZFN-유래 풀은 TALEN-유래 풀과 비교해서 지수기 동안 약간 더 낮은 세포 성장을 보여주었다. 그러나, 배양이 끝날 무렵의 세포 생존 능력은 모든 클론에 대하여 거의 동등한 수준이었다. 배양이 끝날 무렵 용적 생산성은 CHO 야생형 풀의 생산성과 비교해서 TALEN의 경우에는 평균 19% 더 높았고, 아연-핑거-뉴클레아제 풀의 경우에는 평균 9% 더 높았다.
배양이 끝날 무렵 (제14일), 모노클로날 IgG 항체를 대상으로 하여 그 완전성에 관하여 분석하였다. 따라서, 상등액을 원심분리에 의해 수거하고 멸균성 여과하였다. 모노클로날 IgG 항체를 상기 상등액으로부터 포획하고, 단백질 분해적 분해를 알아보기 위하여 CE-SDS (모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트)에 의해 분석하였고, 전하 변이체 분포를 평가하기 위하여 CEC (양이온 교환 크로마토그래피)에 의해 분석하였다. 녹아웃 클론으로부터 유래된 모든 풀은 대략 1%의 유사하게 낮은 수준의 폴리펩티드 클리핑을 나타낸 반면, CHO 야생형으로부터 유래된 생성물은 대략 21%에서 절단되었다.
6.3. 모
서브클론
및 형질감염된 풀의 바이오반응기 스크리닝
7 L 유리 바이오반응기의 제어식 배양 조건을 이용하여, 챕터 6.1. 및 6.2.에서 확인된 바와 같은 가장 우수한 성능의 4개의 모 클론 및 형질감염된 풀을 심층 성상확인하기 위하여 선택하였다. 배양 공정은 본질적으로 챕터 6.1.2.에 기재된 바와 같지만, 챕터 6.2에서 확인된 바와 같은 바람직한 배양 조건만을 사용하였다. 비-형질감염된 모 클론과 비교해서 형질감염된 풀에 대해 약간 더 낮은 성장이 관찰되었는데, 이는 폴리펩티드 발현에 의해 유발된 대사 조직량에 기인된 공지된 현상이다. 그러나, WT 세포주와 비교해서 세포 성장 행위에 있어서의 유의적 차이는 전혀 발견되지 않았다. 대사물, 예컨대 락테이트 및 암모늄이 야생형 세포주와 유사한 통상적 범위 내였다.
생성물 품질은 SEC, CEC 및 CE-SDS에 의해 순도에 관하여 분석적으로 평가하였고 독점적 방법에 의해 N-글리코실화에 관하여 분석하였다. 그 결과는 모든 KO 클론이 응집 및 분해 생성물, 전하 변이체 분포 및 글리코실화 패턴의 측면에서 거의 동등한 수준의 생성물 품질을 달성하였다는 것을 보여주었다. CE-SDS 환원 결과는 클리핑된 종이 모든 KO 서브클론에 대하여 0.7%의 낮은 수준으로 존재한다는 것을 보여주었다. 모든 KO 클론은 참조 야생형 세포주와 비교해서 유사하거나 또는 바람직한 성장 특징을 보여주었을 뿐만 아니라 일관되게 더 우수한 품질의 폴리펩티드를 생성하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis AG
<120> Novel vertebrate cells and methods for recombinantly expressing a
polypeptide of interest
<130> PAT056118-WO-PCT
<150> US 61/985,589
<151> 2014-04-29
<150> US 61/994,310
<151> 2014-05-16
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 855
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 1
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Val Asn Asn Ala Lys Lys Val Glu
35 40 45
Lys Arg Gly Pro Arg Arg Cys Val Val Leu Val Val Leu Leu Val Ser
50 55 60
Phe Leu Phe Leu Ser Leu Val Ala Gly Phe Leu Val Trp His Phe Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Asn Val Arg Ile Gln Lys Val Phe Asn Gly His Leu Arg Val
85 90 95
Thr Asn Glu Asn Phe Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu
100 105 110
Phe Lys Asp Leu Ala Asn Gln Val Lys Glu Ala Leu Lys Leu Leu Tyr
115 120 125
Ser Glu Val Pro Val Leu Gly Pro Tyr His Lys Arg Ser Ala Val Thr
130 135 140
Ala Phe Ser Glu Gly Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser
145 150 155 160
Ile Pro Pro His Leu Ala Glu Glu Val Asp Arg Ala Met Ala Val Glu
165 170 175
Arg Val Val Thr Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ala Leu Lys Ser Phe Val
180 185 190
Leu Thr Ser Val Val Ala Phe Pro Thr Asp Pro Arg Leu Leu Gly Arg
195 200 205
Thr Gln Asp Asn Ser Cys Asn Phe Ala Leu His Ala His Gly Gly Glu
210 215 220
Val Met Arg Phe Thr Thr Pro Gly Phe Pro Asn Ser Pro Tyr Pro Ala
225 230 235 240
His Ala Arg Cys Gln Trp Val Leu Arg Gly Asp Ala Asp Ser Val Leu
245 250 255
Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Val Ala Pro Cys Asp Glu Leu Gly
260 265 270
Asn Asp Leu Val Thr Val Tyr Asp Thr Leu Ser Pro Met Glu Pro His
275 280 285
Ala Val Val Arg Leu Cys Gly Thr Tyr Pro Pro Ser Tyr Asn Leu Thr
290 295 300
Phe Leu Ser Ser Gln Asn Val Phe Leu Val Thr Leu Ile Thr Asn Thr
305 310 315 320
Asp Arg Arg His Pro Gly Phe Glu Ala Thr Phe Phe Gln Leu Pro Lys
325 330 335
Met Arg Ser Cys Gly Gly Ser Leu Ser Glu Ala Gln Gly Leu Phe Ser
340 345 350
Ser Pro Tyr Tyr Pro Gly His Tyr Pro Pro Asn Ile Asp Cys Thr Trp
355 360 365
Asn Ile Lys Val Pro Asn Asn Arg Asn Val Lys Val Arg Phe Lys Leu
370 375 380
Phe Tyr Leu Val Asp Pro Asn Ile Pro Leu Gly Thr Cys Pro Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Val Glu Ile Asn Gly Glu Arg Tyr Cys Gly Glu Lys Ser Gln Phe
405 410 415
Val Val Ser Ser Asn Ser Ser Lys Ile Thr Val Arg Phe His Ser Asp
420 425 430
His Ser Tyr Thr Asp Thr Gly Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp
435 440 445
Ser Asn Asp Pro Cys Pro Gly Met Phe Met Cys Asn Thr Gly Arg Cys
450 455 460
Ile Arg Lys Asp Leu Arg Cys Asp Gly Trp Ala Asp Cys Pro Asp Tyr
465 470 475 480
Ser Asp Glu His Phe Cys Arg Cys Asn Thr Thr His Gln Phe Met Cys
485 490 495
Lys Asn Lys Leu Cys Lys Pro Leu Phe Trp Val Cys Asp Asn Ile Asn
500 505 510
Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Gly Cys Ser Cys Pro Ala Glu
515 520 525
Thr Phe Lys Cys Ser Asn Gly Lys Cys Leu Pro Gln Ser Gln Lys Cys
530 535 540
Asp Gly Lys Asp Asn Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Asp
545 550 555 560
Arg Val Lys Val Val Ser Cys Thr Lys Tyr Thr Tyr Arg Cys His Asn
565 570 575
Gly Leu Cys Leu Ser Lys Gly Asn Pro Glu Cys Asp Gly Lys Lys Asp
580 585 590
Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Lys Asn Cys Asp Cys Gly Leu Arg Ser
595 600 605
Phe Thr Lys Gln Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Asn Ala Asp Glu Gly
610 615 620
Glu Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Leu
625 630 635 640
Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His
645 650 655
Cys Phe Met Asp Asp Arg Asn Phe Lys Tyr Ser Asp His Thr Lys Trp
660 665 670
Thr Ala Phe Leu Gly Leu Leu Asp Gln Ser Lys Arg Ser Ser Thr Gly
675 680 685
Val Gln Glu His Lys Leu Lys Arg Ile Ile Thr His Pro Leu Phe Asn
690 695 700
Glu Ile Thr Phe Asp Tyr Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro
705 710 715 720
Ala Glu Tyr Ser Thr Val Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Thr Thr
725 730 735
His Val Phe Pro Ala Gly Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His
740 745 750
Thr Gln Glu Gly Gly Thr Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile
755 760 765
Arg Val Ile Asn Gln Thr Thr Cys Glu Asp Leu Met Pro Gln Gln Ile
770 775 780
Thr Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser
785 790 795 800
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Thr Glu Gly
805 810 815
Arg Ile Phe Gln Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln
820 825 830
Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Pro Ala Val Arg Asp Trp
835 840 845
Ile Lys Glu Gln Thr Gly Val
850 855
<210> 2
<211> 855
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Ser Asp Arg Ala Arg Lys Gly Gly Gly Gly Pro Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Lys Tyr Asn Ser Arg His Glu Lys Val Asn Gly Leu
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Val Asn Asn Val Lys Lys Val Glu
35 40 45
Lys His Gly Pro Gly Arg Trp Val Val Leu Ala Ala Val Leu Ile Gly
50 55 60
Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Ile Gly Phe Leu Val Trp His Leu Gln
65 70 75 80
Tyr Arg Asp Val Arg Val Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile
85 90 95
Thr Asn Glu Asn Phe Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu
100 105 110
Phe Val Ser Leu Ala Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr
115 120 125
Ser Gly Val Pro Phe Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr
130 135 140
Ala Phe Ser Glu Gly Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser
145 150 155 160
Ile Pro Gln His Leu Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu
165 170 175
Arg Val Val Met Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu Lys Ser Phe Val
180 185 190
Val Thr Ser Val Val Ala Phe Pro Thr Asp Ser Lys Thr Val Gln Arg
195 200 205
Thr Gln Asp Asn Ser Cys Ser Phe Gly Leu His Ala Arg Gly Val Glu
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Leu Met Arg Phe Thr Thr Pro Gly Phe Pro Asp Ser Pro Tyr Pro Ala
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260 265 270
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275 280 285
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<213> Mus musculus
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<213> Rattus norvegicus
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Gly Ala Gly Leu Lys Tyr Asn Ser Arg Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
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<213> Pan troglodytes
<220>
<221> misc_feature
<222> (561)..(561)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 5
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<212> DNA
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<220>
<223> Gm5077 - Antisense sequence of siRNA
<400> 11
aauaaucaca cguucagcgg t 21
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plat - Sense sequence of siRNA
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gaaacaagau gaagacagat t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plat - Antisense sequence of siRNA
<400> 13
ucugucuuca ucuuguuucc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prss35 - Sense sequence of siRNA
<400> 14
ggccuuagac uacgacuaut t 21
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prss35 - Antisense sequence of siRNA
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auagucguag ucuaaggccg g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Matriptase/MT-SP1 - Forward Primer Sequence
<400> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Matriptase/MT-SP1 - Reverse Primer Sequence
<400> 17
accgtccagt gttacacatg aac 23
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Matriptase/MT-SP1 Reporter 1 Sequence
<400> 18
ccaatgaccc atgccc 16
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1ra Forward Primer Sequence
<400> 19
acctgcaaac aaggctacca 20
<210> 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1ra Reverse Primer Sequence
<400> 20
tggcaaacag ctgtgaagga 20
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1ra Reporter 1 Sequence
<400> 21
cagcacctgg tttcc 15
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gm5077 Forward Primer Sequence
<400> 22
tgcgaggagc catattacta catg 24
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gm5077 Reverse Primer Sequence
<400> 23
gcagcgcagc gatactc 17
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gm5077 Reporter 1 Sequence
<400> 24
ccgccgtgtt cttcat 16
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plat Forward Primer Sequence
<400> 25
agctgacatg ggaatactgt gatg 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plat Reverse Primer Sequence
<400> 26
cctttaattc gaaactgtgg ctgtt 25
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plat Reporter 1 Sequence
<400> 27
ccgtgctcca cctgc 15
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prss35 Forward Primer Sequence
<400> 28
aggagagcac cacacaaaga c 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prss35 Reverse Primer Sequence
<400> 29
acacgagtcc actggaagga 20
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prss35 Reporter 1 Sequence
<400> 30
ccccggaccc ctcctg 16
<210> 31
<211> 345
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 31
ttttttgccc agtcctggtt cttccaaact cacaggtgtc actgaacctc cggggctggg 60
aagctattgt cggggagcgt ctctgagtcc tgaaatatct ttctgtttag aacatgaatg 120
gctttgagga gggtgtggag tttctgcctg tgaataatgc caagaaagtg gagaagcgag 180
gcccccggcg ctgtgtggtg cttgtggtcc tgctggtcag tttcctcttt ctctcactcg 240
tggctggctt cctggtgtgg cacttcctct gtgagtacag tgggggctgt gggagggcga 300
cagaggggta gtgttctctc ttctctcaga ggacagacca aaggg 345
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer Sequence
<400> 32
ttttttgccc agtcctggtt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer Sequence
<400> 33
ccctttggtc tgtcctctga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cut. Primer
<400> 34
gtggagtttc tgcctgtgaa 20
<210> 35
<211> 160
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 35
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggag tttctgcctg tgaataatgc caagaaagtg 60
gagaagcgag gcccccggcg ctgtgtggtg cttgtggtcc tgctggtcag tttcctcttt 120
ctctcactcg tggctggctt cctggtgtgg cacttcctct 160
<210> 36
<211> 156
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 36
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggag ttcctgtgaa taatgccaag aaagtggaga 60
agcgaggccc ccggcgctgt gtggtgcttg tggtcctgct ggtcagtttc ctctttctct 120
cactcgtggc tggcttcctg gtgtggcact tcctct 156
<210> 37
<211> 156
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 37
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggag tttctgtgaa taatgccaag aaagtggaga 60
agcgaggccc ccggcgctgt gtggtgcttg tggtcctgct ggtcagtttc ctctttctct 120
cactcgtggc tggcttcctg gtgtggcact tcctct 156
<210> 38
<211> 143
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 38
aacatgaatg gctttgagga gggtgaataa tgccaagaaa gtggagaagc gaggcccccg 60
gcgctgtgtg gtgcttgtgg tcctgctggt cagtttcctc tttctctcac tcgtggctgg 120
cttcctggtg tggcacttcc tct 143
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 39
tggagtttct gcctgtg 17
<210> 40
<211> 146
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 40
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggaa taatgccaag aaagtggaga agcgaggccc 60
ccggcgctgt gtggtgcttg tggtcctgct ggtcagtttc ctctttctct cactcgtggc 120
tggcttcctg gtgtggcact tcctct 146
<210> 41
<211> 14
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 41
gtttctgcct gtga 14
<210> 42
<211> 156
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 42
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggag tgcctgtgaa taatgccaag aaagtggaga 60
agcgaggccc ccggcgctgt gtggtgcttg tggtcctgct ggtcagtttc ctctttctct 120
cactcgtggc tggcttcctg gtgtggcact tcctct 156
<210> 43
<211> 149
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 43
aacatgaatg gctttgagga gggtgtggag taataatgcc aagaaagtgg agaagcgagg 60
cccccggcgc tgtgtggtgc ttgtggtcct gctggtcagt ttcctctttc tctcactcgt 120
ggctggcttc ctggtgtggc acttcctct 149
<210> 44
<211> 11
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 44
ttctgcctgt g 11
<210> 45
<211> 153
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 45
aacatgaatg gctttgagga gggtgtgggc ctgtgaataa tgccaagaaa gtggagaagc 60
gaggcccccg gcgctgtgtg gtgcttgtgg tcctgctggt cagtttcctc tttctctcac 120
tcgtggctgg cttcctggtg tggcacttcc tct 153
<210> 46
<211> 145
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 46
aacatgaatg gctttgagga gggtgtgaat aatgccaaga aagtggagaa gcgaggcccc 60
cggcgctgtg tggtgcttgt ggtcctgctg gtcagtttcc tctttctctc actcgtggct 120
ggcttcctgg tgtggcactt cctct 145
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 47
gagtttctgc ctgtg 15
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 48
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Val Asn Asn Ala Lys Lys Val Glu
35 40 45
Lys Arg Gly Pro Arg Arg Cys Val Val Leu Val Val Leu Leu Val Ser
50 55 60
Phe Leu Phe Leu Ser Leu Val Ala Gly Phe Leu Val Trp His Phe Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Asn Val Arg Ile Gln Lys Val Phe Asn Gly His Leu Arg Val
85 90 95
Thr Asn Glu Asn Phe Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu
100 105 110
Phe Lys Asp Leu Ala Asn Gln Val Lys Glu Ala Leu
115 120
<210> 49
<211> 39
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 49
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu
35
<210> 50
<211> 52
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 50
Ile Met Pro Arg Lys Trp Arg Ser Glu Ala Pro Gly Ala Val Trp Cys
1 5 10 15
Leu Trp Ser Cys Trp Ser Val Ser Ser Phe Ser His Ser Trp Leu Ala
20 25 30
Ser Trp Cys Gly Thr Ser Ser Thr Gln Met Phe Gly Ser Lys Arg Ser
35 40 45
Ser Met Val Ile
50
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 51
Gly Ser Gln Met Arg Thr Phe Trp Met Pro Met Arg Thr Gln Thr Pro
1 5 10 15
Gln Ser Ser Lys Thr Trp Pro Thr Arg
20 25
<210> 52
<211> 39
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 52
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu
35
<210> 53
<211> 52
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 53
Ile Met Pro Arg Lys Trp Arg Ser Glu Ala Pro Gly Ala Val Trp Cys
1 5 10 15
Leu Trp Ser Cys Trp Ser Val Ser Ser Phe Ser His Ser Trp Leu Ala
20 25 30
Ser Trp Cys Gly Thr Ser Ser Thr Gln Met Phe Gly Ser Lys Arg Ser
35 40 45
Ser Met Val Ile
50
<210> 54
<211> 25
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 54
Gly Ser Gln Met Arg Thr Phe Trp Met Pro Met Arg Thr Gln Thr Pro
1 5 10 15
Gln Ser Ser Lys Thr Trp Pro Thr Arg
20 25
<210> 55
<211> 36
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 55
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Glu
35
<210> 56
<211> 55
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 56
Cys Gln Glu Ser Gly Glu Ala Arg Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Cys
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Gln Phe Pro Leu Ser Leu Thr Arg Gly Trp Leu Pro
20 25 30
Gly Val Ala Leu Pro Leu Leu Lys Cys Ser Asp Pro Lys Gly Leu Gln
35 40 45
Trp Ser Ser Glu Gly His Lys
50 55
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 57
Glu Leu Ser Gly Cys Leu
1 5
<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 58
Glu Leu Lys Leu His Arg Val Gln Arg Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gly
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ala Val Val Gln
20
<210> 59
<211> 37
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 59
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu
35
<210> 60
<211> 55
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 60
Cys Gln Glu Ser Gly Glu Ala Arg Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Cys
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Gln Phe Pro Leu Ser Leu Thr Arg Gly Trp Leu Pro
20 25 30
Gly Val Ala Leu Pro Leu Leu Lys Cys Ser Asp Pro Lys Gly Leu Gln
35 40 45
Trp Ser Ser Glu Gly His Lys
50 55
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 61
Glu Leu Ser Gly Cys Leu
1 5
<210> 62
<211> 23
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 62
Glu Leu Lys Leu His Arg Val Gln Arg Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gly
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ala Val Val Gln
20
<210> 63
<211> 39
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 63
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu Cys Leu
35
<210> 64
<211> 52
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 64
Ile Met Pro Arg Lys Trp Arg Ser Glu Ala Pro Gly Ala Val Trp Cys
1 5 10 15
Leu Trp Ser Cys Trp Ser Val Ser Ser Phe Ser His Ser Trp Leu Ala
20 25 30
Ser Trp Cys Gly Thr Ser Ser Thr Gln Met Phe Gly Ser Lys Arg Ser
35 40 45
Ser Met Val Ile
50
<210> 65
<211> 25
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 65
Gly Ser Gln Met Arg Thr Phe Trp Met Pro Met Arg Thr Gln Thr Pro
1 5 10 15
Gln Ser Ser Lys Thr Trp Pro Thr Arg
20 25
<210> 66
<211> 37
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 66
Met Gly Ser Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Leu Glu Asn Met Asn Gly Phe
20 25 30
Glu Glu Gly Val Glu
35
<210> 67
<211> 55
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 67
Cys Gln Glu Ser Gly Glu Ala Arg Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Cys
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Gln Phe Pro Leu Ser Leu Thr Arg Gly Trp Leu Pro
20 25 30
Gly Val Ala Leu Pro Leu Leu Lys Cys Ser Asp Pro Lys Gly Leu Gln
35 40 45
Trp Ser Ser Glu Gly His Lys
50 55
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 68
Glu Leu Ser Gly Cys Leu
1 5
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 69
Glu Leu Lys Leu His Arg Val Gln Arg Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gly
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ala Val Val Gln
20
Claims (23)
- 관심 폴리펩티드의 재조합 발현에 적합한 단리된 척추동물 세포이며, 여기서 척추동물 세포는 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경되고, 매트립타제의 효과는 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 유전자 녹아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵 또는 전술된 것 중 임의의 조합에 의해 저하되거나 또는 제거되기 때문에 손상되며, 여기서 척추동물 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 관심 폴리펩티드를 분비하는 것인, 단리된 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 다음 특징들 중 한 가지 이상을 갖는, 단리된 척추동물 세포:
(a) 척추동물 세포의 게놈이 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능을 손상시키도록 변경되거나;
(b) 매트립타제 유전자의 적어도 하나의 카피 또는 모든 카피가 결실되거나 또는 기능적으로 불활성화된다. - 제2항에 있어서, 다음 특징들 중 한 가지 이상을 갖는, 단리된 척추동물 세포:
a) 척추동물 세포가, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물을 제공하도록 매트립타제 유전자의 적어도 하나의 카피 또는 모든 카피 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나;
b) 척추동물 세포가 프로모터, 5' UTR, 3' UTR 또는 매트립타제 유전자의 다른 조절성 요소에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. - 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 매트립타제 유전자의 코딩 영역 내에 포함되고, 상기 돌연변이로 인해, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 생성되고; 임의로, 하나 이상의 돌연변이가 매트립타제의 엑손 2를 코딩하는 매트립타제 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내에 포함되거나 또는 하나 이상의 돌연변이가 매트립타제의 촉매적 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 매트립타제 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내에 포함됨으로써, 비-기능적이거나 또는 덜 기능적인 발현 생성물이 수득되는 것인, 단리된 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 비-변경된 내인성 매트립타제가 매트립타제 참조 단백질로서 서열식별번호: 1 내지 5에 제시된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 공유하고 상기 매트립타제 참조 단백질과 동일한 단백질 분해적 활성을 갖는 것인, 단리된 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 척추동물 세포가 다음 특징들 중 하나를 갖는 것인, 단리된 척추동물 세포:
a) 척추동물 세포가 포유류 세포이거나;
b) 척추동물 세포가 인간 세포이거나;
c) 척추동물 세포가 설치류 세포이거나;
d) 척추동물 세포가 햄스터 세포이거나;
e) 척추동물 세포가 CHO 세포이거나;
f) 척추동물 세포가 세포 클론 또는 세포주로서 제공된 포유류 세포이다. - 제1항에 있어서, 매트립타제 유전자의 하나 또는 둘 다의 대립유전자의 엑손 2에 하나 이상의 프레임-시프트 돌연변이를 포함하는 CHO 세포인, 단리된 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 다음 특징들 중 한 가지 이상을 갖는 것인, 단리된 척추동물 세포:
a) 치료상 활성 또는 진단 폴리펩티드이거나;
b) 프로테아제에 의한 클리핑의 영향을 받기 쉽거나;
c) 매트립타제에 대한 적어도 하나의 클리핑 부위를 포함하거나;
d) 글리코폴리펩티드이거나;
e) 당단백질, 항체, 비-IgG 단백질, Fc-융합 단백질, Fab 단편, 단백질 복합체, 펩티다제, 시그널 펩티드, 나노보디, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 혈액 인자 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 제1항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드가 상기 세포의 게놈 내로 통합되고, 임의로, 선별성 마커 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드가 상기 세포의 게놈 내로 부가적으로 통합되는 것인, 단리된 척추동물 세포.
- 단리된 척추동물 세포에서의 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 유전자 녹아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵 또는 전술된 것 중 임의의 조합에 의해 저하시키거나 또는 제거함으로써 매트립타제의 효과를 손상시키도록 단리된 척추동물 세포를 변경시키는 단계; 및 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 관심 폴리펩티드는 단리된 척추동물 세포에 의해 분비되는 것인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 단리된 척추동물 세포의 생성 방법.
- (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 척추동물 숙주 세포를, 관심 폴리펩티드의 발현 및 세포 배양 배지 내로의 분비를 허용해 주는 조건하에 배양하는 단계;
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및
(c) 임의로, 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성하는 방법. - (a) 숙주 세포로서 제1항에 따르는 척추동물 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 관심 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 단계
를 포함하며, 여기서 임의로, 단계 (a)는 내인성 프로테아제 매트립타제의 기능이 손상된 척추동물 세포를, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시켜 제1항에 따르는 척추동물 숙주 세포를 제공하는 것을 포함하는 것인, 관심 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 숙주 세포를 선별하는 방법. - 제12항에 있어서, 다음 특징들 중 한 가지 이상을 갖는 방법:
a) 척추동물 세포가 포유류 세포이거나;
b) 단계 (a)에서 제공된 상기 숙주 세포가 부가적으로, 선별성 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 단계 (b)가 상기 복수 개의 숙주 세포를 선별성 마커에 대해 선택적인 조건하에 배양하는 것을 포함하거나;
c) 폴리뉴클레오티드가, 하나 이상의 발현 벡터를 형질감염시킴으로써 척추동물 세포 내로 도입되거나;
d) 단계 (b)가 하나 또는 여러 개의 선별 단계를 포함하거나;
e) 단계 (b)가 유동 세포계수법 기반 선별을 수행하는 것을 포함한다. - 내인성 프로테아제 매트립타제가 단리된 척추동물 세포에서 기능적으로 발현되는 지를 분석하는 단계; 및 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여, 매트립타제 유전자의 기능적 발현을 유전자 녹아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵 또는 전술된 것 중 임의의 조합에 의해 저하시키거나 또는 제거함으로써 상기 내인성 매트립타제의 효과가 손상된 단리된 척추동물 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여 단리된 척추동물 세포를 선별하는 방법.
- 단리된 척추동물 세포로부터 분비되는 관심 폴리펩티드의 재조합 생성을 위하여 단리된 척추동물 세포를 사용하는 방법이며, 여기서 사용된 세포는 내인성 프로테아제 매트립타제의 효과를 손상시키도록 변경되고, 매트립타제의 효과는 매트립타제 유전자의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 유전자 녹아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵 또는 전술된 것 중 임의의 조합에 의해 저하되거나 또는 제거되기 때문에 손상되고, 임의로, 단리된 척추동물 세포는 제2항에 정의된 바와 같은 한 가지 이상의 특징을 갖는 것인, 방법.
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Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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