CN113661247A - 细胞穿透转座酶 - Google Patents
细胞穿透转座酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113661247A CN113661247A CN202080015307.2A CN202080015307A CN113661247A CN 113661247 A CN113661247 A CN 113661247A CN 202080015307 A CN202080015307 A CN 202080015307A CN 113661247 A CN113661247 A CN 113661247A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- cells
- transposase
- cell
- covalently
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 title claims abstract description 171
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 title claims abstract description 167
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 193
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 115
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 claims abstract description 61
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 53
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 106
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 29
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 28
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 28
- -1 linker compound Chemical class 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 9
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 91
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 12
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 6
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 6
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 4
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 3
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N Ala-Val-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 3
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N Arg-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 3
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NJSNXIOKBHPFMB-GMOBBJLQSA-N Asn-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)N)N NJSNXIOKBHPFMB-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 3
- YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- QRULNKJGYQQZMW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QRULNKJGYQQZMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N Asp-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-His Chemical compound N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SNLOOPZHAQDMJG-CIUDSAMLSA-N Gln-Glu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SNLOOPZHAQDMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HHQCBFGKQDMWSP-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N HHQCBFGKQDMWSP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- YMUFWNJHVPQNQD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN YMUFWNJHVPQNQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- SABZDFAAOJATBR-QWRGUYRKSA-N Gly-Cys-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SABZDFAAOJATBR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- AYBKPDHHVADEDA-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AYBKPDHHVADEDA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 3
- JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N His-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- OEROYDLRVAYIMQ-YUMQZZPRSA-N His-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OEROYDLRVAYIMQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 3
- LNJLOZYNZFGJMM-DEQVHRJGSA-N Ile-His-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N LNJLOZYNZFGJMM-DEQVHRJGSA-N 0.000 description 3
- XMYURPUVJSKTMC-KBIXCLLPSA-N Ile-Ser-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N XMYURPUVJSKTMC-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 3
- RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N Ile-Ser-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- YOZCKMXHBYKOMQ-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YOZCKMXHBYKOMQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- VKOAHIRLIUESLU-ULQDDVLXSA-N Leu-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VKOAHIRLIUESLU-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N Leu-Asn-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 3
- JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- RVOMPSJXSRPFJT-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVOMPSJXSRPFJT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- VLMNBMFYRMGEMB-QWRGUYRKSA-N Lys-His-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CNC=N1 VLMNBMFYRMGEMB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N Lys-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N Lys-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N Lys-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Leu-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- OCRSGGIJBDUXHU-WDSOQIARSA-N Met-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 OCRSGGIJBDUXHU-WDSOQIARSA-N 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- CTNODEMQIKCZGQ-JYJNAYRXSA-N Phe-Gln-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CTNODEMQIKCZGQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- KCIKTPHTEYBXMG-BVSLBCMMSA-N Phe-Trp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCIKTPHTEYBXMG-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 3
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- JUJCUYWRJMFJJF-AVGNSLFASA-N Pro-Lys-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 JUJCUYWRJMFJJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- CDGABSWLRMECHC-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O CDGABSWLRMECHC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N Ser-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 3
- MQVGIFJSFFVGFW-XEGUGMAKSA-N Trp-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MQVGIFJSFFVGFW-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 3
- HYVLNORXQGKONN-NUTKFTJISA-N Trp-Ala-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 HYVLNORXQGKONN-NUTKFTJISA-N 0.000 description 3
- RRVUOLRWIZXBRQ-IHPCNDPISA-N Trp-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N RRVUOLRWIZXBRQ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 3
- RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N Trp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 3
- MXFPBNFKVBHIRW-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O MXFPBNFKVBHIRW-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N Tyr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 3
- CCEVJBJLPRNAFH-BVSLBCMMSA-N Tyr-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N CCEVJBJLPRNAFH-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 3
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- WBAJDGWKRIHOAC-GVXVVHGQSA-N Val-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WBAJDGWKRIHOAC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 3
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 3
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 3
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 2
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N Arg-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N Arg-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- LXTGAOAXPSJWOU-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LXTGAOAXPSJWOU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N Asn-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- IJHUZMGJRGNXIW-CIUDSAMLSA-N Asp-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IJHUZMGJRGNXIW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KHGGWBRVRPHFMH-PEFMBERDSA-N Gln-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N KHGGWBRVRPHFMH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- VUVKKXPCKILIBD-AVGNSLFASA-N Gln-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N VUVKKXPCKILIBD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- GPSHCSTUYOQPAI-JHEQGTHGSA-N Glu-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O GPSHCSTUYOQPAI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- LPXHYGGZJOCAFR-MNXVOIDGSA-N Ile-Glu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N LPXHYGGZJOCAFR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- AUJWXNGCAQWLEI-KBPBESRZSA-N Phe-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AUJWXNGCAQWLEI-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- KJKQUQXDEKMPDK-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KJKQUQXDEKMPDK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- NYTKXWLZSNRILS-IFFSRLJSSA-N Val-Gln-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O NYTKXWLZSNRILS-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N Arg-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N Arg-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- NYLBGYLHBDFRHL-VEVYYDQMSA-N Asp-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NYLBGYLHBDFRHL-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OCPPBNKYGYSLOE-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN OCPPBNKYGYSLOE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDFCIKANUNMFGB-PMVVWTBXSA-N His-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 BDFCIKANUNMFGB-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- UKTUOMWSJPXODT-GUDRVLHUSA-N Ile-Asn-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UKTUOMWSJPXODT-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N Ile-Met-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZGUMORRUBUCXEH-AVGNSLFASA-N Leu-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZGUMORRUBUCXEH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LJADEBULDNKJNK-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LJADEBULDNKJNK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZFNYWKHYUMEZDZ-WDSOQIARSA-N Lys-Trp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ZFNYWKHYUMEZDZ-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N Thr-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- DIPIPFHFLPTCLK-LOKLDPHHSA-N Thr-Gln-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O DIPIPFHFLPTCLK-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- VDPRBUOZLIFUIM-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VDPRBUOZLIFUIM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010028188 glycyl-histidyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 102000016470 mariner transposase Human genes 0.000 description 1
- 108060004631 mariner transposase Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
Abstract
睡美人（SB）转座子是用于将转基因插入细胞中的有效非病毒工具。其在基因治疗中的广泛应用受到不受控制的转座酶基因活性和无法直接使用的转座酶蛋白质的阻碍。本发明涉及以下发现：SB转座酶自发地穿透哺乳动物细胞并能够与转座子DNA一起被递送以基因修饰各种细胞系、胚胎、造血和诱导多能干细胞。本发明提供了在对细胞进行基因工程化以及使用转座酶作为穿梭体将货物运送至靶细胞甚至靶细胞器中的方法中应用转座酶的细胞穿透功能的方法和化合物。使用本发明的技术可以滴定测量基因组整合频率，这增加了另一层的安全性，为基因工程和基因治疗的高级应用开辟了机会。
Description
技术领域
睡美人（Sleeping Beauty，SB）转座子是将转基因插入细胞的有效非病毒工具。其在基因治疗中的广泛应用受到不受控制的转座酶基因活性和无法直接使用转座酶蛋白质的阻碍。本发明涉及以下发现：SB转座酶自发地穿透哺乳动物细胞并能够与转座子DNA一起被递送以基因修饰各种细胞系、胚胎、造血和诱导多能干细胞。本发明提供了在对细胞进行基因工程化以及使用转座酶作为穿梭体（shuttle）将货物递送至靶细胞甚至靶细胞器中的方法中应用转座酶的细胞穿透功能的方法和化合物。使用本发明的技术可以滴定测量基因组整合频率，这增加了另一层的安全性，为基因工程和基因治疗的高级应用开辟了机会。
描述
基因工程已经成为研究、生物技术和治疗中的一项重要技术。用于基因货物（genetic cargo）的有效插入，病毒载体被广泛使用。然而，病毒基因递送是繁琐的、昂贵的，并且存在针对载体编码表位的炎症反应（1）和针对由于优先整合到经转录区域中的不利基因组变化（2）的风险。非病毒基因组编辑核酸酶（如锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9）能够通过触发靶细胞基因组中DNA修复介导的变化来实现程序性的敲除和小的编辑。然而，它们对宿主修复的依赖损害了它们用于大的转基因的插入的效用，特别是在医学相关的原代细胞中。最近，固有DNA断裂的致突变的潜力也显示出产生基因组重排（3）和恶性转化（4,5）的风险。
转座子为有效的基因递送提供一种非病毒替代，并且它们在研究和临床试验中的应用正在迅速增加。它们引起与逆转录病毒和慢病毒载体相当的转基因率，但伴随更低的免疫原性、不受限制的货物尺寸和无偏基因组分布（6-8），并且它们在临床实施的复杂性和成本方面具有有利的属性。
转座子用于脊椎动物中的基因工程的应用首先是通过从鱼类基因组中的非活性拷贝重建活性转座子来实现的，其被称为睡美人（SB）（9）。通常，SB系统包含以质粒DNA载体提供的两种组分：一种编码转座酶，以及另一种包含侧翼为转座子末端DNA序列的基因货物。为了实现基因转移，两种载体都必须被转染，并且转座酶基因必须在靶细胞中被表达。表达后，SB转座酶蛋白质特异性结合货物载体的转座子末端，切除转基因并将其整合到靶细胞基因组中的任何TA二核苷酸位点（转座）（图1A）。与基因组编辑核酸酶相比，SB通过直接酯交换反应而不依赖于双链DNA断裂和宿主细胞的DNA修复机制插入其基因货物。由于其在脊椎动物中的高插入效率（10），SB是用于癌症基因发现、转基因和基因治疗应用的宝贵工具（近期于其他地方（7，11-13）进行了综述）。事实上，SB是最先进的无病毒基因递送工具，其已经被用于治疗细胞的离体工程的临床I/II期试验中（6，7，11，13）。
大多数这些试验旨在通过整合嵌合抗原受体（CAR）的遗传信息来重编T细胞。CAR是给T细胞提供针对恶性肿瘤相关抗原的新特异性的人工受体，并且CAR T细胞在白血病和淋巴瘤的治疗方面表现出前所未有的反应率（14，15）。使用SB进行CAR基因插入的前两个已经完成的临床试验已经提供了临床概念验证（16，17）。与已获批的CAR T细胞产品（依赖于基于病毒的基因转移）相比，SB的应用产生了相当的功效，并具有降低制造复杂性和成本的另外的优势，这对于提高该技术的可及性至关重要。
然而，当前的SB系统有一个重要的缺点——使用转座酶编码DNA导致蛋白质表达延长（17），以及甚至能够导致在靶细胞中获取转座酶基因。这种缺乏控制SB转座酶暴露的时间和动力学带来了持续且不受控制的转座风险（18-20），这引起了有关不利的治疗性细胞产品的转化的安全性担忧。为确保转座酶清除和避免输入异常或不稳定的细胞产物，进行中的试验的工程化T细胞在CAR基因递送后被培养2-4周，这会降低细胞适应性和治疗效果（16，17）。因此，迫切需要提高SB的控制性和安全性，这也是一般细胞和基因治疗的关键要求。
早期对控制转座酶暴露的尝试集中在基于mRNA的方法上，该方法缩短了蛋白质表达的时间（18，21，22）并降低了造血干细胞和祖细胞（HSPC）的细胞毒性（23）。然而，为了最大程度地控制活性，需要直接使用蛋白质，但这已被在重组蛋白质生产中的挑战所禁止（24）。事实上，基因组编辑核酸酶的直接递送已被证明可以提高其准确性和控制性（25，26）。另一方面，转座酶通常难以重组生产并且特征为在生理条件下溶解度低，阻碍了有效的蛋白质递送。近期的报导描述了Mos1、Mboumar-9和Mu转座酶-DNA复合物的转染（27-29）；然而，这些酶在哺乳动物细胞中的低效率限制了它们的治疗用途。在医学相关环境中，与病毒衣壳融合的piggyBac转座酶的递送已经被实现并显示出中等效率，但缺点是保留了病毒递送组分（30，31）。对于SB，蛋白质聚集、低稳定性和溶解度仍然是迄今为止蛋白质生产和递送的主要瓶颈（24）。
专利申请PCT/EP2018/072320涉及具有增加的溶解度的改进的SB转座酶（hsSB）的开发。该文件中公开了与其他SB转座酶相比hsSB的改进特性及其用作基因传递的工具（例如在治疗方法的背景下）。
因此，本发明的目的是改进基于转座元件（特别是SB构建体）的基因工程方法。
发明的详细描述
通常，通过简要描述，本发明的主要方面可以被描述如下：
在第一方面，本发明涉及一种用于对靶生物细胞进行基因工程化的方法，该方法包含以任何顺序的以下步骤：（i）将转座子构建体引入生物细胞和/或提供包含转座子构建体的生物细胞；（ii）在不存在或不使用蛋白质转染程序或蛋白质转染试剂的情况下，将靶生物细胞与转座酶蛋白质接触。
在第二方面，本发明涉及一种用于将货物化合物递送至生物细胞中的方法，该方法包含将货物化合物共价地或非共价地且直接地或间接地连接至穿梭蛋白质以获得货物穿梭复合体，以及将生物细胞与货物穿梭复合体接触；其特征在于穿梭蛋白质包含转座酶蛋白质序列。
在第三方面，本发明涉及一种转座酶蛋白质将货物化合物递送至生物细胞中的应用，其中所述转座酶蛋白质被用作细胞穿梭蛋白质并且被共价地或非共价地且直接地或间接地连接至货物化合物。
在第四方面，本发明涉及一种细胞穿梭体，其包含共价地或非共价地连接至货物化合物的转座酶蛋白质；或者共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物适合于细胞穿梭体与货物化合物的共价或非共价连接；或者共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物进一步被共价地或非共价地连接至货物化合物。
在第五方面，本发明涉及一种用于将货物化合物递送至细胞中的试剂盒，该试剂盒包含如在本发明第二方面的方法的上下文中或在根据第四方面的穿梭体的上下文中所定义的穿梭蛋白质。
在第六方面，本发明涉及一种用于将转座酶蛋白质引入生物细胞中的方法，该方法包含在不存在蛋白质转染剂或不使用蛋白质转染程序（例如电穿孔）的情况下将细胞与转座酶蛋白质接触。
详细说明
在下文中将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，但是，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建其他的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应当被理解为支持并涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合或将一个或多个明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选元素组合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有描述的元素的任何排列和组合。
在第一方面，本发明涉及一种用于对靶生物细胞进行基因工程化的方法，该方法包含以任何顺序的以下步骤：（i）将转座子构建体引入生物细胞和/或提供包含转座子构建体的生物细胞；（ii）在不存在或不使用蛋白质转染程序或蛋白质转染试剂的情况下，将靶生物细胞与转座酶蛋白质接触。
根据第一方面，通过与靶基因组进行转座反应来对靶细胞进行基因工程化。这种转座反应在转座元件（转座子构建体或单元）和催化转座反应的转座酶蛋白质存在的情况下自动发生。
本发明最重要的是发现转座酶（优选地hsSB）能够自动地跨过细胞膜并进入细胞核，并且因此通过转座介导基因组修饰。这种活性对于大分子（例如转座酶蛋白质）是不常见的，因为在现有技术方法中，转座酶需要使用例如蛋白质转染试剂或程序（例如电穿孔）有效的转染到细胞中。现在，在本发明的上下文中提供了一种用于对细胞进行基因工程化的方法，其中该方法不包含蛋白质转染步骤，特别地，优选的是该方法不包含为了将转座酶蛋白质引入细胞中蛋白质转染试剂或程序的使用。换言之，本发明的方法包含不使用改变蛋白质跨过细胞膜的穿透（penetration）的任何载体、试剂或方法引入转座酶蛋白质的步骤。但是，如果该方法包括由于无关的原因将不是基因工程所需的转座酶的另一种蛋白质引入细胞的步骤，并且这种另一种蛋白质的这种引入是通过使用蛋白质转染来完成的，则该步骤不应该与涉及转座酶蛋白的转染（递送）的本发明不一致。因此，如果这些另外的步骤是为了引入基因工程所需的转座酶蛋白质之外的其他蛋白质，则可以包含这些另外的步骤。本发明的方法还优选没有转座酶蛋白质通过引入编码转座酶蛋白质的基因表达构建体并在靶细胞内表达所述构建体被间接引入细胞中。
本发明上下文中的术语“蛋白质转染”应被理解为广泛地涉及足以将不能有效地进入靶细胞的蛋白质引入所述靶细胞的任何方法或试剂。普遍的蛋白质转染系统和试剂包括商业蛋白质转染试剂，例如PULSin™、ProteoJuice™、Xfect™和BioPorter®、Pierce™蛋白质转染试剂（ThermoFisher）、TransPass™，以及蛋白质电穿孔等方法。
因此，在基因工程化方法的本发明的上下文中，优选通过将转座酶蛋白质直接添加至含有所述生物细胞的培养基（优选地添加至靶生物细胞的细胞培养基）中来提供转座酶蛋白质。因此，根据本发明的转座酶蛋白质与靶细胞直接接触，而不使用任何改变蛋白质跨过细胞膜的穿透的载体或方法。
如本文所用，术语“转座酶”是指能够转座的功能性核酸-蛋白质复合物的组分并且介导转座的酶。术语“转座酶”也指来自逆转录转座子或来自逆转录病毒的整合酶。如本文所用，“转座反应”是指转座子插入靶核酸中的反应。转座反应中的主要组分是转座子和转座酶或整合酶。例如，根据本发明的转座酶系统优选地是所谓的“睡美人（SB）”转座酶。在某些方面，转座酶是一种具有改进的特性（例如增强的酶功能）的工程化酶。工程化SB转座酶的一些具体实施例包括但不限于SB10、SB11或SB100×SB转座酶（参见例如Mates等人，Nat.Gen.2009，通过引用并入本文）。可以使用其他转座系统，例如Ty1（Devine和Boeke,1994, 以及WO 95/23875）、Tn7（Craig, 1996）、Tn10和IS10（Kleckner 等人，1996）、Himar1mariner转座酶（Lampe 等人，1996）、Mos1（Tosi和Beverley, 2000）、Tc1（Vos 等人,1996）、Tn5（Park 等人，1992）、P element（Kaufman和Rio, 1992）和Tn3（Ichikawa和Ohtsubo, 1990）、细菌插入序列（Ohtsubo和Sekine, 1996）、逆转录病毒（Varmus和Brown1989）和酵母的逆转录转座子（Boeke, 1989）。
在本发明的优选实施方案中，转座酶是睡美人（SB）转座酶，优选是SB100X（SEQ IDNO：2）或衍生自SB100X的酶。
因此，根据本发明的转座酶多肽是具有转座酶活性的多肽，其中至少一个突变的氨基酸残基是位于SB转座酶（优选SB100X转座酶）的氨基酸150和250之间的残基。
在一些实施方案中，优选地，至少一个突变的氨基酸残基是至少两个突变的氨基酸残基，或者至少三个、四个、五个或更多个氨基酸。优选地，当本发明的转座酶多肽的序列与SB转座酶（优选SB100X）的序列比对时，在氨基酸170至180和/或207至217中的任一个中发生突变。更优选地，至少一个突变的氨基酸残基选自SB转座酶，优选SB100X的氨基酸176和/或212。最优选地，至少一个突变的氨基酸残基被突变为丝氨酸残基，并且优选地是C176S、或者C176S和I212S。
在其他实施方案中，本发明的转座酶多肽还包含与SEQ ID NO：1（hsSB）所示的残基150至250之间的氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，最优选100%序列同一性的氨基酸序列。与SEQ ID NO：2中的序列相比，优选转座酶多肽包括至少C176突变，优选C176S。甚至更优选地，转座酶多肽进一步包括在I212位的突变，优选I212S。
在一些实施方案中，本发明的转座酶多肽包含与SEQ ID NO: 1或3（hsSB）中所示的全长氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，最优选100%序列同一性的氨基酸序列。优选地，虽然在一些实施例中序列同一性的程度低于100%，但上文指出的至少一个突变应存在于本发明的转座酶多肽中。
在另一个实施方案中，本发明的自穿透转座酶蛋白质是转座酶的片段。优选地，该片段包含hsSB的DNA结合结构域（图18）。优选地，转座酶的DNA结合结构域包含N和/或C端另外的氨基酸，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200个或更多个。
如本文所用，当在两个或更多个核酸或蛋白质/多肽序列的上下文中的任何地方使用时，术语“相同”或百分比“同一性”是指如使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查（参见例如NCBI网站）所测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有（或至少具有）相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸（即，当比较并比对以在比较窗口或指定区域上获得最大对应性时，在指定区域中（优选在其全长序列上）具有或至少具有约60%的同一性，优选具有或至少具有65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%或94%的同一性，更优选地具有或至少具有约95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性）。在特定的实施方案中，例如当将本发明的转座酶的蛋白质或核酸序列与例如参考（非突变的转座酶）进行比较时，可以通过NCBI中提供的Blast搜索来确定同一性百分比；特别是对于氨基酸同一性，使用具有以下参数的BLASTP 2.2.28+：矩阵：BLOSUM62；空位罚分：存在：11，延伸：1；相邻词阈值：11；多次点击的窗口：40。
此外，在一些实施方案中，与参考未突变转座酶多肽相比，本发明的转座酶多肽具有增加的溶解度，优选地，其中参考未突变转座酶多肽是SB100X转座酶，优选如SEQ ID NO：2（未突变的SB100X）所示。
在一些方面和实施方案中，转座子蛋白质包含与任何给定转座酶蛋白质的氨基酸序列具有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、100%序列同一性的氨基酸序列。此类转座酶蛋白质由SEQ ID NO: 1至3中任一个所示的氨基酸序列组成，或基本上由其组成，与这些序列相比，任选地具有不超过50、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸取代、添加、插入、缺失或倒位。然而，根据本发明所述的这种变体转座酶蛋白质仍保留其转座酶活性和/或其细胞穿透活性。
在本发明的特定实施方案中，转座子构建体包含将被遗传地（genetically）引入靶基因组的基因序列。在本发明公开的上下文中，转座子构建体或单元应涉及包含靶序列的核酸（或基因）构建体，该靶序列旨在与转座子基因元件可操作地连接进行转座，这是由转座酶蛋白质介导的单元成功转座所必需的。在特别优选的实施方案中，转座子构建体不包含编码转座酶蛋白质的核苷酸序列。因此，本发明的转座子构建体或单元优选地含有侧接待插入靶细胞的基因组（待转座的靶序列）的感兴趣的序列的反向末端重复（ITR）或同向末端重复（DTR）。通常转座子单元是核酸并且可以是适合转座的任何形式的载体。
在本发明的某些实施方案中，将转座元件或转座子构建体或单元引入靶细胞，例如通过使用已知的核酸转染系统。然而，本发明的方法也可以在已经含有转座子构建体或单元的靶细胞中进行，因此，其中通过将根据本发明的转座酶蛋白引入靶细胞而开始转座反应。
如本文所用，术语“反向末端重复序列”是指位于转座子单元的一端的序列，当与位于载体或转座子单元的相对端的互补序列组合使用时，该序列可以被转座酶多肽切割。该对反向末端重复涉及本发明公开的转座子单元的转座子的转座活性，特别是涉及感兴趣的DNA的DNA添加或去除、以及切除和整合。在一个实施例中，至少一对反向末端重复似乎是转座活性所需的最小序列。在另一个实施例中，本发明公开的转座子单元可包含至少两对、三对或四对反向末端重复。如本领域技术人员将理解的，为了促进容易克隆，必需的末端序列可以尽可能短，从而含有尽可能少的反向重复。因此，在一个实施例中，本发明公开的转座子单元可以包含不超过一对、不超过两对、不超过三对或不超过四对的反向末端重复。在一个实施例中，本发明公开的转座子单元可以仅包含一个反向末端重复。虽然不希望受到理论的束缚，但设想具有多于一对反向末端重复可能是不利的，因为它可能导致非特异性转座酶结合多个反向末端重复并导致除去期望的序列或插入不期望的序列。本发明公开的反向末端重复可以形成完美的反向末端重复（或可互换地称为“完美反向重复”）或不完美反向末端重复（或可互换地称为“不完美反向重复”）。如本文所用，术语“完美反向重复”是指以相反方向放置的两个相同的DNA序列。上述对具有ITR的转座子单元的描述也适用于包括DTR的转座子单元。
一种可以与本发明的创造性的系统和组分一起使用的转座子系统（或单元）例如是公开于WO 2017/050448 A1中，其通过引用整体包含在本发明的公开中。
根据本发明的转座子构建体是优选的，其中以小环的形式提供所述转座子单元。然而，转座子单元可以是其他核酸系统。然而，在T细胞工程（例如将CAR引入T细胞）的背景下小环是优选的。
在本发明的优选方面和实施方案中，通过转座而被引入靶细胞基因组的靶序列是编码CAR、抗体或T细胞受体的序列。或者是此类分子的任何变体。因此，在一些实施方案中，本发明的方法和化合物被优选地用于对T细胞进行基因工程化以产生CAR T细胞。如本文所用，术语“嵌合抗原受体T细胞”也称为CAR T细胞，它是指表达嵌合抗原受体（CAR）的淋巴细胞。因此，本发明的方法包括引入用于在靶细胞中表达CAR的所有必需的基因元件。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”具有其在本领域中通用的含义，是指人工构建的杂合蛋白质或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体（例如scFv）的抗原结合域。CAR的特征包括它们利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制方式将T细胞特异性和反应性重定向到选定的靶标的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞独立于抗原加工识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体（TCR）α和β链二聚化。设计和生产此类CAR的策略在本领域中是众所周知的，参考文献可以在例如Bonini和Mondino, Eur. J. Immunol. 2015（19）、Srivastava和Riddell,Trends Immunol. 2015（20）、Jensen和Riddell, Curr. Opin. Immunol. 2015（21）、Gill和June, Immunol. Rev. 2015（22）中找到。
在优选实施方案中，本发明的转座子系统是SB转座子系统。
根据本发明所述的靶细胞优选地选自哺乳动物细胞，优选地选自干细胞（例如造血干细胞、胚胎干细胞）、自发永生化细胞、人工永生化细胞、原代细胞（神经元、静息T细胞）、衍生自B细胞的细胞（例如浆细胞）、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、诱导多能干细胞（iPSC）；或者是免疫细胞，例如T淋巴细胞，优选CD4或CD8阳性T细胞；或者是自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、树突细胞或B细胞。
在第二方面，本发明涉及一种用于将货物化合物递送至生物细胞中的方法，该方法包含将货物化合物共价地或非共价地且直接地或间接地连接至穿梭蛋白质以获得货物穿梭复合体，以及将生物细胞与货物穿梭复合体接触；其特征在于穿梭蛋白质包含转座酶蛋白质序列。
在本发明的第二方面，转座酶蛋白质利用细胞穿透活性而被用作细胞穿梭体来将任何种类的货物运送至靶细胞中。通过简单地将这些货物连接至本发明的所述转座酶蛋白质，任何化合物都可以被有效地运送至细胞中。因此，根据本发明的转座酶蛋白质被用作细胞转染载体。
在本发明的优选实施方案中，货物化合物被递送至生物细胞中，并且被递送至所述生物细胞的细胞核中。然而，替代地，通过改变转座酶中的细胞器靶向序列（例如用不同细胞器的信号肽交换核定位信号），可以将货物穿梭复合体靶向不同的细胞器，例如线粒体，内质网、高尔基体等。在某些实施方案中，穿梭蛋白质因此包含核定位信号的缺失或突变或不包含核定位信号，并且任选地包含用于细胞内递送至细胞核以外的细胞器中的信号序列。
在本方面中使用的转座酶优选地是如本文针对其他方面和实施方案所述的转座酶。
在特定实施方案中，本发明的细胞穿梭体包含被共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，优选地其中所述连接子化合物适合于将货物化合物共价地或非共价地连接至穿梭蛋白质。连接子可以是简单的肽连接子，或者可以含有促进货物与穿梭蛋白质连接的任何功能。例如，连接子化合物可以选自分选酶供体或受体位点、生物素或链霉亲和素蛋白质或蛋白质连接系统的功能替代组分。许多这样的系统是技术人员已知的，并且应当包括用于化学交联的特定功能的引入，例如半胱氨酸残基、内含肽或非天然氨基酸。替代地，其也可以是适合于货物化合物的非共价连接（即DNA/RNA/化学品/脂质等的特定结合域）的特定肽。
原则上，本发明的转座酶的细胞穿透活性能够被用于跨细胞膜转运送任何蛋白质。此类货物化合物选自小分子、大分子、肽、多肽、蛋白质、核酸（例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体）、PNA，或者是糖化合物、含脂肪酸的化合物。
与上述本发明第一方面的实施方案类似，第二方面的方法也是优选地不需要添加蛋白质转染剂或程序的方法，其中该方法优选地不包含蛋白质转染试剂或程序（例如电穿孔）的使用。
在第三方面，本发明涉及一种转座酶蛋白质将货物化合物递送至生物细胞中的应用，其中所述转座酶蛋白质被用作细胞穿梭蛋白质并且被共价地或非共价地且直接地或间接地连接至货物化合物。
优选地，递送不需要或不包含蛋白质转染试剂或蛋白质转染程序（例如电穿孔）。在此上下文中，在此引用关于本发明的第一和第二方面以及实施方案的上述描述，将转座酶蛋白质引入细胞或细胞器不需要蛋白质转染。
在第四方面，本发明涉及一种细胞穿梭体，其包含共价地或非共价地连接至货物化合物的转座酶蛋白质；或者共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物适合于细胞穿梭体与货物化合物的共价或非共价连接；或者共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物进一步被共价地或非共价地连接至货物化合物。
在第五方面，本发明涉及一种用于将货物化合物递送至细胞中的试剂盒，该试剂盒包含如在本发明的第二方面的方法的上下文中或在根据第四方面的穿梭体的上下文中所定义的穿梭蛋白质。
在第六方面，本发明涉及一种用于将转座酶蛋白质引入生物细胞中的方法，该方法包含在不存在蛋白质转染剂或不使用蛋白质转染程序（例如电穿孔）的情况下将细胞与转座酶蛋白质接触。
除了上述方面和实施方案之外，本发明还涉及以下项目组：
项目1：一种用于对靶生物细胞进行基因工程化的方法，该方法包含以任何顺序的以下步骤：（i）将转座子构建体引入生物细胞和/或提供包含转座子构建体的生物细胞；（ii）在不存在或不使用蛋白质转染程序或蛋白质转染试剂的情况下，将靶生物细胞与转座酶蛋白质接触。
项目2：根据项目1所述的方法，其中所述转座子构建体包含被遗传地引入靶基因组的基因序列。
项目3：根据项目1或2所述的方法，其中所述转座酶蛋白质是或衍生自睡美人（SB）转座酶。
项目4：根据项目3所述的方法，其中所述SB转座酶为SB100X，优选地为如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
项目5：根据项目3所述的方法，其中所述SB转座酶是高度溶解的SB100X（hsSB），其与参考非突变SB转座酶的氨基酸150和250之间的氨基酸序列相比，包含至少一个突变的氨基酸残基，例如其中所述参考非突变SB转座酶包含如SEQ ID NO: 2所示的序列。
项目6：根据项目5所述的方法，其中所述至少一个突变的氨基酸残基是至少两个突变的氨基酸残基。
项目7：根据项目5或6所述的方法，其中所述至少一个突变的氨基酸残基是SB转座酶（优选地SB100X（SEQ ID NO :2））的氨基酸170至180和/或207至217中的任一个的突变。
项目8：根据项目5至7中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变的氨基酸残基选自SB转座酶（优选地SB100X（SEQ ID NO：2））的氨基酸176和/或212。
项目9：根据项目5至8中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变的氨基酸残基被突变为丝氨酸残基，并且优选地为C176S和I212S。
项目10：根据项目5至9中任一项所述的方法，其中所述转座酶蛋白质进一步包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的残基150至250之间的氨基酸序列（优选地全长序列）具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。
项目11：根据项目1至10中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质包含与转座酶蛋白质的氨基酸序列具有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、100%序列同一性的氨基酸序列。
项目12：根据项目1至11中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质由SEQ ID NO：1至3中任一个所示的氨基酸序列组成，或基本上由其组成，与这些序列相比，任选地具有不超过20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸取代、添加、插入、缺失或倒位。
项目13：根据项目1至12中任一项所述的方法，其中通过将转座酶蛋白质添加至含有所述生物细胞的培养基（优选地添加至靶生物细胞的细胞培养基）中来提供转座酶蛋白。
项目14：根据项目1至13中任一项所述的方法，其中所述靶生物细胞为哺乳动物细胞，优选地选自干细胞（例如造血干细胞、胚胎干细胞）、自发永生细胞、人工永生细胞、原代细胞（神经元、静息T细胞）、衍生自B细胞的细胞（例如浆细胞）、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、诱导多能干细胞（iPSC）；或者是免疫细胞，例如T淋巴细胞，优选CD4或CD8阳性T细胞；或者是自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、树突细胞或B细胞。
项目15：根据项目1至14中任一项所述的方法，其中所述转座子包含编码蛋白质的核苷酸序列，例如编码抗体、T细胞受体或嵌合抗原受体（CAR）的序列。
项目16：一种用于将货物化合物递送至生物细胞中的方法，该方法包含将所述货物化合物共价地或非共价地且直接地或间接地连接至穿梭蛋白质以获得货物穿梭复合体，以及将所述生物细胞与所述货物穿梭复合体接触；其特征在于穿梭蛋白质包含转座酶蛋白质序列。
项目17：根据项目16所述的方法，其中所述货物化合物被递送至生物细胞中，并且被递送至所述生物细胞的细胞核中。
项目18：根据项目16或17所述的方法，其中所述转座酶蛋白序列质衍生自睡美人（SB）转座酶。
项目19：根据项目18所述的方法，其中所述SB转座酶为SB100X，优选地为如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
项目20：根据项目18所述的方法，其中所述SB转座酶是高度溶解的SB100X（hsSB），其与参考非突变SB转座酶（如SEQ ID NO：2所示的序列）的氨基酸150和250之间的氨基酸序列相比，包含至少一个突变的氨基酸。
项目21：根据项目20所述的方法，其中至少一个突变的氨基酸残基是至少两个突变的氨基酸残基。
项目22：根据项目20或21所述的方法，其中至少一个突变的氨基酸残基是SB转座酶（优选地SB100X（SEQ ID NO :2））的氨基酸170至180和/或207至217中的任一个的突变。
项目23：根据项目20至22中任一项所述的方法，其中至少一个突变的氨基酸残基选自SB转座酶（优选地SB100X（SEQ ID NO：2））的氨基酸176和/或212。
项目24：根据项目20至23中任一项所述的方法，其中至少一个突变的氨基酸残基被突变为丝氨酸残基，并且优选地为C176S和I212S。
项目25：根据项目20至24中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质进一步包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的残基150至250之间的氨基酸序列（优选地全长序列）具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。
项目26：根据项目16至25中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质包含与转座酶蛋白质的氨基酸序列具有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、100%序列同一性的氨基酸序列。
项目27：根据项目16至20中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质包含与转座酶蛋白的至少50个（优选地100个、150个、200个，优选至少300个）连续的氨基酸具有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、100％序列同一性的氨基酸序列。
项目28：根据项目16至27中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质由SEQ IDNO: 1至3中任一个所示的氨基酸序列组成，或基本上由其组成，与这些序列相比，任选地具有不超过20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸取代、添加、插入、缺失或倒位。
项目29：根据项目16至28中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质被共价地或非共价地连接至连接子化合物，优选地其中所述连接子化合物适合于将货物化合物共价地或非共价地连接至穿梭蛋白质。
项目30：根据项目29所述的方法，其中所述连接子化合物选自分选酶供体或受体位点、生物素或链霉亲和素蛋白质、或者蛋白质连接系统的功能替代组分。
项目31：根据项目16至30中任一项所述的方法，其中所述货物化合物选自小分子、大分子、肽、多肽、蛋白质、核酸（例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体）、PNA，或者是糖化合物、含脂肪酸的化合物。
项目32：根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述穿梭蛋白质包含核定位信号的缺失或突变或不包含核定位信号，以及任选地包含用于细胞内递送至细胞核以外的细胞器中的信号序列。
项目33：根据前述项目中任一项所述的方法，其中该方法不需要添加蛋白质转染剂或程序，优选地其中该方法不包含蛋白质转染试剂或程序（例如电穿孔）的使用。
项目34：根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是哺乳动物细胞。
项目35：一种转座酶蛋白质将货物化合物递送至生物细胞中的应用，其中所述转座酶蛋白质被用作细胞穿梭蛋白质并且被共价地或非共价地且直接地或间接地连接至所述货物化合物。
项目36：根据项目35所述的应用，其中递送不需要或不包含蛋白质转染试剂或蛋白质转染程序（例如电穿孔）。
项目37：根据项目35或36所述的应用，其中所述转座酶蛋白质是如项目16至34中任一项所述的方法所定义的穿梭蛋白质。
项目38：一种细胞穿梭体，其包含
（i）共价地或非共价地连接至货物化合物的转座酶蛋白质；或者
（ii）共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物适合于所述细胞穿梭体与所述货物化合物的共价或非共价连接；或者
（iii）共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物进一步被共价地或非共价地连接至所述货物化合物。
项目39：根据项目16所述的细胞穿梭体，其中所述转座酶蛋白质是如项目16至34中任一项所定义的穿梭蛋白质。
项目40：根据项目38或39所述的细胞穿体，其中所述货物化合物选自小分子、大分子、肽、多肽、蛋白质、核酸（例如RNA、DNA、RNA-DNA杂合体）、PNA，或者是糖化合物、含脂肪酸的化合物。
项目41：一种用于将货物化合物递送至细胞中的试剂盒，所述试剂盒包含如项目16至34中任一项所定义的穿梭蛋白质，或者根据项目38至40项中任一项所述的细胞穿梭体。
项目42：一种用于将转座酶蛋白质引入生物细胞的方法，所述方法包含在不存在蛋白转染剂或不使用蛋白转染程序（例如电穿孔）的情况下将细胞与所述转座酶蛋白质接触。
项目43：根据项目42所述的方法，其中所述转座酶蛋白质是如项目16至34中任一项所定义的转座酶蛋白质。
项目44：根据项目42或43所述的方法，其中所述转座酶蛋白质是重组表达的蛋白质并被添加至所述生物细胞的细胞培养基中。
如本文所用，术语“本发明的”、“依据于本发明”、“根据本发明”等意指本文所描述的和/或所要求保护的本发明的所有方面和实施方案。
如本文所用，术语“包含”将被解释为涵盖“包括”和“由……组成”，这两种含义都是特别意图的，因此根据本发明被单独公开。在本文中使用时，“和/或”应被视为具有或不具有彼此的两个指定特征或组件中的每一个的特定公开。例如，“A和/或B”将被视为（i）A、（ii）B和（iii）A和B中的每一个的具体公开，就如同它们在本文中分别列出一样。在本发明的上下文中，术语“大约”和“约”表示本领域技术人员将理解为仍能确保所讨论特征的技术效果的精度范围。该术语通常表示与所示的数值相差±20%、±15%、±10%，例如±5%。如本领域技术人员将理解的，对于给定技术效果，数值的这种特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常可能比人为或工程技术效果具有更大的偏差。如本领域技术人员将理解的，对于给定的技术效果，数值的这种特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常可能比人为或工程技术效果具有更大的偏差。当提到单数名词时使用不定冠词或定冠词，除非特别说明，否则例如“一个”、“一”或“该”包括该名词的复数形式。
应当理解，将本发明的教导应用于特定问题或环境，以及包括本发明的变体或其他特征（例如进一步的方面和实施方案）将在根据本文包含的教导的具有本领域普通技术的人员的能力范围内。
除非上下文另有指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。
本文引用的所有参考文献、专利和出版物均通过引用整体并入本文。
附图及序列的详细说明
附图示出：
图1示出了通过SB转座酶的基因组工程化的示意图。LE和RE分别标记左和右转座子末端序列。货物基因转移至靶基因组中由从靶细胞中的质粒载体（弯箭头）表达的转座酶执行。
图2示出了直接的hsSB递送允许在不同的哺乳动物细胞和干细胞中有效的转基因。用携带Venus的转座子质粒转染并用hsSB转座酶电穿孔的HeLa细胞（上图）、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（中图）和小鼠胚胎干细胞（mESC；下图）的代表性流式细胞分析。转染后3周，鉴定稳定表达整合的Venus基因的细胞。电穿孔的hsSB蛋白量如上所示。Y轴：碘化丙啶（PI）染色以排除死细胞；x轴：来自Venus的绿色荧光；NT：未转染的。
图3示出了通过流式细胞术定量含有具有任何转基因载体的重组表达SB蛋白（SBprotAct）的系统在不同细胞系中的转基因效率。误差线表示标准偏差（n=2）。
图4示出了使用自发的hsSB穿透的本发明的细胞工程化步骤的示意图。
图5示出了经hsSB处理（上图）和未经处理（下图）的HeLa细胞的免疫荧光成像，示出了经DAPI染色的细胞核（左）、hsSB染色（中）和合并图（右）。箭头标记细胞核中具有hsSB的细胞。
图6示出了蛋白质印迹分析，示出了加入培养基后HeLa细胞中hsSB的细胞摄取和保留。用抗SB抗体或抗GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）作为内部加样对照对样品进行印迹分析。
图7示出了用编码Venus的转座子MC转染并在培养基中与hsSB孵育的HeLa细胞的代表性流式细胞术分析。2天后分选Venus阳性细胞，并在递送后3周进行分析。Y轴：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色以排除死细胞；x轴：来自Venus的绿色荧光。培养基中hsSB蛋白质浓度显示在每个图的上方。NT：未转染的。
图8示出了在hsSB从培养基穿透后用抗SB抗体进行诱导多能干细胞（iPSC）的蛋白质印迹分析。
图9示出了在用Venus转座子MC转染并用hsSB孵育后3周，iPSC的代表性流式细胞术分析。
图10示出了使用自发的hsSB穿透的T细胞工程化步骤的示意图。
图11示出了T细胞的免疫荧光成像，示出了经DAPI染色的细胞核（左）、hsSB染色（中）和合并图（右）。在不存在原发性SB抗体的情况下经染色的细胞示于图的下方（IF对照）。
图12示出了用转座子微环（MC）转染并与hsSB孵育的CD8+ T细胞的代表性流式细胞术分析。来自健康供体的CD8+ T细胞用CD19 CAR MC转染，并通过磁相关细胞分选（MACS）富集CAR阳性细胞（使用EGFRt作为标记物）。示出了来自3个实验（来自3个不同的T细胞供体）之一的代表性FACS图，其中绘制了来自CD8和EGFRt特异性抗体（分别为CD8-VioBlue和EGFRt-AF647）的荧光。培养基中的hsSB蛋白质浓度显示在每个图的上方。NT：未转染的。
图13示出了由hsSB穿透或MC-MC对照产生的CD19 CAR T细胞的细胞溶解活性。在过量荧光素存在的情况下，从5小时共培养试验中的表达ffLuc的靶细胞的发光信号计算细胞溶解。NT：未转染的。E:T比例：效应物与目标物的比例。
图14示出了通过CAR T细胞基因组DNA的微滴式数字PCR（ddPCR）测量的CAR转基因插入物的平均数。误差线示出了在95%置信区间的两个独立的ddPCR试验（对相同的基因组DNA样本进行）的拷贝数估计值。
图15：示出了hsSB-GFP融合蛋白质的穿透。（A）与蛋白质孵育1小时后hsSB-GFP（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。（B）示出了24小时后hsSB-GFP（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。
图16示出了融合至GFP的N端的hsSB无催化活性突变体的穿透。（A）与蛋白质孵育1小时后hsSB-D153N-D244N-GFP（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。（B）24小时后hsSB-D153N-D244N-GFP（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。
图17示出了GFP-hsSB融合蛋白质的穿透。（A）与蛋白质孵育1小时后GFP-hsSB（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。（B）24小时后GFP-hsSB（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的荧光成像。比例尺为20 µm。
图18示出了hsSB的N端DNA结合结构域（DBD）有效地穿透至HeLa细胞中。（A）与蛋白质孵育3小时后SB染色（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的免疫荧光成像。比例尺为20 µm。构建体hsSB-1-123的示意图示于图的下方。（B）24小时后SB染色（左）和经DAPI染色的细胞核（右）的HeLa细胞的免疫荧光成像。比例尺为20 µm。
序列示出：
SEQ ID NO: 1示出了hsSB
MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEASKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGSMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY
SEQ ID NO: 2（非突变的SB100X）
MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY
SEQ ID NO: 3（用于重组表达的hsSB）
GPMMGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEASKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGSMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY
（下划线是突变的或将要突变的残基。粗体和斜体是用于重组蛋白表达引入的残基）。
实施例
本发明的某些方面和实施方案现在将通过实施例和参考本文阐述的描述、图和表的方式来说明。本发明的方法、应用和其他方面的此类实施例仅是代表性的，并且不应将本发明的范围限制为仅此类代表性实施例。
实施例示出：
实施例1（比较的）：使用hsSB转座酶在哺乳动物细胞中有效转基因
在各种哺乳动物细胞系中测试由发明人开发的高溶解度睡美人（hsSB）转座酶对细胞进行基因工程化的能力。改进的hsSB转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。为了更好地量化hsSB介导的转座，发明人应用荧光报告系统并用含有Venus基因的转座子质粒转染HeLa细胞，然后通过蛋白质电穿孔递送hsSB蛋白。在转染后2天通过荧光激活细胞分选选择获得转座子质粒的细胞。然后三周后，通过对由于hsSB的基因组插入而稳定表达Venus报告基因的绿色荧光细胞进行流式细胞术分析量化转座效率（图2）。检测到荧光细胞百分比明显的剂量依赖性增加，20µg hsSB蛋白达到最大效率（42%）（图2的上图和图3）。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和小鼠胚胎干细胞也能够被本发明的hsSB转座酶有效转染（图2和3）。
实施例2：转座酶具有固有的细胞穿透特性
为了进一步开发用于对哺乳动物细胞进行基因工程化的方法，发明人寻求使转座酶递送更简单和更温和。值得注意的是，发明人观察到当简单地添加至培养基中时，转座酶蛋白质自主地穿透HeLa细胞并进入细胞核（图4和5）。为了测试当以这种方式递送时hsSB是否能够介导转座，发明人用含有Venus基因的MC转染HeLa细胞，然后将hsSB添加至培养基中，无进一步脉冲或转染试剂的使用（图4）。纵向蛋白质印迹分析示出在4小时内hsSB吸收，随后在递送后24小时完全清除（图6）。转染后3周的荧光细胞分选显示高达12%的Venus阳性细胞（图7），表明hsSB介导了有效的转基因整合。
接下来，对人类iPSC进行类似程序的基因工程化测试。iPSC对再生医学提供了巨大的潜力，但由于它们对转染程序的敏感性，因此是最难工程化的细胞之一。发明人首先使用干细胞特异性转染试剂用携带Venus的MC转染iPSC，然后将它们与含有hsSB蛋白的培养基孵育以允许蛋白质穿透至细胞中。hsSB有效地穿透了iPSC（图8）且经处理的细胞三周后的流式细胞术显示高达3.31%的显著转基因效率（计算为3周时稳定整合体占所有转染细胞的百分比，图9）。这表明hsSB的非侵入性细胞穿透有助于修饰iPSC。
实施例3：新的基因工程化方法能够被用于生成CAR T细胞
最后，测试了hsSB的固有的细胞穿透特性是否能够被用于CAR T细胞制造（图10）。由于电穿孔是T细胞的压力因素，hsSB穿透能够帮助保持其适合下游临床应用。发明人首先通过免疫荧光成像分析了原代T细胞中的hsSB穿透，其示出3小时内经刺激的和未经刺激的细胞中的有效的蛋白质摄取（图11）。hsSB也在非分裂细胞中有效地进入细胞核，这与使用其固有的核定位信号的主动运送一致。为了探测转座，用CD19 CAR MC对T细胞进行电穿孔，并将hsSB添加至细胞培养基。这以5-7%的总体转基因频率成功生成人CD8+ CD19 CAR T细胞（图12）。然后CAR T细胞通过MACS（44）被富集到90%纯度，并示出CD19+靶细胞的有效裂解和高水平的效应细胞因子分泌（图12和13）。用该程序产生的细胞显示平均四次插入，与基于CAR MC - SB MC DNA的方案相比较低（6-8次插入；图14）。
实施例4：使用自穿透转座酶蛋白作为货物穿梭体进入细胞
将HeLa细胞接种到Nunc™ Lab-Tek™ II 8孔Chamber Slides™（ThermoFisher）上（每孔2 x104个细胞，在补充有10%（v/v）人血清和2 mM L-谷氨酰胺的500µLDMEM中）。第二天，将细胞与浓度为0.5 µM的hsSB-GFP在250 µL/孔无血清DMEM中孵育1小时。然后，去除培养基并用PFA 4%的PBS固定细胞，以及用DAPI孵育30分钟以观察细胞核。在EMBL Heidelberg的ALMF核心实验室中，使用Zeiss LSM 780共聚焦显微镜（使用63x油浸物镜）对细胞进行成像。为了成像，将细胞核的中间部分置于焦点中以检测hsSB的核定位。
图15示出通过GFP荧光成像观察到hsSB-GFP融合蛋白（hsSB融合至GFP的N端）在1小时内进入细胞核（A）并至少在随后的24小时内被保留（B）。图16A和B示出在HeLa细胞中hsSB的无催化活性突变体的相同效果。此外，将hsSB融合至GFP的C端同样促进穿透至HeLa细胞中（图17）。
在另一个实验中，在HeLa细胞中探测了截短的hsSB（即由蛋白质的DNA结合结构域组成的版本（图18A下图））。结果表明hsSB的DNA结合结构域足以从培养基中自主的细胞穿透。使用SB特异性抗体用免疫荧光成像在细胞中检测hsSB DBD。蛋白质（肽）在3小时内进入细胞（图18A）并至少在随后的24小时被保留（图18B）。
参考文献
1. C. H. Lamers et al., Immune responses to transgene and retroviralvector in patients treated with ex vivo-engineered T cells. Blood117, 72-82(2011).
2. F. Bushman et al., Genome-wide analysis of retroviral DNAintegration. Nat Rev Microbiol3, 848-858 (2005).
3. M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaksinduced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.Nat Biotechnol36, 765-771 (2018).
4. E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale,CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med24, 927-930 (2018).
5. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in humanpluripotent stem cells. Nat Med24, 939-946 (2018).
6. R. Monjezi et al., Enhanced CAR T-cell engineering using non-viralSleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia31, 186-194(2017).
7. M. Hudecek et al., Going non-viral: the Sleeping Beauty transposonsystem breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol52,355-380 (2017).
8. M. M. D'Aloia, I. G. Zizzari, B. Sacchetti, L. Pierelli, M.Alimandi, CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death Dis9, 282 (2018).
9. Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, Z. Izsvak, Molecularreconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and itstransposition in human cells. Cell91, 501-510 (1997).
10. A. J. Dupuy, N. A. Jenkins, N. G. Copeland, Sleeping beauty: anovel cancer gene discovery tool. Human molecular genetics15 Spec No 1, R75-79 (2006).
11. R. Hodge, S. A. Narayanavari, Z. Izsvak, Z. Ivics, Wide Awake andReady to Move: 20 Years of Non-Viral Therapeutic Genome Engineering with theSleeping Beauty Transposon System. Human gene therapy28, 842-855 (2017).
12. K. Kawakami, D. A. Largaespada, Z. Ivics, Transposons As Toolsfor Functional Genomics in Vertebrate Models. Trends in genetics : TIG33,784-801 (2017).
13. P. Kebriaei, Z. Izsvak, S. A. Narayanavari, H. Singh, Z. Ivics,Gene Therapy with the Sleeping Beauty Transposon System. Trends in genetics : TIG33, 852-870 (2017).
14. C. J. Turtle et al., Durable Molecular Remissions in ChronicLymphocytic Leukemia Treated With CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells After Failure of Ibrutinib. J Clin Oncol35, 3010-3020(2017).
15. C. A. Klebanoff, S. A. Rosenberg, N. P. Restifo, Prospects forgene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nat Med22, 26-36(2016).
16. J. Tipanee, Y. C. Chai, T. VandenDriessche, M. K. Chuah,Preclinical and clinical advances in transposon-based gene therapy. Biosci Rep, (2017).
17. P. Kebriaei et al., Phase I trials using Sleeping Beauty togenerate CD19-specific CAR T cells. The Journal of clinical investigation126,3363-3376 (2016).
18. M. Galla et al., Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic acids research39, 7147-7160 (2011).
19. X. Huang et al., Unexpectedly high copy number of randomintegration but low frequency of persistent expression of the Sleeping Beautytransposase after trans delivery in primary human T cells. Human gene therapy21, 1577-1590 (2010).
20. Q. Liang, J. Kong, J. Stalker, A. Bradley, Chromosomalmobilization and reintegration of Sleeping Beauty and PiggyBac transposons.Genesis47, 404-408 (2009).
21. A. Wilber et al., Messenger RNA as a source of transposase forsleeping beauty transposon-mediated correction of hereditary tyrosinemia typeI. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy15,1280-1287 (2007).
22. Z. Jin et al., The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100Ximproves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigenreceptor. Gene therapy18, 849-856 (2011).
23. M. Holstein et al., Efficient Non-viral Gene Delivery into HumanHematopoietic Stem Cells by Minicircle Sleeping Beauty Transposon Vectors.Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy26,1137-1153 (2018).
24. H. Zayed, Z. Izsvak, D. Khare, U. Heinemann, Z. Ivics, The DNA-bending protein HMGB1 is a cellular cofactor of Sleeping Beautytransposition. Nucleic acids research31, 2313-2322 (2003).
25. A. Hendel et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol33, 985-989 (2015).
26. T. Gaj, J. Guo, Y. Kato, S. J. Sirk, C. F. Barbas, 3rd, Targetedgene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature methods9, 805-807 (2012).
27. M. Trubitsyna et al., Use of mariner transposases for one-stepdelivery and integration of DNA in prokaryotes and eukaryotes bytransfection. Nucleic acids research45, e89 (2017).
28. A. O. Paatero et al., Bacteriophage Mu integration in yeast andmammalian genomes. Nucleic acids research36, e148 (2008).
29. T. S. Rasila et al., Mu transpososome activity-profiling yieldshyperactive MuA variants for highly efficient genetic and genome engineering.Nucleic acids research46, 4649-4661 (2018).
30. Y. Cai et al., DNA transposition by protein transduction of thepiggyBac transposase from lentiviral Gag precursors. Nucleic acids research42, e28 (2014).
31. K. A. Skipper et al., Time-Restricted PiggyBac DNA Transpositionby Transposase Protein Delivery Using Lentivirus-Derived Nanoparticles.Molecular Therapy - Nucleic Acids11, 253-262 (2018).
32. S. Kim, D. Kim, S. W. Cho, J. Kim, J. S. Kim, Highly efficientRNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9ribonucleoproteins. Genome Res24, 1012-1019 (2014).
33. J. A. Zuris et al., Cationic lipid-mediated delivery of proteinsenables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol33, 73-80 (2015).
34. L. Mates et al., Molecular evolution of a novel hyperactiveSleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer invertebrates. Nature genetics41, 753-761 (2009).
35. F. Voigt et al., Sleeping Beauty transposase structure allowsrational design of hyperactive variants for genetic engineering. Nat Commun7,11126 (2016).
36. V. Avramopoulou, A. Mamalaki, S. J. Tzartos, Soluble, oligomeric,and ligand-binding extracellular domain of the human alpha7 acetylcholinereceptor expressed in yeast: replacement of the hydrophobic cysteine loop bythe hydrophilic loop of the ACh-binding protein enhances protein solubility.The Journal of biological chemistry279, 38287-38293 (2004).
37. M. Cozzolino et al., Cysteine 111 affects aggregation andcytotoxicity of mutant Cu,Zn-superoxide dismutase associated with familialamyotrophic lateral sclerosis. The Journal of biological chemistry283, 866-874 (2008).
38. H. Slusarczyk, S. Felber, M. R. Kula, M. Pohl, Stabilization ofNAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directedmutagenesis of cysteine residues. Eur J Biochem267, 1280-1289 (2000).
39. X. Xie et al., Rational improvement of simvastatin synthasesolubility in Escherichia coli leads to higher whole-cell biocatalyticactivity. Biotechnol Bioeng102, 20-28 (2009).
40. Z. Izsvak, Z. Ivics, R. H. Plasterk, Sleeping Beauty, a widehost-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates.Journal of molecular biology302, 93-102 (2000).
41. M. L. Davila et al., Efficacy and toxicity management of 19-28zCAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med6,224ra225 (2014).
42. S. L. Maude et al., Chimeric antigen receptor T cells forsustained remissions in leukemia. N Engl J Med371, 1507-1517 (2014).
43. D. W. Lee et al., T cells expressing CD19 chimeric antigenreceptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: aphase 1 dose-escalation trial. Lancet385, 517-528 (2015).
44. X. Wang et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide forselection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood118,1255-1263 (2011).
45. Z. Ivics, Z. Izsvak, A. Minter, P. B. Hackett, Identification offunctional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America93, 5008-5013 (1996).
46. S. Charrier et al., Quantification of lentiviral vector copynumbers in individual hematopoietic colony-forming cells shows vector dose-dependent effects on the frequency and level of transduction. Gene therapy18,479-487 (2011).
47. G. Luo, Z. Ivics, Z. Izsvak, A. Bradley, Chromosomaltransposition of a Tc1/mariner-like element in mouse embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America95, 10769-10773 (1998).
48. P. B. Hackett, D. A. Largaespada, K. C. Switzer, L. J. Cooper,Evaluating risks of insertional mutagenesis by DNA transposons in genetherapy. Transl Res161, 265-283 (2013).
49. J. Chusainow et al., A study of monoclonal antibody-producing CHOcell lines: what makes a stable high producer Biotechnol Bioeng102, 1182-1196(2009).
50. T. L. Lu et al., A Rapid Cell Expansion Process for Production ofEngineered Autologous CAR-T Cell Therapies. Hum Gene Ther Methods27, 209-218(2016).
51. L. Gattinoni et al., A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med17, 1290-1297 (2011).
52. C. A. Klebanoff, L. Gattinoni, N. P. Restifo, Sorting throughsubsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptiveimmunotherapy J Immunother35, 651-660 (2012).
53. C. J. Turtle et al., CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+composition in adult B cell ALL patients. The Journal of clinical investigation126, 2123-2138 (2016).
54. M. V. Maus et al., T cells expressing chimeric antigen receptorscan cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res1, 26-31 (2013).
55. H. Singh, H. Huls, P. Kebriaei, L. J. Cooper, A new approach togene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade Tcells to target CD19. Immunol Rev257, 181-190 (2014).
56. O. Makarova, E. Kamberov, B. Margolis, Generation of deletion andpoint mutations with one primer in a single cloning step. BioTechniques29,970-972 (2000).
57. S. Ruf et al., Large-scale analysis of the regulatoryarchitecture of the mouse genome with a transposon-associated sensor. Nature genetics43, 379-386 (2011).
58. M. Hudecek et al., The nonsignaling extracellular spacer domainof chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity.Cancer Immunol Res3, 125-135 (2015).
59. M. Hudecek et al., The B-cell tumor-associated antigen ROR1 canbe targeted with T cells modified to express a ROR1-specific chimeric antigenreceptor. Blood116, 4532-4541 (2010).
60. M. Hudecek et al., Receptor affinity and extracellular domainmodifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigenreceptor T cells. Clin Cancer Res19, 3153-3164 (2013).
61. H. Li, R. Durbin, Fast and accurate short read alignment withBurrows-Wheeler transform. Bioinformatics25, 1754-1760 (2009).
62. A. R. Quinlan, I. M. Hall, BEDTools: a flexible suite ofutilities for comparing genomic features. Bioinformatics26, 841-842 (2010).
63. J. T. Robinson et al., Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol29, 24-26 (2011).
64. W. Huber et al., Orchestrating high-throughput genomic analysiswith Bioconductor. Nature methods12, 115-121 (2015).
65. B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S. L. Salzberg, Ultrafast andmemory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology10, R25 (2009).
66. C. W. Chiang et al., Ultraconserved elements in the human genome:association and transmission analyses of highly constrained single-nucleotidepolymorphisms. Genetics 192, 253-266 (2012)。
序列表
<110> 欧洲分子生物学实验室
尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学
<120> 细胞穿透转座酶
<130> 21F-1881-CNP
<150> EP19158066.1
<151> 2019-02-19
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 高溶解度转座酶
<400> 1
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Ser
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ser Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 2
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SB100X
<400> 2
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于重组表达的hsSB
<400> 3
Gly Pro Met Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys
1 5 10 15
Arg Ile Val Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser
20 25 30
Lys Arg Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys
35 40 45
Tyr Lys His His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg
50 55 60
Arg Val Leu Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln
65 70 75 80
Ile Asn Pro Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu
85 90 95
Thr Gly Thr Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg
100 105 110
His Asn Leu Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn
115 120 125
Arg His Lys Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys
130 135 140
Asp Arg Thr Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile
145 150 155 160
Glu Leu Phe Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly
165 170 175
Glu Ala Ser Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Ile Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala
195 200 205
Leu His Lys Ile Asp Gly Ser Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile
210 215 220
Leu Lys Gln His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg
225 230 235 240
Lys Trp Val Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val
245 250 255
Val Ala Lys Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro
260 265 270
Ser Gln Ser Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu
275 280 285
Lys Lys Arg Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His
290 295 300
Gln Leu Cys Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly
305 310 315 320
Lys Leu Val Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe
325 330 335
Lys Gly Asn Ala Thr Lys Tyr
340
Claims (15)
1.一种用于对靶生物细胞进行基因工程化的方法，所述方法包含以任何顺序的以下步骤：（i）将转座子构建体引入生物细胞和/或提供包含转座子构建体的生物细胞；（ii）在不存在或不使用蛋白质转染程序或蛋白质转染试剂的情况下，将所述靶生物细胞与转座酶蛋白质接触。
2.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转座酶蛋白质是或衍生自睡美人（SB）转座酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述SB转座酶是包含与SEQ ID NO：1至3中任一个所示的序列具有至少80％序列同一性的序列的蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述转座酶蛋白质由SEQ ID NO：1至3中任一项所示的氨基酸序列组成，或基本上由其组成，与这些序列相比，任选地具有不超过50个氨基酸的取代、添加、插入、缺失或倒位。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过将所述转座酶蛋白质添加至含有所述生物细胞的培养基中来提供所述转座酶蛋白质，优选地添加至所述靶生物细胞的细胞培养基中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述靶生物细胞为哺乳动物细胞，优选地选自干细胞，例如造血干细胞、胚胎干细胞；自发永生细胞；人工永生细胞；原代细胞（神经元、静息T细胞）；衍生自B细胞的细胞，例如浆细胞；中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；诱导多能干细胞（iPSC）；或者是免疫细胞，例如T淋巴细胞，优选地CD4或CD8阳性T细胞；或者是自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、树突细胞或B细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述转座子包含编码蛋白质的核苷酸序列，例如编码抗体、T细胞受体或嵌合抗原受体（CAR）的序列。
8.一种用于将货物化合物递送至生物细胞中的方法，所述方法包含将货物化合物共价地或非共价地且直接地或间接地连接至穿梭蛋白质以获得货物穿梭复合体，以及将所述生物细胞与所述货物穿梭复合体接触；其特征在于所述穿梭蛋白质包含转座酶蛋白质序列，优选地转座酶蛋白质如权利要求1至7中任一项所定义。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述穿梭蛋白质被共价地或非共价地连接至连接子化合物，优选地其中所述连接子化合物适合于将所述货物化合物共价地或非共价地连接至所述穿梭蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述连接子化合物选自分选酶供体或受体位点、生物素或链霉亲和素蛋白质、或蛋白质连接系统的功能替代组分。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述货物化合物选自小分子；大分子；肽；多肽；蛋白质；核酸，例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体；PNA；或者是糖化合物、含脂肪酸的化合物。
12.一种转座酶蛋白质将货物化合物递送至生物细胞中的用途，其中所述转座酶蛋白质被用作细胞穿梭蛋白质并被共价地或非共价地且直接地或间接地连接至所述货物化合物。
13.一种细胞穿梭体，其包含
（i）共价地或非共价地连接至货物化合物的转座酶蛋白质；或者
（ii）共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物适合于所述细胞穿梭体与所述货物化合物的共价或非共价连接；或者
（iii）共价地或非共价地连接至连接子化合物的转座酶蛋白质，并且其中所述连接子化合物进一步被共价地或非共价地连接至货物化合物。
14.一种用于将转座酶蛋白质引入生物细胞中的方法，所述方法包含在不存在蛋白质转染试剂或不使用蛋白质转染程序（例如电穿孔）的情况下将细胞与所述转座酶蛋白质接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述转座酶蛋白质是如前述权利要求中任一项所定义的转座酶蛋白质。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19158066.1 | 2019-02-19 | ||
| EP19158066 | 2019-02-19 | ||
| PCT/EP2020/054371 WO2020169673A1 (en) | 2019-02-19 | 2020-02-19 | Cell penetrating transposase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113661247A true CN113661247A (zh) | 2021-11-16 |
Family
ID=65494055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080015307.2A Pending CN113661247A (zh) | 2019-02-19 | 2020-02-19 | 细胞穿透转座酶 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220145332A1 (zh) |
| EP (1) | EP3927835A1 (zh) |
| JP (1) | JP2022520283A (zh) |
| CN (1) | CN113661247A (zh) |
| AU (1) | AU2020226714A1 (zh) |
| CA (1) | CA3130645A1 (zh) |
| WO (1) | WO2020169673A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109477073A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-03-15 | 来恩生物医药私人有限公司 | 表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104428310A (zh) * | 2012-06-26 | 2015-03-18 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 细胞穿透肽和鉴定细胞穿透肽的方法 |
| WO2017046259A1 (en) * | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Ethris Gmbh | Improved transposon system for gene delivery |
| US20170101629A1 (en) * | 2014-04-09 | 2017-04-13 | Dna2.0, Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
| WO2017062668A2 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Dna2.0, Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
| US20180209960A1 (en) * | 2011-05-23 | 2018-07-26 | Phylogica Limited | Method of Determining, Identifying or Isolating Cell-Penetrating Peptides |
| CN110997909A (zh) * | 2017-08-21 | 2020-04-10 | 欧洲分子生物学实验室 | 改进的转座酶多肽及其用途 |
| CN113498439A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-10-12 | 波赛达治疗公司 | 纳米转座子组合物及使用方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5677170A (en) | 1994-03-02 | 1997-10-14 | The Johns Hopkins University | In vitro transposition of artificial transposons |
| DE102015012301B4 (de) | 2015-09-23 | 2021-07-15 | Pfeiffer Chemie-Armaturenbau Gmbh | Kanalsystem für eine Leitungskomponente einer prozesstechnischen Anlage, System zum Detektieren einer Prozessmediumsleckage und Leitungskomponente der prozesstechnischen Anlage |
-
2020
- 2020-02-19 CA CA3130645A patent/CA3130645A1/en active Pending
- 2020-02-19 US US17/431,903 patent/US20220145332A1/en active Pending
- 2020-02-19 CN CN202080015307.2A patent/CN113661247A/zh active Pending
- 2020-02-19 WO PCT/EP2020/054371 patent/WO2020169673A1/en unknown
- 2020-02-19 JP JP2021548222A patent/JP2022520283A/ja active Pending
- 2020-02-19 EP EP20704565.9A patent/EP3927835A1/en active Pending
- 2020-02-19 AU AU2020226714A patent/AU2020226714A1/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180209960A1 (en) * | 2011-05-23 | 2018-07-26 | Phylogica Limited | Method of Determining, Identifying or Isolating Cell-Penetrating Peptides |
| CN104428310A (zh) * | 2012-06-26 | 2015-03-18 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 细胞穿透肽和鉴定细胞穿透肽的方法 |
| US20170101629A1 (en) * | 2014-04-09 | 2017-04-13 | Dna2.0, Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
| WO2017046259A1 (en) * | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Ethris Gmbh | Improved transposon system for gene delivery |
| WO2017062668A2 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Dna2.0, Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
| CN110997909A (zh) * | 2017-08-21 | 2020-04-10 | 欧洲分子生物学实验室 | 改进的转座酶多肽及其用途 |
| CN113498439A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-10-12 | 波赛达治疗公司 | 纳米转座子组合物及使用方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JOSHUA D. RAMSEY等: "Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells I Elsevier Enhanced Reader", PHARMACOL. THERA, pages 78 - 86 * |
| MICHAEL HUDECEK等: "Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side", CRITICAL REVIEWS IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 52, no. 4, pages 355 - 380, XP055541375, DOI: 10.1080/10409238.2017.1304354 * |
| PETER JA¨RVER等: "Co-transduction of Sleeping Beauty Transposase and Donor Plasmid via a Cell-penetrating Peptide: A simple one step Method", INT J PEPT RES THER, vol. 14, pages 60 * |
| 胡云燕: "AtHARBI1-2蛋白的原核表达及其核酸酶活性测定", 中国硕士学位论文全文数据库 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109477073A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-03-15 | 来恩生物医药私人有限公司 | 表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞 |
| CN109477073B (zh) * | 2016-03-31 | 2024-04-12 | 来恩生物医药私人有限公司 | 表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2020226714A1 (en) | 2021-08-26 |
| CA3130645A1 (en) | 2020-08-27 |
| WO2020169673A1 (en) | 2020-08-27 |
| EP3927835A1 (en) | 2021-12-29 |
| US20220145332A1 (en) | 2022-05-12 |
| JP2022520283A (ja) | 2022-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11912985B2 (en) | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence | |
| US11795452B2 (en) | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences | |
| KR102465067B1 (ko) | 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템 | |
| JP7240007B2 (ja) | 改良されたトランスポザーゼポリペプチドおよびその使用 | |
| JP6965466B2 (ja) | 操作されたカスケード構成要素およびカスケード複合体 | |
| WO2020069029A1 (en) | Novel crispr nucleases | |
| US20220145332A1 (en) | Cell penetrating transposase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |