JPH08506181A

JPH08506181A - 新規抗凝固性補助因子活性

Info

Publication number: JPH08506181A
Application number: JP6516938A
Authority: JP
Inventors: ダールベック，ビョルン
Original assignee: ダールベック，ビョルン
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1996-07-02
Also published as: EP0690991A1; US7169572B1; CA2154080C; FI953565A; NZ261190A; ATE168781T1; PL181102B1; BR9406223A; HU9502190D0; DE69411898T3; AU690535B2; PL310050A1; DE69411898T2; CA2154080A1; ES2119165T3; DK0690991T3; EP0690991B2; CZ184995A3; GR3027697T3; US20070212743A1

Abstract

(57)【要約】活性化プロテインＣ（＝ＡＰＣ）に対する第２補助因子活性であるＡＰＣ第２補助因子活性と称される新規血液抗凝固活性が記載されている。該補助因子活性は、それが第Ｖ因子についてのかかる方法と同様の方法を用いて血漿から豊富化され得るタンパクとして行動するので、第Ｖ因子に関連すると思われる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、豊富なフラクションは、３つの分子バンドを、各々、１７５−２５０kdおよび１００−１８０kdおよび３３０kdで生じる。補助因子活性が豊富なまたは欠損している調製物；ＡＰＣ第２補助因子活性に関連する第Ｖ因子部位について特異的な抗体調製物；ＡＰＣ第２補助因子活性、プロテインＣおよび／またはプロテインＳの欠損に関する障害の治療に関係する診断および治療的使用ならびにＡＰＣ第２補助因子活性（正常な第Ｖ因子）、プロテインＣ／ＡＰＣおよび／またはプロテインＳが豊富な調製物の様々な使用などの様々な態様が記載されている。ＡＰＣ第２補助因子活性は、補助因子の投与が患者に有益である他の疾患に関係しても治療的に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】新規抗凝固性補助因子活性本発明は、概して、ヒト血液凝固系に関係し、おそらく幾種類かの他の哺乳動物種の血液凝固系にも関係する新規抗凝固性補助因子活性に関する。血液凝固は、血小板と共働して止血を生じるように機能する多くのタンパクを含む複雑な系である。該凝固系は、血漿中および内皮血液細胞の表面上に存在する一連の抗凝固性タンパクによって厳密に調節される［エスモン（Esmon）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２６４（１９８９）４７４３−４７４６；ボーアー（Bauer）、セミナーズ・イン・ヘマトロジー（Sem．Hematol．）２８（１９９１）１０−１８；およびラパポート（ Rapaport）、ブラッド（Blood）７３（１９８９）３５９−６５］。生理学的条件下で、プローおよび抗−凝固性メカニズムは、止血および凝固を与えるように繊細にバランスが取られている。このバランスが乱されると、出血または血栓塞栓症が生じる。本発明は、近年、解明されたプロテインＣおよびプロテインＳに関連する生理学的に重要な抗凝固系に関係する新規活性に関し、下記スキーム１に説明する血液凝固相互作用の一部として示される。スキーム１前記抗凝固系において、ビタミンＫ依存性血漿タンパクであるプロテインＣは、トロンビン／トロンボモジュリン複合物による内皮細胞上の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）への活性化後、凝固第Ｖ_a因子および第VIII_a因子、すなわち、各々、凝固第Ｖ因子および第VIII因子の活性化形を選択的に分解する重要な成分である［エスモン、前記文献；ステンフロ（Stenflo）、プロテイン・シー・アンド・リレイテッド・プロテインズ（Protein C and related proteins）、バーチナ（Bertina）編（チャーチル・リビングストン・ロンガム・グループ（Churchill Livingstone Longham Group）、英国）（１９８８）２１−５４；マン（Mann）ら、Ann．Rev．Biochem．５７（１９８８）９１５−９５６；およびケイン（Kane）ら、ブラッド（Blood）７１（１９８８）５３９−５５］。ＡＰＣの活性は、第Ｖ_a因子および第VIII_a因子の分解においてＡＰＣに対して補助因子として機能するプロテインＳと称される別のビタミンＫ依存性血漿タンパクによって影響される［エスモン、前記文献；ステンフロ、前記文献；およびダ Haemostas．）６６（１９９１）４９−６１］。前記第Ｖ_a因子および第VIII_a因子は、各々、第Ｘ因子およびプロトロンビンの活性化に関係するリン脂質結合補助因子であり、かくして、フィブリノーゲンのフィブリンへの転換に、すなわち、クロット形成に間接的に関係する。したがって、凝固反応の速度は、第VIII因子および第Ｖ因子の活性化とそれらの活性化形の分解との間のバランスに依存し、非活性化第VIII因子および第Ｖ因子は、ＡＰＣについての乏しい基質である。血液凝固系における妨害は、重篤なかつしばしば生命を威嚇する症状としてよく発現され、該妨害の基礎となる原因についての知識は、診断および／または発現した病気の好結果の治療または血液凝固障害について疾病素質を有する個体のスクリーニングを可能にするために、非常に重要である。例えば、精製プロテインＣの治療的使用は、栓友病に関連するプロテインＣ欠損症の発見の結果として開発された。栓友病は、公知の危険因子の不在下で、成人における早発型静脈血栓塞栓症に向かう傾向と定義することができる。異常は、幾人かの栓友病患者について測定されたが、かかる場合の大部分において、検体検査異常は、同定されかった。本発明は、遺伝し、かつ、家族性栓友病に関連することが示された、ＡＰＣ耐性と称される活性化プロテインＣに対する抗凝固性反応における新しい欠損症に関する。２、３の場合、栓友病は、抗プロテインＣ抗体［ミッチェル（Mitchell）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New England Journal of Medicine）、１９８７、第３１６巻、１６３８−１６４２］、抗カルジオリピン抗体［アマー（Amer）ら、トロンボシス・リサーチ（Thrombosis Research）５７（１９９０）２４７−２５８］および欠損症第VIII因子分子［ダールベック６５、アブストラクト３９、６５８（１９９１）］などの仮定的因子に関連していた。本願の最優先日後に発行された文献であるＷＯ９３／１０２６１には、発現した血液凝固障害のin vitro診断方法または血液凝固障害について素因を与えられている個体のin vitroスクリーニング方法が開示されている。これらの方法は、試験されるべき個体由来の血漿試料に添加された外因性ＡＰＣに対する抗凝固性反応の測定に基づいており、ＡＰＣに対する弱い抗凝固性反応、すなわち、ＡＰＣ耐性は、血液凝固障害、特に血栓塞栓症の発現または該疾患についての疾病素質を示す。ＡＰＣ耐性について全く説明されていないが、ＡＰＣに対する耐性は、血液凝固系における未知の相互作用またはその未知の凝固因子によるものであることが示されている。しかしながら、ＡＰＣ耐性を、機能性プロテインＳ欠損症、プロテインＣ阻害性抗体、ＡＰＣについてのプロテアーゼ阻害剤、または耐ＡＰＣ性第Ｖ_a因子分子を与える突然変異または第VIII因子遺伝子突然変異に関係させるいくつかのなしうる説明は除外されていた。本発明によると、ＡＰＣ耐性は、第Ｖ_a因子および第VIII_a因子に対して向けられたＡＰＣのタンパク分解効果を増強する従前に認識されていない抗凝固性補助因子活性の欠損によることが判明した。この抗凝固性補助因子活性の発見について［プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Ｎatl．Acad．Sci．ＵＳＡ）、９０（１９９３）１００４−１００８］。該文献の発行日は、本願の最優先日後である。さらに詳しくは、この抗凝固活性は、第Ｖ因子によって発現されることが判明した。第Ｖ因子は、プロ凝固性（procoagulant）第Ｖ_a因子の前駆体であり、後者は、前記プロテインＣ抗凝固系においてＡＰＣによって分解されるので、この発見は驚くべきことである。かくして、第Ｖ因子は、ＡＰＣについて見いだされた第２の補助因子であり、第１の補助因子は、前記のようにプロテインＳである。したがって、本発明の新規抗凝固性補助因子活性は、「ＡＰＣ第２補助因子活性」または「第Ｖ因子抗凝固活性」と称され、場合により、第Ｖ因子は、「ＡＰＣ第２補助因子」とも称される。第Ｖ因子の従来公知の活性は、「第Ｖ因子プロ凝固活性」と称される。しかしながら、該活性が第Ｖ_a因子と関連する可能性は、全体的に排除することはできない。本発明の新規抗凝固性補助因子活性の発見は、血栓症を有するある患者および該患者の血漿を前記ＷＯ９３／１０２６１［１９９１年１１月１３日の優先日を持ち、ＵＳは、指定国の１つである；該文献の記載内容は、出典明示により本［トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb Haemost）６５、アブストラクト３９（１９９１）６５８］によって開示された方法でアッセイした場合の異常なＡＰＣ耐性の発見に基づいている。血栓症を有する患者の大きなコホートを研究すると、ＡＰＣ耐性は、特発性血栓塞栓事象の３０〜４０％において根元的な原因であることが判明した［トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb Hae mostas）６９、９９９、アブストラクト（１９９３）］。後に、本発明により、正常な血漿から得られた粗製フラクションが活性を含有し、これが耐ＡＰＣ性血漿の欠損を矯正したが、一方、著しいＡＰC耐性を有する患者由来の耐ＡＰＣ性血漿からの対応するフラクションが不活性であることが見いだされた。これは、ＡＰＣに対する新規補助因子の存在を証明する。さらに、この活性を測定するように設計されたアッセイで該活性において精製された調製物を使用することにより、ＡＰＣに対する新規補助因子の存在についての確証が成し遂げられた。かくして、本発明によると驚くべきことにヒト第Ｖ因子がプロ凝固性第Ｖ_a因子の前駆体としてのそのよく知られている機能に加えてＡＰＣに対する補助因子としての活性を有することが見いだされた。おそらく、このヒト第Ｖ因子の二重機能は、幾種類かの動物種、特に哺乳動物由来の血液から誘導された第Ｖ因子によっても発現されるが、他の種では発現されない。例えば、今までのところ得られた全ての結果は、ウシ血漿が該活性を欠いていることを示す。第Ｖ因子の該補助因子活性は、活性化プロテインＣのタンパク分解効果を増強し、かくして、第Ｖ_a因子、すなわち、第Ｖ因子の活性化形の分解および第VIII_a 因子の分解を促進するという結果を生じる。第Ｖ因子のプロ凝固活性がトロンビンによるその活性化によるものであり、３つのペプチド結合が切断され、その結果、天然第Ｖ因子のＮ末端部分とＣ末端部分との間に複合物としてプロ凝固性第Ｖ_a因子の形成を生じることは、従前によく知られている。しかしながら、第Ｖ因子の中央部分から誘導された２つの大きな活性化ペプチドの機能は知られていない。本明細書の実施例において示すように、ＡＰＣ第２補助因子活性は、使用されたＡＰＣ耐性試験において第Ｖ_a因子については見いだされなかった。かくして、ＡＰＣ第２補助因子活性は、無傷の第Ｖ因子分子によって選択的に発現され、おそらく、それらの第Ｖ_a因子への活性化の間に切断された大きなフラグメントが該活性の大部分に寄与する。しかしながら、該活性が、精製工程の下では分解されない、第Ｖ因子との非常に安定な複合物を形成する分子全体に関連する可能性は、全体的に排除することはできない。したがって、本発明に関して、「第Ｖ因子」および「ＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子」なとの表現は、第Ｖ因子の複合体および第Ｖ因子のフラグメント、好ましくは該活性を有する、第Ｖ因子のトロンビン切断により生じるフラグメント以外のものをも包含するものである。保持されたＡＰＣ補助因子活性を有する修飾第Ｖ因子は、ヘビ毒酵素および他のプロテアーゼなどのヒトまたは非ヒト起源の他の酵素によるタンパク分解性切断を介しても得られる。さらにまた、ＡＰＣ第２補助因子活性がその精製の間に未知の酵素による部分タンパク分解後に残存することが判明した。これは、ＡＰＣ第２補助因子活性第Ｖ因子フラグメントの可能性のある存在を示す。ＡＰＣ第２補助因子および抗凝固活性を有する第Ｖ因子なる表現は、該活性を発現する第Ｖ因子／第Ｖ_a因子のフラグメントおよびサブユニットまたは該活性に関連する領域に関する免疫的決定因子を含む。便宜のために、凝固因子などは、本明細書の全体にわたって関連する種ではないが、特記しない限り、好ましくは、ヒト起源のかかる因子を意味する。本明細書の実施例には、本発明の新規ＡＰＣ第２補助因子活性の精製および特徴付けのために使用される方法が記載され、その第Ｖ因子との関係が証明される。第Ｖ因子でのＡＰＣ第２補助因子活性の存在についての証明の概要は、以下のとおりである：１．ＡＰＣ第２補助因子活性の単離のために設計された方法と第Ｖ因子の単離のための初期の方法とは、非常に類似している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、３つのバンドが約２００〜２２０kＤa（Ｃ末端部分）、１４０〜１６０kＤa（Ｎ末端部分）および第Ｖ因子について報告されたものと非常に類似する３３０kＤaで出現オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Ｉnvest．）６６（１９８０）５８３−９１を参照のこと］。３３０kＤaでのバンドの強度は、精製工程の間に高濃度のプロテアーゼ阻害剤を使用すると、ＡＰＣ第２補助因子活性および第Ｖ因子の両方について増強される。例えば、１０mＭのベンズアミジン・塩酸塩濃度は、３３０kＤaで有意なバンドを生じさせる。２．ヒト第Ｖ因子に対する特異的ポリクローナル抗血清［ダコパット・アクティーゼルスカブ（DakopattＡ／Ｓ）、デンマーク国］は、ウエスタン・ブロッティングでＡＰＣ第２補助因子活性に関連する３つのバンドの各々と反応する。３．トロンビンのＡＰＣ第２補助因子活性からなる本発明調製物への添加後、３つのバンドは消失し、得られた生成物は、第Ｖ因子のトロンビン活性化によって形成される生成物と区別がつかなくなる。４．第Ｖ因子と反応する１７のモノクローナル抗体は、免疫原としてＡＰＣ第２補助因子活性に関して精製された調製物を使用することによって得られた。該モノクローナル抗体のうち２つは、第Ｖ因子プロ凝固活性を阻害せずにＡＰＣ第２補助因子活性を一部阻害した。５．第Ｖ因子プロ凝固活性およびＡＰＣ第２補助因子活性は、試験されたいずれのクロマトグラフィー物質上でも共溶離される。試験された物質を示すと、ヘパリン・セファロース、ブルー−セファロース、麦芽レクチン・セファロース、Ｑ−セファロースおよびＳ−セファロース［ファーマシア（Pharmacia）、スウェーデン国］である。６．第Ｖ因子プロ凝固活性およびＡＰＣ第２補助因子活性は、共に、ヒト第Ｖ因子に対するポリクローナル抗体を有するマトリックス上に保持される［ダコパッツ・アクティーゼルスカブ（Dakopatts Ａ／Ｓ）、デンマーク国］。７．第Ｖ因子プロ凝固活性およびＡＰＣ第２補助因子活性は、共に、ヒト第Ｖ因子と交差反応するウシ第Ｖ因子の種々のフラグメントに対する抗血清を有するマトリックス、例えば、セファロースおよびアフィゲル（Affigel）などの上に保持される。８．第Ｖ因子プロ凝固活性およびＡＰＣ第２補助因子活性は、共に、免疫原としてＡＰＣ第２補助因子活性に関して精製された調製物を使用することによって調製された高親和性モノクローナル抗体を有するクロマトグラフィー支持体、例えば、アフィゲルなどの上に保持され、共溶離される。本質的に、この抗体は、ＡＰＣ第２補助因子活性または第Ｖ因子プロ凝固活性のいずれも阻害しなかった。溶離は、約１０.５〜１１のpＨで行った。９．最近の刊行物は、第Ｖ因子に対する自己抗体が血栓を生じることを開示している［カプア・エイ（Kapur Ａ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（A．J．Hematol．）４２（１９９３）３８４−３８８］。ＡＰＣ第２補助因子活性が豊富な調製物は、第Ｖ因子の単離のために従前に使用されたと同様の方法によって得られた。カルシウムイオンなどの二価の金属イオンがＡＰＣ第２補助因子活性に対して安定化効果を有することが判明した。故に、カルシウムイオンは、精製の間に添加された。実質的には、同一の精製方法が、前記ＷＯ９３／１０２６１に開示されている新規活性を説明するための最初の試みとして使用された。ここで与えられた結果に従って、新規活性は、第Ｖ因子、または、可能な場合、前記のようなその複合物もしくはフラグメントの新規特性として示されたＡＰＣへの補助因子活性として定義された。かくして、別の、より簡単な調製方法が利用可能となる。ゲルクロマトグラフィー、アフィニティリガンドとして抗ＡＰＣ第２補助因子活性抗体などを用いるアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの現行の方法が、好適には改良後に、使用された。さらに、ＤＮＡ組換え技術に基づく方法も適用可能である。したがって、本発明は、血液、または、血漿などの血液関連物質から誘導された調製物であって、該調製物が、ＡＰＣに対する補助因子として抗凝固活性を示すことができる血液凝固成分に関して精製され、それにより、第Ｖ_a因子および第VIII_a因子に対して向けられたそのタンパク分解活性を増強し、該血液凝固成分が、第Ｖ因子、または、所望により、第Ｖ因子の安定な複合物および該活性を示すことができる分子単位からなる調製物にも関する。第Ｖ因子の正常な血漿レベルは、約１０〜２０μg／mlである。他の血液凝固／抗凝固因子と同様に、正常な血漿１ml中のＡＰＣ第２補助因子活性を、自由裁量により１ユニット（Ｕ）と記す。本発明は、ＡＰＣ第２補助因子活性に関連する第Ｖ因子の領域、例えば、ＡＰＣ第２補助因子活性またはＡＰＣ第２補助因子不活性を引き起こすエピトープを有する部位がある領域に対して特異的な抗体および抗体調製物にも関する。かかる抗体調製物は、ポリクローナル、または、好ましくは、モノクローナルである。好ましくは、かかる調製物の抗体は、ＡＰＣ第２補助因子活性に関連する１以上の第Ｖ因子部位に特異的に結合する。別に、かかる部位は、第Ｖ因子のＡＰＣ第２補助因子不活性、かくして、ＡＰＣ耐性に関係するエピトープからなっていてもよい。本発明に関して、「ＡＰＣ第２補助因子不活性に関係するエピトープ」なる表現は、ＡＰＣ第２補助因子活性の減少または消失に関するエピトープを含むことを意味する。ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ（hen，chicken）の如きトリなどの好適な動物の適正な免疫原による免疫化、および、該動物から誘導された適切な流体から、例えば、哺乳動物の場合には血液もしくは血清から、または、トリを免疫化した場合にはタマゴからの該抗体の回収からなる公知方法に従って得ることができる。およびミルシュタイン，シー（Milstein，C．）［ネイチャー（Nature）２５６、４９５（１９７５）］によって開示されたような慣用の方法によって得られるモノクローナル抗体である。一般に、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、哺乳動物、好ましくはマウスを適正な免疫原で免疫化し、骨髄腫細胞と免疫化された動物由来の脾臓細胞などのリンパ球との融合によりハイブリッド細胞を生成し、好適な培地において融合細胞を選択し、抗体産生性細胞をスクリーニングし、抗体産生性細胞、すなわちハイブリドーマをクローニングし、次いで、マウスの腹水中または所望により培養培地中で、その中での該ハイブリドーマの増殖によりモノクローナル抗体を産生することを含む。しかしながら、抗原に結合する本発明のモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、当該技術分野でよく知られているように、組換え技術に基づく方法に従って得ることもできる。かかる方法において、真核または原核起源の好適な宿主細胞を使用することができる。かかる宿主細胞は、当該技術分野でよく知られている。免疫原として、第Ｖ因子の精製調製物を使用することができるか、または、そのフラグメントまたは誘導体は、ＡＰＣ第２補助因子活性の出現の原因である抗原性決定因子からなる。かかるフラグメントまたは誘導体は、通常、抗原性になるべきタンパクである免疫原性担体にコンジュゲートしてもよい。免疫原として、正常な無傷のヒト第Ｖ因子とではなく免疫原と反応性のあるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択するための二工程スクリーニング方法と組み合わせた（下記に従って得ることができる）ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損しているヒト第Ｖ因子を使用することによって、ヒトＡＰＣ第２補助因子不活性エピトープ、すなわち、ＡＰＣ第２補助因子活性の減少または消失に関連するエピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体が有効に得られる。本発明の好ましい具体例は、少なくとも一部において、第Ｖ因子のＡＰＣ第２補助因子活性に結合し、かつ、該活性を阻害するモノクローナル抗体に関連する。本発明は、抗原に結合することができるかかるモノクローナル抗体の誘導体およびフラグメントにも関する。本発明によれば、マウス／マウスハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、容易に得られるので好ましい。かかるモノクローナル抗体についての例としては、仮受託番号ＸＡＭ−４−５−１９３１２０８４６を有する英国サリスバリィのヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（European Collection of Animal cell culture）、ピーエイチエルエス・センター・フォー・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・リサーチ（ＰＨＬＳ Centre for Applied Microbiology ＆ Research）に１９９３年１２月８日に寄託された新規ハイブリッド細胞系によって産生されたものが挙げられる。本発明に関して、このハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体は、Ｍ４（マスター（Master）４）と称される。特記しない限り、「抗体（または抗体調製物）」なる用語は、その２つの重鎖および２つの軽鎖を有する無傷の抗体ならびに可変ドメイン（Ｆ_v）を含有する誘導抗体の種々の形態、例えば、Ｆab、Ｆab'、Ｆ（ab'）₂などのフラグメント；一本鎖抗体；放射性標識化、蛍光または酵素結合抗体などの標識抗体；固相に結合した抗体などを包含する。本発明の別の具体例は、１、２、３、４、５またはそれ以上の異なるモノクローナル抗体などの前記特異性を有する一定数のモノクローナル抗体からなるか、または、ポリクローナルである抗体調製物に関連している。ＡＰＣ第２補助因子活性に関連する部位に固有に存在するエピトープに対して特異的に向けられるポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物は、試料中のＡＰＣ第２補助因子活性の存在または不在を特異的に（定量的および定性的に）測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、および、好ましくは、仮受託番号ＸＡＭ−４−５−１９３１２０８４６を有する前記ハイブリドーマに関する。第Ｖ因子を精製するために使用することができる第Ｖ因子について特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、従前に知られているが、ＡＰＣ第２補助因子活性に関連する第Ｖ因子の領域に対して意図的に生じさせられたモノクローナル抗体は、以前には開示されていない。本発明の抗体調製物（モノクローナルおよびポリクローナル）は、ほとんどの場合、本発明の抗体が固体担体に結合され、例えば血漿調製物中に存在する第Ｖ因子を選択的に結合するために使用されるアフィニティクロマトグラフィーに基づいた精製方法において使用することができる。次いで、固体担体に結合した第Ｖ因子は、溶離され、回収される。第Ｖ因子に結合し、第Ｖ因子のＡＰＣ第２補助因子活性を少なくとも一部分阻害する本発明の好ましいモノクローナル抗体を使用して、第Ｖ因子の該活性を阻害することができる。かかるモノクローナル抗体は、従前に知られている抗第Ｖ因子抗体のように、ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している血漿調製物を得るためにも使用される。本発明の重要な態様は、第Ｖ因子の新規抗凝固活性、すなわち、ＡＰＣ第２補助因子活性の知識を使用する治療方法、薬物および医薬組成物に関する。したがって、本発明は、in vivoでＡＰＣの抗凝固活性を増強または維持するための薬物または医薬組成物の製造のためのＡＰＣに対する補助因子として抗凝固活性を有する第Ｖ因子、そのサブユニットまたはフラグメントの使用にも関する。特に、かかる組成物は、血栓症および汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を含む血栓塞栓障害などの血管障害に罹っているかまたはその疾病素質を有する患者の治療用である。かかる薬物または医薬組成物は、−７０℃のような低温で貯蔵することができる、高度に精製された第Ｖ因子調製物からなる。本発明調製物は、例えば、動脈および静脈血栓症についての増加したリスクに関連する種々の臨床状況において、個体が矯正または増強された血液抗凝固活性から利益を得る他の状態または状況に関して使用してもよい。さらにまた、本発明のＡＰＣ第２補助因子活性は、ＡＰＣの効果に非常に重要であるので、この活性は、それ自体またはプロテインＣ／ＡＰＣおよび／またはプロテインＳと組み合わせて使用してもよい。これが重要であることを証明する臨床状況は、特に、血栓症のリスクが増加する状況において、ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している患者を含む。さらに、補足的なＡＰＣ第２補助因子活性は、血栓崩壊治療後の心筋梗塞に関して、術後期の、特に、危険な患者において、血栓症について治療を受けた患者に対する補助薬として顕微手術を受けている患者においてなどで有益である。ＡＰＣ第２補助因子活性についての投与経路は、静脈内または動脈内注射または輸液などの血液凝固／抗凝固因子による治療のために通常適用されるものである。他の血液因子について示唆されるように、経口投与を排除することはできない。投与量は、小さな効果でさえ血栓症のおそれのある患者に有益であるという条件下で、少なくとも期間じゅう、患者自身の活性化プロテインＣの効果または共投与したプロテインＣ／活性化プロテインＣの効果を完全にまたは一部維持するという意味において有効であるべきである。１〜１００、おそらく４０〜７０ mg／日の範囲の量が有用であるとみなすことができる。ＡＰＣ第２補助因子活性を示す第Ｖ因子は、哺乳動物の身体中で代謝されるので、反復投与が好ましい。種々のタイプの利用可能な医薬組成物は、他の血液凝固／抗凝固因子用と同様であるが、ＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子のために必要である特異的な安定性必要条件に適応される。例えば、所望により適切な賦形剤で希釈されていてもよい凍結乾燥またはスプレイ乾燥粉末剤および無菌または無菌的に調製された水性溶液剤を使用することができる。本発明の別の態様は、ＡＰＣ第２補助因子活性の欠損に関連する障害の治療用医薬組成物の調製のためのプロテインＣ／活性化プロテインＣおよび／またはプロテインＳの使用に関する。プロテインＣおよびプロテインＳの従来技術の治療用と同一タイプの組成物は、適用可能である。本発明の別の態様は、ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している第Ｖ因子調製物に関し、好ましくは、ヒトから誘導される。その有効な治療用途は、ＡＰＣ第２補助因子活性を超える第Ｖ_a因子活性の増加が患者に有益な場合である。前記治療方法および組成物は、哺乳動物、特に、ヒト用である。本発明の新規抗凝結補助因子活性は、ＡＰＣの機能活性に関するかかる血液凝固／抗凝固障害の診断方法を研究するために、および、ＡＰＣの機能活性に直接または間接的に左右される血液凝固／抗凝固系に関する成分の機能活性のモニターリングおよび／または測定方法を研究するためにも使用することができる。したがって、本発明の好適な具体例は、個体、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物の血液凝固／抗凝固障害、好ましくは、血栓塞栓障害の診断方法またはその疾病素質の測定方法であって、該方法が、該個体から誘導された試料、好ましくは、血液または血漿などの血液誘導試料において、抗凝固活性を示す血液成分のレベルを測定することからなり、該血液成分が第Ｖ因子からなり、ＡＰＣに対する補助因子としてのその抗凝固活性のレベルが測定され、異常な、好ましくは、減少したレベルが該障害についての症状発現または疾病素質を示し、特に、低下したレベルについては該障害が血栓塞栓障害である、血液凝固／抗凝固障害の診断方法またはその疾病素質の測定方法に関する。前記方法の好適な具体例は、プロテインＣ／ＡＰＣ、プロテインＳまたはＡＰＣ第２補助因子活性について個体からの適切な試料をアッセイし、判明した異常なレベル、好ましくは、低下したレベルを、欠損が血栓塞栓障害の根元的な原因であるか、または、該障害の疾病素質を与えるＡＰＣ第２補助因子としてのその能力においてアッセイした因子、すなわち、活性化プロテインＣ／プロテインＣ、プロテインＳまたは第Ｖ因子に関連する血液凝固障害を個体が有することを診断することに関係させることに関する。前記方法において、抗凝固ＡＰＣ第２補助因子活性のレベルは、以下に説明する機能性ＡＰＣ第２補助因子活性をアッセイするための本発明の方法に従って研究された方法に従って測定されるのが好ましい。そのＡＰＣ第２補助因子活性に関連する構造素子を有する第Ｖ因子について特異的な免疫ベース活性アッセイおよび非機能性アッセイを使用することもできる。かくして、本発明の別の態様は、活性化プロテインＣ／プロテインＣ、プロテインＳおよびＡＰＣ第２補助因子活性を示す第Ｖ因子についての機能的アッセイ、ならびに、ＡＰＣ第２補助因子活性を示す第Ｖ因子についての免疫アッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定方法にも関する。アッセイ自体は、診断薬として以外の、例えば、ＡＰＣ補助因子系における成分の精製方法のモニターリング、対照血漿の標準化などの他の用途も有する。Ａ．ＡＰＣ、プロテインＣ、ＡＰＣ第２補助因子活性およびプロテインＳの機能的アッセイこれらのアッセイは、初期に開示されたと同様のプロトコールを利用する［ベルティナ（Bertina）ら、Res．Clin．Lab．２０（１９９０）１２７−１３８；ウルフ（Wolf）ら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb．Haemost．）６２（１９８９）１１４４−１１４５；ＷＯ−Ａ−９１０２８１２；ＷＯ−Ａ − ンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb．Haemost．）６５、アブストラクト３９、（１９９１）６５８］。かくして、ＡＰＣ、プロテインＳおよび第Ｖ因子（後者は、ＡＰＣ第２補助因子としてのその能力における）の系における成分は、ＡＰＣによって適切なＡＰＣ基質の転換からアッセイされる。正常なＡＰＣ基質は、第Ｖ_a因子および／または第VIII_a因子であり、これらの一方または両方は、非活性化（第Ｖ因子、第VIII因子）または活性化タンパクの、組換え技術による調製物を含む富化されたまたは非常に精製された調製物としてアッセイ媒質に添加されるのが好ましい。比較されるべき一連の試料内で、アッセイ媒質は、実質的には、同一レベルの（ａ）ＡＰＣまたはプロテインＣがアッセイされるべきである場合、ＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子または同一の試料誘導活性を遮断する阻害薬およびプロテインＳまたは試料誘導プロテインＳ活性を遮断する阻害薬のうちの少なくとも１つ；（ｂ）ＡＰＣ第２補助因子活性がアッセイされるべきである場合、プロテインＳまたは試料誘導プロテインＳ活性を遮断する阻害薬およびＡＰＣのうちの少なくとも１つ；ならびに（ｃ）プロテインＳがアッセイされるべきである場合、ＡＰＣ第２補助因子活性を与える第Ｖ因子または同一の試料誘導活性を遮断する阻害薬およびＡＰＣのうちの少なくとも１つを有する。したがって、比較されるべきである一連の試料についての最終アッセイ媒質は、試料およびＡＰＣの基質、ならびに、所望により、好ましい突然変異体においては、試料から誘導されず、ＡＰＣ、プロテインＳまたはプロテインＳに対する阻害薬およびＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子またはこの活性に対する阻害薬から選択される１または２つの、好ましくは２つの物質を含有しており、ただし、残存する物質の１つは、アッセイされるべき実態（すなわち、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＳまたはＡＰＣ第２補助因子活性）である。本発明方法は、ａ）水性アッセイ媒質中、１以上の工程で、試料、および本質的に試料中に存在するかまたはアッセイ媒質に添加されるＡＰＣに対する基質ならびに所望により本質的に試料中に存在するかまたはアッセイ媒質に添加されるさらなる血液凝固成分をインキュベートし、ｂ）ａ）によるインキュベーションの間にＡＰＣによって生じた基質の転換を測定し、次いで、ｃ）測定されるべき活性に公知の方法で測定された値を関連させることからなり；該方法では、所望により、１または２つの、好ましくは、２つの物質は、ａ）のアッセイ媒質に添加され、該物質は、ＡＰＣ、プロテインＳまたはプロテインＳ阻害薬、および抗凝固活性を有する第Ｖ因子または該活性に対する阻害薬から選択され、ただし、残存する物質ＡＰＣ、プロテインＳまたはＡＰＣ第２補助因子活性のうちの１つは、試料に存在し、第Ｖ因子についての機能活性が測定されるべきである成分であり、該活性は、ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性である。存在してもよい他の成分の例としては、凝固酵素および第Ｖ_a因子および／または第VIII_a因子の分解の測定を可能にする他の血液因子が挙げられる。これら他の因子は、別々に添加されても、試料中に既に存在していてもよい。試料がプロテインＣを含有し、ＡＰＣがアッセイされるべきである場合、プロテインＣについての活性化因子を添加しなければならない。試料がアッセイ反応を妨害する変化するレベルの凝固因子（アッセイされるべきもの以外のもの）を含有する場合、試験結果における試料内変化を回避するためにそれらを過剰に（すなわち、アッセイ媒質中で実質的に一定値に）確保すべきである。血漿試料について、一定値は、アッセイされるべき実態が欠損している正常な血漿を過剰に添加することによって行われる。添加されるべき成分は、富化されたかまたは非常に精製された形態であってもよい。第VIII因子／第VIII_a因子および／またはＡＰＣ補助因子活性を示さない第Ｖ因子の形態の添加が好適であると考えることができる。ＡＰＣ補助因子活性を欠いている形態の例としては、該活性が欠損しているヒト第Ｖ因子、該活性を通常は示さない種からの第Ｖ因子（例えば、ウシ第Ｖ因子、およびＡＰＣ第２補助因子活性ではなく第Ｖ因子活性を示す第Ｖ因子フラグメント）が挙げられる。アッセイ媒質におけるプロテインＳの添加は、ＡＰＣ第２補助因子活性またはプロテインＣが測定されるべきである場合、プロテインＳにおける試料内変化によって生じる測定値の変化を回避するために行われる。プロテインＳが測定されるべきである場合、ＡＰＣ第２補助因子活性は、同一の目的のために添加される。この背景にある主要な思想は、測定されるべき因子以外の因子の機能活性レベルを、操作間でアッセイ媒質中で実質的に一定に維持することである。前記したとおり、これは、かかる因子を過剰にアッセイ媒質中に含ませることによって、例えば、正常な血漿を過剰に添加することによって、および／または、例えば、かかる因子の活性の原因であるエピトープに結合する抗体などのかかる因子についての機能的に過剰の阻害薬を含ませることによって行われる。かくして、プロテインＳのＡＰＣ補助因子活性の原因であるエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、ＡＰＣ第２補助因子活性をアッセイするためのアッセイ媒質中に成功裏ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２６５（１９９０）８１２７−８２３５］。同様に、前記モノクローナル抗体のようなＡＰＣ第２補助因子活性についての機能的阻害薬は、プロテインＳがアッセイされるべきである場合、アッセイ媒質中に有効に含まれる。本発明によると、機能的アッセイは、添加された第VIII因子／第VIII_a因子の存在下で好適に行われる。添加されるべき成分の混合順序についての原理および種々の測定原理は、当該技術分野でよく知られている。前記引用文献を参照のこと。これは、ＡＰＣ活性がフィブリノーゲン（凝固アッセイ）および活性がＡＰＣ活性によって影響される凝固酵素に対する色素産生性基質などの基質によって追跡されることも含む。かくして、好適な色素産生性、蛍光産生性および発光産生性基質は、トロンビンおよび第Ｘ_a因子基質である。試料は、通常、個体／患者由来の血漿であるか、または、試料は、ＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子、プロテインＣ（ＡＰＣ）またはプロテインＳ（これらの全ては、製造プロセスから誘導される）、または、アッセイで使用されるべき標準であってもよい。プロテインＣ／ＡＰＣまたはプロテインＳについての診断方法における付加物として、ＦＶ抗凝固活性についてのアッセイにおける標準もしくは対照として、または、ＡＰＣ第２補助因子活性が一部または完全に欠損している患者に投与するための治療薬として、血漿から精製した天然の第Ｖ因子（ＦＶと略記される）の代わりにＦＶを組換え技術を介して産生したもの（ｒＦＶ）を使用してもよい。別法としては、プローまたは抗凝固活性の修飾された発現を有するＦＶの組換え変異体またはフラグメントは、同一の目的のために、および、ＦＶ抗凝固活性のための方法における付加物においても利用される。かかる修飾は、ＦＶにおけるトロンビンの突然変異またはＡＰＣ切断部位を介して生じさせられる。前者の場合はＦＶのプロ凝固活性が、および後者の場合はＦＶの抗凝固活性が、一部または完全に失われる。さらにまた、かかる種またはその好適な免疫原性ペプチドフラグメントは、診断用または治療用のモノクローナル抗体の調製のために使用される。ＡＰＣ基質としての第Ｖ_a因子および／または第VIII_a因子およびＡＰＣ基質転換を測定するための試料からの因子を利用するＡＰＣ第２補助因子活性についてのアッセイにおいて、ＡＰＣ活性に対する感度は、ビタミンＫ拮抗薬による治療により患者からの血漿中でかなり増加させられ、ある凝固アッセイ、特に、ＡＰＴＴ試験における凝固時間の延長を増加させる。ＡＰＣ活性に対する増加した感度は、第IX因子、第Ｘ因子および第II因子などのビタミンＫ依存性タンパクの低下したレベルによって説明される。ＡＰＣ第２補助因子活性は、ビタミンＫ依存性ではないので、したがって、所望によりプロテインＳと組み合わせてもよい第IX 因子、第IX_a因子、第Ｘ因子および第II因子のうち少なくとも１つなどのあるビタミンＫ依存性タンパクのアッセイ媒質への外因性添加によってかかる患者からの血漿中のこの活性を測定することを可能にする。これらのタンパクは、クエン酸バリウム溶離液［ダールベック（Dahlback）、バイオケミカル・ジャーナル（ Biochem．J．）２０９（１９８３）８３７−４６］または水酸化アルミニウム溶離液［ベルティナ（Bertina）ら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Throm bos Hemostas）５１（１９８４）１−５］などの重金属塩溶離液の形態で、または、ＡＰＣ基質転換を測定する前に精製された成分として添加される。血漿が（標準または低分子量の）ヘパリンを含有する場合、過剰のヘパリンを添加することによって、または、アッセイ結果への妨害を減少させるためのヘパリン阻害薬としてポリブレンまたはプロタミンなどを添加することによってこの効果を中和するのは好適である。前記のとおり、ＰＣ／ＡＰＣまたはプロテインＳの機能的活性または第Ｖ因子抗凝固活性を測定するための本発明方法は、例えば前掲の引用文献（出典明示により本明細書の一部とする）において初期に開示された方法と同様である。かくして、これらの方法の詳細な説明は、必要とされない。しかしながら、本質的には、かかる方法は、速度が直接または間接的に測定されることができ、アッセイされるべき物質に関係している基質の転換の測定に基づいており、例えば、好適には、試料中に本質的に存在するかまたは試料に添加される、転換速度を検出するのに必要なさらなる成分の存在下での凝固または色素産生性アッセイに基づいている。かかる成分は、基質転換速度の測定のために使用され得る活性化凝固因子を導入するために供される試薬からなる。この試薬は、少なくとも第IX_a因子を存在させ、ある凝固因子または内因的もしくは外因的経路を介して系を活性化させる試薬からなる。したがって、この試薬は、第IX_a因子または第XI_a因子（内因的経路）、第XII_a因子（内因的経路）、カリクレイン（内因的経路）、カオリン、セライトまたはエラグ酸（内因的経路）などの接触活性化因子（内因的経路）、ＡＰＴＴ試薬（活性化部分トロンボプラスチン時間；すなわち、リン脂質および接触活性化因子（内因的経路）を含有する試薬）、組織トロンボプラスチン（ＰＴ試薬、ＰＴ＝プロトロンビン時間（外因的経路））、組織因子、第VII_a因子および第Ｘ_a因子であってもよい。添加することができる他の成分は、使用されるモードに左右され、モニターされたもの以外の酵素に対する血漿プロテアーゼ阻害薬またはフィブリン重合阻害薬の包含を必要とする。Ｃa²⁺は、遊離非複合形態のＣa²⁺イオン、すなわち、遊離非複合形態の強いＣa²⁺イオンを与える血漿可溶性塩の形態である。かかるさらなる成分としては、好適には、第VIII因子／第VIII_a因子および第Ｖ因子／第Ｖ_a因子も挙げられる。転換速度が測定される基質は、活性が活性化プロテインＣ、例えば、トロンビン（＝第II_a因子）および第Ｘ_a因子によって影響される酵素に対する合成基質からなる。好適な合成基質は、水溶性であり、３、４または５つのアミノ酸残基およびアミノペプチダーゼによる攻撃から保護されるアミノ末端を有するオリゴペプチド構造を有するのが好ましい。該保護は、保護基によって、またはアミノ末端にＤ−アミノ酸を有することによって行われる。検出可能な応答を与えるために、合成基質のカルボキシ末端は、特異的に放出され、かつ、関連血液凝固プロテアーゼの作用により検出され得る基でアミド化される。放出されるべき基は、色素産生性、蛍光産生性、または化学発光産生性基および他の分析的に検出可能な基の間で選択される。さらに、エイチ・シー・ヘンカー（H．C．Hemker）、「ハンドブック・オブ・シンセティック・サブストレーティス・フォー・ザ・コアギュレーション・アンド・フィブリノリティック・システム」（Handbook ofsyn thetic substrates for the coagulation and fibrinolytic system）、マルティヌス・ニジョフ・パブリシャーズ（Martinus Hijhoff Publishers）、１９８３およびジェイ・フェアード（J．Fareed）ら、「シンセティック・ペプタイド・サブストレーティス・イン・ヘモスタティック・テスティング」（Synthetic peptide substrates in hemostatic testing）、シーアールシー・クリティカル・リビューズ・イン・ケミカル・ラボラトリー・サイエンシズ（ＣＲＣ Critica l Reviews in Clinical Laboratory Sciences）第１９巻、イシュー２、７１− １３４（１９８３）を参照のこと。血漿試料以外の試料の場合、外因的フィブリノーゲンが基質として添加されてもよい。測定されるべき物質に関する特異的結果を得るためには、ある場合には、できる限り高い最終アッセイ媒質の血漿試料含量を維持することを試みるべきである。したがって、良好な特異性を有する試験中の血漿試料含量は、＞１０％、特に、＞２０％または＞３５％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、他の場合には、実質的に低い含量、すなわち、１０％（ｖ／ｖ）未満を使用することができる。Ｂ．ＡＰＣ第２補助因子活性についてのイムノアッセイ本発明の抗体調製物は、ＡＰＣ第２補助因子活性の免疫アッセイを可能にするであろう。かかるアッセイは、抗ＡＰＣ第２補助因子抗体がある量の試料中でＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子と免疫複合物を形成させられることを意味し、これは、試料中のＡＰＣ第２補助因子活性レベルの定量的または定性的尺度である。該試料は、機能的アッセイについてと同様である。本発明は、ＢおよびＣのアッセイのための試薬にも関する。血漿から精製されたか、または、組換え技術によって調製されたＡＰＣ第２補助因子活性を示す第Ｖ因子からなる精製調製物、所望により活性化形態であっても、プロテインＣ活性化因子と組み合わせてもよいプロテインＣ調製物、およびプロテインＳ調製物（所定量のそれらの各々の因子を含有する）は、前記アッセイにおいて試薬または標準または対照として使用される。プロテインＣ調製物は、所望によりプロテインＳと組み合わせてもよい、第IX因子、第Ｘ因子および第 II因子から選択される少なくとも１つのビタミンＫ依存性凝固因子と組み合わせてもよい。治療用生成物および調製物は、組換え技術によって得られてもよい。さらにまた、本発明のモノクローナル抗体は、組換え技術によって得られてもよく、実質的には、よく知られているＰＣＲ技術を使用して、所望の特異性を有するかかる抗体を得てもよい。情報が第Ｖ因子抗凝固活性およびプロテインＳの間の相互関係に基づいて種々の第Ｖ因子突然変異体について得られるという指摘がある。方法は、好適な抗体の存在または不在下でかかる情報を得るように設計される。抗体の存在下でのかかる方法は、第Ｖ因子抗凝固活性およびプロテインＳなどの分析物についての定量的方法として使用されてもよい。Ｃ．ハイブリダイゼーションアッセイ本願の出願直前に得られた最近の結果は、遺伝したＡＰＣ耐性を有する大家族の慣用のＤＮＡ結合研究において、第Ｖ因子遺伝子における中性多形性およびＡＰＣ耐性の発現の間に強いつながりがあることを示した。これは、第Ｖ因子における突然変異がＡＰＣ耐性の原因であることを強く示している。これは、低レベルのＡＰＣ第２補助因子活性のために、血栓のおそれがある個体を検出するために、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸配列決定が慣用方法で使用され得るという確証である。かくして、これらのタイプのアッセイは、個体において、ＡＰＣ第２補助因子活性を有するか、または、この活性が欠損している第Ｖ因子分子の発現の存在または不在について固有の１以上の核酸フラグメントおよび／または配列の異常な存在または不在を検査するために使用される。プロトコールおよび条件は、第Ｖ因子遺伝子について特異的な試薬、および、所望により、ＡＰＣ耐性に関連するかまたは正常な第Ｖ因子遺伝子について特異的な突然変異体を使用することを除いては、他の遺伝子について通常適用されたものと同様である。個体からの細胞試料が適切である。さらにまた、本発明は、第Ｖ_a因子プロ凝固活性を発揮するように活性化される能力を有するが、抗凝固活性（好ましくは、ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性ではない）を発揮する能力は有しない第Ｖ因子、好適には、ヒト第Ｖ因子に関しており、該因子は、実質的に純粋な形態である。本発明の別の態様は、（好ましくはＡＰＣに対する補助因子としての）抗凝固活性を発揮する能力を有するが、第Ｖ_a因子のプロ凝固活性を発現する能力を有しない第Ｖ因子、好適には、ヒト第Ｖ因子に関連する。かかる因子は、正常な第Ｖ因子についてと同様の方法で血漿から精製することができるか、または、組換え技術によって調製することができる。可能な適用は、標準において、補足試薬として、および治療用である。図面に関する以下の説明において、本発明をさらに説明する。これらの図面については、以下のとおりである。第１図は、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性のＱ−セファロース（Ａ）およびセファクリルＳ−３００（Ｂ）上でのクロマトグラフィーを示す。第２図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット法およびアガロースゲル電気泳動法での単離されたＡＰＣ第２補助因子活性／第Ｖ因子の特徴付けによる結果を示す。第３図は、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーによるＡＰＣ第２補助因子活性および第Ｖ因子の共精製（copurification）を示す。第４図ＡおよびＢは、精製したＡＰＣ第２補助因子活性／第Ｖ因子によるＡＰＣ耐性の矯正（correction）を示す。物質および方法ＡＰＣ第２補助因子活性についてのアッセイ最近開示されたＡＰＣ−ＡＰＴＴ法［ＰＣＴ／ＳＥ／９２００７８１；およびデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ）、９０（１９９３）１００４−１００８］の変形を研究して、ＡＰＣ第２補助因子活性をその精製の間に測定した。当該方法は、遺伝したＡＰＣに対する乏しい応答を有した個体からの血漿および乏しいＡＰＣ応答を標準化する能力について試験された正常な血漿から得られたフラクションを使用した。ＡＰＣ第２補助因子活性アッセイと称されるアッセイを以下のとおり行った：ＡＰＣに対する乏しい応答を示す血漿（ＡＰＣ耐性血漿と称される）５０μlを試験フラクション５０μlおよび活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試薬（ＡＰＴＴ −オートメイテッド（automated）、オルガノン・テクニカ（Organon Technica ）（ＵＳＡ））５０μlと一緒に３７℃で５分間インキュベートした後、ＡＰＣ −ＣaＣl₂混合物（特記しない場合は、０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０mＭＴris−ＨＣl、０.０５ＭＮaＣl、３０mＭＣaＣl₂（pH７.５）中２０nＭヒトＡＰＣ）５μlの添加によって凝固を開始させ、該凝固時間を測定した。試験試料中のＡＰＣ第２補助因子活性の存在は、凝固時間の増加に関連する。好適には、各試料は、ＡＰＣの該ＣaＣl₂溶液への添加なしでも平行して分析され、凝固時間のＡＰＣ依存性延長を算出した。ＡＰＣ第２補助因子活性についての投与−応答曲線を作成するために、ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している血漿を対照血漿と混合し、ＡＰＣ−ＡＰＴＴ法において試験血漿として使用した。ＡＰＣの抗凝固応答は、対照血漿のパーセンテージに関連しており、曲線は、指数形を有した。ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している血漿がＡＰＣ第２補助因子活性を発現する第Ｖ因子を完全に欠いていたかが知られていなかったので、該アッセイは、種々のフラクションにおける補助因子の半定量を提供するだけであった。しかしながら、該アッセイは、ＡＰＣ第２補助因子活性をその精製の間に追跡する手段を提供するという目的にかなった。従前の開示［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．C lin．Invest．）６６、５８３−５９１（１９８０）］に従って、第Ｖ因子欠損血漿を使用して、第Ｖ因子凝固アッセイを行った。第Ｖ因子活性の存在は、該欠損血漿の凝固時間を短縮させた。ＡＰＣ第２補助因子活性アッセイおよび第Ｖ因子凝固アッセイの両方において、ユニットに転換された結果よりも初期の凝固データが示された。電気泳動方法、免疫学的方法および他の方法：従前に開示された技術［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２６１、９４９５−９５０１（１９８６）］を使用して、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下の勾配（５〜１５％）ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン・ブロット法を行った。第Ｖ因子に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清は、ダコパッツ・アクティーゼルスカブ（Dakopatts Ａ／Ｓ）の親切な贈与物であった。抗血清の特異性を示すデータは、従前に報告されていた［ブラッド（Blood）６８、２４４−２４９（１９８６）］。ウシ第Ｖ因子の単離された重鎖および軽鎖フラグメントに対してウサギポリクローナル抗体を生じさせた［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２６１、９４９５−９５０１（１９８６）］。従前に詳細に開示されたとおり［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２６５、８１２７−８１３５（１９９０）］、標準的な方法を使用してモノクローナル抗体を生じさせた。Balb／cマウスの免疫化において、Ｓ−３００プール中の精製したタンパクを抗原として使用した。１７種類の抗体を得、それらの反応性をウエスタン・ブロット法を用いて試験した。製造者の指示に従って、マスター（Master）３０と称される抗体約２０mgをアフィゲル（Affigel）１０（バイオラッド（Biorad））４mlに結合させた。ヒト第Ｖ因子およびウシ第Ｖ因子フラグメントに対するポリクローナル抗血清のＩgＧフラクションをアフィゲルに結合させた（約５mg／ml）。実施例１：ＡＰＣ第２補助因子活性の精製試料の全操作は、氷浴上で行った；クロマトグラフィーおよび遠心分離は、冷所で、好適には４℃で行った。血液回収：地方血液銀行からヒトの新しく冷凍（ −７０℃）したクエン酸処理血漿を入手した。冷凍血漿（２.３Ｌ）を３７℃で解凍し、以下のプロテアーゼ阻害薬を添加した：フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（１mＭ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）（１mＭ）、ダイズトリプシン阻害薬（５０mg／Ｌ）、トラシロール（Trasy lol）（アプロチニン（aprotinin））（１０ユニット／mlと同等の１.５mg／Ｌ）、およケミカル・ジャーナル（Biochem．Ｊ．）２０９（１９８３）８３７−８４６］に従って、血漿（氷浴上に維持している）をクエン酸バリウム吸着に付し、バリウム吸着した血漿を、固体ＰＥＧの添加によって分留されたポリエチレングリコール沈殿（ＰＥＧ６０００）（８％ｗ／ｖ）に付した。８％ＰＥＧ上澄み液中でＡＰＣ補助因子活性を回収した。８％ＰＥＧ上澄み液を同量の１０mＭベンズアミジンで希釈し、次いで、１０mＭベンズアミジンを含有する、２０mＭＴris− ＨＣl、０.１ＭＮaＣl、１mＭＣaＣl₂（pH７.５）中で平衡化されたＱ−セファロース［スウェーデン国ウプサラのファーマシア・エルケイビー・バイオテクノロジー（Pharmacia ＬＫＢ Biotechnology）］と混合した。１時間、ゆっくりと混合した後、ベフナー漏斗においてゲルを回収し、平衡緩衝液Ａ３Ｌ、０.１％Ｔween ２０を有する平衡緩衝液Ｂ１Ｌ、および０.１ＭＮaＣlの代わりに０. １５ＭＮaＣlを含有する平衡緩衝液Ｃ２Ｌで洗浄した。次いで、ゲルをカラム（直径５cm）に充填し、吸着されたタンパクをＮaＣlの一次勾配液（２０mＭＴr is-ＨＣl、１mＭＣaＣl₂、１０mＭベンズアミジン（pH７.５）中０.１５−０. ５ＭＮaＣl、各勾配容器中１.５Ｌ）で溶離した。流速は、３３０ml／時であり、フラション１１mlを回収した。フラクションを、１／１０希釈において、ＡＰＣ第２補助因子活性および第Ｖ因子活性について分析した（第１図）。水平棒（horizontal bar）によって示されるようにフラクションを集め、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄沈殿に付した（７０％飽和）。該沈殿物を遠心分離によって回収し、１０mＭベンズアミジン、１mＭＤＦＰおよび１mＭＰＭＳＦを含有する最少量の２０mＭＴris−ＨＣl、０.１５ＭＮaＣl、１mＭＣaＣl₂（pH7.5）に溶解させ、ＤＥＰおよびＰＭＳＦを用いない以外は同一の緩衝液で平衡化させたセファクリルＳ−３００（ファーマシア（Pharmacia））を有するカラム（２.５cm× ９３cm）に適用した。該カラムを１０ml／時で操作し、フラクション１.２mlを回収した。フラクションを、１／１０希釈において、ＡＰＣ第２補助因子活性アッセイおよび第Ｖ因子アッセイを用いて分析した（第１図）。水平棒によって示されるようにフラクションを集め、−７０℃で貯蔵した。実施例２：モノクローナル抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィーＳ−３００クロマトグラフィーにより実施例１において得られたタンパク（所定の操作において、２０mＭＴris−ＨＣl、０.１ＭＮaＣl、２mＭＣaＣl₂（p H７.５）中約６mg）を、マスター３０と称され、実施例３において得られる固定化モノクローナル抗体を有するアフィゲルのカラム（０.７５cm×７.５cm）に適用した。該カラムおよびタンパクは、２０mＭＴris−ＨＣl、０.１ＭＮaＣl、２mＭＣaＣl₂（pH７.５）中で平衡化させた。溶出液の吸光度が０に達するまでカラムを洗浄した後、結合タンパクを５０mＭジエタノールアミン、２mＭＣaＣl₂（pH１０．６）で溶離した。該溶出液のpＨを３ＭＴris−ＨＣl （pＨ７.５）（フラクション１ml当たり５０μl）ですぐに中和した。該フラクションを、ＡＰＣ第２補助因子活性アッセイおよび第Ｖ因子凝固アッセイにより（１／５希釈で）分析した。活性フラクションを集め、限外濾過（ＹＭ１０薄膜）によって濃縮し、−７０℃で貯蔵した。精製したＡＰＣ第２補助因子／第Ｖ因子を、従前の開示［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Clin．Invest．）６６、５８３−５９１（１９８０）］に従って、トロンビンで活性化させた。実施例３：モノクローナル抗体の調製標準的なプロトコールに従って、Ｂalb／cマウスの免疫化のために免疫原として、実施例１からの精製タンパク、すなわち、第Ｖ因子（ＡＰＣ第２補助因子）を使用した。該マウスからの脾臓細胞をＳp２／０Ａg１４マウス骨髄腫細胞系（前掲）による開示に従って、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンＤＭＥＭ培地中で選択した。固相エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、マウス由来の抗血清中の第Ｖ因子に対して産生された抗体を検出し、抗体産生性ハイブリッド細胞を検出した。これらのアッセイにおいて、第Ｖ因子（標準的なコーティング緩衝液中１０μg／ml）を、微量滴定プレート上のウエル中で被覆した。免疫マウス由来の抗血清およびハイブリッド細胞培養物の上澄み液を希釈中でウエルに添加し、個々のウエルを、自体公知の方法で酵素標識二次抗体の助けにより第Ｖ因子に結合された抗体の存在についてアッセイした。正のウエルからのハイブリッド細胞、すなわち、抗体産生性細胞を限界希釈によってクローン化し、サブクローン化し、拡大させた。プリスタン前処理マウスの腹腔内における移植後、モノクローナル抗体は、腹水中で多量に産生された。１７のマスターを得た。これらの全ては、ウエスタン・ブロット法に従って示されるように第Ｖ因子についての抗原性決定因子と反応し、これらのモノクローナル抗体の大部分（Ｍabと略記する）は、第Ｖ因子の同一領域、すなわち、第Ｖ因子の中央の１５０kＤaからなる活性化フラグメントに向かう。マスター３０と称されるこれらのＭabのうちの１つを、実施例２に従って第Ｖ因子のアフィニティピューリフィケーションのために使用した。実施例４この実施例では、実施例３において調製したＭabを試験して、血漿中の凝固活性およびＡＰＣ第２補助因子活性についてのそれらの影響を測定した。精製したＭabの４００μg／mlまでの増加する量を正常な血漿に添加し、インキュベーション（１５〜３０分）後、凝固分析に基づく慣用の第Ｖ因子アッセイを用いて第Ｖ因子の活性を測定し、外因性ＡＰＣに対する応答を以下のとおり測定した。変化する濃度のＭab（１０〜４００μｇ／ml）からなる正常な血漿試料を市販のＡＰＴＴ試薬と一緒にインキュベートした。（本試験において、オルガノン（ Organon）からのオートメイテッド（Automated）ＡＰＴＴを使用した。スウェーデン国メルンダルのクロモゲニックス・アクチボラゲット（ChromogenixＡＢ）、コーテスト・エイピーシー・レジスタンス（ＣＯＡＴＥＳＴＡＰＣResistanc e）からＡＰＴＴ試薬を用いて、同様の結果が得られた）。３７℃で５分間のインキュベーション後、３０mＭＣaＣl₂（０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２０mＭＴris−ＨＣl、５０mＭＮaＣl（pH７.５）中）または活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）（０.１％ＢＳＡを含有する２０mＭＴris−ＨＣl、５０mＭＮaＣl（pH７.５）に溶解させた３０mＭＣaＣl₂中約２μg／ml）のいずれかを添加し、凝固時間を測定した。実質的には、ダールベック従ってＡＰＴＴアッセイを行った。これらのＭabの存在は、慣用のＡＰＴ時間、すなわち、添加したＣaＣl₂からなる試料について得られた凝固時間に影響を与えなかった。あるいは、単に適度には、４５〜５０秒の凝固時間が観察された。しかしながら、マスター１およびマスター４と称されるＭabの２つがＣaＣl₂溶液中のＡＰＣを添加した試料についての凝固時間を短縮したことが判明した（ＡＰＣ時間）。以下の凝固時間が得られた：Ｍabの不在下でのＡＰＣ時間１１０〜１２０秒マスター４の存在下でのＡＰＣ時間８０〜９０秒。これらの結果は、マスター４の存在下での血漿中のＡＰＣ第２補助因子活性の一部の阻害を示す。マスター４のこの部分阻害活性は、添加量に依存することが判明し、最大阻害は、血漿１ml当たり５０〜１００μgのマスター４を添加する場合に得られた。マスター４は、前記のとおり沈殿した。前記試験からの結果について第１図〜第４図（Ａ、Ｂ）を参照して以下に検討する。さらに詳しくは、以下のとおりである。第１図は、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性のＱ−セファロース（Ａ）およびセファクリルＳ−３００（Ｂ）上でのクロマトグラフィーを示す。両方のカラム上で、ＡＰＣ第２補助因子活性の溶離プロフィル（上段）は、第Ｖ因子のもの（中段）と同時に起こった。第Ｖ因子活性は、第Ｖ因子欠損血漿の凝固時間の短縮として示され、一方、ＡＰＣ補助因子活性は、ＡＰＣ耐性血漿の凝固時間のＡＰＣ依存性延長に関連した。水平棒によって示されるようにフラクションを集めた。第２図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン・ブロット法およびアガロースゲル電気泳動法での単離されたＡＰＣ第２補助因子／第Ｖ因子の特徴付けによる結果を示す。実施例１で得られたＳ−３００カラムからのプールを、トロンビンとのインキュベーションの前後で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルをクーマシーブルー（Ａ）で染色するか、または、実施例３で得られたモノクローナル抗体（マスター３）（Ｂ）もしくはポリクローナル（Ｃ）抗体を使用してウエスタン・ブロット法に付した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した試料は、減少した；タンパク約２０μgをタンパク−染色ゲル中で各レーンに適用し、一方、ウエスタン・ブロット法のために使用されるレーンの各々には約１μgを適用した。トロンビン切断タンパクを有するレーンにＴと記す。分子量マーカーの位置は、左側に設けた。第Ｖ因子関連ポリペプチドには矢印を付し、一方、トロンビンによって形成されたフラグメント［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）２５７、６５５６−６５６４］は、矢じりによって示される。１５０kＤaフラグメントは、クーマシーによってあまり染色されないが、ウエスタン・ブロット法では容易に観察される。断続的に観察されるバンドは、星印によって示される。Ｓ−３００プールをアガロースゲル電気泳動法によっても分析した（下段）。血漿対照のアルブミン（alb）、α₁、α₂、β₁およびβ₂バンドの位置を垂線によって示す。第３図は、モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーによるＡＰＣ第２補助因子活性および第Ｖ因子の共精製を示す。Ｓ−３００プールをモノクローナル抗体（マスター３０）アフィニティクロマトグラフィーに適用した。カラムの結合能を超えていたので、タンパクのほとんどがカラムを通過した。カラムを洗浄した後、結合タンパクを高pHで溶離した（溶離の開始を矢印によって示した）。ＡＰＣ第２補助因子活性および第Ｖ因子アッセイの両方によりフラクションを分析した。第Ｖ因子活性は、第Ｖ因子欠損血漿の凝固時間の短縮に関連しており、一方、ＡＰＣ補助因子活性は、ＡＰＣ耐性血漿の凝固時間のＡＰＣ依存性延長を与えた。２本の破線は、緩衝液対照の凝固時間を示す。第４図Ａ−Ｂは、精製したＡＰＣ第２補助因子／第Ｖ因子によるＡＰＣ耐性の矯正を示す。親和性精製したＡＰＣ第２補助因子／第Ｖ因子（５０μlの容量中所定の濃度で）をＡＰＣ耐性血漿（５０ml）と混合した。次いで、該混合物をＣ aＣl₂溶液中、ＡＰＣの存在下（●）および不在下（○）で、ＡＰＣ第２補助因子活性アッセイ（Ａ）で試験し、かつ、第Ｖ因子アッセイ（Ｂ）で試験した。各点は、二重反復測定の平均を示す。結果試験血漿としてＡＰＣ耐性を有する個体からの血漿（ＡＳ血漿と称する）を使用して、生物学的アッセイを用いてＡＰＣ第２補助因子活性を分析し、ＡＰＣ第２補助因子の正常な血漿からの精製のために方法を工夫した。当該方法の第１工程は、クエン酸バリウム吸収であり、プロテインＣおよびＳを含むビタミンＫ依存性タンパクを除去した。クエン酸バリウム溶出液は、ＡＰＣ第２補助因子活性を全く有していなかった。ＰＥＧ６０００沈殿による上澄み液血漿の分留により、ＡＰＣ第２補助因子活性は、８％ＰＥＧ上澄み液中に存在し、一方、溶解した０〜８％ＰＥＧ６０００沈殿物は、ＡＰＣ第２補助因子活性を全く有していなかった。８％ＰＥＧ上澄み液中のＡＰＣ第２補助因子活性を、まず、Ｑ−セファロースを有するカラム上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって、次いで、セファクリルＳ−３００上でのゲル濾過によって精製した（第１図）。この精製プロトコールは、凝固第Ｖ因子の精製方法と非常に類似しており［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Invest．）６６５８３−５９１（１９８０）］、第Ｖ因子は、ＡＰＣ第２補助因子活性の同一フラクション中に見られた。精製は、種々の変形を伴って少なくとも１０回行い、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性についての溶離プロフィールは、一環して、非常に類似していた。Ｓ−３００プール中のタンパクは、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性の両方を発現し、第Ｖ因子について従前に報告された特徴を示した［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin.Inve st．）６６５８３−５９１（１９８０）］。ヘパリン・セファロース、ブルー・セファロースおよび麦芽アグルチニン・セファロースなどのいくつかの他のクロマトグラフィー原理を使用して２つの活性を分離するさらなる試みは、不成功に終わり（示さない）、実際には、ＡＰＣ第２補助因子活性は、試みられたすべてのクロマトグラフィー支持体上で第Ｖ因子と一緒に精製することが判明した。Ｓ−３００プール中のタンパクのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、約２２０,０００および１３０−１５０,０００の分子量を有するバンドに加えて、（一本鎖第Ｖ因子に対応する）３３０kＤＡバンドが生じた（第２図）。これらのバンドは、切断された第Ｖ因子を表し、３３０kＤa種と同様に、それらは、ウエスタン・ブロット法による第Ｖ因子に対するポリクローナル抗血清と反応した（第２図）。２２０kＤaバンドは、第Ｖ_a因子の７４kＤa軽鎖および２つの活性化フラグメントの大きい方（１５０kＤa）を含む第Ｖ因子のＣ末端部分を表し、ウシ第Ｖ_a因子の軽鎖に対する抗血清によって認識された（結果は、示さない）。１３０−１５０kＤaバンドは、第Ｖ因子のＮ末端部分（１０５kＤa重鎖＋２つの活性化フラグメントの小さい方）からなり、したがって、ウシ第Ｖ_a 因子重鎖に対する抗血清と反応した（結果は、示さない）。ウエスタン・ブロット法でポリクローナル第Ｖ因子抗血清と反応しなかった低分子量のさらなるバンドは、しばしば見られるが、存在する場合、Ｓ−３００クロマトグラフィー上での（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断される）それらの溶出プロフィルは、第Ｖ因子の活性またはＡＰＣ第２補助因子活性と関係しなかった。精製タンパクのトロンビンと一緒のインキュベーションは、トロンビン切断第Ｖ因子についてのフラグメント特徴を生じ、付随して、ＡＰＣ第２補助因子アッセイにおける活性が失われ、これは、ＡＰＣ第２補助因子活性が第Ｖ_a因子によってではなく、第Ｖ因子によってのみ発現されることを示した。アガロースゲル電気泳動により、精製タンパクは、インター−アルファ位に１つの種として移行し、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性は、共に、ゲルのこの位置から溶出された（示さない）。第Ｖ因子は、タンパク分解に対して非常に感受性が高いので、多量のプロテアーゼ阻害薬が最終プロトコールに含まれた。プロテアーゼ阻害薬の不在下で行うと、精製方法により３３０kＤa種を欠いているが、２２０kＤaおよび１３０−１５０kＤaバンドを含有する、より分解された産生物を生じた。この精製された産生物は、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性の両方を発現した。第Ｖ因子は、その安定性のためにカルシウムを必要とし；カルシウムが精製に含まれない場合、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性の両方が徐々に失われた。モノクローナル抗体の産生において、実施例３における抗原としてＳ−３００プール中のタンパクを使用した。１７の抗体が得られ、それらは、全て、ウエスタン・ブロット法によって判断されると、３３０kＤa−本鎖第Ｖ因子と、および、２２０kＤa種と反応することが判明した（第２図）。第Ｖ因子のトロンビン切断後、全ての抗体は、１５０kＤa活性化フラグメント（２つの活性化フラグメントのうち大きい方）と反応した。抗体のうちの１つ（マスター３０）をアフィゲルに固定化し、アフィニティクロマトグラフィーのために使用した（第３図）。Ｓ−３００プールをカラムに適用した。カラムに結合したタンパクを溶離し、第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性の両方を有することが判明した。両方の活性の溶出プロフィルは、同時に起こったが、かなりのトレイリング（trailing）を示した。より高いまたは低い pHまたは変性剤を使用するなどの他の溶離条件を試みたが、それらが両方の活性を失わせたので不成功に終わった。Ｓ−３００プールを、ヒト第Ｖ因子またはウシ第Ｖ_a因子フラグメントに対する固定化ポリクローナル抗体を有するカラムにも適用した。第Ｖ因子およびＡＰＣ第２補助因子活性は、共に、カラム上に保持されるが、結合タンパクを溶出することを必要とした変性条件により、両方の生物学的活性が失われた（結果は、示さない）。増加した濃度の、親和性精製したＡＰＣ第２補助因子／第Ｖ因子をＡＳ血漿に添加し、ＡＰＣに対する抗凝固応答を試験した。ＡＰＣに対する抗凝固応答の投与依存性増加が見られた（第４図Ａ）。正常な血漿のものと比較してＡＳ血漿のＡＰＣ応答を得るために第Ｖ因子の正常な血漿濃度と同じオーダーである約２５ mg／Ｌを必要とした（ＡＰＣの存在下での凝固時間：９０〜１１０秒）。親和性精製したタンパクは、凝固時間の短縮によって示されるように、第Ｖ因子アッセイにおいても活性であった（第４図Ｂ）。ＡＰＣ補助因子系における成分についてのアッセイ以下の実施例は、ＡＰＣ、ＡＰＣ第２補助因子活性を有する第Ｖ因子およびプロテインＳからなるＡＰＣ補助因子系における２つの成分の一定なレベルを維持し、残存するものを変化させることによって、種々の基質転換速度が達成されることを示す。これは、成分の各々について前記で概略記載したようなアッセイを構成することができることを意味する。ＡＰＣ第２補助因子活性が欠損している血漿を使用するアッセイは、物質および方法のセクションに記載した。実施例５：色素産生性アッセイにおけるＡＰＣ第２補助因子の効果該アッセイの原理は、ＦＸのＦIX_a依存性活性化を介してＡＰＣによるＦVIII_a の分解のモニターリングに基づいており、この系において、ＦVIII_aは、ＦIX_aに対する重要な補助因子として供する。かくして、ＦVIII_aの減少したレベルにより、ＦＸ_a感受性色素産生性ペプチド基質の加水分解を介して測定されたＦＸ_aの発生を減少させる。カビ・ファーマシア・アクチボラゲット（Kabi Pharmacia ＡＢ）、スウェーデン国ストックホルム］２ＩＵ／mＬを含有する５０mmol／ＬＴris−ＨＣl緩衝液（pH７.３、Ｉ＝０.１５）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の正常な血漿希釈液（１：２０）５０μＬを０.０６nkat／mＬウシトロンビン（活性対基質Ｓ−２２３８（クロモジェニックス・アクチボラゲット（Chromogenix ＡＢ）、スウェーデン国メルンダル））５０μＬと３７℃で３０秒間混合した。 II．次いで、４０mmol／ＬＴris-ＨＣl（pH７.３）および０.１５％ＢＳＡ、１２mmol／ＬＣaＣl₂、および３０μmol／Ｌリン脂質ならびに以下に定義する他の成分を含有する試薬（Ｒ）混合物１００μＬを前記混合物に添加し、次いで、３７℃で２分間インキュベートした。 III．次いで、この混合物から２５μＬをサブサンプリングし、０.２％ＢＳＡを有する５０mmol／ＬＴris−ＨＣl緩衝液（pH７.３、Ｉ＝０.１５）１セイ原理［クロモジェニックス・アクチボラゲット（Chromogenix ＡＢ）、スウェーデン国メルンダル］に従ってＦVIII活性を分析した。クロモジェニックス・アクチボラゲット（Chromogenix ＡＢ）、スウェーデン国メルンダル）および３０μmol／Ｌリン脂質を含有する試薬２００μＬを希釈したサブサンプル１００μＬと混合し、次いで、２５mmol／ＬＣaＣl₂１００μＬと混合した。３７℃で５分間インキュベートした後、０.９mmol／Ｌ色素産生性ＦＸ_a基質Ｓ−２７６５［クロモジェニックス・アクチボラゲット（Chromogenix ＡＢ）、スウェーデン国メルンダル］２００μlを添加した。３７℃でさらに
３分間インキュベートした後、２０％酢酸１００μＬの添加により基質加水分解を停止させ、放出されたクロモフォアｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリン）の吸光度を分光計で４０５nmで測定した。このアッセイ系において、試料中の活性ＦVIIIの濃度は、吸光度に正比例する。種々のＲ混合物中の補足成分の含量は、以下のとおりである：Ａ．ナシＢ．０.４μg／mＬＡＰＣＣ．０.４μg／mＬＡＰＣ＋０.３Ｕ／mＬＡＰＣ第２補助因子活性Ｄ．０.４μg／mＬＡＰＣ＋１μg／mＬヒトプロテインＳＥ．０.４μg／mＬＡＰＣ＋１μg／mＬヒトプロテインＳ＋０.３Ｕ／mＬＡＰＣ第２補助因子活性。正常な血漿は、約１０μg／mLの遊離プロテインＳを含有し、故に、試料希釈液は、精製したヒトプロテインＳの添加量の¹/₄に相当する、第II段階における０.０５×０.０５×１０＝０.０２５μgと一緒に寄与する。ＡＰＣ第２補助因子活性の含量は、定量方法が存在しないので、概算として考慮されるべきである。結果：かくして、結果は、ＡＰＣ第２補助因子活性の添加がＦＸ_a発生の減少、すなわち、第II段階でのＦVIII_aの不活性化の増加した速度として示されるプロテインＳの両方のレベルでのＡＰＣの活性を増強することを示す。実施例２：凝固アッセイにおけるＡＰＣ第２補助因子活性の効果ＦＶ_a補助因子およびＦVIII_a補助因子は、フィブリン形成の原因酵素であるトロンビンの発生において含まれる。これらの補助因子は、ＡＰＣによって分解され、故に、ＡＰＣの活性は、フィブリンクロットの発生に必要とされる時間の延長として凝固アッセイにおいて示される。プロテインＣ（ＰＣ）は、プロ酵素として循環するので、試料中のＰＣの活性化は、ヘビ毒酵素プロタックＣ（Protac われる。以下の実験を行った：カビ・ファーマシア・アクチボラゲット（Kabi Pharmacia ＡＢ）、スウェーデン国ストックホルム］１０μＬをＰＣ欠損血漿１００μＬ、Ａ２５μＬと混合し、次いで、５０mmol／ＬＴris−ＨＣl（pH７.５、Ｉ＝０.１５）、０.２％ＢＳＡおよび以下に定義するさらなる成分を含有する試薬（Ｒ）混合物２５μＬを前記混合物に添加した。この完全な混合物を３７℃で４分間インキュベートした。 II．次いで、前記混合物に２２mmol／ＬＣaＣl₂１００μＬを添加し、３７℃ でクロット形成に必要な時間を記録した。Ｒ−混合物中の補足：Ａ．ナシＢ．２μg／mＬＰＣＣ．２μg／mＬＰＣ＋２.６Ｕ／mＬＡＰＣ第２補助因子活性Ｄ．４μg／mＬＰＣＥ．４μg／mＬＰＣ＋２.６Ｕ／mＬＡＰＣ第２補助因子活性Ｆ．２.６Ｕ／mＬＡＰＣ第２補助因子プロテインＣ欠損血漿は、凝固プロセスに含まれる他の血漿タンパクと一緒に、およびＡＰＣに対する補助因子プロテインＳと一緒にも寄与する。第Ｉ段階でのＡＰＣ第２補助因子活性の最終濃度は、約０.２〜０.３Ｕ／mＬである（前記を参照のこと）。結果：かくして、当該実験は、ＡＰＣ第２補助因子活性の添加が、凝固時間の増加した延長として発現されるＡＰＣ活性を増強することを示す。ＰＣの不在下でのＡＰＣ第２補助因子調製物の添加の効果自体は、単に小さい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 Ｃ０７Ｋ 16/36 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/56 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4Ｃ 49/00 Ｚ 7431−4Ｃ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中における血液凝固成分の機能活性の測定方法であって、該活性が活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）について特異的な基質の転換に関係することができ；該方法が、アッセイされるプロテインＣ抗凝固系、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＳまたは抗凝固第Ｖ因子中に関係する成分についてのアッセイであり、該方法が、試料およびＡＰＣについての基質を含有するアッセイ媒質中でＡＰＣによって生じた基質の転換を測定し、次いで、測定されるべき成分の活性に公知の方法での測定値を相互に関連させることからなり；該方法において、所望により、１または２つ、好ましくは２つの物質がアッセイ媒質に添加され、該物質が、ＡＰＣ、プロテインＳまたは試料誘導プロテインＳ活性を遮断する阻害薬、および抗凝固活性を有する第Ｖ因子または同一試料誘導活性を遮断する阻害薬から選択され；ただし、残存する物質、すなわち、ＡＰＣ、プロテインＳおよび抗凝固活性を有する第Ｖ因子が試料中に存在し、第Ｖ因子についての機能活性を測定される成分であり、該活性がＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性であることを特徴とする、試料中における血液凝固成分の機能活性の測定方法。２．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性が、所望により、添加されたプロテインＳまたは試料誘導プロテインＳ活性を遮断する阻害薬の存在下で測定される請求項１記載の方法。３．ＡＰＣへの活性化後のプロテインＣまたはＡＰＣが測定され、ＡＰＣ補助因子活性を有する第Ｖ因子または同一試料誘導活性を遮断する阻害薬、およびプロテインＳまたは試料誘導プロテインＳ活性を遮断する阻害薬のうち少なくとも１つが添加される請求項１記載の方法。４．プロテインＳが測定され、ＡＰＣ補助因子活性を有する第Ｖ因子または同一試料誘導活性を遮断する阻害薬、およびＡＰＣのうち少なくとも１つが添加される請求項１記載の方法。５．第VIII因子および／または第VIII_a因子がアッセイ媒質に添加される請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。６．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性が、所望により、添加されたプロテインＳまたは該プロテインＳ阻害薬の存在下で測定され、ＡＰＣの基質が第Ｖ_a因子および／または第VIII_a因子からなり、試料が個体から誘導され、試料の凝固タンパクがＡＰＣ基質転換を測定するために利用され；ただし、試料がビタミンＫ拮抗薬を用いる治療において個体から誘導されるか、または、ビタミンＫ依存性凝固因子が欠損している場合、試料中のかかるビタミンＫ依存性因子の活性が、所望によりプロテインＳと組み合わせてもよい、活性または非活性形態で少なくとも１つのビタミンＫ依存性凝固因子の添加によって修飾される請求項１記載の方法。７．アッセイ媒質に添加された各選択物質の機能的レベルが比較されるべき試料のアッセイ媒質中で実質的に一定である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．実質的に一定のレベルが、試料によって提供されたレベルと比較して機能的に過剰の選択物質をアッセイ媒質中に含ませることによって達成される請求項７記載の方法。９．阻害薬として、抗体が使用されて、ＡＰＣ、プロテインＣもしくはプロテインＳの活性またはＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性に関連するエピトープに特異的に結合する請求項７記載の方法。１０．試料が血液または血漿などの血液誘導試料である請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。１１．１または２つの選択物質がアッセイされるべき物質が欠損している血漿の形態で提供される請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。１２．アッセイされた物質の測定レベルが、試料が誘導される個体における血液凝固障害を診断するために使用される請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。１３．個体、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物における血液凝固／抗凝固障害、好ましくは、血栓塞栓障害の診断方法、またはその疾病素質の測定方法であって、該方法が個体から誘導された試料、好ましくは、血液または血漿などの血液誘導試料中の抗凝固活性を発現する血液成分のレベルを測定することからなり、該血液成分が第Ｖ因子からなり、異常なレベルが障害の症状発現または疾病素質を示し、減少したレベルについては、該障害が好ましくは血栓塞栓障害であることを特徴とする、個体における血液凝固／抗凝固障害の診断方法、またはその疾病素質の測定方法。１４．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性のレベルが測定される請求項１３記載の方法。１５．抗凝固活性がＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性を測定するために適応させた請求項２記載の測定方法に従って測定される請求項１４記載の方法。１６．ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性を有する第Ｖ因子が免疫学的方法を用いて測定される請求項１３記載の方法。１７．ＡＰＣに対する補助因子として第Ｖ因子の抗凝固活性が請求項６記載の測定方法に従って測定される請求項１４記載の方法。１８．ＡＰＣに対する補助因子としてのＶ因子の抗凝固活性が、好適には請求項２記載の測定方法を用いて凝固分析に基づいて試料中で測定され、（ｉ）試料の一部が、添加されたＡＰＣの不在下、または、所望により、ＡＰＣによる基質転換の測定を可能にするために必要な別の血液凝固成分の存在下でインキュベートされ、（ii）試料の一部が、添加されたＡＰＣの存在下、および、所望により、ＡＰＣによる基質転換の測定を可能にするために必要な別の血液凝固成分の存在下でインキュベートされ；全凝固時間が、所望により好適な転換後に、使用され、正常な個体について同一の方法で得られた凝固時間に基づいて確立されたカットオフ値以下の結果がＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性の欠損を示す請求項１５記載の方法。１９．ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性に関連するエピトープを有する第Ｖ因子の領域または部位と特異的に反応する抗体調製物。２０．調製物がモノクローナルであり、所定の数、例えば、１〜５個の範囲で選択された数の請求項１９記載の特異性を有するモノクローナル抗体からなる請求項１９記載の抗体調製物。２１．第Ｖ因子に、好ましくは、ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性に関連する第Ｖ因子の領域または部位を認識し、それに選択的に結合するポリクローナル抗体からなる抗体調製物であって、該領域または部位が所望により該活性についてのエピトープからなっていてもよい抗体調製物。２２．モノクローナル抗体からなり、該抗体がマウス／マウスハイブリドーマ細胞によって産生され、好ましくは、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーにおいて仮受託番号ＡＭ−４−５−１９３１２０８４６の下に寄託されたハイブリドーマ細胞系によって産生される請求項２０記載の抗体調製物。２３．ＡＰＣに対する補助因子としてその抗凝固活性に関連するエピトープを有する第Ｖ因子の領域または部位と特異的に反応する（モノクローナル）抗体産生性細胞系。２４．ハイブリドーマ細胞系である請求項２３記載の細胞系。２５．ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーにおいて仮受託番号ＡＭ−４−５−１９３１２０８４６の下に寄託されたハイブリドーマ細胞系である請求項２４記載の細胞系。２６．プロテインＣ、ＡＰＣ、第Ｖ因子またはプロテインＳまたはその組合せの抗凝固活性を個体において増強させるかまたは正常に保持するための薬物または医薬組成物の製造のためのＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性を有する第Ｖ因子、そのサブユニットまたはフラグメントの使用。２７．血管障害、好ましくは、血栓症および汎発性血管内凝固症候群などの血栓塞栓障害の治療用薬物または医薬組成物が製造される請求項２６記載の使用。２８．ＡＰＣに対する補助因子として第Ｖ因子の抗凝固活性のイン・ビトロ測定用血漿パッケージ調製物であって、該調製物が、例えば、該活性の発現能を有する第Ｖ因子に関する免疫低下によって抗凝固活性の欠損を生じさせたヒト血漿からなり、該血漿が、所望により、抗凝固活性を本質的に欠いている種からの第Ｖ因子、例えば、ウシ第Ｖ因子を、または、第Ｖ_a因子を補足されてもよいか、あるいは、該調製物が、血漿が該活性を欠いている１以上の個体からのヒト血漿からなることを特徴とする血漿パッケージ調製物。２９．欠損血漿が正常な血漿と、または抗凝固活性を有する第Ｖ因子と混合され、該混合物が、例えば対照血漿としての使用のために、好適な低レベルで抗凝固活性の発現能を有する請求項２８記載の血漿パッケージ調製物。３０．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性のイン・ビトロ測定用の血漿パッケージ調製物であって、該調製物が第Ｖ因子抗凝固活性の部分欠損を有する個体からの血漿の混合物であり、該混合物が、例えば対照血漿としての使用のために、好適な低レベルで抗凝固活性の発現能を有する血漿パッケージ調製物。３１．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性が欠損している血漿であって、該血漿が、例えば該活性の発現能を有する第Ｖ因子に関する免疫低下によって抗凝固活性の欠損を生じさせたヒト血漿からなり、該血漿が、所望により、該抗凝固活性を本質的に欠いている種からの第Ｖ因子、例えば、ウシ第Ｖ因子を、または、第Ｖ_a因子を補足されていてもよいか、あるいは、該血漿が、該活性を欠いている１以上の個体からのヒト血漿からなることを特徴とする血漿。３２．欠損血漿が正常な血漿と、または、該活性を有する第Ｖ因子と混合されるか、または、第Ｖ因子抗凝固活性の部分欠損を有する個体からの血漿との混合物であり、該混合物が、例えば対照血漿としての使用のために、好適な低レベルで抗凝固活性の発現能を有する請求項３１記載の血漿。３３．請求項２８記載の免疫低下血漿パッケージ調製物または請求項３１記載の血漿を得るための請求項１９〜２２のいずかれ１項記載の抗体調製物の使用。３４．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性の測定用プロテインＳ調製物。３５．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性の測定用の、所望により活性化形態であるか、または、プロテインＣについての活性化因子と組み合わせされていてもよいプロテインＣ調製物。３６．調製物が、所望によりプロテインＳと組み合わせていてもよい、第VII 因子、第IX因子、第Ｘ因子および第II因子から選択される少なくとも１つのビタミンＫ依存性凝固因子と組み合わせられている請求項３５記載のプロテインＣ調製物。３７．ＡＰＣに対する補助因子としての第Ｖ因子の抗凝固活性のレベルにおける機能的妨害に関する障害の治療用薬物または医薬組成物の製造のためのプロテインＣ／活性化プロテインＣまたはプロテインＳの使用。３８．第Ｖ_a因子プロ凝固活性を発揮するために活性化させられる能力を有するが、抗凝固活性（好ましくは、ＡＰＣに対する補助因子としての抗凝固活性ではない）を発揮する能力を有してない第Ｖ因子、好適にはヒト第Ｖ因子であって、該因子が実質的に純粋な形態であることを特徴とする第Ｖ因子。３９．好ましくはＡＰＣに対する補助因子として、抗凝固活性を発揮する能力を有するが、第Ｖ_a因子のプロ凝固活性を示す能力を有しない第Ｖ因子、好適にはヒト第Ｖ因子。