JP2023527693A - 神経疾患を治療するための補体成分ｃ１ｒ阻害剤、並びに関連する組成物、システム、及びそれを使用する方法 - Google Patents

神経疾患を治療するための補体成分ｃ１ｒ阻害剤、並びに関連する組成物、システム、及びそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、神経疾患の治療における使用のための補体Ｃ１ｒサブコンポーネント（Ｃ１Ｒ）阻害剤に関する。本発明は、特に、Ｃ１Ｒ発現の下方調節のためのＣ１Ｒ阻害剤の使用に関する。本発明はまた、Ｃ１Ｒに相補的であり、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡのレベルを減少させることができる核酸分子に関する。本発明はまた、薬学的組成物、及び神経疾患の治療におけるその使用も含む。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年５月１１日に出願された「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題される米国仮特許出願、及び２０２０年５月１１日に出願された「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ１Ｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題される米国仮特許出願に関連しており、どちらの内容もその全文が参照により本明細書に援用される。本出願は、２０２０年５月１１日に出願された「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ１Ｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題される米国仮特許出願第６３／０２３１１３号の優先権を主張し、その内容は全文が参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年５月６日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ３６０９０－ＷＯ＿Ｃ１Ｒ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは１９８，７８４バイトである。
技術分野
本発明は、神経疾患の治療における使用のための補体Ｃ１ｒサブコンポーネント（Ｃ１Ｒ）阻害剤に関する。本発明は、特に、Ｃ１Ｒ発現の下方調節のためのＣ１Ｒ阻害剤の使用に関する。本発明はまた、Ｃ１Ｒに相補的であり、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡのレベルを減少させることができる核酸分子に関する。本発明はまた、薬学的組成物、及び神経疾患の治療におけるその使用も含む。
補体系は、食細胞による微生物又は損傷細胞の除去を促進するとともに、炎症を促進する、自然免疫系の一部である。補体系は、シナプス除去を仲介する補体系の古典的経路とともに、脳内のシナプス剪定にも関与している。このプロセスには、補体成分１（Ｃ１）複合体（Ｃ１Ｑ、Ｃ１Ｓ、及びＣ１Ｒからなる）による古典的経路の開始が関与しており、補体成分２（Ｃ２）及び補体成分４（Ｃ４）の切断につながり、補体成分３（Ｃ３）の切断とミクログリア細胞によるシナプスの貪食が続く。発達初期における正常な脳回路の精緻化における役割を超えて、古典的補体経路の異常な活動が、さまざまな神経疾患におけるシナプス損失と神経変性を媒介できることが十分に確立されている。患者サンプルにおける補体レベルの上昇と、マウスモデルにおける補体成分の減少又は排除の有益な効果の観察により、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、ウイルス誘発性認知障害、緑内障、黄斑変性症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、中枢神経系エリテマトーデス及び統合失調症を含む状態における補体の有害な役割が同定された。
そのような状態に対処するための治療剤及び予後薬剤が当該技術分野で依然として必要とされている。本発明は、これらの及び他のニーズを満たすものである。
発明の目的
本発明は、補体成分１Ｒ（Ｃ１Ｒ）発現の下方調節のための、並びに神経疾患における予防的及び治療的介入のための、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で使用され得るＣ１Ｒの核酸阻害剤を提供する。本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣ１Ｒの発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、新規の核酸分子をさらに同定する。
本発明は、核酸を標的とするとともに、例えばＣ１Ｒの機能に関連する疾患を治療又は予防するのに有用なＣ１Ｒの発現を調節することができる、オリゴヌクレオチドに関する。
したがって、第１の態様では、本発明は、タウオパチー又は統合失調症などの神経疾患の治療及び／又は予防における使用のためのＣ１Ｒ阻害剤、特に、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ及び／又はＣ１Ｒタンパク質などのＣ１Ｒの量を減少させることができるＣ１Ｒ阻害剤を提供する。そのような阻害剤は、有利には、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡを減少させることができる、１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子である。
さらなる態様では、本発明は、哺乳動物Ｃ１Ｒ、例えば、ヒトＣ１Ｒ、マウスＣ１ｒａ、Ｃ１ｒｂ又はカニクイザルＣ１Ｒに少なくとも９０％相補的な、例えば、９０～９５％、９５～９８％、又は完全に相補的な、少なくとも１０ヌクレオチド、特に１６～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む１２～６０ヌクレオチド、例えば１２～３０ヌクレオチドの核酸分子に関する。そのような核酸分子は、Ｃ１Ｒを発現する細胞におけるＣ１Ｒの発現を阻害することができる。Ｃ１Ｒの阻害は、細胞中に存在するＣ１Ｒタンパク質の量の減少を可能にする。核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、又はｓｈＲＮＡ核酸分子（特に化学的に生成されたｓｈＲＮＡ分子）から選択することができる。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１Ｒの発現及び／又は活性を阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡに関する。特に、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡを減少させる１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシド及び１つ又は複数のホスホロチオエート結合を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド又は修飾ｓｉＲＮＡが有利である。
さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡなどの本発明のＣ１Ｒ阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のＣ１Ｒ阻害剤、例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物を有効量で標的細胞に投与することによって、Ｃ１Ｒを発現している前記細胞におけるＣ１Ｒ発現のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ調節のための方法を提供する。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒ発現は、治療なしのレベル又は対照で治療されたレベルと比較して、標的細胞中で、少なくとも５０％、例えば５０～６０％；又は少なくとも６０％、例えば６０～７０％；又は少なくとも７０％、例えば７０～８０％；又は少なくとも８０％、例えば８０～９０％；又は少なくとも９０％、例えば９０～９５％減少する。
さらなる態様では、本発明は、Ｃ１Ｒのｉｎ ｖｉｖｏ活性に関連する疾患、障害、又は機能障害を治療又は予防するための方法であって、該疾患、障害、又は機能障害に罹患する又は罹りやすい対象に、治療的又は予防的に有効量の本発明のＣ１Ｒ阻害剤、例えば本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを投与することを含む、方法を提供する。
定義
化合物
本明細書では、本発明の化合物に関する「化合物」という用語は、Ｃ１Ｒ発現又は活性を阻害することができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明に係るＲＮＡｉ分子若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、Ｃ１Ｒを標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施態様では、本明細書の化合物は、「阻害剤」又は「Ｃ１Ｒ阻害剤」とも呼ばれる。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。オリゴヌクレオチドは、本明細書では「核酸」又は「核酸分子」とも呼ばれる。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも呼ばれる場合がある。明細書及び特許請求の範囲に記載するオリゴヌクレオチドは、概して、７０ヌクレオチド長未満の治療用オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得るか若しくはそれを含み得、又は例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー若しくはリボザイムなどの別の核酸分子であり得る。治療的オリゴヌクレオチド分子は、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって、研究室内で作製される。ｓｈＲＮＡは、多くの場合、レンチウイルスベクターを用いて細胞に送達され、次いで転写されて一本鎖ＲＮＡを生成し、これにより、ＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含む）と相互作用することができるステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造が形成されることになる。本発明の一実施態様では、ｓｈＲＮＡは、化学的に生成されたｓｈＲＮＡ分子である（プラスミド又はウイルスからの細胞ベースの発現に依存しない）。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。概して、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。しかしながら、いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは標的細胞への侵入時にベクターから転写されるｓｈＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドという用語は、その薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、及びプロドラッグも含む。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～７０ヌクレオチド長、例えば１２～６０、例えば１３～５０、例えば１４～４０、例えば１５～３０、例えば１６～２５、例えば１６～２２、例えば１６～２０連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、１２～２５ヌクレオチドの長さを有し得る。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの態様では、１５～２１ヌクレオチドの長さを有し得る。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２４以下のヌクレオチド、例えば２２、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１のヌクレオチドを含むか又はそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、核酸分子が１５～２０ヌクレオチドを含むと記される場合、１５ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長の両方が含まれる。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。
オリゴヌクレオチドは、哺乳動物又は哺乳動物細胞中の標的核酸の発現を調節することができる。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、標的核酸の発現を阻害する。
本発明の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨと相互作用する高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
オリゴヌクレオチドのライブラリは、異なるオリゴヌクレオチドのコレクションとして理解されるべきである。オリゴヌクレオチドのライブラリの目的は様々であり得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、オリゴヌクレオチドのライブラリ内で強力な配列、例えば最も強力な配列を同定する目的で設計された、１つ又は複数の哺乳動物Ｃ１Ｒ標的核酸を標的とする重複する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、親又は先祖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド設計バリアント（子核酸分子）のライブラリであって、ここで、オリゴヌクレオチド設計バリアントは親核酸分子のコア核酸塩基配列、例えば親の保存配列を保持する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」という用語は、例えば対応する標的遺伝子の発現を調節するために、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとして定義される。概して、本発明の核酸分子はアンチセンス核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである必要はない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である場合、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
有利には、いくつかの実施態様では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるためＲＮＡヌクレオシドを含まない。
有利には、いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドのいくつか、大部分、又はすべては、ＤＮＡヌクレオシドであること、例えば、修飾されていないヌクレオシドの５０％、７５％、９５％、又は１００％はＤＮＡヌクレオシドであることが有利である。
ＲＮＡｉ分子
本明細書では、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」という用語は、ＲＮＡヌクレオシドを含有するとともに、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する短い二本鎖オリゴヌクレオチドを指し、触媒的ＲＩＳＣ成分のアルゴナウトと相互作用する。ＲＮＡｉ分子は、細胞、例えば哺乳動物対象などの対象内の細胞における標的核酸の発現を調節、例えば阻害する。ＲＮＡｉ分子には、一本鎖ＲＮＡｉ分子（Ｌｉｍａ ａｔ ａｌ ２０１２ Ｃｅｌｌ １５０：８８３）及び二本鎖ｓｉＲＮＡ、並びに短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本発明のいくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤である。
ｓｉＲＮＡ
「低分子干渉リボ核酸」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は、概してｍＲＮＡの発現を干渉する低分子干渉リボ核酸ＲＮＡｉ分子を指す。この用語は、二本鎖ＲＮＡ分子の一種であり、当該技術分野においては、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られている。ｓｉＲＮＡは典型的には、（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）センス鎖、及び（ガイド鎖とも呼ばれる）アンチセンス鎖を含み、一方又は両方の鎖は１７～３０ヌクレオチド長、典型的には１９～２５ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖は、標的核酸（好適には成熟ｍＲＮＡ配列）に相補的、例えば少なくとも９０％、例えば９０～９５％相補的であり、又は例えば完全に相補的であり、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的であるため、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖、又は二本鎖領域を形成する。ｓｉＲＮＡ鎖は、平滑末端の二重鎖を形成し得るか、又は有利には、センス及び／又はアンチセンス鎖の ３’末端は、例えば、１、２、若しくは３のヌクレオシドの３’オーバーハングを形成し得（例えば、Ｄｉｃｅｒによって生成される生成物に類似する）、これはｉｎ ｖｉｖｏでＲＩＳＣ基質を形成する。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。いくつかの実施態様では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２ｎｔ ３’オーバーハングを有する。したがって、二重鎖領域は、例えば１７～２５ヌクレオチド長、例えば２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
一旦細胞内に入ると、アンチセンス鎖は、標的核酸の標的分解又は標的阻害を媒介するＲＩＳＣ複合体に組み込まれ得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡヌクレオシドに加えて修飾ヌクレオシドを含む。一実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子はまた、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。特に、２’フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又は２’－Ｏ－メトキシエチルをｓｉＲＮＡに組み込むことができる。
いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡセンス（パッセンジャー）鎖のヌクレオチドのいくつか、大部分、又はすべて（例えば、７５～９０％、８０～９５％、又は１００％）は、ＬＮＡなどの２’糖修飾ヌクレオシドで修飾され得る（例えば、国際公開第２００４／０８３４３０号及び同第２００７／０８５４８５号を参照されたい）。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は不連続であり得る（例えば、国際公開第２００７／１０７１６２号を参照されたい）。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のシード領域での熱不安定化ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのオフターゲット活性の減少に有用である（例えば、国際公開第２０１８／０９８３２８号を参照されたい）。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に５’リン酸基又は５’リン酸模倣物を含む。いくつかの実施態様では、アンチセンス鎖の５’末端は、ＲＮＡヌクレオシドである。
一実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートのヌクレオシド間結合をさらに含む。ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｉｅ）又はメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、一方又は両方の鎖の３’末端にあり得（例えば、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖）；又はホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、一方又は両方の鎖の５’末端にあり得（例えば、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖）；又はホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、一方又は両方の鎖の５’及び３’末端の両方にあり得る（例えば、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖）。いくつかの実施態様では、残りのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ｓｉＲＮＡ分子では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を減少させ得るか又は阻害し得る。したがって、いくつかの実施態様では、アンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオシド間結合が修飾されているわけではなく、例えば、いくつかの実施態様では、ヌクレオシド間結合の１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は４０～６０％が修飾されている。
ｓｉＲＮＡ分子は、リガンドをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
生物学的分布については、ｓｉＲＮＡを標的リガンドに結合させるか、及び／又は脂質ナノ粒子に製剤化することができる。特定の例では、核酸分子は、脳細胞又はＣＮＳの他の細胞を標的とする部分にコンジュゲートされる。よって、核酸分子は、血液脳関門全体への送達を容易にする部分にコンジュゲートされ得る。例えば、核酸分子は、トランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片にコンジュゲートされ得る。
本発明の他の態様は、薬学的組成物、特に、治療的使用に適したｓｉＲＮＡ分子といった、ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物と、例えば本明細書に開示されている種々の疾患状態の治療のために、本発明のｓｉＲＮＡといったｄｓＲＮＡ分子を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法とに関する。
ｓｈＲＮＡ
「短ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、概して４０個と７０個の間のヌクレオチド長、例えば４５個と６５個の間のヌクレオチド長、例えば５０個と６０個の間のヌクレオチド長であり、ステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成する分子を指し、これは、Ｄｉｃｅｒ（特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡをプロセシングし、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ得ると考えられる）として既知のエンドヌクレアーゼと相互作用することができる。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。いくつかの実施態様では、ｓｈＲＮＡ分子は、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ＲＮＡｉ分子では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を減少させ得るか又は阻害し得る。したがって、ｓｈＲＮＡ分子のステムループにおけるすべてのヌクレオシド間結合が修飾されているわけではなく、例えば、いくつかの実施態様では、ヌクレオシド間結合の１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は４０～６０％が修飾されている。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ｓｈＲＮＡ分子のステムループの３’及び／又は５’末端、特に標的核酸に相補的ではない分子の部分に有利に配置され得る。標的核酸に相補的なｓｈＲＮＡ分子の領域は、しかしながら、例えば、Ｄｉｃｅｒによる切断後に３’末端及び／又は５’末端になると予測される部分における最初の２～３個のヌクレオシド間結合でもまた修飾され得る。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的な核酸分子の領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖に含まれる。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して９５％、９８％、９９％、又は１００％相補的であるｓｈＲＮＡ分子の一部である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基（例えば、標的化のためのコンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して１００％相補的である。
ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。
修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシドの１つ又は複数は修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は「修飾ユニット」又は「修飾モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、例えば、２つのヌクレオシドを一緒に共有結合するホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合であるとして当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１つ又は複数のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
本発明のオリゴヌクレオチドでは、例えばヌクレオシド間結合の１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は４０～６０％に対して、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を使用することが有利であり得る。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さに起因して、特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の、例えば少なくとも６０％、例えば６０～８０％；例えば少なくとも７０％、例えば７０～８５％；例えば少なくとも７５％、例えば７５～９０％；例えば少なくとも８０％、例えば８０～９５％；又は例えば少なくとも９０％、例えば９０～９９％は、ホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオエートである。
いくつかの有利な実施態様では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えば、他のＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域で許容され得る（例えば、ＥＰ２７４２１３５にあるように）アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含み得る。
核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なっていてもよいが核酸ハイブリダイゼーション中に機能する、修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
いくつかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチル シトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル ５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変化させることにより、修飾される。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
修飾オリゴヌクレオチド
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合及び／又は修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
相補性
「相補性」又は「相補的」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
本明細書で使用される「％相補的」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成する２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）を指すと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）の観点から説明される。生理学的条件では、Ｔｍは、親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ， ２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応では、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９６５， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．に記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５： １４６０－１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによって核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内の推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物Ｃ１Ｒをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、Ｃ１Ｒ標的核酸と称することができる。
本発明の治療用オリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物Ｃ１Ｒのエクソン領域（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡであるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもある）を標的とすることができるか、又は例えば、Ｃ１ＲプレｍＲＮＡ（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の任意のイントロン領域を標的とすることができる。
表１ａは、配列番号３、すなわちヒトＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列の予測エクソン及びイントロン領域を列挙する。
表１ａ．ヒトＣ１ＲプレｍＲＮＡ中のエクソン及びイントロン。
Figure 2023527693000001
いくつかの実施態様では、標的核酸は、Ｃ１Ｒタンパク質、特に哺乳動物Ｃ１Ｒタンパク質、例えばヒトＣ１Ｒタンパク質をコードする。例えば、表２及び表３を参照すること。これらは、ヒト、カニクイザル、及びマウスＣ１Ｒ（表２）のゲノム配列並びにヒト、サル、及びマウスＣ１ＲのプレｍＲＮＡ配列並びにヒトＣ１Ｒの成熟ｍＲＮＡ（表３）の概要を提供する。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、５、及び６、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物Ｃ１Ｒをコードする配列）からなる群から選択される。
表２．種にわたるＣ１Ｒに関するゲノム及びアセンブリ情報。
Figure 2023527693000002
本発明の核酸分子を研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ用途に関して、本発明の治療用核酸分子は、典型的には、Ｃ１Ｒ標的核酸を発現する細胞内で、Ｃ１Ｒ標的核酸の発現を阻害することができる。本発明の核酸分子の核酸塩基の連続配列は、場合によって１つ又は２つのミスマッチを除いて、核酸分子の長さにわたって測定される場合、典型的には、Ｃ１Ｒ標的核酸の保存領域に相補的である。いくつかの実施態様において、標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡ、例えば、マウスＣ１ｒａなどの哺乳動物Ｃ１Ｒタンパク質をコードするプレｍＲＮＡ、例えば、配列番号１として開示されているものなどのマウスＣ１ｒａプレｍＲＮＡ配列、配列番号３として開示されているものなどのヒトＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列、配列番号４として開示されているものなどカニクイザルＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列、又は配列番号６として開示されているヒト成熟ｍＲＮＡなどの成熟Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡである。いくつかの実施態様において、標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡ、例えば、マウスＣ１ｒｂなどの哺乳動物Ｃ１Ｒタンパク質をコードするプレｍＲＮＡ、例えば、配列番号２として開示されているものなどのマウスＣ１ｒｂプレｍＲＮＡ配列、配列番号３として開示されているものなどのヒトＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列、配列番号５として開示されているものなどカニクイザルＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列、又は配列番号６として開示されているヒト成熟ｍＲＮＡなどの成熟Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡである。配列番号１、２、３、４、５、及び６はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。
上記配列の異なる、すなわちより短いアノテーションが付けられたｍＲＮＡアイソフォームが存在することが知られている。アイソフォームは当該技術分野でよく知られており、既知の配列データベースから導出することができる。
例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表２及び３に提供される。
表３．標的核酸の概要。
Figure 2023527693000003
注：配列番号３、５、及び６は、配列決定が配列を正確に精製することができず、したがって縮重配列が含まれる、複数のＮＮＮＮの領域を含む。疑いを避けるため、本発明の化合物は実際の標的配列に相補的であり、したがって、縮重化合物ではない。いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、複数のＮＮＮＮを含む領域に結合しない。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号１である。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号２である。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号３である。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号４である。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号５である。
いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号６である。
標的
本明細書で使用される「標的」という用語は、補体Ｃ１ｒサブコンポーネント（Ｃ１Ｒ）を指し、これは、本開示の文脈ではＣ１Ｒであり得る。Ｃ１Ｒは、補体Ｃ１ｒとも呼ばれる。さらに、「標的」という用語は、Ｃ１Ｒ標的核酸、及びＣ１Ｒタンパク質を指すこともできる。
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子に相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域を含むか、又はそれからなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施態様では、標的配列は、本発明の核酸分子の相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかの核酸分子により標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。当該技術分野では、Ｃ１Ｒ遺伝子は、個体間で高レベルの可変性を示すことがよく知られている。「標的配列」という用語は、Ｃ１Ｒの公にアノテーション付けられたすべてのバリアントを包含する。
いくつかの実施態様では、標的配列は、ヒトＣ１Ｒ ｍＲＮＡエクソン、例えばＥａ１～Ｅａ１１からなる群から選択されるヒトＣ１Ｒ ｍＲＮＡエクソンからなる群から選択される配列である（例えば上記の表１ａ参照）。
したがって、本発明は、Ｅａ１～Ｅａ１１（表１ａ参照）からなる群から選択される配列番号３のエクソン領域に少なくとも９０％相補的、例えば９０～９５％又は完全に相補的な連続配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施態様では、標的配列は、ヒトＣ１Ｒ ｍＲＮＡエクソン、例えばＩａ１～Ｉａ１０からなる群から選択されるヒトＣ１Ｒ ｍＲＮＡイントロンからなる群から選択される配列である（例えば上記の表１ａ参照）。
したがって、本発明は、Ｉａ１～Ｉａ１０（表１ａ参照）からなる群から選択される配列番号３のイントロン領域に少なくとも９０％相補的、例えば９０～９５％又は完全に相補的な連続配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施態様では、標的配列は、配列番号６である。いくつかの実施態様では、本明細書で言及される連続ヌクレオチド配列は、配列番号６の標的配列に少なくとも９０％（例えば９０～９５％）相補的、例えば少なくとも９５％（例えば９５～９８）相補的である。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号６の標的配列に対して完全に相補的である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸上の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
オリゴヌクレオチドが相補的であるか又はハイブリダイズする標的核酸配列は、概して、少なくとも１０ヌクレオチドの連続する核酸塩基のストレッチを含む。連続ヌクレオチド配列は、１２個と７０個の間のヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１５～２０、例えば１６～２１連続ヌクレオチドである。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、表４ａに示される領域を標的とする。
表４ａ：配列番号３の例示的な標的領域
Figure 2023527693000004
Figure 2023527693000005
Figure 2023527693000006
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。本発明の治療的使用のためには、標的細胞が脳細胞である場合が有利である。いくつかの実施態様では、脳細胞は、ニューロン及びミクログリア細胞からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｒｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、若しくはウッドチャック細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞（例えば、カニクイザル細胞）若しくはヒト細胞である。
いくつかの実施態様では、標的細胞は、Ｃ１ＲプレｍＲＮＡ又はＣ１Ｒ成熟ｍＲＮＡなどのＣ１Ｒ ｍＲＮＡを発現する。Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
天然に存在するバリアント
「天然に存在するバリアント」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、若しくは多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＣ１Ｒ 遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドの十分に相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物Ｃ１Ｒ標的核酸、例えば配列番号３及び／又は配列番号４に対して少なくとも９５％（例えば９５～９８％）、例えば少なくとも９８％（例えば９８～９９％）、又は少なくとも９９％（例えば９９～１００％）相同性同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、配列番号３のヒトＣ１Ｒ標的核酸に対して少なくとも９９％（例えば９９～１００％）相同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物Ｃ１Ｒ標的核酸、例えば配列番号３及び／又は配列番号５に対して少なくとも９５％（例えば９５～９８％）、例えば少なくとも９８％（例えば９８～９９％）、又は少なくとも９９％（例えば９９～１００％）相同性同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在するバリアントは、既知の多型である。
発現の阻害
本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、標的細胞においてＣ１Ｒの量又は活性を阻害するＣ１Ｒ阻害剤の能力の全体的な用語として理解されるべきである。発現又は活性の阻害は、Ｃ１ＲプレｍＲＮＡ若しくはＣ１Ｒ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＣ１Ｒタンパク質若しくは活性のレベルを測定することによって決定され得る。発現の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで決定され得る。阻害は、対照を参照することによって決定される。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体又は標的細胞であることが一般に理解されている。
「阻害剤」、「阻害」又は「阻害する」という用語は、Ｃ１Ｒの量、発現、及び／又は活性を下方調節する、減少させる、抑制する、減らす、低下させる、又は低減させるとも呼ばれ得る。
Ｃ１Ｒの発現の阻害は、例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの分解によって、例えばＲＮＡ干渉経路を介して機能するギャップマー又は核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを動員するＲＮａｓｅ Ｈを使用して起こり得る。あるいは、本発明の阻害剤は、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ又はポリペプチドに結合し、Ｃ１Ｒの活性を阻害するか、又は他の分子へのその結合を妨げ得る。
いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒ標的核酸の発現の阻害は、標的細胞中のＣ１Ｒタンパク質の量の低減をもたらす。好ましくは、Ｃ１Ｒタンパク質の量は、対照と比較して低減する。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒタンパク質の量の低減は、対照と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％である。いくつかの実施態様では、対象と比較したとき、標的細胞中のＣ１Ｒタンパク質の量は、少なくとも５０％、例えば５０～６０％、又は少なくとも６０％、例えば６０～７０％、又は少なくとも７０％、例えば７０～８０％、少なくとも８０％、例えば８０～９０％、又は少なくとも９０％、例えば９０～９５％減少する。
糖修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含み得る。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
そのような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。
糖修飾には、リボース環上の１つ又は複数の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドに自然に見られる２’－ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。
高親和性修飾ヌクレオシド
「高親和性修飾ヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合に、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定された、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃の範囲内、より好ましくは＋１．５～＋１０℃の範囲内、最も好ましくは＋３～＋８℃の範囲内の融解温度の上昇をもたらす。多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３参照）。
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２， １９， ９３７を参照のこと。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
Figure 2023527693000007
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２， ７３－７６， Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１０， Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ． １５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５?９６６７に開示されている。
本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例がスキーム１に示されている（ここで、Ｂは上記定義されたとおりである）。
スキーム１：
Figure 2023527693000008
本発明の分子における使用のための特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供している。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に援用される）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％～１５％、又は２０％超、例えば２０～２５％。又は２０～３０％を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１）から入手できる。
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に用いられる。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－隣接、ギャップ、及び３’－隣接、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を、‘５－＞３’配向において含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員するのを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）により、及び一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）により、隣接される。領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める（すなわち、親和性を高める糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。
ギャップマー設計において、ギャップ領域の５’及び３’末端のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。隣接はさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’隣接の５’末端及び３’隣接の３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２から３２ヌクレオシド、例えば１３から２４、例えば１４から２２ヌクレオシド、例えば１５から２１ヌクレオシドであり得る。
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば、
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、１２～１５ヌクレオチド長）、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長（例えば、１４～２０ヌクレオチド長）である。
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’は、独立して１～８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち１～４個は２’糖修飾され、それぞれＦ及びＦ’領域の５’及び３’末端を画定し、Ｇは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６～１６個のヌクレオシドの領域である。
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’は、独立して１～８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち１～４個は２’糖修飾され、それぞれＦ及びＦ’領域の５’及び３’末端を画定し、Ｇは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６個と１８個の間のヌクレオシドの領域である。いくつかの実施態様では、Ｇ領域はＤＮＡヌクレオシドからなる。
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか又はそれを含む。いくつかの実施態様では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択され得る。
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、ＬＮＡと２’置換糖修飾ヌクレオチドの両方を含む（混合ウィング設計）。いくつかの実施態様では、２’置換糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドは、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。このような実施態様では、隣接領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦとＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここで、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
ＬＮＡギャップマー
「ＬＮＡギャップマー」は、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方がＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれらからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方がベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれからなるギャップマーである。
いくつかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１－５－［領域Ｇ］６－１８－［ＬＮＡ］１－５であり、式中、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義で定義したとおりである。
ＭＯＥギャップマー
「ＭＯＥギャップマー」は、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥ（メトキシエチル）ヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施態様では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］５－１６－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］６－１４－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］８－１２－［ＭＯＥ］３－６、例えば［ＭＯＥ］５－［領域Ｇ］１０－［ＭＯＥ］ ５ のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義で定義したとおりである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’を含むか又はそれらからなってもよく、さらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含んでもよい。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ”と称され得る。
領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。
領域Ｄ’及びＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むか又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。いくつかの実施態様では、Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこれらの塩基修飾型ではない。Ｄ’又はＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施態様では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に適したヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、例えば、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式のうちの１つ又は複数により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１－８－Ｇ５－１８－Ｆ’２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１８－Ｆ’２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１－８－Ｇ５－１８－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１８－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
いくつかの実施態様では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
治療
本明細書で使用される「治療」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。予防は、対象が最終的に疾患に陥った場合、疾患発症の可能性を遅延若しくは減少させること、疾患再発の頻度を遅延若しくは減少させること、及び／又は疾患の重症度若しくは持続期間を減少させることも含む。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施態様では、予防的であり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施態様では、治療は、補体介在性神経疾患、例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、ウイルス性認知障害、緑内障、黄斑変性症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、中枢神経系エリテマトーデス、及び統合失調症からなる群より選択される神経疾患を有すると診断された患者に実施される。いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、アルツハイマー病などのタウオパチーの治療に使用するためのものである。いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、統合失調症の治療に使用するためのものである。
患者
本発明の目的について、「対象」（又は「患者」）は、脊椎動物であり得る。本発明に関連して、用語「対象」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳動物と、他の生物との両方を含む。したがって、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、ヒトである。
本明細書の他の箇所で記載されるように、治療される患者は、神経疾患又は神経変性障害に罹患してもよく、又は罹りやすくてもよい。疾患又は障害に「罹りやすい」患者は、疾患又は障害の素因がある患者及び／又はそうでなければ疾患又は障害の発症又は再発するリスクがある患者である。罹りやすい患者は、患者が予防的治療又は介入から利益を得る程度まで、疾患又は障害を発症する可能性が高いと理解することができる。
「神経疾患」とは、神経系の疾患又は障害を意味し、がんに関連する神経症状、及び神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。
「神経変性疾患」とは、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、ウイルス性認知障害、緑内障、黄斑変性症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、中枢神経系エリテマトーデス、統合失調症を含むが、これらに限定されない疾患を意味する。いくつかの実施態様では、治療される患者は、アルツハイマー病などのタウオパチーに罹患する。いくつかの実施態様では、治療される患者は、統合失調症に罹患する。
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）又は「アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）」とも呼ばれるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＤ）は、慢性的な神経変性障害であり、典型的には、進行性の認知機能の低下、並びに記憶喪失の増加、言語、判断、及び／又は問題解決の問題を特徴とし、日常業務を遂行できなくなり、最終的には認知症に至る可能性がある。
シナプス除去及びニューロン損傷は、Ｃ１の活性化によって開始される補体系の古典的経路によって媒介される可能性があり、Ｃ２及びＣ４の切断につながり、さらにはＣ３の切断につながり、食作用及び炎症、さらに下流の補体の活性化を引き起こす可能性がある。補体Ｃ１ｒサブコンポーネント（Ｃ１Ｒ）は、補体系に関与しているタンパク質である。
Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｑ、及びＣ１Ｓは、Ｃ１複合体を形成し、これは、血清補体系の第１の成分である。Ｃ１Ｒは、タンパク質分解切断によってＣ１Ｓをその活性型に活性化するセリンプロテアーゼである。タンパク質分解切断の後、Ｃ１Ｓは、Ｃ２及びＣ４を活性化し、これはＣ３の切断につながる。
本発明に関連して、発明者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子がＣ１Ｒの発現を阻害することを示した。Ｃ１Ｒの発現の減少は、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ４、及びＣ３の切断の減少につながる可能性があり、よって、ミクログリア細胞によるシナプスの貪食及び補体活性化の他の有害な影響の減少につながり得る。
本発明の一態様は、神経疾患、特にタウオパチー及び統合失調症から選択される神経疾患の治療及び／又は予防における使用のためのＣ１Ｒ阻害剤である。いくつかの実施態様では、タウオパチーは、アルツハイマー病である。Ｃ１Ｒ阻害剤は、例えばＣ１Ｒタンパク質に特異的に結合する小分子であり得る。ここで、前記阻害剤は、Ｃ１Ｓタンパク質の切断を防止又は減少させる。
本発明の実施態様は、Ｃ１Ｒ阻害剤であり、これは、Ｃ１Ｒタンパク質の発現を防止又は減少させることができ、それによりＣ１Ｓの切断の減少につながる。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒ阻害剤は、ミクログリア細胞によるシナプスの貪食の阻害につながる。
神経疾患の治療における使用のためのＣ１Ｒ阻害剤
理論に拘束されることなく、Ｃ１ＲはＣ１Ｓの切断に関与しており、これは（Ｃ２及びＣ４の切断を介した）Ｃ３の切断につながり得ると考えられる。したがって、Ｃ１Ｒは、ミクログリア細胞によるシナプスの貪食に関与すると考えられる。
本発明のいくつかの実施態様では、阻害剤は、抗体、抗体断片又は小分子化合物である。いくつかの実施態様では、阻害剤は、Ｃ１Ｒタンパク質に特異的に結合する、抗体、抗体断片、又は小分子であり得る。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒタンパク質は、配列番号３、４、５、及び６からなる配列によってコードされる。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒタンパク質は、配列番号６からなる配列によってコードされる。
本発明の核酸分子
治療用核酸分子は、潜在的に優れたＣ１Ｒ阻害剤であるが、それは、治療用核酸分子が、Ｃ１Ｒ転写物を標的とするとともに、例えばＲＮＡ干渉経路又はＲＮａｓｅ Ｈ切断のいずれかを介してそれらの分解を促進することができるためである。あるいは、アプタマーなどのオリゴヌクレオチドもまた、Ｃ１Ｒタンパク質の阻害剤として作用し得る。
本発明の一態様は、神経疾患の治療及び／又は予防における使用のためのＣ１Ｒ標的化核酸分子である。このような核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択され得る。
このセクションは、神経疾患の治療及び／又は予防における使用に適した新規の核酸分子について記載する。いくつかの実施態様では、神経疾患は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、ウイルス性認知障害、緑内障、黄斑変性症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、中枢神経系エリテマトーデス、統合失調症からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、神経疾患はアルツハイマー病などのタウオパチーである。いくつかの実施態様では、神経疾患は統合失調症である。
本発明の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＣ１Ｒ ｍＲＮＡ及び／又はＣ１Ｒタンパク質の発現を阻害することができる。阻害は、Ｃ１Ｒタンパク質をコードする標的核酸にオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって達成され得る。いくつかの実施態様では、標的核酸は、哺乳動物Ｃ１Ｒ配列であり得る。いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号３の配列などのヒトＣ１ＲプレｍＲＮＡ配列、又は配列番号６などのヒト成熟Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施態様では、標的核酸は、哺乳動物Ｃ１Ｒ配列であり得る。いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号４又は５の配列などのカニクイザルＣ１Ｒ配列であり得る。
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、標的の発現を阻害又は下方調節することにより、それを調節することができる。好ましくは、このような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して、少なくとも２０％（例えば２０～３０％）の阻害をもたらし、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して、少なくとも３０％（例えば３０～４０％）、少なくとも４０％（例えば４０～５０％）、又は少なくとも５０％（例えば５０～６０％）の阻害をもたらす。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、トランスフェクション用に２０～５０ｎＭの核酸分子を使用して、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも（例えば５０～６０％）又は６０％（例えば５０～６０％）阻害することができる場合がある。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、ｇｙｍｎｏｓｉｓ用に５０～３５０ｎＭの核酸分子を使用して、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％（例えば５０～６０％）又は６０％（例えば５０～６０％）阻害することができる場合がある。適切には、実施例は、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例１及び「材料及び方法」セクション）。Ｃ１Ｒ阻害は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップマー領域などのオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、Ｃ１Ｒ発現の所望の阻害を示すのに尚充分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
本発明の一態様は、１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子であって、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば少なくとも１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、哺乳動物Ｃ１Ｒ標的核酸、特にヒトＣ１Ｒ ｍＲＮＡに対して少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、核酸分子に関する。これらの核酸分子は、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ及び／又はＣ１Ｒタンパク質の発現を阻害することができる。
本発明の一態様は、哺乳動物のＣ１Ｒ標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば１２～３０ヌクレオチド長、又は例えば１５～２１ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１２～３０ヌクレオチド長の核酸分子に関する。
本発明のさらなる態様は、配列番号３の標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、１４～２２、例えば１５～２１ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む本発明による核酸分子に関する。
いくつかの実施態様では、核酸分子は、１２～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域に対して、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。
オリゴヌクレオチド、若しくはその連続ヌクレオチド配列が、標的配列の領域に完全に相補的（１００％相補的）である、又は、いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に、１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合、有利である。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号３及び／又は配列番号６の標的配列の領域に１００％相補的である。
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号３の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号４及び５及び／又は配列番号６の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である。
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１及び２、及び／又は配列番号３、及び／又は配列番号４及び５の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補的、例えば完全に（又は１００％）相補的である。
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子の連続配列は、表４ａに示す標的領域１Ａ～３７４Ａからなる群から選択される配列番号３の領域に少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、１２～６０ヌクレオチド長、例えば１３～５０、例えば１４～３５、例えば１５～３０、例えば１５～２１連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。好ましい実施態様では、核酸分子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２１ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施態様では、標的核酸に相補的である核酸分子の連続ヌクレオチド配列は、１２～３０、例えば１３～２５、例えば１５～２１連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、標的配列に相補的であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの連続ヌクレオチド配列は、１８～２８、例えば１９～２６、例えば２０～２４、例えば２１～２３連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施態様では、標的核酸に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２～２２、例えば１４～２１、例えば１５～２１、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表８（材料及び方法セクション）に列挙された配列からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる。
連続オリゴヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオシド及びＲＮＡヌクレオシド（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子）又はＤＮＡヌクレオシド（特に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いて設計することができる。
有利な実施態様では、核酸分子又は連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含み、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の最も３’側のヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドである。
さらなる実施態様では、核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間修飾は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。
有利には、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートなどの少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル・ヌクレオシド間結合である。
オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端における少なくとも２～３個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である場合、有利である。
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドでは、連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えば７０～８０％、少なくとも９０％、例えば９０～９５％、又はすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である場合が有利である。いくつかの実施態様では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
本発明の有利な実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することができる。有利な構造設計は、例えば、「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、及び「ＭＯＥギャップマー」の「定義」セクションに記載されているギャップマー設計である。本発明では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＦ－Ｇ－Ｆ’設計のギャップマーである場合が有利である。
いくつかの実施態様では、Ｆ－Ｇ－Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’」の「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又はＤ’’をさらに含み得る。
いくつかの実施態様では、本発明の阻害剤は、ＲＮＡ干渉のプロセスを誘導することができる（例えば国際公開第２０１４／０８９１２１号に記載される）。
製造方法
さらなる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、この方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、それにより、本発明の核酸分子による配列中のオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合連続ヌクレオチド単位を形成することを含む。好ましくは、この方法はホスホラミダイト化学を使用する（例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１５４巻， ２８７－３１３頁参照）。
製造されたオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように１つ又は複数の修飾を含み得る。例えば、製造されたオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合、及び／又は１つ又は複数の修飾核酸塩基を含み得る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法は、そのような修飾をオリゴヌクレオチドに導入することをさらに含み得る。
いくつかの実施態様では、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドに導入され得る。いくつかの実施態様では、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドが導入され得る。いくつかの実施態様では、１つ又は複数の高親和性修飾ヌクレオシド及び／又は１つ又は複数のＬＮＡヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに導入され得る。いくつかの実施態様では、本明細書の他の箇所に記載される領域Ｄ’及び／又はＤ’’が、オリゴヌクレオチドに加えられる。
さらなる態様では、本発明の薬学的組成物を製造するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、方法が提供される。
本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、その薬学的に許容される塩、エスエル、溶媒和物の形態で、又はプロドラッグの形態で、存在し得る。したがって、そのような形態の本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法が提供される。
薬学的な塩
本発明による化合物は、その薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。さらなる態様では、本発明は、核酸分子の薬学的に許容される塩、例えば薬学的に許容されるナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。例として、以下の塩が挙げられる：ナトリウム塩、カリウム塩、若しくはリチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩若しくはマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩と、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、若しくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機塩とを含むアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、若しくはヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、又はリン酸塩を含む無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、若しくはエタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩若しくはｐ－トルエンスルホン酸塩等のアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、又はマレイン酸塩等の有機酸塩；及びグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、若しくはアスパラギン酸塩等のアミノ酸塩。これらの塩は、既知の方法によって調製され得る。
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸分子の薬学的に許容される塩、例えば薬学的に許容されるナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
溶媒和物
本発明による化合物は、溶媒和物の形態で存在し得る。本明細書では、「溶媒和物」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドと、１つ又は複数の薬学的に許容される溶媒分子、例えばエタノール又は水とを含む分子錯体を説明するために使用される。溶媒が水である場合、溶媒和物は「水和物」である。本発明の意味内の薬学的に許容される溶媒和物は、水和物及び他の溶媒和物を含む。
プロドラッグ
さらに、本発明による化合物は、プロドラッグの形態で投与され得る。プロドラッグは、ｉｎ ｖｉｖｏで変換を受けて親活性薬物を生成する化合物と定義される。細胞膜は本質的に親油性であるため、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、中性又は親油性の等価物と比較してしばしば減少する。１つの解決策は、プロドラッグアプローチを使用することである（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ， Ｒ． Ｍ． （１９９８） ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ｖｏｌ． １３１， ｐｐ． １０３－１４０を参照のこと）。このようなプロドラッグの例には、限定されないが、アミド、エステル、カーバメート、カーボネート、ウレイド、及び、ホスフェートが含まれる。これらのプロドラッグは、既知の方法によって調製され得る。
薬学的組成物
さらなる態様では、本発明は、本発明の化合物のいずれか、特に前述の核酸分子又はその塩と、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、限定されないが、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。薬学的に許容される塩には、限定されないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝食塩水である。いくつかの実施態様では、核酸分子は、５０～３００μＭの溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３， １９９０）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、例えば、薬学的に許容される希釈剤、担体、及びアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供する（参照により本明細書に援用される）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤等もまた、例えば国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子、又はその薬学的に許容される塩は、粉末、例えば凍結乾燥粉末などの固体形態である。本発明の化合物又は核酸分子は、薬学的組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性物質と混合されてもよい。薬学的組成物の調製のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、又は滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３個と１１個の間、より好ましくは５個と９個の間又は６個と８個の間、最も好ましくは７個と８個の間、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は薬学的組成物は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、脳内、脳室内、眼内、又は髄腔内投与など）を介して投与することができる。
いくつかの実施態様では、投与は、例えば腰椎穿刺による、髄腔内投与を介する。
有利には、例えば神経障害の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチド又は薬学的組成物は、髄腔内又は頭蓋内に、例えば脳内又は脳室内投与を介して投与される。
本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩又は組成物などのオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用を提供する。
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である薬品の製造のための、本発明の薬学的塩又は組成物などの、本発明のオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用を提供する。
いくつかの実施態様では、治療的に又は予防的に有効な量の、本発明のオリゴヌクレオチド又は薬学的組成物が投与される。
送達プラットフォーム
標的組織へのオリゴヌクレオチドの送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子、細胞透過性ペプチド、及びミクロスフェアを含むがこれらに限定されない担体媒介送達によって増強され得る（例えば、Ｄａｓｓ， Ｃ Ｒ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００２； ５４（１）：３－２７を参照のこと）。
いくつかの実施態様では、本発明の阻害剤、例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、脳を標的とする。例えば、脳への送達は、トランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片など、血液脳関門を通過する送達を容易にする部分に前記阻害剤をコンジュゲートすることによって達成され得る。
併用療法
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子、核酸分子コンジュゲート、薬学的に許容される塩、又は薬学的組成物などの本発明の阻害剤は、別の治療剤との併用療法で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療薬であり得る。
例として、本発明の阻害剤は、ヌクレオチド配列依存性作用機序を通じて作用する配列特異的オリゴヌクレオチドベースの治療薬などのオリゴヌクレオチドベースの治療薬などの他の活性物質と組み合わせて使用され得る。
さらなる例として、本発明の阻害剤は、１つ又は複数のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び／又は１つ又は複数のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用され得る。コリンエステラーゼ阻害剤は、例えば、ドネペジル、タクリン、ガランタミン、又はリバスチグミンであり得る。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、例えば、メマンチンであり得る。
さらなる例として、本発明の阻害剤は、１つ又は複数の定型抗精神病薬及び／又は１つ又は複数の非定型抗精神病薬と組み合わせて使用され得る。定型抗精神病薬は、例えば、クロルプロマジン、フルフェナジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、チオリダジン、チオチキセン、又はトリフルオペラジンであり得る。非定型抗精神病薬は、例えば、アリピプラゾール、アリピプラゾールラウロキシル、アセナピン、ブレクスピプラゾール、カリプラジン、クロザピン、イロペリドン、トシル酸ルマテペロン、ルラシドン、オランザピン、パリペリドン、パルミチン酸アリペリドン、又はジプラシドンであり得る。
いくつかの実施態様では、本発明の阻害剤は、以下のうちの１つ又は複数と組み合わせて使用される：Ｃ９ＯＲＴ７２を標的とするアンチセンス化合物（例えば、国際公開第２０１４／０６２７３６号に記載されているようなもの）；Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９のうちの１つ又は複数の発現をブロックする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、又はｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００８／０４４９２８号に記載されているようなもの）；Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９のうちの１つ又は複数の活性をブロックする抗体（例えば、国際公開第２００８／０４４９２８号に記載されているようなもの）；補体カスケードの活性を低下させるアンチセンス又は二本鎖ＲＮＡ（例えば、国際公開第２００５／０６０６６７号に記載されているようなもの）；及び、例えばＣ１ｓのタンパク質分解活性を阻害するために、Ｃ１ｓに結合する抗体（例えば国際公開第２０１４／０６６７４４号に記載されているようなもの）。
いくつかの実施態様では、本発明の阻害剤は、補体Ｃ４又はＣ４のＣ４ｂ部分に結合する抗体（例えば、国際公開第２０１７／１９６９６９号に記載されているようなもの）と組み合わせて使用される。
いくつかの実施態様では、本発明の阻害剤は、「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題された、２０２０年５月１１日出願の米国仮特許出願及び「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ１Ｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ， Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ，」と題された、２０２０年５月１１日出願の米国仮特許出願に開示される１つ又は複数の核酸分子と組み合わせて使用される。
用途
本発明の核酸分子は、例えば、診断のため、並びに治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。
研究では、そのような核酸分子を使用して、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物）及び動物モデルにおけるＣ１Ｒタンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進し得る。典型的には、標的調節は、タンパク質に対応するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。
本発明の核酸分子を研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
検出又は診断方法
本発明にさらに包含されるものは、神経疾患を有すると疑われる患者における神経疾患を診断するための方法であって、
ａ）患者からのサンプル中の１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸、例えばＣ１Ｒ ｍＲＮＡ由来のＣ１ＲｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの量を決定する工程であって、決定がサンプルを本発明の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、Ｃ１Ｒ核酸の量を決定する工程と、
ｂ）工程ａ）において決定された量を基準量と比較する工程と、
ｃ）工程ｃ）の結果に基づいて、対象が神経疾患に罹患しているか否かを診断する工程と
を含む方法である。
いくつかの実施態様では、神経疾患を診断する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
「神経疾患」という用語は、本明細書の他の箇所で定義されている。この定義は適宜、適用される。いくつかの実施態様では、診断される神経疾患は、アルツハイマー病などのタウオパチーである。いくつかの実施態様では、診断される神経疾患は統合失調症である。
「サンプル」という用語は、体液のサンプル、分離された細胞のサンプル、又は組織若しくは器官由来のサンプルを指す。体液のサンプルは、周知の技術によって入手することができ、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、痰、腹水、唾液、涙液のサンプルを含む。いくつかの実施態様において、サンプルは、脳脊髄液サンプルである。
組織又は器官のサンプルは、例えば生検によって、任意の組織又は器官から入手し得る。いくつかの実施態様では、サンプルは、脳組織サンプル又は脊髄サンプル等の神経組織サンプルである。
いくつかの実施態様では、サンプルは、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、及び／又はミクログリア細胞を含む。
対象は哺乳動物であり得る。いくつかの実施態様では、対象はヒトである。いくつかの実施態様では、対象はヒトである。いくつかの実施態様では、対象はカニクイザルである。
上述の方法の工程ａ）では、サンプル中に存在するＣ１Ｒ核酸分子の量が決定されることになる。決定されるＣ１Ｒ核酸は、Ｃ１Ｒタンパク質をコードする核酸であることになる。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒ核酸は、哺乳動物Ｃ１Ｒ核酸である。いくつかの実施態様では、Ｃ１Ｒ核酸は、ヒトＣ１Ｒ核酸である。
Ｃ１Ｒ核酸は、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ配列であり得る。一実施態様では、核酸はＣ１Ｒ ｍＲＮＡである。別の実施態様では、Ｃ１Ｒ核酸は、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡである。
上述の方法の工程ｂ）では、Ｃ１Ｒ核酸の量は、基準、すなわち基準量と比較されることになる。「基準量」又は「基準」という用語は、当業者によく理解されている。適切な基準量は、原則として、統計学の標準的な方法を適用することによって、所定のバイオマーカーの平均又は平均値に基づいて、対象のコホートについて算出することができる。適切な基準によって、神経疾患の診断が可能になる。したがって、基準は、神経疾患に罹患している患者と神経疾患に罹患していない患者との差別化を可能にする。いくつかの実施態様では、基準は、所定値である。
いくつかの実施態様では、基準量より多い量は、神経疾患に罹患している患者を示すのに対して、基準量より少ない量は、神経疾患に罹患していない患者を示す。
工程ａ）における１つ又は複数の核酸の量の決定は、本発明の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させることを含むものとする。例えば、サンプルは、サンプル中に存在する１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸（Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡなど）への前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドと接触し、それにより、前記オリゴヌクレオチド及び前記Ｃ１Ｒ核酸の二本鎖を形成する。いくつかの実施態様では、１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸の量は、例えば検出可能なラベルを介して、形成された二本鎖の量を決定することによって、決定される。したがって、上記の方法に使用される１つ又は複数のオリゴヌクレオチドは、検出可能なラベルを含み得る。
サンプル中、例えば、上に定義されたサンプル中の１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸を検出するための方法が、本明細書にさらに包含される。この方法は、上記のように本発明の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドとサンプルを接触させることを含み得る。いくつかの実施態様では、サンプルは、神経疾患を有するか又は有すると疑われる患者由来である。
本発明はまた、Ｃ１Ｒを発現している標的細胞においてＣ１Ｒ発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、有効量の本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は薬学的組成物を前記細胞に投与することを含む方法も、包含する。
いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞であってよい。好ましい実施態様では、標的細胞は脳内に存在する。標的細胞は、脳細胞であり得る。いくつかの実施態様では、脳細胞は、ニューロン及びミクログリア細胞からなる群より選択される。
本発明の一態様は、医薬として使用するための本発明の核酸分子又は薬学的組成物に関する。
本発明の一態様では、本発明の核酸分子又は薬学的組成物などのＣ１Ｒ阻害剤は、Ｃ１Ｒを発現する細胞中のＣ１Ｒの量を減少させることができる。
例えば、Ｃ１Ｒ発現を阻害する核酸分子は、対照と比較して、影響が及んだ細胞中のＣ１Ｒタンパク質を、少なくとも５０％（例えば５０～６０％）、又は少なくとも６０％（例えば６０～７０％）、又は少なくとも７０％（例えば７０～８０％）、少なくとも８０％（例えば８０～９０％）、又は少なくとも９０％（例えば９０～９５％）減少させ得る。対照は、未処理の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物であり得る。
Ｃ１Ｒ発現の阻害は、例えば材料及び方法のセクションに記載されるように、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定され得る。
Ｃ１Ｒレベルの低減により、本発明の核酸分子又は薬学的組成物は、神経疾患の発症を阻害するために、又はその治療において使用することができる。
したがって、本発明の一態様は、神経疾患を有するか又はそれに罹りやすい個体におけるＣ１Ｒタンパク質を低減するための、本発明の核酸分子又は薬学的組成物などのＣ１Ｒ阻害剤の使用に関する。
本発明の核酸分子又は薬学的組成物などのＣ１Ｒ阻害剤で治療される対象（又は本発明の核酸分子又は薬学的組成物を予防的に受けるもの）は、好ましくはヒト、より好ましくは神経疾患を有するヒト患者、さらにより好ましくはタウオパチーを有するヒト患者、さらにより好ましくはアルツハイマー病を有するヒト患者である。いくつかの実施態様では、ヒト患者は統合失調症を有する。
したがって、本発明は、神経疾患を治療する方法であって、有効量の、本発明の核酸分子又は薬学的組成物などの、Ｃ１Ｒ阻害剤を投与することを含む、神経疾患を治療する方法に関する。本発明は、神経疾患を予防する方法にさらに関する。一実施態様では、本発明のＣ１Ｒ阻害剤は、神経疾患の治療を意図するものではなく、その予防のみを意図する。
いくつかの実施態様では、治療される対象は、心血管障害又は疾患（例えば国際公開第２０１４／０８９１２１号に記載されているようなもの）を有しない。いくつかの実施態様では、治療される対象は、痛みの治療（例えば国際公開第２００５／０６０６６７号に記載されているようなもの）を必要としない。
本発明はまた、医薬、特に神経疾患の治療における使用のための医薬の製造のための、本発明の核酸又は薬学的組成物などのＣ１Ｒ阻害剤の使用を提供する。好ましい実施態様では、医薬は、髄腔内又は頭蓋内投与用の剤形で製造される。
本発明はまた、医薬を製造するための本発明の核酸分子又は薬学的組成物の使用であって、医薬が静脈内投与のための剤形である、使用を提供する。
キット
本発明はまた、本発明の核酸分子又は薬学的組成物などの本発明のＣ１Ｒ阻害剤と、Ｃ１Ｒ阻害剤を投与するための指示書とを含むキットを提供する。指示書は、Ｃ１Ｒ阻害剤が、アルツハイマー病又は統合失調症などの本明細書で言及される神経疾患又は神経変性障害の治療のために使用され得ることを示し得る。
本明細書で使用される「キット」という用語は、本発明のＣ１Ｒ阻害剤を投与するための構成要素を含むパッケージ化された製品を指す。キットは、キットの構成要素を保持する箱又は容器を含み得る。キットはまた、本発明のＣ１Ｒ阻害剤を投与するための指示書も含むことができる。
材料及び方法
実施例１：初代マウス肝細胞におけるＣ１Ｒを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の試験
供給業者の推奨に従って、加湿インキュベーター内で細胞を維持した。ベンダー及び推奨される培養条件を表５に示す。
表５細胞培養の詳細
Figure 2023527693000009
アッセイでは、細胞を培養培地中の９６マルチウェルプレートに播種し、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に、表５に報告されているようにインキュベートした。細胞の細胞密度は表５に示す。
オリゴヌクレオチドを表７で示す濃度で添加した。オリゴヌクレオチドの添加の７２時間後に細胞を採取した（表５参照）。製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、２００μＬの水に溶出した。続いてＲＮＡを９０℃に１分間加熱した。
遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔＴＭ ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸＴＭ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲに使用されるプライマーアッセイは、標的及び内因性コントロールの両方について表６にまとめられている。
表６．ｑＰＣＲプライマープローブの詳細
Figure 2023527693000010
表７の相対的なマウスＣ１ｒａ及びマウスＣ１ｒｂ ｍＲＮＡ発現レベルは、コントロール（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示される。試験化合物についてのさらなる情報は表８で見出すことができる。
表７．ｍＲＮＡ発現レベル（ＰＭＳ処理細胞の％）
Figure 2023527693000011
表７から、Ｃ１Ｒプールは、異なる濃度で効率的にＣ１Ｒ ｍＲＮＡを減少させることができることが分かる。
本発明は、以下のオリゴヌクレオチド化合物を提供する（表８）：
表８オリゴヌクレオチド化合物
Figure 2023527693000012
Figure 2023527693000013
表中、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

Claims (34)

  1. 神経疾患の治療における使用のためのオリゴヌクレオチドＣ１Ｒ阻害剤。
  2. 神経疾患がタウオパチー又は統合失調症から選択される、請求項１に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  3. Ｃ１Ｒ阻害剤が、Ｃ１Ｒの量を減少させることができる、請求項１又は２に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  4. 前記阻害剤が、哺乳動物のＣ１Ｒ標的配列、特にヒトＣ１Ｒ標的配列に少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む１２～３０ヌクレオチド長の核酸分子であり、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡを発現する細胞におけるＣ１Ｒ ｍＲＮＡの発現を減少させることができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  5. 前記阻害剤が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  6. 哺乳動物のＣ１Ｒ標的配列が、配列番号３及び／又は６からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  7. 連続ヌクレオチド配列が、配列番号３の標的配列に少なくとも９８％相補的、例えば完全に相補的である、請求項４から６のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  8. Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡが、少なくとも６０％、例えば６０～７０％減少される、請求項４から７のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤。
  9. 哺乳動物のＣ１Ｒ標的配列、特にヒトＣ１Ｒ標的配列に９５％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む１２～３０ヌクレオチド長の核酸分子であって、Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡの発現を阻害することができる、核酸分子。
  10. 連続ヌクレオチド配列が、配列番号３及び６からなる群から選択される配列に完全に相補的である、請求項９に記載の核酸分子。
  11. １２～２５、例えば１６～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、請求項９又は１０に記載の核酸分子。
  12. 二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのガイド鎖などのＲＮＡｉ分子である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. 一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. １つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  16. １つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. １つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項１５又は１６に記載の核酸分子。
  18. 連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項９～１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  19. 連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも９０％、又は９０～９５％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. 核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することができる６個と１８個の間のヌクレオシドの領域、例えば６個と１８個の間のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、請求項９から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  21. 請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子の薬学的に許容される塩。
  22. 請求項９～２０のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項２１に記載の薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  23. Ｃ１Ｒを発現している標的細胞におけるＣ１Ｒ発現を阻害するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
  24. 疾患を治療するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物を、神経疾患に罹患しているか又は罹りやすい対象に投与することを含む、方法。
  25. 神経疾患がタウオパチー及び統合失調症からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 治療用薬剤又は診断用薬剤としての使用のための、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
  27. タウオパチー又は統合失調症などの神経疾患の治療における使用のための、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
  28. タウオパチー又は統合失調症などの神経疾患の治療のための医薬の調製のための、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物の使用。
  29. Ｃ１Ｒ標的配列がＣ１Ｒ標的配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載の、使用のためのＣ１Ｒ阻害剤、請求項９から２０、及び２６から２８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、請求項２２に記載の薬学的組成物、又は請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
  30. 請求項１から８のいずれか一項に記載のＣ１Ｒ阻害剤、又は請求項９から２０、及び２６から２８のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物と、前記Ｃ１Ｒ阻害剤、前記核酸分子、前記薬学的に許容される塩、又は前記薬学的組成物を投与するための指示書とを含む、キット。
  31. 神経疾患を有すると疑われる患者における神経疾患を診断するための方法であって、以下
    ａ）患者からのサンプル中の１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸の量、例えばＣ１Ｒ ｍＲＮＡ若しくはＣ１Ｒ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの量を決定する工程であって、決定がサンプルを請求項９から２０のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子と接触させることを含む、Ｃ１Ｒ核酸の量を決定する工程と、
    ｂ）工程ａ）において決定された量を基準量と比較する工程と、
    ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、対象が神経疾患に罹患しているか否かを診断する工程と
    を含む方法。
  32. サンプルが、工程ａ）において、サンプル中に存在する前記１つ又は複数のＣ１Ｒ核酸（Ｃ１Ｒ ｍＲＮＡなど）への前記１つ又は複数の核酸分子のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記１つ又は複数の核酸分子と接触し、それにより、前記核酸分子と前記Ｃ１Ｒ核酸との二本鎖を形成する、請求項３１に記載の方法。
  33. ヌクレオチド単位を反応させること、及びそれにより核酸分子に含まれる共有結合された連続するヌクレオチド単位を形成することを含む、請求項９から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を製造するための方法。
  34. 核酸分子への１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドの、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合の、及び／又は１つ又は複数の修飾核酸塩基の導入を含む、請求項３３に記載の方法。
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