JP3163105B2 - 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 - Google Patents
血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法Info
- Publication number
- JP3163105B2 JP3163105B2 JP52098395A JP52098395A JP3163105B2 JP 3163105 B2 JP3163105 B2 JP 3163105B2 JP 52098395 A JP52098395 A JP 52098395A JP 52098395 A JP52098395 A JP 52098395A JP 3163105 B2 JP3163105 B2 JP 3163105B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- factor
- apc
- mutation
- nucleic acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Description
本発明はうっ血分野に関するものであり、特に血栓症
に係わる。より具体的には、本発明は、血栓発現傾向、
特に遺伝性の血栓発現傾向のスクリーニング及び診断方
法に関する。従って、本発明の方法は、個体が血栓症に
かかる危険を調べるために使用できる。 発明の背景 深静脈血栓症は一般的な病気である。確定されている
危険因子としては、手術して間もない状態、悪性疾患、
妊娠及び分娩、長期の不動化、並びに凝固系の主要阻害
物質のうちの一つの欠乏が挙げられる（Ref.1）。主要
阻害物質は、プロテインＣ、プロテインＳ及びアンチト
ロンビンであることが知られている。多くの患者の深静
脈血栓症の原因はまだ解明されていない。しかしなが
ら、遺伝的に静脈血栓症の傾向がある幾つかの家族に、
活性化プロテインＣ（APC）に対する抗凝血応答の弱さ
が見られることが最近確認された（Ref.2）。 APCの抗凝血特性は、タンパク質限定分解によって活
性化補因子V a及びVIII aを不活化する能力にある（Re
f.3）。このような補因子V a及びVIII aの不活化は、重
要な凝固酵素であるトロンビンの生成率を低下させる。
この作用はin vitroで、正常血漿にAPCを加え、その効
果を凝固検査、例えばAPTT（activated partial thro
mboplastin time）を測定する検査で調べることによ
り、視覚化できる。プロテインＣの活性化は、トロンビ
ン−トロンボモジュリン複合体を介して内皮細胞の表面
で起こる（Ref.27）。トロンボモジュリン（thrombomod
ulin）は、トロンビンに結合することができる膜糖タン
パク質である。この結合によってトロンビンは、フィブ
リノーゲンをフィブリンに変換する能力と、血小板を活
性化する能力とを失う。即ち、トロンビンは凝血特性を
失い、プロテインＣの活性化によってそれ自体の生成も
低下する（いわゆる負のフィードバック）。in vivo
（カルシウムの存在下）では、プロテインＣの活性化
は、内皮上のトロンボモジュリンの存在にほぼ全面的に
依存する。APCはその後、APC阻害物質（PCI）及びα１
アンチトリプシンとの複合体の形成によって中和され
る。これは、正常な状態では、APCが循環系中に短時間
しか存在せず、抗凝血作用が通常は局所的に発現される
状態を維持することを意味する。 APCによる補因子V a及びVIII aの不活化が、Ca2+、リ
ン脂質及びAPC補因子プロテインＳの存在下で最適に進
行することは、一般的に認められていた（Ref.4、28、2
9）。しかしながら、この見解はその後、精製タンパク
質系ではプロテインＳはAPCに対して補因子活性をほと
んど示さないという発見により、正当性が問われること
になった（Ref.5、Ref.6）。in vivoの観察事項（遺伝
性プロテインＳ欠乏の場合の血栓症の傾向）とin vitr
oの観察事項（精製タンパク質系におけるプロテインＳ
のAPC補因子活性の弱さ）との間のこのような明らかな
矛盾は、Dahlbckらの発見（Ref.2）によって解決され
得る。Dahlbckらは、アンチトロンビン活性が正常値
であり、プロテインＣ及びプロテインＳも（免疫学的及
び機能的に）正常値であり、異常プラスミノーゲン、異
常フィブリノーゲン又は抗凝血性狼瘡（lupus anticoa
gulant）の徴候を示さないが、活性化プロテインＣに対
する抗凝血応答が弱い患者について報告している。前記
応答は、精製ヒトAPCをin vitro添加した後の血漿の応
答（凝固時間、APTT）を調べるためにDahlbackが開発し
た新しいテスト（Ref.2）で発見された。これらの血栓
症患者の血漿に活性化プロテインＣを加えても、APTTは
予想に反して延長されなかった。この現象に関して多数
のメカニズムを想定した結果、APCに対する弱い抗凝血
応答を誘起すると見なされるものが一つだけあった。即
ち、前記患者に欠乏している、これまで未知のAPC補因
子の存在である。 下記のメカニズムは従来、APCに対する弱い抗凝血応
答の原因として認められていなかった： 1. APCに対する自己抗体の存在、 2. APCと反応する即時型作用性プロテアーゼ阻害物
質、 3. 機能性プロテインＳの欠乏、 4. 第Ｖ因子又は第VIII因子遺伝子の突然変異。 Dahlbck（Ref.2,7）は、検査した家族では、プロテ
インＳと無関係に作用するとされているこれまで知られ
ていないAPC補因子の遺伝的な欠乏が、APC耐性の原因で
あると想定した。Dahlbckら（Ref.2）はまた国際特許
出願第WO93/10261号で、凝固因子を含む患者試料に活性
化プロテインＣを加え、該APC添加によって左右される
酵素活性を測定することにより、血栓塞栓障害を診断す
る検査方法を開示した。Dahlbckらの出願明細書に
は、記載の実験結果は、当該障害が、これまで未知の１
種類以上の凝固因子、又は既知の因子の未知の相互作用
に関係していることを示すものであると記述されてい
る。未知の因子は、APCによる分解に対して耐性を示す
第V a又は第VIII a因子ではなく、APCに対する免疫グロ
ブリン型阻害物質でもない。また、プロテインＳの欠乏
にも関係がない。Dahlbckら（Ref.2）は、彼らの発明
が、遺伝性又は非遺伝性の血栓発現傾向のような血栓塞
栓疾患の更に進んだ診断、並びに妊娠、避妊ピルの使
用、手術等に関連した血栓症の危険の決定に特に有用な
方法であると述べている。彼らはその方法が、試料中の
凝固系をそれ自体公知のように完全に又は部分的に活性
化し、活性化プロテインＣと共にインキュベートし、次
いで発色性基質の凝固又は変換のような基質変換反応速
度を測定することを特徴とすると記述している。測定し
た変換速度は、正常血漿試料に関して得られた値と比較
される。この速度が大きければ、試料の由来源である個
体が凝固疾患にかかっている可能性がある。この疾患
は、プロテインＳの欠乏、又はAPCによる分解、もしく
はAPCに対する免疫グロブリン型阻害物質による分解に
対して耐性の第V a因子もしくは第VIII a因子の産生に
よって発現されない。前記国際特許出願でDahlbckら
は更に、該出願明細書に記載のデータは、当該患者が欠
陥第VIII/VIII a因子を有し得ないことを示すものであ
ると記述している。これは、彼らがそれより先にThrom
b.Haemostas.65,アブストラクト39,658（1991）で述べ
たこと、即ち患者の血漿試料への活性化プロテインＣの
添加、及び生じた作用の検査によって、活性化プロテイ
ンＣにより分解されない欠陥第VIII a因子分子が明らか
にされたという主張に反するものである。前記国際特許
出願では更に、APCによる第V a及び第VIII a因子の阻害
を直接測定するためにアッセイが使用されている。前記
国際特許出願に記載の第X a因子ベースの凝固アッセイ
を使用すると、APCによる患者第V a因子の阻害が正常で
あることが判明した。これは、患者血漿試料中の第V a
因子が、外部から添加したAPCにより正常に分解される
ことを示唆するものである。 Dahlbckら（Ref.2）の報告に続いて、別のグループ
がこの分野での研究を開発した。Griffinらは、Blood,V
ol.82,nr.7,1993,1989−1993ページに、確認可能な血液
凝固異常がない25人の静脈血栓患者、及び予め異型（he
terozygous）プロテインＣ又はプロテインＳ欠乏を有す
ると確認された22人の患者について実施したAPC耐性検
査の結果を記述している。これらの患者に関するAPTTの
APC誘発延長（APC induced prolongation）アッセイ
が、35の正常被験者に関する結果と比較された。結果
は、このようなAPCへの抗凝血応答の新しい欠陥が、驚
いたことに、25人の患者の52〜64％、即ち予め血栓発現
傾向を有すると診断されなかった患者の大半に存在する
ことを示した。この欠陥は、22人の異型プロテインＣ又
はプロテインＳ欠乏患者のうち20人の患者には見られな
かった。これは、新しい因子が、プロテインＣ又はプロ
テインＳの欠乏に関係のない危険因子であることを示唆
するものであった。正常血漿と２種類の著しい欠陥のあ
る血漿（APTTのAPC誘発延長＜20秒）の各々とを混合
し、APTTアッセイを行って、正常血漿が欠陥血漿の弱い
応答を修正する能力を評価した。結果は、Dahlbckら
（Ref.2）の結果と類似していた。これも、正常血漿
が、欠陥のある患者血漿に欠失している因子を含むこと
を示唆するものであった。前記文献には、APC存在下のA
PTT値からAPC不在下のAPTT値を差し引いた値として単純
に定義された正味のAPTT延長時間計算値が記載されてい
る。前記文献はまた、APC存在下のAPTT対APC不在下のAP
TTの比と、このパラメーターをAPC誘発APTT延長の値と
比較したという事実も記述している。この比較は、異常
患者の指標である極めて小さいAPTT比の値と、正常被験
者に関するこれらのパラメーターとの間の優れた相関を
明らかにした。従って、APC誘発APTT延長のパラメータ
ー、あるいはAPC存在下対APC不在下のAPTT値の比のパラ
メーター、又はこれら二つのパラメーターを診断パラメ
ーターとして使用できると結論された。これらのパラメ
ーターの中には、この目的に関して、前記文献の別のパ
ラメーターより有用と思われるものはない。前記文献に
は更に、使用したAPC誘発APTT延長アッセイが、Potzsch
ら（Ref.19）によりBlood 80:267a 1992（アブストラ
クト）に報告されている抗凝血性狼瘡患者の血漿中の内
在性第VIII因子のAPC誘発不活化を用いるアッセイを連
想させると記載されている。この後者のアッセイに基づ
いて、Griffinらの文献には、血栓症を有する抗凝血性
狼瘡患者に由来する血漿はAPCに対する応答が弱く、従
って血栓症を有する患者を血栓症のない患者から区別す
ることができると報告されている。Griffinらは、新し
い仮想のAPC補因子に対する自己抗体が、抗凝血性狼瘡
患者の血栓症の危険性に関与し得ると推測した。彼らは
更に、新しいAPC補因子の後天的欠乏が、血栓症の後天
的危険性と関係があり得ると推測することに興味を引か
れると述べている。 Kosterらは、Lancet,1993年12月18日,Vol.342,1503−
1506ページで、活性化プロテインＣ（APC）に対する抗
凝血応答の弱さを特徴とする凝固系の異常の臨床的重要
性を調べるために、集団ベース症例対照テストをいかに
して実施したかを記述することによって、APC耐性と血
栓症との関係を更に深く検討している。家族内の研究に
基づけば、APCに対するこのような弱い応答は、常染色
体優性形質として遺伝すると思われる（Ref.2、７及び4
7）。原因不明の血栓症のために凝固ユニット（coagula
tion unit）と称されている患者の間で前記異常は約40
％の羅患率を示し、血栓発現傾向の主因であった（Ref.
8及び９）。KosterがLancet,1993年12月18日,Vol.342,1
503−1506ページに記述している研究では、APCに対する
弱い応答の臨床的重要性が、最初の客観的に確認された
深静脈血栓症の経験がなく、内在する悪影響（underlyi
ng malignancy）もない、任意に選択した70歳以下の一
連の患者について調べられている。APCに対するこれら
の患者の血漿の感度が、対応する健康対照の感度と比較
された。活性化プロテインＣ（APC）に対する血漿APTT
の感度は、プロテインＳ活性アッセイのために先に開発
された試薬及び反応条件を用いて（Ref.11）、本質的に
Dahlbckら（Ref.2）が記述しているように測定され
た。結果は、APTT（＋APC）/APTT（−APC）の値として
定義されるAPC感度比（APC−SR）として示されている。
Kosterらの論文には（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,
1503−1506ページ）、プロトロンビン及び／又は第Ｘ因
子の低い濃度（＜0.5u/ml）が、APC−SRを増加させると
記述されている。そのため、経口抗凝血剤で治療してい
る患者の血漿の評価に該検査を使用することはできな
い。98個の一連の試料では、Kosterらのテスト（Lance
t,1993年12月18日,Vol.342,1503−1506ページ）で得ら
れたAPC−SRと、WO93/10261号に記載のようにChromogen
ixによって開発されたテストで得られたAPC−SRとの間
に良好な相関が見出された。健康対照被験者に基づいて
APC感度比の基準範囲が算出された。データの対数変換
及び平均値の三つの標準偏差（SD）外の値を有する10人
の被験者の除外後の正常の下限値は、2.17（平均値−1.
96 SD）であった。血栓症にかかる危険と応答の度合い
との間に反比例関係が発見された。血栓症患者の弱いAP
C応答の羅患率が21％であり、且つ血栓症の確率比（odd
s ratio）が6.6であるという理由から、弱いAPC応答は
深静脈血栓症の一般的な強力危険因子とみなし得ると結
論された。さらには、APC感度比が約1.10の被験者は同
型（homozygous）又は二重異型（double heterozygou
s）であり得、APC感度比が約1.50の被験者は異常に対し
て異型であり得るとさえ推論された。健康対照被験者の
前記異常の羅患率は５％であった。APC−SRの分布は明
らかに双峰であるため、Kosterらは、被験者が正常範囲
内で低すぎる値を有するのではなく、実際に異常なAPC
応答を有すると考えた。従って、血栓症にかかる危険と
APC応答との間の関係は、単純な単一遺伝子欠陥のモデ
ルに従うものではないと思われた。前記異常は健康被験
者の間に広く発見されたため、Kosterらは、プロテイン
Ｃ欠乏についても同様であるように、欠陥自体が血栓症
を起こすのに十分であるとは思えないと考えた（Ref.1
5、Ref.16）。特定の患者における血栓症の発生には、
別の原因となる因子が必要と思われる。これは後天的因
子であり得、まだ知られていない遺伝子欠陥もしくは変
異でもあり得る。しかしながら、別の原因となる因子が
存在すれば、弱いAPC応答は、相対的危険性の６〜７倍
の増加によって証明されるように、血栓症を発生させる
危険が高い。前記論文には、弱いAPC応答の潜在的欠陥
は、活性化プロテインＣに対する補因子の常染色体優性
遺伝性欠乏が仮想されたとしても（Ref.7）、依然とし
て解明されないままであると記述されている。弱いAPC
応答は、プロテインＣ、プロテインＳ又は抗トロンビン
の欠乏の５〜10倍の頻度を有すると思われる一方で、ほ
ぼ類似の相対的血栓症危険率を与える（Ref.17及び1
8）。これは、Kosterらによれば、前記異常に関する総
ての静脈血栓症患者の検査を価値あるものにし得るデー
タである。 要約すれば、当業界では、プロテインＣ抗凝血経路の
欠陥が、比較的高い血栓症発生危険率に関係しているこ
とが確認された。活性化プロテインＣに対する弱い抗凝
血応答は細部にわたって研究されてきたが、活性化プロ
テインＣに対する弱い抗凝血応答の原因はまだ解明され
ていない。多くの仮説がたてられたが、唯一受け入れら
れたのは、活性化プロテインＣに対して弱い抗凝血応答
を示す患者に明らかに欠乏している未知のAPC補因子の
存在である。仮想のAPC補因子のアイデンティティは不
明である。また、APCに対する応答の変化を検出するた
めに現在使用されている検査は、既に抗凝血剤を使用し
ている被験者には使用できない。 発明の説明 驚くべきことに、弱い抗凝血プロテインＣ応答の原因
である同定されていない補因子のアイデンティティが判
明した。前述の認められていなかったメカニズムのうち
の一つが、実際に、血栓発現傾向のある患者の大半にお
けるプロテインＣ抗凝血経路の欠陥に関与していること
が判明したのである。この欠陥の原因は、発現後に、第
Ｖ因子及び／又は第V a因子（前記第Ｖ因子の活性化産
物）、又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子（前記第
VIII因子の活性化産物）のAPCによる不活化の度合いの
低下に関与する、第Ｖ因子又は第VIII因子をコードする
核酸物質中の突然変異の存在に結び付けられた。従って
前記欠陥は、まだ同定されていないAPC補因子の突然変
異の結果ではなく、実際には、第Ｖ因子もしくは第VIII
因子の欠乏、又はより特定的にはこれら因子の活性化産
物の欠陥に起因する。 当業界で公知のように、血栓症が発生する危険とAPC
耐性の存在との間の関係は既に確認されており、この種
の欠陥のスクリーニングは実際に、血栓症を起こす危険
が高い患者の診断に極めて有用と思われる。現在では、
どの因子が関係のある遺伝子欠陥を有しているかが分か
っているため、APC耐性を調べるためのChromogenixテス
ト以外の方法で集団を実際にスクリーニングすることが
可能となった。 APC耐性に関連した変異を受けた第Ｖ因子又は第VIII
因子についてスクリーニングする時に、突然変異タンパ
ク質の存在を調べるためにDNA技術を使用するか又は抗
体を使用することが可能になった。本発明は、血栓症及
び／又は活性化プロテインＣ（APC）に対する弱い抗凝
血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングす
る方法に関する。前記遺伝性欠陥は、患者の血栓症発生
の危険が高いことを示すか、又は実際に血栓症を生起さ
せるようなものである。該方法は、それ自体公知の方法
で第Ｖ因子又は第VIII因子をコードする核酸物質の突然
変異の存在を測定することからなり、但し核酸物質発現
時の前記突然変異は、APCによる前記第Ｖ因子及び／又
は第V a因子（前記第Ｖ因子の活性化産物）、あるいは
前記第VIII因子及び／又は第VIII a因子（前記第VIII因
子の活性化産物）の不活化の度合いの低下に関係してお
り、及び／又は、該方法は、タンパク質第Ｖ因子及び／
又は第V a因子中に存在する突然変異、及び／又はタン
パク質第VIII因子及び／又は第VIII a因子中に存在する
突然変異を、それ自体公知の方法で、前記第Ｖ因子及び
／又は第V a因子あるいは第VIII因子及び／又は第VIII
a因子の分析、又は前記第Ｖ因子及び／又は前記第V a因
子、及び／又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子のタ
ンパク分解フラグメントの分析により調べることからな
り、但し前記突然変異はAPCによる前記第Ｖ因子及び／
又は前記第V a因子及び／又は第VIII因子及び／又は第V
III a因子の不活化の度合いの低下に相関するものであ
る。本発明は特に、第Ｖ因子及び／又は第VIII因子をコ
ードする核酸配列における突然変異が、第Ｖ及び／又は
第V a因子及び／又は第VIII及び／又は第VIII a因子上
のAPCの結合部位又は開裂部位をコードする核酸配列部
分内に存在し、該突然変異が、APCによって弱く不活化
された第Ｖ因子及び／又は第V a因子及び／又は第VIII
因子及び／又は第VIII a因子を生成させる場合の方法に
関する。第Ｖ因子、第VIII因子、第V a因子及び第VIII
a因子中のAPCの結合及び開裂部位は多数存在することが
知られている（表１、Ref.34、35、36、48、49、52、J.
Biol.Chem.262,11233−11238（1987）に記載のOdegaard
Ｂ及びMann K.G.の論文、並びにBlood 82,Suppl.1,
p.58a,1993に記載のKalafatis M.,Haley P.E.及びMan
n K.G.のアブストラクト参照）。 結合部位は必ずしも開裂部位ではない。しかしなが
ら、この種の因子へのAPCの結合を弱めるあらゆる効果
がこの種の因子のAPC耐性にも作用することはかなり明
白である。なぜなら、一般的に、該因子はAPCと結合し
た後でなければAPCによって開裂することができないか
らである。結合及び／又は開裂部位に作用する突然変異
は、結合部位に位置するアミノ酸の一次アミノ酸配列中
に存在し得、又はAPC結合及び／又は開裂に対する親和
性が小さい三次構造を形成させる分子中の別の場所の突
然変異に起因し得る。多数のAPC結合及び／又は開裂部
位が明らかにされているため、分子全体ではなく、これ
らの位置の突然変異についてスクリーニングを行うのが
最も簡単であることは明白である。多くのAPC開裂部位
が第Ｖ、第V a、第VIII及び第VIII a因子のＨ鎖上に存
在することが知られているため、検出すべき突然変異
は、Ｈ鎖上のAPC開裂部位をコードする核酸配列部分内
の位置に存在するのが好ましい。 第Ｖ及び第VIII因子の活性化はトロンビン因子X aに
よって生起し得、第Ｖ因子の場合はある種のヘビ毒によ
っても生起し得る。当業者は、「特定因子によって
（で）活性化された（した）」という表現を、「特定因
子を介して活性化された（した）」と解釈することもで
きる。その結果得られる活性化因子は、それぞれの活性
化方法に起因して少しだけ異なる。従って、トロビンで
活性化した第V a因子のAPCによる結合及び／又は開裂を
低下させる突然変異が、X aで活性化した第V a因子のAP
Cによる結合及び／又は開裂を低下させないことは可能
であり、その逆も可能である。第Ｖ因子は次のドメイン
構造A1A2/BA3C1C2を有し、X aで活性化した第V a因子は
構造A1A2/B′A3C1C2を有し、トロビンで活性化した第V
a因子は構造A1A2/A3C1C2を有する。三次構造の相違はお
そらく、異なる方法で活性化された時に生じるこれら因
子のＬ鎖の構造変化に起因する。本明細書に記載の実施
例では、活性化がX aを介して開始され、トロビンを介
して活性化された第V a因子のAPC不活化に作用しなかっ
た時には、説明されている特定の突然変異が実際に、第
V a因子のAPC不活化のみを抑制したことが明らかにされ
ている。この特定の突然変異は、第Ｖ因子のＨ鎖上に存
在していたため、トロビンを介して活性化した第V a因
子及びX aを介して活性化した第V a因子の両方に存在す
るが、おそらくは、二つの形態の活性化因子Ｖの三次構
造の相違のためにこれら二つの形態の活性化因子内で同
じ作用を発揮することはない。 通常は、APCによる不活化は活性化第Ｖ因子又は活性
化第VIII因子上で生起するため、本発明の方法は、好ま
しくは、第V a因子及び第VIII a因子上のAPCに対する結
合親和性の低下及び／又はAPCによる開裂の低下を引き
起こす突然変異の検出に適用される。一般的には、第V
a因子及び第VIII a因子に存在する突然変異は、これら
の活性化産物の由来源である第Ｖ因子又は第VIII因子上
にも存在する。従って、第Ｖ因子又は第VIII因子をコー
ドする核酸配列を分析すれば、活性化因子V a又はVIII
aにも存在し得る突然変異が検出されることになる。従
って、本発明の方法による分析は、第Ｖ及び第VIII因子
の核酸レベル、例えばDNA及び／又はmRNAレベル、並び
に第V a、第VIII a、第Ｖ及び第VIII因子のうちのいず
れか、又はこれらの因子に由来するフラグメント上のタ
ンパク質レベルで実施することができる。 第V a因子DNAは、HepG2細胞（Ref.20）及びヒト胎児
肝臓（Ref.21及び22）からクローニングされた。第Ｖ因
子の完全アミノ酸配列は既知であり（Ref.20、23）、第
Ｖ因子遺伝子の構造も解明されている（Ref.23）。Shen
らは（The Journal of Immunology,Vol.150,2992−3
001,No.7,1993年４月１日）、どのようにしてヒト第Ｖ
因子の細胞供給源を発見したかを記述している。彼ら
は、逆転写とそれに次ぐポリメラーゼ連鎖反応（RT−PC
R）とを用いて、ヒトリンパ球内の第Ｖ因子mRNAを同定
した。PCRで得られた結果は、Ｔ細胞 cDNAライブラリ
ーからの第Ｖ因子cDNAの独立クローニングによって確認
された。第Ｖ因子cDNAの配列は、肝臓第Ｖ因子mRNAとほ
ぼ同じであった。第Ｖ因子タンパク質の連結領域の一部
をコードする限定された長さのmRNAが、６個のヌクレオ
チド置換に基づくヌクレオチド多形性を有することが判
明した。Shenらは、増幅後に誘導された14個の独立クロ
ーン内に存在する増幅F7/F8第Ｖ因子cDNAフラグメント
が、６個のヌクレオチドベース置換を有すると記述して
いる。２個の置換は、それぞれ位置2209及び2236でのチ
ミンからシトシン及びシトシンからチミンへの置換であ
り、これらはサイレント（silent）突然変異であった。
４個の置換は、位置2302でやはりサイレント突然変異を
生起させるグアニンからアデニンベースの置換、並びに
位置2573でのアルギニンからリシンへのアミノ酸変化、
位置2595でのアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸変
化、位置2773でのグルタミン酸からリシンへのアミノ酸
変化であった。これらの推定上のアミノ酸変化は、前記
論文で、第Ｖ因子機能に重大に作用しない保存的置換で
あると記述されている。クローンのうちの半分（14個の
うち７個）は更に、位置2290でアデニンからグアニンへ
の置換を示した。これは、EcoR I部位を消滅させる別の
サイレント置換であった。これらの突然変異の中には、
APC結合又は開裂に対する親和性の低下に関与している
ものはなかった。 Shenらの論文には、第Ｖ因子mRNAを、例えばポリメラ
ーゼ連鎖反応を生起させるのに十分な量で、ヒトリンパ
球から回収できると記述されている。この情報に基づい
て、当業者は、本発明の方法を実施するのに十分な量の
核酸をヒトから容易に回収できる。Shenらの論文には、
ヒト第Ｖ因子核酸の核酸増幅に使用できるオリゴヌクレ
オチドが多数紹介されている。 Bruce Odegaard及びMannは（The Journal of Bio
logical Chemistry,Vol.262,No.23,1987年８月15日,p
p.11233−11238）、第Ｖ及び第V a因子の両方につい
て、トロンビンによる第Ｖ因子の開裂が、Mr＝94,000の
Ｈ鎖（Ｄ鎖）及びMr＝74,000のＬ鎖（Ｅ鎖）を形成させ
ると記述している。各鎖自体は、活性化プロテインＣ及
び第X a因子によるタンパク質分解を受け易い。活性化
プロテインＣ又は第X a因子によるＥ鎖の開裂は、二つ
の主要フラグメント、Mr＝30,000及びMr＝48,000を与え
る。彼らはまた、活性化プロテインＣ及び第X a因子が
Ｅ鎖を同じ位置で開裂すると記述している。Ｄ鎖の活性
化プロテインＣ開裂では、二つの産生物Mr＝70,000及び
Mr＝24,000が得られる。Mr＝70,000フラグメントは、無
傷Ｄ鎖と同じNH2末端配列を有するが、Mr＝24,000フラ
グメントはそうではない。彼らは、活性化プロテインＣ
によるＤ鎖の開裂が第V a因子の部分的不活化の原因で
あることを明らかにした。Ｌ鎖の開裂はより遅いため、
第V a因子の不活化がそのＨ鎖の開裂に関係があるとい
う証拠は、Ref.10、12、13、14及び48にも示されてい
る。 Odegaard及びMannは、第V a因子と第VIII a因子との
間に大きな類似性があることも明らかにした。第VIII a
因子は、タンパ分解によって活性が調節される凝固カス
ケード（clotting cascade）の別の補因子である。第V
III a及び第V a因子は多くの類似した構造的及び機能的
特性を有する。どちらもトロンビン又は第X a因子によ
る開裂を介して大きなプロコファクターから産生され、
どちらもほぼ同じ大きさを有し、Ｈ鎖とＬ鎖とからな
る。どちらももタンパク分解複合体の活性に大きく寄与
する一方で、それ自体はタンパク分解活性を発揮しな
い。また、どちらもも活性化プロテインＣにより不活化
される。この共通の特徴の根底には、一次構造の明らか
な相同もある（Ref.24,25及び26）。Odegaardらはま
た、第Ｖ因子と第VIII因子との間の更に大きな配列相同
を同定した。彼らは特に、開裂が生起する第Ｖ因子分子
内の位置に十分妥当に対応する第VIII因子分子内の位置
で、ウシ第Ｖ因子とヒト第VIII因子との間に配列相同セ
グメントが明らかに存在すると記述している。ヒト第Ｖ
因子について（実施例１で）我々が明らかにした作用
は、特定の面における第Ｖ因子と第VIII因子との同等性
に起因して、第VIII及び／又は第VIII a因子についても
付随的に期待できる。Odegaard及びMannは更に、APCに
よる第V a因子の開裂後にＨ鎖が残らない場合でも、残
留補因子活性が残ると記述している。これは、第V a因
子の不活化が、単一結合の単なる開裂より複雑な事象で
あることを意味する。これは、第Ｖ因子分子のAPC結合
及び／又は開裂部位の突然変異が、実際にAPCによる不
活化に対する親和性を低下させるのに十分であるという
本明細書の実施例の説明を更に驚くべきものとするもの
である。第VIII因子の場合は、APC開裂部位はArg 56
2、Arg 336及びArg 740にあると想定され（Ref.4
9）、APC結合部位は残基2009−2018上でA3ドメイン内に
存在すると想定された（Ref.35、36）（表１も参照のこ
と）。 本発明の方法は、第Ｖ因子及び／又は第V a因子又は
第VIII因子及び／又は第VIII a因子のAPC開裂及び／又
は結合部位のうちの一つ以上において、核酸もしくはタ
ンパク質のいずれかのレベル又は両方のレベルで、一つ
以上の突然変異を検出するために適用される。特に、タ
ンパク質のＨ鎖上、又はＨ鎖をコードする核酸上に位置
するAPC結合及び／又は開裂部位が関連部位とみなされ
る。 Kalafatisらは（Blood 82,Suppl.1,p.58A,1993）、
膜結合ヒト第V a因子が、Arg 506及びArg 306でのＨ
鎖の開裂後に、活性化プロテインＣによって不活化され
ることを明らかにした。彼らは、ヒト第V a因子のＨ鎖
の開裂パターンが、PCPS小胞の存在又は不在に依存する
と記述している。膜表面の不在下、又はPCのみからなる
リン脂質小胞の存在下では、開裂の結果として、残基１
−506からなるフラグメントと残基507で始まるフラグメ
ントとが得られ、後者のフラグメントはCOOH末端でAPC
により更に開裂される。これと対照的に、PCPS小胞の存
在下では、活性の完全な喪失は、Mr＝75,000フラグメン
トの開裂、並びにMr＝40,000及びMr＝30,000フラグメン
トの出現に関係している。Mr＝30,000フラグメントは残
基307〜506に対応する。これは、Arg 306でのAPCによ
る開裂を示すものである。APCと共にインキュベートし
た後は、PCPS小胞の存在下でも不在下でも、補因子のＬ
鎖の開裂は観察されない。このようにして、補因子がPC
PSに結合した時に特定のAPC開裂部位が明らかにされ
る。膜の存在は、APCによるヒト第V a因子の完全不活化
にとって必須であり、Arg 506での開裂は補因子を部分
的に不活化するだけであり、Arg 306での開裂はアニオ
ン脂質依存性であって、ヒト第V a因子の完全不活化に
必要とされる。APCによるウシ第V a因子の不活化に関し
ても類似のデータが最近発表された（Ref.48）。このよ
うに、当業界の現状から、ヒト第V a因子にはAPCによる
潜在的開裂部位が少なくとも二つ存在することが明らか
である。Kalafatisらは更に、ヒト第Ｖ因子のリシン994
に別のAPC開裂部位を検出した（Ref.52）。従って、本
発明の方法は、核酸もしくはタンパク質のレベルで、又
はこれら両方のレベルで、第Ｖ及び／又は第V a因子内
のこれらのAPC開裂部位のうちの一つ以上における突然
変異を検出するために適用される。APC開裂部位は、Ｈ
鎖上のArg 506及びArg 306に位置する。アミノ酸Arg
679及びLys 994にも別の部位が存在することが判明
した。 以上の説明に鑑みて、本発明の方法、即ち血栓症及び
／又は活性化プロテインＣ（APC）に対する弱い抗凝血
応答に関連した遺伝性欠陥、即ち患者の血栓症発生の危
険が高いことを示すか又は実際に血栓症を発生させる遺
伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法であって、そ
れ自体公知の方法で、第Ｖ因子をコードする核酸物質の
突然変異、即ち核酸物質の発現時に前記第Ｖ因子及び／
又は第V a因子のAPCによる不活化の度合いの低下に関与
する突然変異の存在を調べることからなる本発明の方法
は、第Ｖ因子がX aで活性化した第Ｖ因子に由来するも
のである場合に特に有利である。 本発明の方法は特に、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸50
6に対応する位置に変化したアミノ酸を含む突然変異ア
ミノ酸配列を有するヒト第Ｖ又は第V a因子をコードす
る核酸配列内の突然変異を検出するために適用される
（Ref.21）。特に、前記突然変異が、アミノ酸アルギニ
ンを血漿因子Ｖの配列のアミノ酸506でアミノ酸グルタ
ミンにより置換させた突然変異である場合に適用され
る。特に、アミノ酸506に対応するアミノ酸のコドンの
第二ヌクレオチド、ヌクレオチドＧが突然変異を起こし
た場合がこれに相当する。ヌクレオチドＧが、血漿因子
Ｖの配列のアミノ酸506に対応するアミノ酸のコドンの
第二ヌクレオチドに対応する位置でＡに突然変異した場
合が特にそうである。 実施例で明らかにされるように、本発明は、被験者が
第Ｖ因子及び／又は第V a因子又は第VIII因子及び／又
は第VIII a因子における突然変異に対して同型であるか
又は異型であるかを調べる方法にも関する。この方法
は、APCに対する抗凝血応答に欠陥が存在するかどうか
を調べるそれ自体公知の方法を実施し、次いで、欠陥の
診断に有用であることが知られているパラメーターの
値、例えば（APTT＋APC）／（APTT−APC）の値を算出
し、得られた値を、正常な個体又は同型もしくは異型で
あることがわかっている個体に由来する試料について同
じ方法で得た値と比較し、それによって被験者がAPCに
対する抗凝血応答の欠陥に関して同型であるか又は異型
であるかを確認することからなり、特に実施例１に記載
の具体例、並びに、最も特定的にはAPC結合及び／開裂
部位の突然変異に起因してAPCに対する抗凝血応答を変
化させる第Ｖ、第V a、第VIII及び／又は第VIII a因子
の別の突然変異に関する任意の同等の具体例では、第Ｖ
因子及び／又は第V a因子、又は第VIII因子及び／又は
第VIII a因子における突然変異の存在及び任意にその種
類を決定するための任意の公知の方法と組合わせて使用
される。 本発明の方法は、核酸標的増幅反応の実施により突然
変異を検出することによって達成できる。このような標
的増幅反応は当業者によく知られている。突然変異が存
在し得る特定長さの核酸の５′及び３′末端に隣接する
種々の長さの核酸を認識しこれにハイブリダイズする特
異的プライマーを一つ以上使用する必要がある。前記ハ
イブリダイゼーションは、突然変異が存在し得る特定長
さの核酸の増幅に十分な程度まで実施される。要求され
るハイブリダイゼーションのストリンジェンシーも、核
酸標的増幅の当業者にはよく知られている。当業界で一
般的に行われている標的増幅反応は多数あり、NASBA（N
ucleic Acid Seqence Based Amplification、核酸
配列ベースの増幅）、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、L
CR（リガーゼ連鎖反応）及びPCR（Repair Chain Reac
tion、修復連鎖反応）が挙げられる。PCR標的増幅方法
の場合は、市販のAmplicor（登録商標）反応キットを使
用し得る。突然変異が存在し得る特定長さの核酸を認識
しこれにハイブリダイズするのに十分な特異性を有する
プライマーを使用することも可能である。別の増幅方法
は、Chironによって商業的に開発されたような分枝鎖増
幅からなり、この場合は標的ではなくプローブが増幅さ
れる。 核酸の増幅後は、突然変異の存在及び任意に種類を検
出するためのそれ自体公知の方法による増幅核酸分析を
本発明の方法で実施する。 核酸物質を増幅せずに突然変異を決定することも可能
である。核酸上の突然変異の存在を調べるために標的増
幅反応が開発される前に使用されていた当業者に公知の
方法は多数存在し、これらの方法は総て本発明の方法の
種々の具体例で使用できる。例えば、正常〜ストリンジ
ェントのハイブリダイゼーション条件、例えばブロッテ
ィング方法を使用し、次いで単離した核酸の分析をそれ
自体公知の方法で実施して突然変異の存在及び任意に種
類を検出する場合には、分析すべき因子をコードする核
酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズするのに十
分な特異性を有する少なくとも一つの核酸配列に対する
ハイブリダイゼーション反応によって、決定すべき突然
変異を検出することができる。 突然変異の存在及び任意に種類の検出は、このように
して単離した核酸を例えばサンガー配列反応を用いて配
列分析にかけ、それによって核酸配列を確認し、次いで
この配列決定の結果を非突然変異因子の既知の配列と比
較することにより実施できる。単離した核酸配列を更に
別のハイブリダイゼーション検査にかけることも可能で
ある。この別のハイブリダイゼーション検査は、突然変
異の存在及び任意に種類を検出するために、突然変異を
含む核酸物質のフラグメントに少なくともハイブリダイ
ズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応する相補
配列を含む、適当な長さの核酸配列を用いて実施する。
最初のハイブリダイゼーションステップは、因子が突然
変異を起こしているか否かに関係なく、因子をコードす
る核酸を単離するだけであり、第二のハイブリダイゼー
ションステップは、単離核酸物質上の突然変異の存在の
有無を決定するために、確認したいと思う実際の突然変
異核酸配列の相補配列に、単離した配列を実際にハイブ
リダイズさせることからなる。この後者のハイブリダイ
ゼーション反応は、信頼できる結果を得るためにストリ
ンジェント条件下で実施する必要があり、その他のハイ
ブリダイゼーションステップは、正常〜ストリンジェン
ト条件下で実施し得る。以上、特定核酸上の突然変異の
存在を調べるための従来の方法を二つ説明したが、当業
者には明らかなように、多くの公知の方法が使用可能で
ある。分子生物学に関する種々の標準的文献には、この
種の方法が広く記述されている。例えば、Sambrook,J.,
Fritsch,E.F.Maniatis,T.,Molecular Cloning:a Labo
ratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory
Press,Cold Spring Harbor,New York,1989）参照。 本発明のスクリーニング方法で得た増幅核酸物質は、
その後、配列決定反応を用いるか、又は増幅反応にかけ
られなかった単離核酸物質の分析について前述したよう
に、突然変異の存在及び任意に種類を検出するために突
然変異を含む核酸物質のフラグメントに少なくともハイ
ブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応
する相補配列へのハイブリダイゼーションを用いる分析
検査を使用することによって分析することも可能であ
る。 特に、第Ｖ因子の突然変異の存在を分析する場合は、
単離した及び／又は増幅した核酸物質を、配列表の配列
番号12及び13の配列から選択した適当な長さの核酸物質
に対するハイブリダイゼーション検査にかけ得る。例え
ば、ハイブリダイゼーションに極めて適しているプライ
マー又は核酸配列は、ヒト第Ｖ因子をコードする核酸配
列のイントロン10の少なくとも一部分、又はストリンジ
ェント条件下でイントロン10の前記部分にハイブリダイ
ズすることができる誘導体を含む。このような誘導体
は、イントロン10の対応する部分に対して90％以上の相
同を有するのが好ましい。ヒト第Ｖ因子の核酸配列は既
知であり、ヒト第Ｖ因子をコードする核酸配列は配列表
の配列番号１に示されている。該配列はRef.21から誘導
される。イントロン10の少なくとも一部分を含むハイブ
リダイゼーション用核酸配列を使用すれば、第Ｖ因子を
コードする核酸内に存在する突然変異、特にAPC結合及
び／又は開裂部位をコードする核酸の突然変異を単離し
及び／又は増幅し及び／又はその後検出することがかな
り簡単になる。これは、Ｈ鎖上に位置する突然変異を検
出するのに特に適している（配列番号10、14参照）。ま
た、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅用の核酸配
列のプライマーは、配列表の配列番号２〜11の配列から
選択できる。前述のように、当業界では他の多くのオリ
ゴヌクレオチドプライマーが知られている。これらのプ
ライマーは、第Ｖ及び／又は第V a因子をコードする核
酸を単離するために、増幅の目的又はハイブリダイゼー
ション反応に使用することも可能である。正常因子をコ
ードする配列は突然変異因子の配列と同様に既知である
ため、当業者は、本発明の方法でスクリーニングする突
然変異の単離及び／又は増幅及び／又は存在及び種類の
決定に最も適したオリゴヌクレオチド配列を選択するこ
とができる。 本発明の方法では、特に分析すべき核酸を標的増幅に
かけた場合には、単離した及び／又は増幅した及び／又
はハイブリダイズした核酸物質を配列分析にかけ、次い
で配列を対応する非突然変異因子の核酸配列と比較す
る。増幅又は単離した及び／又はハイブリダイズした核
酸物質を、制限フラグメント分析によって分析すること
も可能である。特に、突然変異を起こした第Ｖ因子に関
する実施例で説明する突然変異の場合には、使用できる
酵素はMnl Ｉである。制限フラグメント分析に使用で
きる制限酵素は当然、検出すべき突然変異の種類とその
位置とに依存する。当業者は、別の新しいステップを用
いずに、過度の負担がかからないルーチンの実験だけ
で、前記酵素を選択できる。 前述のように、本発明の方法は、タンパク質をコード
する核酸配列ではなくタンパク質を分析することによっ
て実施することもできる。これは特に、タンパク質の突
然変異が、第Ｖもしくは第V a因子上にAPC結合及び／又
は開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内に存在し、APC
によってあまり不活化されない第Ｖ因子及び／又は第V
a因子の形成を引き起こすか、又は第VIIIもしくは第VII
I a因子上にAPC結合及び／又は開裂部位を与える核酸配
列部分内に存在し、APCによってあまり不活化されない
第VIII因子及び／又は第VIII a因子の形成を引き起こす
場合の、本発明の有用な具体例である。 前述のように、第Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因
子上にAPC開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内の突然
変異の存在は、APCによる不活化に対する突然変異因子
の耐性を明らかに変える突然変異であり、従ってこのよ
うな突然変異の検出は本発明の方法の好ましい具体例で
ある。当業界で既に明らかにされているように、第V a
又は第VIII a因子の不活化は通常、APCが因子のＨ鎖を
開裂した時にその結果として生起する。従って、突然変
異因子の開裂度を変えることになるような開裂部位にお
ける突然変異の検出は、本発明の好ましい具体例であ
る。タンパク質を突然変異に関して分析する時は、開裂
部位自体の一次アミノ酸配列が関係するだけでなく、タ
ンパク質の三次構造も、結合及び／又は開裂部位と直接
関係のない一次配列のどこかの突然変異に起因して変形
し得る。周知のように、タンパク質の実際の結合部位又
は開裂部位から遠く離れて位置する突然変異は、タンパ
ク質の三次構造に大きく作用し得、それによって、前記
タンパク質への結合、この場合はAPCによる結合を抹消
又は低下させ得る。従って、本発明の方法は、APCによ
る開裂及び／又は結合部位の一次核酸配列における突然
変異の検出だけでなく、APCによる因子の結合及び／又
は開裂を低下させる変化した三次構造を有する突然変異
因子の発生を引き起こす突然変異の検出にも適用され
る。 第Ｖ及び第VIII因子は互いに異なるメカニズムで活性
化でき、その結果得られる因子はどちらもその由来源で
ある因子とは異なる三次構造を有することが知られてい
るため、第Ｖ因子又は第VIII因子の突然変異が前記分子
のAPC結合及び／又は開裂部位には影響し得ず、活性化
因子のそれに影響し得ることは明らかであり、その逆も
明らかである。それにもかかわらず、活性化第Ｖ又は第
VIII因子の結合及び／又は開裂の変化に関与する一次ア
ミノ酸配列の突然変異は、第Ｖ又は第VIII因子上にも存
在する。特異的抗体の使用によって突然変異タンパク質
の検出を行う場合は、突然変異の存在及び任意に種類を
検出するために、突然変異を含む活性化因子に対して特
異的な抗体を使用することが可能である。あるいは、分
析すべきタンパク質をタンパク分解によって開裂し、そ
れによって、第Ｖ及び／又は第V a因子又は第VIII及び
／又は第VIII a因子の一次アミノ酸配列における突然変
異に対して特異的な抗体の使用を可能にする線状又は部
分的線状構造を得ることも可能である。従って、該突然
変異検出方法は活性化因子の分析に限定する必要はな
く、実際、まだ活性化されていない第Ｖ因子又は第VIII
因子についても実施できる。 突然変異がAPC結合及び／又は開裂部位に存在する時
は、第Ｖ、第V a、第VIII、第VIII a因子をAPCで処理
し、次いでフラグメントを公知の方法で分析すれば、因
子が正常な場合とは異なるフラグメントが明らかにされ
る筈である。 例えば、第Ｖ因子の場合は、アミノ酸506の突然変異
がその位置でのAPCの開裂及び／又は結合を阻止する。
従って、活性化APCでの処理の結果、部位306、679及び9
94で開裂が生起し、一つのフラグメントaa307−aa679
と、配列１−306、680−994及び995−末端を含む三つの
別のフラグメントとが得られる。所期のフラグメントは
307−679である。正常第Ｖ因子はこのフラグメントを含
まず、aa506の活性開裂部位に起因して、別の二つのフ
ラグメント、即ちaa307−506及びaa507−679を含む。従
って、aa307−aa679の検出は、アミノ酸506における突
然変異APC部位の存在を示す。 極めてエレガントな検査は、第Ｖ因子をAPC処理後に
二つの抗体の存在にかける操作を含み得る。このような
APC処理は血清の調製中に自然に生起する。この検査で
は一方の抗体がアミノ酸506の上流のタンパク質の部位
に対して特異的であり、前記部位が、aa506の上流の最
も隣接した開裂部位、aa306の下流に位置する。もう一
方の抗体は、アミノ酸506の下流のタンパク質の部位に
対して特異的であり、前記部位は、aa506の下流の最も
隣接したAPC開裂部位、aa679の上流に位置する。該検査
は、両方の抗体によって検出されるフラグメントの検出
を含む。この種の検査はサンドイッチ・イムノアッセイ
であり得る。好ましくは、一方の抗体を固定するか又は
固定し得、他方の抗体に、イムノアッセイの当業者に公
知の方法で検出可能マーカーを具備する。この種の検査
における、フラグメント307−506の一部分を特異的に認
識する抗体の使用は、本発明の範囲内に含まれる。フラ
グメント507−679の一部分を特異的に認識する抗体自
体、及び前述のような検査における該抗体の使用も、本
発明の範囲に含まれる。抗体はモノクローナル抗体が好
ましい。一方の抗体がフラグメント１−306の一部分に
対して特異的であり、他方の抗体がフラグメント307−5
06の一部分に対して特異的である二つの抗体を用いて、
類似の方法で、Arg306に位置するAPC開裂部位の突然変
異を検出するために適当な検査を実施し得る。この種の
検査における、フラグメント307−506の一部分を特異的
に認識する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フ
ラグメント１−306の一部分を特異的に認識する抗体自
体、及び前述のような検査における該抗体の使用も本発
明の範囲に含まれる。アミノ酸679に位置するAPC開裂部
位の突然変異の検出にも、前述と類似の方法で検査を実
施し得る。この突然変異の場合は、フラグメント507−6
79の一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされると
共に、アミノ酸680の下流のフラグメントの一部分に対
して特異的な抗体が一つ必要とされる。この種の検査に
おける、フラグメント507−679の一部分を特異的に認識
する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フラグメ
ント507−569の一部分を特異的に認識する抗体及びフラ
グメント570−994の一部分を特異的に認識する抗体、並
びに前記と類似の検査におけるこれらの抗体のうちの一
つ以上の使用も、本発明の範囲に含まれる。リシン994
のAPC開裂部位における突然変異を検出するための検査
も同様に説明し得る。フラグメント994−末端及び680−
994は関連フラグメントであり、これらのフラグメント
を認識することができる抗体も関連がある。 一般的には、第Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因子
の突然変異に関する検査は、それ自体公知の方法による
イムノアッセイで二つの抗体を使用して、特定のAPC開
裂部位でのAPCによる開裂を低下又は阻止する突然変異
の存在又は不在を検出することからなり得る。この場
合、一方の抗体は前記APC開裂部位の上流のフラグメン
トを認識し、もう一方の抗体は前記APC開裂部位の下流
のフラグメントを認識し、いずれかの抗体が認識する因
子の部分と、突然変異の存在又は不在の決定が行われる
べき特定のAPC開裂部位との間に別のAPC開裂部位は存在
しない。この突然変異検出原理に基づく種々の具体例
は、イムノアッセイの当業者には明らかであろう。例え
ば、更に別の一つ以上のプロテアーゼをAPCと組合せて
使用し得ることは明らかであろう。前記APCは、使用す
る試料の種類に応じて、試料に加えるべきもの、又は試
料中に既に存在しているものである。前述の更に別の一
つ以上のプロテアーゼは、因子上の検出すべき活性APC
開裂部位が存在しない場合には、不活性APC開裂部位を
含むタンパク分解フラグメントに両抗体が結合すること
になり、検出すべき活性APC開裂部位が存在する場合に
は、どちらの抗体もタンパク分解フラグメントに結合で
きないようにタンパク分解フラグメントが形成されるこ
とになる。これは、分析すべきAPC開裂部位の上流及び
下流で因子の開裂を引き起こす一つ以上のプロテアーゼ
を選択することにより最も簡単に達成できる。二つの抗
体のうちの一方は、決定すべきAPC開裂部位の上流、且
つAPC開裂部位の上流でプロテアーゼが開裂する位置の
下流のフラグメントの一部分を認識し、二つの抗体のう
ちのもう一方は、決定すべきAPC開裂部位の下流、且つA
PC開裂部位の下流でプロテアーゼが開裂する位置の上流
のフラグメントの一部分を認識し、前記一つ以上のプロ
テアーゼは、その開裂部位が、決定すべきAPC開裂部位
と、非突然変異因子上に存在するような隣接APC開裂部
位との間に位置するように、因子を開裂する。更に別の
具体例では、突然変異APC開裂部位の開裂を行うことは
できるが非突然変異APC開裂部位の開裂を行うことはで
きない、又はその逆のプロテアーゼを、APCの代わりに
使用し得る。決定すべき突然変異の種類が確認されれ
ば、当業者は、適当なプロテアーゼに関して、プロテア
ーゼについて知られている認識部位をスクリーニングす
るためのルーチンの実験を行いさえすればよい。 突然変異の検出の別の可能性は、もっと以前から使用
されているアミノ酸配列分析技術にある。非突然変異因
子のアミノ酸配列がわかれば、分析すべき因子のアミノ
酸配列を決定して、その配列を対応する非突然変異因子
の既知の配列と比較することは比較的簡単である。しか
しながら、突然変異の存在についてタンパク質を分析す
るための簡単で効果的な方法は、抗体の使用、例えばEL
ISAもしくはRIA、又は当業者に公知の他の種々の免疫学
的検査の使用である。 第Ｖ因子及び第VIII因子の活性化形態が、ある特定の
メカニズムによって活性化されたものである場合には、
APC結合及び／又は開裂の低下のみを示すことも可能で
ある。これは、第Ｖ因子に関して実施例１で明らかにす
る。実施例１では、トロンビンを用いて活性化した活性
化形態がAPCの結合及び／又は開裂能力の変化を示さな
いのに対し、第X a因子で活性化した活性化形態はAPCに
よる結合及び／又は開裂の低下を示す。しかしながら、
前述のように、突然変異の影響が活性化形態のうちの一
つで生起するだけであるかどうかに関係なく、第Ｖ因
子、トロンビンで活性化した第V a因子、又はX aで活性
化した第V a因子のいずれかに突然変異の存在を検出す
ることは、もちろん可能である。 実施例１で説明するように、原因不明の血栓発現傾向
を示す患者の大部分に代表的に見られる、第Ｖ因子の特
異的突然変異が検出された。これは、血漿因子Ｖのアミ
ノ酸配列のアミノ酸506に対応する位置のアミノ酸の突
然変異であった（Ref.21に開示）。従って、アミノ酸50
6の突然変異を決定することができる方法は、本発明の
好ましい具体例を構成する。一般的に、検出すべき突然
変異が、特に第Ｖ（ａ）因子及び／又は第VIII（ａ）因
子のＨ鎖上で、APC開裂部位に位置するアルギニンアミ
ノ酸の変化を含む場合の方法は、適切に実施し得る本発
明の方法の具体例である。 突然変異を検出するためには、突然変異タンパク質第
Ｖ因子及び／又は第V a因子に結合することができる
か、又は突然変異タンパク質第Ｖ因子及び／又は第V a
因子の線状タンパク分解フラグメントに結合することが
できる特異的抗体を使用し得る。前記抗体は、非突然変
異タンパク質又は非突然変異タンパク質の対応するタン
パク分解フラグメントに対する結合親和性が低い。抗体
を用いて行う方法は、タンパク質第VIII及び／又は第VI
II a因子、並びに前記突然変異タンパク質第VIII及び／
又は第VIII a因子の線状タンパク分解フラグメントにも
使用し得る。 別の方法として、タンパク質第Ｖ及び／又は第V a因
子、又はタンパク質の第VIII及び／又は第VIII a因子に
結合することができる抗体を使用することも可能であ
る。前記タンパク質はAPCによる不活化の度合いの低下
を示さず、前記抗体は、APCによる不活化の度合いの低
下を示す突然変異タンパク質を産生させる突然変異を含
む、対応する因子及び／又は該因子のタンパク分解フラ
グメントに対する結合親和性が低い。この場合は、単離
タンパク質又はタンパク分解フラグメントに対する抗体
の非結合が突然変異の存在を示すことになるようなテス
トを開発し得る。本発明は、前述のような抗体を使用し
て実施する方法に関するだけでなく、抗体自体にも関す
る。 本発明の方法では、最初に、正常血漿標準と比較した
APC添加時の凝固時間の変化について試料をスクリーニ
ングし、次いで、試料が示すAPC耐性が標準と比べて変
化していると診断された場合には、第Ｖ因子又は第VIII
因子をコードする核酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第
V a、第VIIIもしくは第VIII a因子のアミノ酸配列の分
析、及び／又は第Ｖ、第V a、第VIIIもしくは第VIII a
因子自体の分析を行う。試料を、特異的突然変異の存在
に関する分析、例えば後述の実施例で説明する第Ｖ因子
の突然変異に関する分析に直接かけることも可能であ
る。使用する方法は、事例の状況と、検査の対象とに依
存する。例えば、大きな集団をスクリーニングする場合
は、コストが最も低い方法を使用するのが好ましい。検
出すべき突然変異が抗体を用いて決定するのが困難な時
もあり、その場合は好ましくは核酸配列又は制限フラグ
メント分析を使用し得る。また、制限フラグメント検査
に使用すべき酵素が廉価であればこのような検査の実施
は極めて簡単であり、実施コストが低く、明らかに適し
たものと言える。従って本発明は、試料が、正常第Ｖ因
子及び／又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子及び／
又は第V a因子を含む試料と比べて、APCによる結合及び
／又は開裂の変化を示すかどうかを決定し、次いで前述
の方法で前記変化を引き起こす突然変異を更に分析する
検査の使用にも関する。 本発明の別の目的は、被験者の同型又は異型である第
Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因子の突然変異を検出
することにある。これは、KosterらによりLancet,1993
年12月18日,Vol.34に記述されているような、被験者がA
PC耐性を示すかどうかを調べるための検査プロトコルを
用いて実施し得る。基本的には、Kosterは、33mM CaCl
2と25mMトリス（pH7.5）と50mM NaClと0.05％オボアル
ブミンとを含む試薬（APTT−APC）50μｌ、又は2.0μg/
mlのヒトAPC及び0.6％グリセロールも含む前記試薬（AP
TT＋APC）50μｌで凝血塊の形成を開始させる前に、50
μｌのAPTT試薬（Cephotest（登録商標）、バッチ10302
9）と共に37℃で360秒間インキュベートした50μｌの非
希釈血漿の使用について記述している。彼はその結果
を、APTT（＋APC）及びAPTT（−APC）の比であると定義
されるAPC感度比（APC sensitivity ratio）（APC−S
R）として表した。これらの条件下では、正常血漿のAPC
−SRが示される。プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の
濃度が減少すると（＜0.5U/ml）、APC−SRは増加する。
従ってこの方法は、経口抗凝血剤で治療している患者の
評価には使用できない。Kosterは更に、このテストによ
って、彼が得た結果と、前文で述べたChromogenixアッ
セイを使用して得られた結果との間に、良好な相関（Pe
arson相関係数0.54）が存在することが判明したと記述
している。驚くべきことに、我々は、Kosterテストが、
被験者が第Ｖ因子の突然変異について同型であるか又は
異型であるかを調べるために適用した場合には、異型の
ほぼ半分を検出できないChromogenixテストより遥かに
良く異常を検出することを発見した。第14図はKosterテ
スト、第11図はChromogenixテストを示している。我々
は、Kosterの方法及び市販のChromogenixテストを用い
て、1691 GG（正常）又は1691 AG（異型）であると遺
伝子型決定された（genotyped）個体の無作為抽出試料
の検査を２回実施した。Chromogenixテストでは、正常
被験者及び異型被験者で得られた感度比の間に大きな重
複が存在しており、そのため異型の50％以上がChromoge
nixテストではAPC耐性であると同定できなかった。そこ
で我々は、被験者が、APC耐性を引き起こす第Ｖ因子突
然変異に関して異常であるか又は正常であるかを決定す
るのに適した別のテストを発見した。Kosterテストは従
来、被験者がAPC耐性一般について正常であるか又は異
常であるかを決定するのに有用であると見なされていた
だけであるが、我々は、該テストが実際には、APC耐性
につながる第Ｖ因子突然変異を検出し、それもChromoge
nixテストより遥かに大きい信頼度で検出することを発
見した。われわれのテストでは0.84以下の値が異常であ
り、正常被験者と同型被験者との間に重複は生じない。
これは、Chromogenixテストと比べて大きな改善であ
る。我々はこの改善が、Chromogenixテストの場合と異
なる活性化剤の使用、そしてより重要なことに、異なる
カルシウム濃度の使用に起因すると考える。この改善さ
れたテストでは、25mM CaCl2以上の試料中カルシウム
濃度を適用する。好ましくは、45mM以下、より好ましく
は30〜40mM、特に31〜35mMとする。このより高い濃度は
おそらく、試料中のクエン酸塩をChromogenix配合の場
合より十分に中和する。別の改良点は、Cephotest試薬
を活性化剤として使用することにある。この方法はまた
Chromogenixテストと類似しており、該テストをかなり
改善したものとみなすべきものである。APC感度比につ
いて得られた値を正規化した場合は（実施例１参照）、
特に第Ｖ因子突然変異に関して、0.84未満の値がAPC耐
性に関して異常であることを表し、0.84を超える値がAP
C耐性に関して正常であることを表す。同型決定の場合
は、0.50未満の値が記録されなければならない。異型は
0.50〜0.70の値を示す。しかしながら、この改善された
方法は、抗凝血剤で治療した患者には適用できない。 この実施例では、検出された突然変異が、第Ｖ因子の
アミノ酸506のコドンにおけるＧ→Ａ突然変異であっ
た。突然変異の発生頻度及びこれに関連した血栓症発生
の危険度の高さは、被験者が同型であるか又は異型であ
るかの決定が、親から子孫への突然変異因子の遺伝に関
する危険性を評価する時に大きな問題となることを意味
する。実施例２で、我々は、第Ｖ因子における突然変異
の存在、特にＧ→Ａ突然変異が、実際に、血栓症を発生
させる危険因子であることを説明する。また、初めて心
筋梗塞にかかった患者の６％が1691 Ｇ−Ａ突然変異の
キャリヤーであるという先に観察された事実は、この突
然変異が動脈血栓症の弱い危険因子（相対危険度1.5〜
2.0）であることを意味し得る。心臓発作の危険の増加
が適時に検出されれば、被験者は生活様式を調整し、こ
のような発作を防ぐように注意することができる。静脈
血栓症に関して重要なことは、前文で既に説明した。 本発明は、ここで説明する全ての具体例で本発明の方
法を実施するのに必要な要素を含むキットにも関する。
これには例えば、前述の特異的抗体のうちの一つ以上、
特にAPC開裂及び／又は結合部位を認識する前述の抗体
対を含み、及び／又は前述のような標的増幅反応及び／
又はハイブリダイゼーション反応のための一つ以上のプ
ローブ又はプライマーもしくはプライマー対を含む検査
キットが含まれる。本発明は特定的には、第Ｖ因子及び
／又は第V a因子のアミノ酸506をコードする核酸配列の
突然変異を含む核酸配列を増幅するための一つ以上のプ
ライマーを含むキットに関する。このキットは、一つの
特定の突然変異又は複数の突然変異を検出するためのプ
ライマー及び／又は抗体を含み得る。該キットは、好ま
しくは、特定集団に多く見られるAPCによる結合及び／
又は開裂の低下及び／又は抹消を引き起こす主要突然変
異の検出に必要な構成要素を含む。 実施例１ 血栓症を有する無作為抽出した一連の患者の21％（La
ncet,1993年12月18日,vol.342,pp.1503−1506,Koster
ら）、及び個人的に又は家族に血栓症の病歴がある選択
した患者の約50％（Ref.8及びBlood,Vol.82,No.7（1993
年10月１日）:pp.1989−1993,J.H.Griffinら）の血漿中
で、APCに対する弱い抗凝血結応答（「APC耐性」（Ref.
2））が最近発見された。我々はこの実施例で、APC耐性
の表現型が、APCによる不活化に対して耐性である第Ｖ
因子分子−FV（Q506）又はFV Leiden−の合成を予告す
る第Ｖ因子遺伝子の単一点突然変異（1691,G→Ａ）に関
する異型性又は同型性に関連していることを明らかにす
る。オランダ集団における突然変異の対立遺伝子頻度は
約２％であり、血栓症の全ての既知の遺伝性危険因子
（プロテインＣ−（Ref.17）、プロテインＳ−（Ref.3
0）、アンチトロンビンIII（Ref.31）欠失）の頻度の合
計の10倍以上に達する（Ref.32）。 明らかに健康な個体の５％がAPCに対して弱い抗凝血
応答を示し、このAPC耐性が深静脈血栓症発生危険度の
７倍の増加（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,pp.1503
−1506,T.Kosterら）に関係しているという我々の発見
に促されて、我々はこの表現型の分子的基礎を調べた。 APCに対する血漿の応答度は、二つのAPTT、即ちAPCの
存在下で測定したAPTT、及びAPCの不在下で測定したAPT
Tの比として測定される（Lancet,1993年12月18日,Vol.3
42,pp.1503−1506,T.Kosterら、Blood,Vol.82,No.7（19
93年10月１日）;pp.1989−1993,J.H.Griffinら、及びRe
f.2）。標準化のために、前記比（APC感度比又はAPC−S
R）を、基準血漿について得られた比（ｎ−APC−SR）に
合わせて正規化する。APC耐性はｎ−APC−SR＜0.84（外
れ値を除外した後の健康対照100の平均ｎ−APC−SRから
1.96SDを差し引いた値）によって定義される。 14人の関係の無いAPC耐性患者の親の分析の結果、同
型及び異型をｎ−APC−SRに基づいて同定できるAPC耐性
（又はAPC補因子II欠失（Ref.2））の家族的形態の概念
が得られた（第１図の説明文参照）。混合実験により、
この概念の別の裏付けが得られた（第１図）。即ち、１
倍容の正常血漿を、同型APC補因子II欠失（ｎ−APC−SR
0.38）であると分類された患者の血漿１倍容に加える
と、ｎ−APC−SRが0.57になった。これは、前記欠失に
関して異型であると分類された患者の血漿中で発見され
た比（平均ｎ−APC−SR 0.58）と同じである。同型APC
補因子II欠失（平均ｎ−APC−SR 0.40）であると分類
された４人の関係の無い患者の血漿を混合しても前記比
は修正されなかった。これは、４人の患者全員が同じ血
漿タンパク質を欠失又は欠乏していることを意味する
（Ref.2及びBlood,Vol.82,No.7（1993年10月１日）:pp.
1989−1993,J.H.Griffinら参照）。 APC補因子II活性が既知の凝血タンパク質のうちの一
つの機能的特徴である可能性を調べるために、APC補因
子IIレベルを、単一タンパク質が欠乏している一連の血
漿中で測定した（第２図）。これらの血漿はいずれも、
第Ｖ因子欠乏血漿（＜５％）を除いて、正常なAPC補因
子IIレベル（60〜155％）を有していた。第Ｖ因子欠乏
血漿に種々の量の単離ヒト第Ｖ因子を加えると、第Ｖ因
子凝血活性及びAPC補因子II活性の両方が導入された。 第Ｖ因子がAPC補因子IIの候補であることの独立した
裏付けが、APC耐性を有する大家族の連鎖研究から得ら
れた（第３図）。 第Ｖ因子遺伝子（F5）のヒト遺伝子座を染色体１（1q
21−25）についてマッピングした（Ref.33）。便利な
（PCR可能な）多形性F5マーカーについての報告は存在
しない。しかしながら、公表されている第Ｖ因子cDNA及
びゲノム配列の多様性（Ref.20−23及びThe Journal
of Immunology,Vol.150,2992−3001,No.7,1993年４月
１日,N.L.L.Shenら）は、我々が第Ｖ因子遺伝子の二つ
の新しい多形性を同定する助けになった。残念ながら、
前記APC耐性家族では、これらの多形性のどちらも情報
を与えるものではなかった。そこで我々は、この家族の
1q21−25領域（第４図参照）の幾つかの遺伝子座に関す
るマイクロサテライト（microsatellite）・マーカーの
分離（segregation）を検査した。第５図の表は、これ
らのマーカーとAPC耐性の表現型との間の関係に関する
二つ組ロドスコア（pairwise lodscore）を示してい
る。かなり肯定的な結果は、F5遺伝子座から4cM以内に
位置する遺伝子座D1S61（θ＝0.00でZmax 7.27）に関
してだけ得られた。 この時点で我々は、APC耐性が第Ｖ因子遺伝子の欠陥
に関係があるという証拠が、関連突然変異の調査を開始
するのに十分なだけそろっていると考えた。我々は調査
の焦点を、推定上のAPC結合部位（残基1865−1874）（R
ef.35、36）及び推定上のAPC開裂部位（Arg−506）（Re
f.21及びThe Journal of Biological Chemistry,Vo
l.262,No.23,1987年８月15日,pp.11233−11238,Bruce
Odegaard及びKenneth Mann）をそれぞれ含む第Ｖ因子
の二つの領域に絞った。 第一のアプローチとして、末梢血液リンパ球から単離
した第Ｖ因子遺伝子の異所転写体（ectopic transcrip
t）を用いて第一鎖cDNAを合成し、次いでAPC結合及び開
裂部位をコードする二つの領域を増幅した。PCRフラグ
メントの直接的配列決定の結果、APC補因子IIの同型接
合欠失として分類された二人の関係の無い患者の両方
が、1691,G→Ａトランジションに対して同型接合である
ことが判明した（第６図）。この突然変異は、Gln（CA
A）（FA（Q506）又はFV Leiden）によるArg−506（CG
A）の置換を予測させるものである。1691 Ａを包囲す
る225bp、及び推定上のAPC結合部位をコードする領域を
包囲する275bpに、別の配列異常は観察されなかった
（第７図）。 Arg−506の後の開裂がAPCによるヒト第V a因子の不活
化のきっかけであれば、位置506へのGlnの導入が抑制性
（inhibitory）開裂を防止することが予測される。凝固
プロセスの間に、血漿因子Ｖはまず第X a因子によって
活性化され（105/220kDaヘテロダイマーの形成（Ref.3
7））、次いで更にトロンビンによってプロセスされる
（105/74kDaヘテロダイマーの形成（Ref.38））（Ref.3
9）。興味深いことに、我々はGlnによるArg−506の置換
が、第Ｖ因子のX a活性化形態のAPCによる不活化のみを
阻止し（第８図）トロンビン活性化形態の不活化は阻止
しないことを発見した（データ示さず）。 二人の関係の無いAPC耐性患者が同じ突然変異に対し
て同型接合であるという観察事実は、この変化がAPC耐
性患者の大半に存在することを示唆する。この可能性を
調べるために、ゲノムDNAを1691 Ｇ→Ａトランジショ
ンの存在についてスクリーニングするテストを設計し
た。前記突然変異は、イントロン10の開始点から11nt51
のエクソン10に存在し、イントロン10のヌクレオチドは
最初の８個のみが公表されているため（Ref.23）、半ネ
スト型（hemi−nested）逆PCR（Ref.40）によって、よ
り長いイントロン10配列を形成した（配列14も参照）。
この情報に基づいて、遺伝子型決定に使用し得る二つの
重複ゲノムフラグメントを増幅するためのプライマーを
設計した。 Mnl Iでの267bpフラグメントの消化を使用して、正常
（1691 Ｇ）又は突然変異対立遺伝子の存在を明らかに
し、この正常又は突然変異対立遺伝子に対して特異的な
オリゴヌクレオチドと222bpフラグメントとのハイブリ
ダイゼーションを用いて、1691 Ａを正に同定した。こ
のアプローチを用いて、我々はまず第３図の家系の構成
員を総て調べた。この家系の一部について、第10図に示
すように、1691,G→Ａトランジションに関する異型接合
性のAPC耐性（ｎ−APC−SR＜0.84）を用いた完全な同時
分離（cosegregation）が明らかにされた。更に、経口
抗凝血剤で治療したためにｎ−APC−SRが得られない４
人の患者（II.6、II.8、II.14、III.22）は、異型接合
性であることが判明した。 最初の客観的に確認された深静脈血栓を経験したこと
がある301人の患者と、年齢及び性別が適合した301の集
団対照とについて先に行われた検査では、64人のAPC耐
性血栓症患者が同定された（Lancet,1993年12月18日,Vo
l.342,pp.1503−1506,T.Kosterら）。これら64の患者
と、対応する64の対照とを、Ｇ→Ａトランジションの存
在についてスクリーニングした。128の個体のうち70が
ｎ−APC−SR＜0.84を示した（64の患者及び６の対
照）。そのうち56の個体が突然変異を有しており（53の
患者及び３の対照）、患者のうち６人の突然変異が両方
の対立遺伝子にあり（平均ｎ−APC−SR 0.43;範囲0.41
−0.44）、他の50が一つの対立遺伝子にあった（平均ｎ
−APC−SR 0.57;範囲0.50−0.67）。残りの14のAPC耐
性個体は突然変異を有しておらず、わずかに減少したｎ
−APC−SRを有していただけであった（平均ｎ−APC−SR
0.78;範囲0.70−0.83）。58の非APC耐性個体はいずれ
も突然変異を有していなかった（平均ｎ−APC−SR 0.9
9;範囲0.83−1.19）。また、ｎ−APC−SR＞0.84の100人
の血栓症患者の中に突然変異のキャリヤーはいなかった
が、予想した通り、対応する100の適合対照のうち３は
突然変異のキャリヤーであった。この３つは（ｎ−APC
−SRがそれぞれ0.57、0.58及び0.59）、ｎ−APC−SR＜
0.84を有する唯一の対照であった。 我々のデータは、ｎ−APC−SR＜0.84の個体の80％、
及びｎ−APC−SR＜0.70の個体の100％が、1691,G→Ａト
ランジションに関して異型又は同型接合であり、また逆
にすべての突然変異キャリヤーがｎ−APC−SR＜0.7を有
することを示すものである。オランダ集団における突然
変異対立遺伝子の比較的高い頻度（約２％）と、APC耐
性が深静脈血栓症の一般的な強力危険因子であるという
我々の発見（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,T.Koster
ら）とを組合わせるて考えると、この遺伝性の第Ｖ因子
欠乏は現在のところ最も一般的な遺伝性凝血障害という
ことになる。 第１図及び第２図 血漿中のAPC補因子II濃度の測定 第１図．血漿中のAPC補因子II活性のアッセイに関する
検量線 APC補因子IIは、APC耐性を有する個体に欠失又は欠乏
している、APCの想定上の新しい補因子である（Ref.
2）。APC補因子IIが欠乏している同型接合患者の血漿
（APC補因子II ０％）中の正常血漿（APC補因子II 10
0％）希釈物中で、ｎ−APC−SRを測定した。第１図の曲
線は、９回の異なる実験の結果である。APC補因子II欠
乏同型又は異型接合の分類は、APC耐性を有する14のプ
ロバンド（proband）（ｎ−APC−SR＜0.84）に関する親
分析の結果に基づく。２個のプロバンド（ｎ−APC−SR
0.38/0/41）では両親がAPC耐性を有しており（平均ｎ
−APC−SR 0.55）、11個のプロバンド（平均ｎ−APC−
SR 0.57）では、親の一方がAPC耐性である（平均ｎ−A
PC−SR 0.59）のに対し他方がAPC耐性ではなく（平均
ｎ−APC−SR 0.96）、１個のプロバンド（ｎ−APC−SR
0.74）では両親ともAPC耐性ではなかった（ｎ−APC−
SR 0.96/0.99）。我々は、個体のｎ−APC−SRに基づい
て、個体をAPC補因子II欠乏に関し同型又は異型接合で
あると分類できると考える（同型：平均0.40、ｎ＝2;異
型：平均0.58、範囲0.51−0.67、ｎ＝26）。 第２図．単一凝固因子が欠乏している（＜５％）血漿中
のAPC補因子II活性レベル 血漿は、先天性欠乏を有する患者に由来するもの
（ａ、ｇ、ｆ、ｍ、ｇ、ｒ、ｓ、ｔ）、又はイムノデプ
リーション（immunodepletion）によって製造したもの
（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｊ、ｈ、ｉ、ｋ、ｌ、ｐ）である。
血漿は、第II因子欠乏（ａ）、第VII因子欠乏（ｂ）、
第IX因子欠乏（ｃ）、第Ｘ因子欠乏（ｄ）、第XI因子欠
乏（ｅ）、第XII因子欠乏（ｊ）、第XIII因子欠乏
（ｇ）、プロテインＣ欠乏（ｌ）、プロテインＳ欠乏
（ｉ）、β２−糖タンパク質欠乏（ｊ）、抗トロンビン
欠乏（ｋ）、第Ｖ因子欠乏（l,m）、第VIII因子欠乏
（p,q）又はvon Willebrand因子欠乏（ｒ、ｓ、ｔ）で
あった。第Ｖ因子欠乏血漿（ｍ）に精製ヒト第Ｖ因子
（Serbio,Gennevilliers,France）を二つの異なる濃
度、54％（ｎ）及び90％（ｏ）で加え、20mMクエン酸ナ
トリウム、150mM NaCl、4mM CaCl2に対して透析し、A
PC補因子II活性について検査した。 方法： 二つのAPTT測定、即ちAPCの存在下での測定及び不在
下での測定の結果に基づき、既述の方法と全く同じ方法
（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,T.Kosterら）でAPC
−SRを計算した。検査試料のAPC−SRを、プールしてあ
った正常血漿のAPC−SRで割り算して、ｎ−APC−SRを計
算した。第１図に示すような検量線で、APC補因子II欠
乏血漿中の検査血漿の二つの異なる希釈物（1:1、3:4）
のｎ−APC−SRを読み取ることにより、APC補因子II活性
を測定した。 第３図〜第５図.APC耐性を有する家族の連鎖分析 第３図.APC耐性（又はAPC補因子II欠乏）を有する家族
の家系 ●，■:n−APC−SR＜0.84（平均0.65;範囲0.59−0.71、
ｎ＝13）の個体；○，□:n−APC−SR＞0.84（平均1.03;
範囲0.87−1.29、ｎ＝20）の個体； 経口抗凝血剤で治療した患者（これらの患者のｎ−APC
−SR測定は無意味）； 検査しなかった個体。 第４図．染色体ｌのq21−25領域の統合的遺伝連鎖地図 遺伝子座APOA2、D1S104、D1S61、AT3、LAMB及びF13B
の相対位置を、NIH/CEPH Collaborative Mapping Gr
oup連鎖地図（Ref.41）から誘導した。隣接遺伝子座間
の遺伝距離はcMで示す。F5及びD1S61遺伝子座のマーカ
ーの情報を提供する三つのCEPH家族におけるこれら２個
のマーカーの分離を調べたところ、F5遺伝子座は、この
地図上で、D1S61遺伝子座から4cM以内に位置していた
（55の減数分裂で、これら二つの遺伝子座の間に組換え
は観察されなかった：θ＝0.00でZmax16.6）。 第５図．染色体１マーカーでのAPC耐性の二つ組ロドス
コア 第３図の家系の検査できる個体総てを分析した。遺伝
子座ApoA2、D1S104、D1S61、LAMB及びF13Bのマーカーの
オリゴヌクレオチド配列はゲノムデータバンクから入手
できる。プライマーはオランダプライマーベースから得
た。AT3遺伝子座の三つの異なる多形性マーカーは、こ
の家族の情報を提供するものではなかった。Dr.J.Ottか
ら入手したLINKAGEパッケージバージョン5.3からのMLIN
Kプログラムを用いて、２点連鎖分析（two point lin
kageanalysis）を実施した。性別平均ロドスコアを示
す。 方法： ApoA2、D1S104、D1S61、LAMB及びF13Bのマイクロサテ
ライト・マーカーをPCRで増幅した。条件:50mM NaCl、
10mMトリス−HCl（pH9.6）、10mM MgCl2、0.01％BSA、
200μＭ、dGTP、dATP及びdTTP、20μＭ dCTP、0.7μCi
α32P dCTP、0.43U Taqポリメラーゼ（Cetus,Emery
ville,CA,USA）、50ngの各プライマー及び30ngのゲノム
DNA。最終延伸（elongation）ステップを10分間にし
て、94℃（１′）、55℃（２′）、72℃（１′）で27サ
イクル実施した。PCR生成物を６％変性用ポリアクリル
アミド配列ゲル上で分離し、その後ゲルを乾燥し、Ｘ線
フィルムに暴露した。 F5多形性：第Ｖ因子遺伝子のエクソン13からの636bp
フラグメント（Ref.23）を、配列表のプライマー番号２
（PR−766、nt2253−2272（Ref.21））及び番号３（PR
−768、nt2870−2899（Ref.21））を用いてPCRで増幅し
た。PCR条件については第10図及び第11図の説明文を参
照されたい。Hinf Ｉで制限すると、nt 2298のC/T二
形性（C:0.68;T:0.32）と、nt2411の稀なA/G二形性（A:
0.98;G:0.02）とが検出される。これらのマーカーのう
ち、第３図の家系で情報提供するものはない。 第６図〜第８図.APC補因子II欠乏同型接合患者の第Ｖ因
子遺伝子突然変異の同定 第６図.APC補因子II同型接合欠乏として分類された患者
のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラム cDNA PCRフラグメント（ヒト第Ｖ因子のアミノ酸417
〜572をコードする（Ref.21））の非コード鎖のヌクレ
オチド配列の一部を、一人の患者（Ｐ）及び一人の非AP
C耐性対照（Ｃ）に関して示す。矢印は、GlnによるArg
506の置換を予告する1691,G→Ａトランジションの位
置を示す。 第７図．第Ｖ因子分子の簡単な説明図 ヒト第Ｖ因子は、数種類の内部反復を含む330kDa糖タ
ンパク質である（Ref.21）。第X a因子での活性化は、1
05/220kDaヘテロダイマー（A1A2/B′A3C1C2）（Ref.3
8）の形成につながり、トロンビンでの活性化は105/74k
Daヘテロダイマー（A1A2/A3C1C2）（Ref.37）の形成に
つながる。APCは第V a因子のA3領域に結合し（Ref.35、
36）、Arg−505後のA2領域内での開裂によってウシ第V
a因子を阻害する（The Journal of Biological Che
mistry,Vol.262,No.23,1987年８月15日,pp.11233−1123
8,Bruce Odegaard及びKenneth Mann）。 ヒト（Arg−506）及びウシ（Arg−505）第V a因子の
推定上の（Ref.43）APC開裂部位を包囲するアミノ酸配
列を示す。APC耐性患者では、Arg−506がGlnで置換され
ている。 第８図.APCによる不活化に対する第X a因子活性化第Ｖ
因子（Q506）の耐性 第Ｖ因子（R506）又は第Ｖ因子（Q506）を含む、Al
（OH）３吸着しフィブリノーゲン欠失した血漿（２時
間、37℃;0.3U/ml-1アーブン）を、30mMCaCl2及び20μ
Ｍ PS/PC（25/75）の存在下で、第X a因子（２ nM）
で処理した。８分後、第Ｖ因子の活性化が終了した時点
で、1.9nMのAPC又は緩衝液を加えた。様々な時間間隔
で、10μｌの試料をストップ緩衝液（50mMトリス−HC
l、pH7.9、180mM NaCl、0.5mg/ml-1OVA、5mM CaCl2）
中で1/100に希釈し、Pietersらの方法（Ref.44）を用い
て、第V a因子活性について直接アッセイした。0.70U/m
l-1FV（R506）（0.64μＭトロンビン分-1）又は0.49U/m
l-1FV（Q506）（0.20μＭトロンビン分-1）の完全な活
性化後に測定した第V a因子活性は、任意に100％とみな
される； ○；−APC;●，＋APC。 方法： cDNA合成：同意した患者及び非APC耐性対照のクエン
酸含有血液10mlのリンパ球フラクションからRNAを単離
した（Ref.45）。１μｇのRNAを鋳型として使用し、ス
ーパースクリプト・キット（BRL,Betheda,Md,U.S.A.）
を用いて、混合ランダムヘキサマーの存在下で第一鎖cD
NAを合成した。cDNAフラグメントの増幅。プライマー配
列４（PR−764,nt 1421−1440（Ref.21））及び配列５
（RP−856,nt 1867−1891（Ref.21））は、推定上のAP
C開裂部位を含む残基417〜572をコードする領域を増幅
し、プライマー配列６（PR−849 nt 5608−5627（Re
f.21））及び配列７（RP−848,nt 6040−6063（Ref.2
1））は、APC結合領域を含むアミノ酸残基1812〜1963を
コードする領域を増幅する。PCR条件は、第９図及び第1
0図の説明文に記載の通りである。PCRフラグメントをゲ
ル化温度が極めて低いアガロース上で精製し、PCR反応
と同じプライマーを用いて前述のように直接配列決定し
た（Ref.42）。APC結合領域の配列決定を補助するため
に、更にもう一つのプライマーを合成した：配列８（PR
−847,nt 5905−5927（Ref.21））。 第９図及び第10図.APC耐性と第Ｖ因子の1691A対立遺伝
子の存在との関係 第９図.1691AのAPC耐性による同時分離 上部は家系（第３図）における個体の位置を示し、可
能であればｎ−APC−SRも示す（II6は経口抗凝血剤治療
に関する）。中間部は、267bp PCRフラグメントのMnl
Ｉ消化の結果を示す。下部は、222bpフラグメント
と、1691A対立遺伝子（PR 1005）に特異的なビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドとのドットブロットハイブリダ
イゼーションの結果を示す。 第10図.n−APC−SR＜0.84の64人の血栓症患者及び対応
する64の対照の222bp PCRフラグメントと、1691A対立
遺伝子（PR 1005）に特異的なビオチニル化オリゴヌク
レオチドとのドットブロットハイブリダイゼーション。 総ての患者（Ｐ）及び対照（Ｃ）は、十分な説明を受
けた上で同意を与えてくれた。スラッシュはこの実験で
失敗したPCR反応の位置を示す。 方法： 1691G/Aを含むゲノムフラグメントの増幅。Mnl−Ｉ消
化のために、配列９（PR−6967;nt 1581−1602（Ref.2
1））を５′プライマーとして使用し、且つ配列10（PR
−990;イントロン10のnt 127〜−146）を３′プライマ
ーとして使用して、267bpフラグメントを増幅した。ド
ットブロットハイブリダイゼーションのために、配列11
（PR−6966、nt1626−1647（Ref.21））を５′プライマ
ーとして使用し、PR−990（配列10）を３′プライマー
として使用して、222bpフラグメントを増幅した。条件:
54mM トリス−HCl（pH8.8）、5.4mM MgCl2、5.4μＭ
EDTA、13.3mM（NH4）2SO4、８％ DMSO、8mM β−メ
ルカプトエタノール、0.4mg/ml-1 BSA、0.8mMの各ヌク
レオシドトリホスフェート、400ngの各プライマー、200
〜500ng DNA及び2UTaqポリメラーゼ（Cetus,Emeryvill
e,CA,USA）を含む混合物125μｌを、91℃（40″）、55
℃（40″）及び71℃（２′）のサイクルに36回かけた。
267bpフラグメント（７−10μｌ）を0.4U Mnl Ｉ（Bi
olabs,Cambridge,Ma,USA）で消化した。1691Gフラグメ
ントは67、37及び163bpのフラグメントを与え、1691Aフ
ラグメントは67及び200bpのフラグメントを与える。222
bpフラグメント（約100ng）を、1691Gを検出するための
ビオチニル化配列特異的オリゴヌクレオチド配列12（PR
1006;nt 1682−1699（Ref.21））、及び1691Aを検出す
るための配列13（PR1005）とのドットブロットハイブリ
ダイゼーションに使用した。手順は全く前述通りである
（Ref.46）。ハイブリダイゼーション後、ストリンジェ
ンシー洗浄を、PR−1006で53℃、PR−1005で52℃で実施
した。 実施例２ 我々は、凝固因子Ｖ（第Ｖ因子Leiden）異常の突然変
異に関して異型及び同型接合の個体における静脈血栓症
発生の危険度を調べた。我々は、最初の客観的に確認さ
れた深静脈血栓症を有する70歳以下の471人の患者、及
び474人の健康な対照の、第Ｖ因子Leiden遺伝子型を決
定した。我々は、血栓症患者の中に85の異型接合個体及
び７の同型接合個体を発見し、対照被験者の中に14の異
型接合個体を発見した。 異型接合個体の場合は相対危険度が７倍増加したのに
対し、同型接合個体の場合は80倍増加した。これらの個
体は遥かに若い年齢で（32歳対44歳）血栓症を経験して
いた。同型接合個体は主に女性であり、殆どが血液型Ａ
であった。 血栓症発生の危険は年齢と共に増加するため、絶対危
険度差は、異型接合個体及び同型接合個体の両方につい
て、年齢のより高い患者で極めて顕著である。同型接合
個体の場合は、絶対危険度が数％／年になる。これは、
第Ｖ因子Leidenに関して同型接合の個体の大半が、一生
のうち少なくとも一回は血栓症を経験することを意味す
る。 突然変異第Ｖ因子遺伝子は対立遺伝子の頻度が高いた
め、同型接合キャリヤーは、別の種類の遺伝性血栓発現
傾向の場合のように極端に稀ではない。同型接合状態が
異型接合状態より大きい危険度を与えるかどうかはこれ
まで知られていなかった。我々は、血栓症発生危険度
と、第Ｖ因子Leidenに関して同型接合である患者の臨床
的特徴とを調べた。これらは、深静脈血栓症に関する大
規模症例対照検査（large case control study）で
確認された（The Leiden Thrombophilia Study:LET
S）（Koster T.ら,Venous thrombosis due to poo
r anticoagulant response to activated protein
C:Leiden Thrombophilia Study.Lancet 1993;342:
1503−1506）。 方法 試験計画 LETSの計画の詳細について以前に開示されている（T.
Koster等，“Venous thrombosis due to poor ant
icoagulant responser to activated protein C:L
eiden Thrombophilia Study,"Lancet 342,pp.1503−
1506,1993）。本発明者は70歳未満の続発患者を考慮下
に置き、既知の悪性障害の不在下に客観的に確認された
最初の深静脈血栓症のエピソード後に前記患者をライデ
ン、アムステルダム及びロッテルダムのanticoagulatio
n Clinicに、抗凝血治療の外来監視のために委託し
た。患者は急性血栓症事象後少なくとも６ヵ月（６〜19
ヵ月）診療した。適格患者の90％が試験への参加を希望
した。474人の血栓症患者に加えて、本発明者は474人の
対照被験者も用意し、これらの被験者は静脈性血栓塞栓
症の履歴を有せず、既知の悪性障害に羅患しておらず、
性別が同じであり、かつ年齢もほぼ同じ（±５歳）であ
った。 データ収集及び研究室分析 全被験者に、指標日付、即ち血栓症事象の日付以前の
特定期間内に限定した過去における後天性危険状況の存
在についての質問を含む標準的な質問票に回答させた。
本発明者が“後天性危険状況”と看做したのは、いずれ
も指標日付の前年に有った手術、手術を行なわない入
院、または自宅の長期不動化（２週間以上）、及び指標
日付時点での妊娠である。 前腕前部静脈から血液を、0.106mmol/lのクエン酸三
ナトリウムを収容したSarstedt Monovette（登録商
標）管内に採取した。白血球から高分子DNAを単離し、
４℃で貯蔵した。突然変異体第Ｖ因子−ライデン遺伝子
（1691;G→Ａトランジション）の存在を既述のように確
認した。この方法によって本発明者は、各患者に関し、
当該患者がホモ接合性正常（GG）であるか、第Ｖ因子ラ
イデン突然変異に関してヘテロ接合性（AG）であるか、
それとも前記異常のホモ接合性保有者（AA）であるかを
確定した。技術者には常に、試料の立場、即ち試料が患
者と対照被験者とのいずれに由来するかを知らせなかっ
た。DNA分析用の細胞は471人の患者及び474人の対照か
ら入手可能であった。 分析及び統計処理 患者（cases）及び対照における第Ｖ因子ライデン突
然変異のヘテロ接合性及びホモ接合性保有者の頻度を、
単純な交叉作表によって比較した。ヘテロ接合状態に関
連する危険の分析では性別及び年齢は、常染色体遺伝異
常に肯定的に作用すると予測されないので交絡（confou
nding）数であるとは考えられなかったため、ヘテロ接
合状態に関する相対的危険度の推定値は非整合暴露オッ
ズ比の計算によって求めた。95％信頼区間をWoolfに従
って設定した（B.Woolf,“On estimating the relat
ion between blood group and disease,"Ann.Hum.
Genet.19,pp.251−253,1955）。 ホモ接合状態に関連する危険度は上述の標準的な方式
では推定できなかったが、これは対照中にホモ接合性個
体が見出されなかったからである。従って、（対照にお
ける）Hardy−Weinberg平衡の仮定下に対照母集団内の
ホモ接合性個体の予測数を計算し、その後オッズ比を標
準的な方式で推定した。ホモ接合状態に関する（log）
オッズ比の分散を、Woolfの方法を改良した方法によっ
て推定した。欄の内容ａ、ｂ、ｃ及びｄを有する２行２
列の表の各欄をPoisson分布の実現と看做せば、log（O
R）の分散は1/a＋1/b＋1/c＋1/dとなる（B.Woolf,“On
estimating the relation between blood group
and disease,"Ann.Hum.Genet.19,pp.251−253,195
5）。遺伝子型GG及びAAを有する個体数を患者では計数
し、対照に関してはHardy−Weinberg平衡から算出し、
必要な二次変換を行なうと、log（OR）の分散は1/AA
（患者）＋1/GG（患者）＋4/A（対照）＋4/A（対照）＋
4/G（対照）となり、その際AA及びGGは遺伝子型（個
体）の数であり、Ａ及びＧは対立遺伝子の数である。 様々な遺伝子型及び年齢における血栓症の絶対的危険
度を、まずHardy−Weinberg平衡の仮定下に（自治体当
局提供の情報から得た）原母集団の人年数を分割するこ
とによって計算した。分割した人年によって患者を各サ
ブグループ（遺伝子型、年齢）に分け、それによって絶
対的危険度の推定値を得た。その後、これらの粗い出現
率データを対数変換後に、三つの年齢群（０〜29歳の25
歳群、30〜49歳の40歳群及び50〜69歳の60歳群）と、各
層の患者数に関して加重したヘテロ接合状態（0,1）及
びホモ接合状態（0,1）に関する指示変数とを有する加
重最少２乗回帰モデルへとモデル化した。層特定的な出
現率をまず推定し、その後加重最少２乗回帰によって平
滑化する［“最終平滑化”（S.Greenland,“Multivaria
te estimation of exposure−specific incidence
from case−control studies,"J.Chron.Dis.34,pp.
445−453,1981）］この方法はGrizzle等が開示している
（J.E.Grizzle,C.F.Starmer及びG.G.Koch,“Analysis
of categorical data by linear models,"Biometr
ics 25,pp.489−504,1969）。Poisson分布では患者数
の分散は患者数に等しいので、この方法はPoisson回帰
モデルを作成するのとほとんど同じである。Poisson回
帰モデルは、ホモ接合状態（及びヘテロ接合状態）に関
する出現率比が当該対数（出現率）に関して年齢層間で
一定であるという仮定の下に、特にホモ接合状態に関し
てより安定な推定値をもたらす。このモデルは log（Ｉ）＝α＋β１＊年齢＋β２＊AG（0,1）＋β３＊AA（0,1） と表記でき、この式は後に、（係数の真数として）絶対
的危険度及び相対的危険度の推定値の計算に用い得る。 結果 471人の患者のうち、欠陥に関してヘテロ接合性であ
ったのは85人（18％）、ホモ接合性であったのは７人
（1.5％）であり、その他の379人（80％）は第Ｖ因子ラ
イデン突然変異を有しなかった。対照では474人のうち
の14人（2.9％）がヘテロ接合性、他の460人は総て正常
であった。対照中にホモ接合性個体は存在しなかった。 ホモ接合性個体は他の患者より甚だしく若年で血栓症
に羅患し、その血栓症羅患平均年齢はヘテロ接合性患者
の44歳、及び突然変異を有しない患者の46歳に対して32
歳であった（表２）。 ホモ接合性患者における深静脈血栓症の臨床経過は平
凡であった。全員が脚の深静脈血栓症に羅患した。４人
はヘパリン化のために短期間入院し、３人は外来患者と
してクマリン誘導体のみでの治療を受けた。７人の患者
のうちで顕性動脈疾患（心筋梗塞、卒中または末梢動脈
疾患）の履歴を有するものは皆無であった（表３）。 ７人のホモ接合性患者のうち６人（86％）は女性であ
り、これに対してヘテロ接合性個体では46人（54％）、
突然変異を有しない個体では217人（57％）が女性であ
った。また、上記７人の患者のうちの６人は血液型がＡ
型であったが、他の464人の患者のうちでＡ型は249人
（54％）であった。45歳以下である５人のホモ接合性女
性患者のうち、３人は血栓症事象の時点で経口避妊薬を
用いており、このことはいずれにせよ現在通常の使用に
類似していた。非Ｏ型の血液型、及び経口避妊薬の使用
はそれ自体が静脈血栓症の危険因子であるので、上記の
数字はこれらの危険因子とホモ接合性第Ｖ因子ライデン
との、複合的な性質を有する相互作用を示唆している。 ７人のホモ接合性患者のうちの２人（29％）には、事
象の前年に血栓症の素因は存在しなかった（１人は血栓
症となる45日前に股関節部の手術を受け、１人は血栓症
事象の60日前に出産後一晩入院した）。85人のヘテロ接
合性個体のうちの25人（29％）の患者、及び379人の正
常な患者のうちの131人（35％）に後天性危険因子が存
在した。 過去の危険状況（手術、妊娠、入院）が血栓症を招か
なかった例は、第Ｖ因子ライデン突然変異に関してホモ
接合性である患者ではその他の患者におけるほど頻繁に
生起しなかった。それでも、７人のホモ接合性患者のう
ち５人は過去に、後に血栓症をもたらさない危険状況に
遭遇していた（２人が手術を受け、４人が５人の子供を
出産）。 上記７人の患者を、最初の血栓症事象後長期経口避妊
を行なわせずに平均２年間追跡した。１人の患者は再発
性血栓症に羅患した（１回/13.4年；年率7.4％）。両親
14人のうちの３人が静脈血栓症の履歴を有したが、これ
は予測の約５倍である。 Hardy−Weinberg平衡下に正常個体：ヘテロ接合性個
体：ホモ接合性個体の相対的頻度はp2:2pg:q2となり、
その際ｐは正常遺伝子の、またｑは異常遺伝子の対立遺
伝子頻度である。p2:2pgが460/474:14/474であったの
で、第Ｖ因子ライデンの対立遺伝子頻度（ｑ）は0.015
となる。ｐ＝0.985及びｑ＝0.015という対立遺伝子頻度
は、非選択個体474人中での459.9人（GG）、14.0人（A
G）及び0.107人（AA）という分布に合致する。 対照474人中のホモ接合性個体の予測数（q2）が0.107
人であることから、ホモ接合性状態に関するオッズ比は
（7/379）／（0.107/460）＝79となる。即ち、ホモ接合
性個体にとっての血栓症の危険度は正常個体の約80倍で
ある（CI95:22〜289）。 表４に三つの年齢群に関して、0.015の対立遺伝子頻
度を用いて各年齢群におけるホモ接合性対照の予測数を
計算した場合のオッズ比を示す。ホモ接合性個体におけ
る高い血栓症の相対的危険度は年齢と共に低下すること
が明らかである。このことは、ヘテロ接合性個体の相対
的危険度が年齢を越えて多かれ少なかれ一定であること
と対照的である。 続いて、異なる年齢群及び遺伝子型における絶対的危
険度（出現率）を、Hardy−Weinberg平衡の仮定下での
原母集団における年齢分布に関するデータを用いて計算
した。表４に示したように、出現率は遺伝子型GGを有す
る最低年齢群での毎年10,000人当たり僅か0.55人という
値から、より高い年齢群のヘテロ接合性個体に関する毎
年10,000人当たり16.3人という値まで上昇する。総ての
年齢群においてホモ接合性個体に関する危険度の方がヘ
テロ接合性個体に関する危険度よりはるかに高いこと
も、表４に示した数値から明らかである（毎年10,000人
当たり78〜176人）。しかし、これらの出現率推定値は
三つの年齢群に分けた僅か７人の個体に基づくものであ
るので不安定であり、かつ最高年齢群では意外にも低下
している。本発明者が用いた回帰モデルはこれらの推定
値を平滑化し、なぜなら該モデルは相対的危険度が年齢
群を越えて一定であると仮定するからである。図12に示
したように、このモデルは正常個体及びヘテロ接合性個
体には良く適合する（係数：定数 −10.06;年齢 0.02
93;AG 1.96;AA 4.52）。ホモ接合性個体に関する平滑
化された出現率推定値は今や、30歳未満での10,000人年
当たり82人から50〜69歳での10,000患者年当たり227人
へと上昇する（図13）。これらの推定値は、ほとんどの
ホモ接合性患者がその人生において少なくとも一つの血
栓症事象を経験することを意味する。 検討 抗APC性は、突然変異体第Ｖ因子遺伝子に関する対立
遺伝子頻度が約1.5％である一般的な異常である。この
ことは、母集団の３％がヘテロ接合性であり、ホモ接合
性個体は出生10,000人当たり約２人と予測可能であるこ
とを意味する。 この試験において本発明者は、ホモ接合性個体の血栓
症の危険度が高く、しかもヘテロ接合性個体の危険度を
甚だしく上回ることを示す。この結論は、ホモ接合性個
体がその最初の血栓症事象を若年時に経験していること
によって支持される。 ホモ接合性第Ｖ因子ライデンがもたらす血栓症の危険
度がホモ接合性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓ欠乏が
もたらす血栓症の危険度に全く近似しないことは明らか
であり、これらの異常は新生児電撃性紫斑病を誘発する
（H.E.Branson等，“Inherited protein Ｃ deficie
ncy and coumarin−reponsive chronic relapsing
purpura fulminans in ａ newborn infant,"Lan
cet ii,p.1165,1983;C.Mahasadana等，“Neonatal pu
rpura fulminans associated with homozygous pr
otein Ｓ deficiency,"Lancet 335,pp.61−62,199
0）。ホモ接合性第Ｖ因子ライデンを有する個体は全員
最初の血栓症事象前に成人に達しており、１人は中年後
期にすら達していた。ほとんどのホモ接合性個体は過去
に、血栓症をもたらさない危険状況を経験しており、そ
のような危険状況（妊娠、産褥）のほとんどに関して抗
凝血性予防法は示されていない。このことは、抗APC性
をホモ接合性タンパク質Ｃ欠乏におけるような定性的欠
陥（タンパク質Ｃ活性の不在）ではなく、定量的欠陥
（第V a因子の不活性化速度の低下）と看做すべきであ
ることを示している。 この試験で目立った発見は、ホモ接合性患者において
女性が優勢であることであった。それらの女性の間では
経口避妊薬が他の患者間でと同様に頻繁に用いられてい
たので、経口避妊薬の使用が抗APC性との相乗作用によ
って一定の役割を果たしたと考えられる。ピルの使用及
び抗APC性はいずれも一般的であるので、特にヘテロ接
合性保有者（全女性の３％）に関しては上記の関連性を
更に別の試験によって調べるべきである。 ヘテロ接合性個体に関する相対的危険度は、異なる年
齢群同士の間で一定であると考えられる。このような観
察は、年齢と共に上昇する背景出現率に照らして理解し
ければならない。上記の事態は、図12及び図13に示した
ように、血栓症の絶対的危険度、または抗APC性によっ
て助長される絶対的危険度がより高齢のヘテロ接合性個
体にとってより重大となることを意味する。 毎年10,000人当たり約２人という、本発明者の得た総
合的な出現率推定値は、1,000人年当たり約0.5〜１人の
通常の推定値より小さいということが留意され得る（H.
E.Branson等，“Inherited protein Ｃ deficiency
and coumarin−responsive chronic relapsing p
urpura fulminans in ａ newborn infant,"Lancet
ii,p.1165,1983;T.Koster,“More objectivediagnos
es of venous thromboembolism,"Neth.J.Med.38,pp.
246−248,1991）。このことは、本発明者の試験での年
齢制限（70歳未満）、確認済みの血栓症への限定、悪性
障害に羅患した患者の除外、及び最初の血栓症事象への
限定によりきわめて容易に説明される。 ホモ接合性患者は80倍大きい血栓症の危険度を有し、
その結果総合的な出現率は毎年約１％となる。より高い
年齢群において観察された出現率低下は、最初の血栓症
事象を未だ経験していない当該年代の個体が母集団内に
ほとんど存在しないことによって説明できる。この出現
率低下はまた、ホモ接合性患者が少数（即ち、最高年齢
群には１人のみ）であることの結果でもあった。いずれ
の場合も、加重回帰モデルから再算出した出現率値が最
良の危険度推定値であると考えられ、この値は50歳以上
の患者では毎年２％より高くなる。 本発明者は、ホモ接合性第Ｖ因子ライデンによって惹
起される抗APC性が深静脈血栓症の危険度を高めると結
論付ける。深静脈血栓症は成人期前には出現しないと考
えられ、更には妊娠及び産褥などの危険状況において必
ず出現するともかぎらない。とはいえ本発明者は、ホモ
接合性患者は危険状況下では、抗凝血剤を用いる短期予
防を受けるべきであると確信する。しかし、第Ｖ因子ラ
イデン突然変異に関してホモ接合性である個体において
持続的な予防を行なうことはかならずしも必要でない。 図12及び図13 年齢に基づき求めた、第Ｖ因子ライデン遺伝子型に関
する粗な（図12）、及び平滑化した（図13）出現率推定
値。 （図中）最下方の線は遺伝子型GGに関する推定値を示
し、上方の線は遺伝子型AGに関する推定値を示す。図13
には遺伝子型AA（ホモ接合性の第Ｖ因子ライデン）に関
する推定値も示す。粗な出現率は記号＋で示し、平滑化
した出現率は記号□で示す。10,000人年当たりの平滑化
した出現率は、GGに関しては0.9（０〜20歳）、1.4（30
〜49歳）及び2.5（50〜69歳）;AGに関しては6.3（０〜2
9歳）、9.8（30〜49歳）及び17.6（50〜69歳）;AAに関
しては81.5（０〜29歳）、126.5（30〜49歳）及び227.3
（50〜69歳）であった。 実施例３ プラスミド及びin vitro RNA １人の健康なヒト（ホモ接合性野生型）並びに２人の
患者ID90及びID137（いずれもホモ接合性突然変異体）
のPBMCから単離したRNAを、オランダ国ライデンの鬱血
及び血栓症研究センター（Hemostatis and Thrombosi
s Research Centre）から入手した。506位のアミノ酸
に存在する突然変異を包含する297ntの断片を、制限酵
素EcoR I及びCsp451を用いてベクターpG30中でクローニ
ングした。得られたプラスミドを、野生型クローンはpG
30/FVwt、突然変異体クローンはpG30/FVmutとそれぞれ
名付けた。 適正配列のクローニングを配列分析によって確認し、
その後プラスミドを、in vitro RNA合成のためにCsCl
濃度勾配によって精製した。ソースとしてプラスミドpG
30/FVwtを用いて系制御プラスミド（pG30/FV E2）を、
プローブ配列（21nt）の欠失及びE2配列（144nt）の挿
入によって構築した。上記３種のプラスミドを、標準的
なプロトコルにおいてT7 RNAポリメラーゼを用いるin
vitro RNA転写に用いた。プラスミドをBamH1で直線
状とし、T7 RNAPでの転写後にこれらのプラスミドか
ら、297ntのwt及びmutクローン並びに420ntの系制御ク
ローンとそれぞれに続く700ntのベクター配列とから成
るRNAが得られ、従ってin vitro RNAの全長は約1kbで
あった。in vitro転写後、RNAをDNアーゼＩで処理し、
Tip 100カラム（Qiagen）プロトコルを用いて精製し、
分光光度計で定量した。適当な連続稀釈を水で行ない、
in vitro RNAを−70℃で貯蔵した。 プライマー及びプローブ NASBA増幅プライマー、及びELGA及びECL検出用の検出
プローブの配列を表５に示す。 P1は第Ｖ因子コーディング配列のエキソン10に位置
し、P2配列はエキソン11に位置する。その結果、このプ
ライマーセットは、スプライシングによりイントロン10
配列が取り出されるmRNA配列しか増幅し得ない。ELGAま
たはECLにおいてより良く機能することから、２種の一
般的（generic）プローブが用いられる。しかし、ELGA
とECLとの両方のために一方の一般的プローブを選択す
ることが可能であるべきである。増幅プライマーは20％
アクリルアミド、7M尿素スラブゲル上で精製した。溶離
及びEtOHからの析出後、プライマーを500μｌのH2Oに溶
解させ、濃度を分光光度計（OD260）によって測定し
た。 ビオチンオリゴを合成機で製造し、これをEtOHから析
出させ、かつH2Oに溶解させて用いた。NH2−オリゴへの
HRPラベルの結合を標準的なプロトコルに従って実現
し、プローブは更に精製することなく用い（一般的ELGA
プローブ）、またはスラブゲル上で精製した（野生型及
び突然変異体特異的ELGAプローブ）。ECLオリゴを合成
し、更に精製することなく用いた。 核酸の単離 核酸の単離は総て、Boom等が述べている方法（J.Cli
n.Microbiol.28,pp.495−503,1990）を用いて行なっ
た。100μｌの全血から核酸を抽出し（臨床試料参
照）、溶離を100μｌのH2Oで行ない、典型的には５μｌ
の溶出液をNASBA増幅のためのインプットとして用い
た。残りの溶出液は−70℃で貯蔵した。 NASBA増幅 NASBA増幅を次のように行なった。５μｌのRNAに、10
μｌの2.5倍NRG緩衝液（１倍緩衝液中での最終濃度:pH
8.5のトリス 40mM;KCl 70mM;各dNTP 1mM;ATP/CTP/UT
P 2mM;GTP 1.5mM;ITP 0.5mM;MgCl2 12mM）と、6.25
μｌの４倍プライマー混合物（１倍緩衝液中での最終濃
度:DMSO 15％ v/v;P1 0.2μM;P2 0.2μＭ）と、1.7
5μｌのH2Oとから成る18μｌのプレミックス溶液を添加
した。試料を65℃で５分間インキュベートし、続いて41
℃で５分間インキュベートした。41℃において可能なか
ぎり多くを管から取り出し、２μｌの酵素混合物（８単
位のAMV−RT、40単位のT7RNAP、0.1単位の大腸菌RNアー
ゼＨ、2.6μｇのBSA、1.5Mのソルビトール）を添加し、
その後穏やかに混合し（即ちタッピングし）、41℃で90
分間インキュベートした。 ELGA検出 ELGA検出のために、一般的プローブ、野生型プローブ
及び突然変異体プローブをそれぞれ含有する３種のプロ
ーブ溶液を用いた。野生型及び突然変異体HRP標識プロ
ーブの特異性を高めるべく、これらの標識プローブを該
プローブと対を成す非標識プローブと混合した（表６参
照）。 増幅後、１μｌの増幅物を４μｌの適当なプローブ混
合物［５μｌ中の最終濃度:SSC、BFB、XCFF １倍；グ
リセロール及び適当なプローブ（表５参照）５％ v/
v］に添加し、混合し、45℃で15分間インキュベートし
た。その後、アクリルアミドゲル（５％アクリル／ビス
アクリル、0.04％デキストラン硫酸、NASBA elfo緩衝
液＝25mMトリス、25mMホウ酸、500μＭ EDTA;pH8.3）
上で2.5μｌの試料を、0.5倍NASBA elfo緩衝液に加え1
50Vで泳動させて分析した。電気泳動後、標準的なTMB/U
P基質溶液（比1:1で混合）を用いてゲルを約６分間染色
した。普通、ゲルを50％メタノール（O/N）中で固定
し、２枚の透明な箔の間で空気乾燥させた。 ECL検出 ECLでも３種のプローブ溶液を用いて増幅物を検出し
た（表７参照）。 ハイブリダイゼーション反応開始のため、10μｌのEC
L混合物（0.1％ w/v BSA、12.5倍SSC、２×1012分子
のECL一般的プローブ）と、10μｌのビーズ混合物（0.1
％ w/v BSA、１倍PBS、２μｌの適当なビーズ溶液及
び適当な非標識プローブ）と、５μｌの（水での）21倍
稀釈増幅物とを混合し、ストーブにおいて常に振盪しつ
つ45℃で30分間インキュベートした。その後、300μｌ
のECLアッセイ緩衝液を添加し、管をECLシグナル読み取
りのためECL装置に設置した。 結果 感度 第Ｖ因子mRNAのNASBA増幅に用いたプライマーは、野
生型及び突然変異体配列に関して長さ182ntの増幅物を
もたらした。プライマーを系制御（SC）in vitro RNA
の増幅に用いると、長さ305ntの増幅物が得られる。in
vitroで生じた野生型、突然変異体及びSC RNAの連続
稀釈物を用いて、増幅の感度を調べた（表８）。 ３種のインプットRNAのいずれにおいても、分析感度
は100分子以上である。10分子のインプットとの反応が
陽性である場合も有り、このことは感度が実際は10分子
と100分子との間であることを示している。 実施例４ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 核酸の単離において野生型または突然変異体RNAが存
在する場合に当該RNAと競合しないように添加するべきS
C RNAの量を決定するべく、幾つかのSC RNA量を分析
した。前記量のSC RNAを、試料を加えずに、また100μ
ｌの全血を加えて単離し、かつ対照としてSC RNAの連
続稀釈物を直接増幅した。増幅後のELGA分析の結果を表
９に示す。明らかに、核酸を単離する間に何等かの核酸
損失が生じる（Ａシリーズのインプット３の行とＣシリ
ーズのインプット３の行とを比較されたい）。 Ａシリーズ（表９）から、溶解緩衝液に加えるべきSC
RNAの最少量は１×105分子であるという結論を得るこ
とができる。この量のSC RNAは、100μｌの全血から単
離した野生型または突然変異体RNAの増幅を抑制しな
い。実際のところ、SC RNAは上記の10倍量で用いて
も、100μｌの全血から単離した野生型または突然変異
体RNAに対して抑制性でない（表９のＢシリーズ）。更
に行なった実験では、適当であれば常に、核酸単離前に
105分子のSC RNAを溶解緩衝液に添加した。 実施例５ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 ＧからＡへの単一塩基突然変異という、第Ｖ因子mRNA
の突然変異の性格に起因して、野生型プローブは突然変
異体増幅物に関して甚だしいバックグラウンドシグナル
を発生し、かつこの逆も成り立つということが予測され
る。このことはELGA検出とECL検出との両方に該当す
る。複雑なハイブリダイゼーションプロトコルを回避す
るためには、標識したプローブを該プローブと対を成す
非標識プローブと混合して、非相同増幅物に関するバッ
クグラウンドハイブリダイゼーションを抑制する。表10
に、ELGA検出によって調べた、プローブ混合物での野生
型及び突然変異体増幅物の特異的検出の結果を示す。 HRP標識野生型プローブの場合、バックグラウンドを
十分低下させるには250倍過剰な非標識突然変異体プロ
ーブを添加するべきであることは明らかである。HRP標
識突然変異体プローブを用いる場合は100倍過剰な非標
識野生型プローブを添加すれば、バックグラウンドを許
容可能なレベルまで低下させるのに十分である。ECL検
出を用いて、多かれ少なかれ同様の実験を行なった。EC
L法では非標識プローブは、磁性ビーズ上の特異的ビオ
チニル化捕捉プローブと競合するはずである。異なる過
剰倍率の非標識プローブ比率を用いて行なったECL検出
の結果を表11に示す。 後でECL検出を行なうためには、ビーズ上のビオチニ
ル化プローブが野生型プローブである場合は10倍過剰な
非標識突然変異体プローブを、またビーズ上のビオチニ
ル化プローブが突然変異体プローブである場合は４倍過
剰な非標識野生型プローブを共に用いるべきであること
が判明した。ELGA及びECL検出を行なう場合に添加しな
ければならない非標識プローブ量同士の相違はハイブリ
ダイゼーション方式に関連するに違いない。ECL方式で
は特異的プローブを磁性ビーズに結合させ、従って該プ
ローブのハイブリダイゼーション反応は液中プローブに
比べて遅い。その結果、標識しない液中プローブは比較
的僅かに過剰な量で添加しなければならない。ELGAでは
２種の液中プローブ間で競合が起こり、それによって比
較的多量の非標識プローブを添加しなければならなくな
る。
に係わる。より具体的には、本発明は、血栓発現傾向、
特に遺伝性の血栓発現傾向のスクリーニング及び診断方
法に関する。従って、本発明の方法は、個体が血栓症に
かかる危険を調べるために使用できる。 発明の背景 深静脈血栓症は一般的な病気である。確定されている
危険因子としては、手術して間もない状態、悪性疾患、
妊娠及び分娩、長期の不動化、並びに凝固系の主要阻害
物質のうちの一つの欠乏が挙げられる（Ref.1）。主要
阻害物質は、プロテインＣ、プロテインＳ及びアンチト
ロンビンであることが知られている。多くの患者の深静
脈血栓症の原因はまだ解明されていない。しかしなが
ら、遺伝的に静脈血栓症の傾向がある幾つかの家族に、
活性化プロテインＣ（APC）に対する抗凝血応答の弱さ
が見られることが最近確認された（Ref.2）。 APCの抗凝血特性は、タンパク質限定分解によって活
性化補因子V a及びVIII aを不活化する能力にある（Re
f.3）。このような補因子V a及びVIII aの不活化は、重
要な凝固酵素であるトロンビンの生成率を低下させる。
この作用はin vitroで、正常血漿にAPCを加え、その効
果を凝固検査、例えばAPTT（activated partial thro
mboplastin time）を測定する検査で調べることによ
り、視覚化できる。プロテインＣの活性化は、トロンビ
ン−トロンボモジュリン複合体を介して内皮細胞の表面
で起こる（Ref.27）。トロンボモジュリン（thrombomod
ulin）は、トロンビンに結合することができる膜糖タン
パク質である。この結合によってトロンビンは、フィブ
リノーゲンをフィブリンに変換する能力と、血小板を活
性化する能力とを失う。即ち、トロンビンは凝血特性を
失い、プロテインＣの活性化によってそれ自体の生成も
低下する（いわゆる負のフィードバック）。in vivo
（カルシウムの存在下）では、プロテインＣの活性化
は、内皮上のトロンボモジュリンの存在にほぼ全面的に
依存する。APCはその後、APC阻害物質（PCI）及びα１
アンチトリプシンとの複合体の形成によって中和され
る。これは、正常な状態では、APCが循環系中に短時間
しか存在せず、抗凝血作用が通常は局所的に発現される
状態を維持することを意味する。 APCによる補因子V a及びVIII aの不活化が、Ca2+、リ
ン脂質及びAPC補因子プロテインＳの存在下で最適に進
行することは、一般的に認められていた（Ref.4、28、2
9）。しかしながら、この見解はその後、精製タンパク
質系ではプロテインＳはAPCに対して補因子活性をほと
んど示さないという発見により、正当性が問われること
になった（Ref.5、Ref.6）。in vivoの観察事項（遺伝
性プロテインＳ欠乏の場合の血栓症の傾向）とin vitr
oの観察事項（精製タンパク質系におけるプロテインＳ
のAPC補因子活性の弱さ）との間のこのような明らかな
矛盾は、Dahlbckらの発見（Ref.2）によって解決され
得る。Dahlbckらは、アンチトロンビン活性が正常値
であり、プロテインＣ及びプロテインＳも（免疫学的及
び機能的に）正常値であり、異常プラスミノーゲン、異
常フィブリノーゲン又は抗凝血性狼瘡（lupus anticoa
gulant）の徴候を示さないが、活性化プロテインＣに対
する抗凝血応答が弱い患者について報告している。前記
応答は、精製ヒトAPCをin vitro添加した後の血漿の応
答（凝固時間、APTT）を調べるためにDahlbackが開発し
た新しいテスト（Ref.2）で発見された。これらの血栓
症患者の血漿に活性化プロテインＣを加えても、APTTは
予想に反して延長されなかった。この現象に関して多数
のメカニズムを想定した結果、APCに対する弱い抗凝血
応答を誘起すると見なされるものが一つだけあった。即
ち、前記患者に欠乏している、これまで未知のAPC補因
子の存在である。 下記のメカニズムは従来、APCに対する弱い抗凝血応
答の原因として認められていなかった： 1. APCに対する自己抗体の存在、 2. APCと反応する即時型作用性プロテアーゼ阻害物
質、 3. 機能性プロテインＳの欠乏、 4. 第Ｖ因子又は第VIII因子遺伝子の突然変異。 Dahlbck（Ref.2,7）は、検査した家族では、プロテ
インＳと無関係に作用するとされているこれまで知られ
ていないAPC補因子の遺伝的な欠乏が、APC耐性の原因で
あると想定した。Dahlbckら（Ref.2）はまた国際特許
出願第WO93/10261号で、凝固因子を含む患者試料に活性
化プロテインＣを加え、該APC添加によって左右される
酵素活性を測定することにより、血栓塞栓障害を診断す
る検査方法を開示した。Dahlbckらの出願明細書に
は、記載の実験結果は、当該障害が、これまで未知の１
種類以上の凝固因子、又は既知の因子の未知の相互作用
に関係していることを示すものであると記述されてい
る。未知の因子は、APCによる分解に対して耐性を示す
第V a又は第VIII a因子ではなく、APCに対する免疫グロ
ブリン型阻害物質でもない。また、プロテインＳの欠乏
にも関係がない。Dahlbckら（Ref.2）は、彼らの発明
が、遺伝性又は非遺伝性の血栓発現傾向のような血栓塞
栓疾患の更に進んだ診断、並びに妊娠、避妊ピルの使
用、手術等に関連した血栓症の危険の決定に特に有用な
方法であると述べている。彼らはその方法が、試料中の
凝固系をそれ自体公知のように完全に又は部分的に活性
化し、活性化プロテインＣと共にインキュベートし、次
いで発色性基質の凝固又は変換のような基質変換反応速
度を測定することを特徴とすると記述している。測定し
た変換速度は、正常血漿試料に関して得られた値と比較
される。この速度が大きければ、試料の由来源である個
体が凝固疾患にかかっている可能性がある。この疾患
は、プロテインＳの欠乏、又はAPCによる分解、もしく
はAPCに対する免疫グロブリン型阻害物質による分解に
対して耐性の第V a因子もしくは第VIII a因子の産生に
よって発現されない。前記国際特許出願でDahlbckら
は更に、該出願明細書に記載のデータは、当該患者が欠
陥第VIII/VIII a因子を有し得ないことを示すものであ
ると記述している。これは、彼らがそれより先にThrom
b.Haemostas.65,アブストラクト39,658（1991）で述べ
たこと、即ち患者の血漿試料への活性化プロテインＣの
添加、及び生じた作用の検査によって、活性化プロテイ
ンＣにより分解されない欠陥第VIII a因子分子が明らか
にされたという主張に反するものである。前記国際特許
出願では更に、APCによる第V a及び第VIII a因子の阻害
を直接測定するためにアッセイが使用されている。前記
国際特許出願に記載の第X a因子ベースの凝固アッセイ
を使用すると、APCによる患者第V a因子の阻害が正常で
あることが判明した。これは、患者血漿試料中の第V a
因子が、外部から添加したAPCにより正常に分解される
ことを示唆するものである。 Dahlbckら（Ref.2）の報告に続いて、別のグループ
がこの分野での研究を開発した。Griffinらは、Blood,V
ol.82,nr.7,1993,1989−1993ページに、確認可能な血液
凝固異常がない25人の静脈血栓患者、及び予め異型（he
terozygous）プロテインＣ又はプロテインＳ欠乏を有す
ると確認された22人の患者について実施したAPC耐性検
査の結果を記述している。これらの患者に関するAPTTの
APC誘発延長（APC induced prolongation）アッセイ
が、35の正常被験者に関する結果と比較された。結果
は、このようなAPCへの抗凝血応答の新しい欠陥が、驚
いたことに、25人の患者の52〜64％、即ち予め血栓発現
傾向を有すると診断されなかった患者の大半に存在する
ことを示した。この欠陥は、22人の異型プロテインＣ又
はプロテインＳ欠乏患者のうち20人の患者には見られな
かった。これは、新しい因子が、プロテインＣ又はプロ
テインＳの欠乏に関係のない危険因子であることを示唆
するものであった。正常血漿と２種類の著しい欠陥のあ
る血漿（APTTのAPC誘発延長＜20秒）の各々とを混合
し、APTTアッセイを行って、正常血漿が欠陥血漿の弱い
応答を修正する能力を評価した。結果は、Dahlbckら
（Ref.2）の結果と類似していた。これも、正常血漿
が、欠陥のある患者血漿に欠失している因子を含むこと
を示唆するものであった。前記文献には、APC存在下のA
PTT値からAPC不在下のAPTT値を差し引いた値として単純
に定義された正味のAPTT延長時間計算値が記載されてい
る。前記文献はまた、APC存在下のAPTT対APC不在下のAP
TTの比と、このパラメーターをAPC誘発APTT延長の値と
比較したという事実も記述している。この比較は、異常
患者の指標である極めて小さいAPTT比の値と、正常被験
者に関するこれらのパラメーターとの間の優れた相関を
明らかにした。従って、APC誘発APTT延長のパラメータ
ー、あるいはAPC存在下対APC不在下のAPTT値の比のパラ
メーター、又はこれら二つのパラメーターを診断パラメ
ーターとして使用できると結論された。これらのパラメ
ーターの中には、この目的に関して、前記文献の別のパ
ラメーターより有用と思われるものはない。前記文献に
は更に、使用したAPC誘発APTT延長アッセイが、Potzsch
ら（Ref.19）によりBlood 80:267a 1992（アブストラ
クト）に報告されている抗凝血性狼瘡患者の血漿中の内
在性第VIII因子のAPC誘発不活化を用いるアッセイを連
想させると記載されている。この後者のアッセイに基づ
いて、Griffinらの文献には、血栓症を有する抗凝血性
狼瘡患者に由来する血漿はAPCに対する応答が弱く、従
って血栓症を有する患者を血栓症のない患者から区別す
ることができると報告されている。Griffinらは、新し
い仮想のAPC補因子に対する自己抗体が、抗凝血性狼瘡
患者の血栓症の危険性に関与し得ると推測した。彼らは
更に、新しいAPC補因子の後天的欠乏が、血栓症の後天
的危険性と関係があり得ると推測することに興味を引か
れると述べている。 Kosterらは、Lancet,1993年12月18日,Vol.342,1503−
1506ページで、活性化プロテインＣ（APC）に対する抗
凝血応答の弱さを特徴とする凝固系の異常の臨床的重要
性を調べるために、集団ベース症例対照テストをいかに
して実施したかを記述することによって、APC耐性と血
栓症との関係を更に深く検討している。家族内の研究に
基づけば、APCに対するこのような弱い応答は、常染色
体優性形質として遺伝すると思われる（Ref.2、７及び4
7）。原因不明の血栓症のために凝固ユニット（coagula
tion unit）と称されている患者の間で前記異常は約40
％の羅患率を示し、血栓発現傾向の主因であった（Ref.
8及び９）。KosterがLancet,1993年12月18日,Vol.342,1
503−1506ページに記述している研究では、APCに対する
弱い応答の臨床的重要性が、最初の客観的に確認された
深静脈血栓症の経験がなく、内在する悪影響（underlyi
ng malignancy）もない、任意に選択した70歳以下の一
連の患者について調べられている。APCに対するこれら
の患者の血漿の感度が、対応する健康対照の感度と比較
された。活性化プロテインＣ（APC）に対する血漿APTT
の感度は、プロテインＳ活性アッセイのために先に開発
された試薬及び反応条件を用いて（Ref.11）、本質的に
Dahlbckら（Ref.2）が記述しているように測定され
た。結果は、APTT（＋APC）/APTT（−APC）の値として
定義されるAPC感度比（APC−SR）として示されている。
Kosterらの論文には（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,
1503−1506ページ）、プロトロンビン及び／又は第Ｘ因
子の低い濃度（＜0.5u/ml）が、APC−SRを増加させると
記述されている。そのため、経口抗凝血剤で治療してい
る患者の血漿の評価に該検査を使用することはできな
い。98個の一連の試料では、Kosterらのテスト（Lance
t,1993年12月18日,Vol.342,1503−1506ページ）で得ら
れたAPC−SRと、WO93/10261号に記載のようにChromogen
ixによって開発されたテストで得られたAPC−SRとの間
に良好な相関が見出された。健康対照被験者に基づいて
APC感度比の基準範囲が算出された。データの対数変換
及び平均値の三つの標準偏差（SD）外の値を有する10人
の被験者の除外後の正常の下限値は、2.17（平均値−1.
96 SD）であった。血栓症にかかる危険と応答の度合い
との間に反比例関係が発見された。血栓症患者の弱いAP
C応答の羅患率が21％であり、且つ血栓症の確率比（odd
s ratio）が6.6であるという理由から、弱いAPC応答は
深静脈血栓症の一般的な強力危険因子とみなし得ると結
論された。さらには、APC感度比が約1.10の被験者は同
型（homozygous）又は二重異型（double heterozygou
s）であり得、APC感度比が約1.50の被験者は異常に対し
て異型であり得るとさえ推論された。健康対照被験者の
前記異常の羅患率は５％であった。APC−SRの分布は明
らかに双峰であるため、Kosterらは、被験者が正常範囲
内で低すぎる値を有するのではなく、実際に異常なAPC
応答を有すると考えた。従って、血栓症にかかる危険と
APC応答との間の関係は、単純な単一遺伝子欠陥のモデ
ルに従うものではないと思われた。前記異常は健康被験
者の間に広く発見されたため、Kosterらは、プロテイン
Ｃ欠乏についても同様であるように、欠陥自体が血栓症
を起こすのに十分であるとは思えないと考えた（Ref.1
5、Ref.16）。特定の患者における血栓症の発生には、
別の原因となる因子が必要と思われる。これは後天的因
子であり得、まだ知られていない遺伝子欠陥もしくは変
異でもあり得る。しかしながら、別の原因となる因子が
存在すれば、弱いAPC応答は、相対的危険性の６〜７倍
の増加によって証明されるように、血栓症を発生させる
危険が高い。前記論文には、弱いAPC応答の潜在的欠陥
は、活性化プロテインＣに対する補因子の常染色体優性
遺伝性欠乏が仮想されたとしても（Ref.7）、依然とし
て解明されないままであると記述されている。弱いAPC
応答は、プロテインＣ、プロテインＳ又は抗トロンビン
の欠乏の５〜10倍の頻度を有すると思われる一方で、ほ
ぼ類似の相対的血栓症危険率を与える（Ref.17及び1
8）。これは、Kosterらによれば、前記異常に関する総
ての静脈血栓症患者の検査を価値あるものにし得るデー
タである。 要約すれば、当業界では、プロテインＣ抗凝血経路の
欠陥が、比較的高い血栓症発生危険率に関係しているこ
とが確認された。活性化プロテインＣに対する弱い抗凝
血応答は細部にわたって研究されてきたが、活性化プロ
テインＣに対する弱い抗凝血応答の原因はまだ解明され
ていない。多くの仮説がたてられたが、唯一受け入れら
れたのは、活性化プロテインＣに対して弱い抗凝血応答
を示す患者に明らかに欠乏している未知のAPC補因子の
存在である。仮想のAPC補因子のアイデンティティは不
明である。また、APCに対する応答の変化を検出するた
めに現在使用されている検査は、既に抗凝血剤を使用し
ている被験者には使用できない。 発明の説明 驚くべきことに、弱い抗凝血プロテインＣ応答の原因
である同定されていない補因子のアイデンティティが判
明した。前述の認められていなかったメカニズムのうち
の一つが、実際に、血栓発現傾向のある患者の大半にお
けるプロテインＣ抗凝血経路の欠陥に関与していること
が判明したのである。この欠陥の原因は、発現後に、第
Ｖ因子及び／又は第V a因子（前記第Ｖ因子の活性化産
物）、又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子（前記第
VIII因子の活性化産物）のAPCによる不活化の度合いの
低下に関与する、第Ｖ因子又は第VIII因子をコードする
核酸物質中の突然変異の存在に結び付けられた。従って
前記欠陥は、まだ同定されていないAPC補因子の突然変
異の結果ではなく、実際には、第Ｖ因子もしくは第VIII
因子の欠乏、又はより特定的にはこれら因子の活性化産
物の欠陥に起因する。 当業界で公知のように、血栓症が発生する危険とAPC
耐性の存在との間の関係は既に確認されており、この種
の欠陥のスクリーニングは実際に、血栓症を起こす危険
が高い患者の診断に極めて有用と思われる。現在では、
どの因子が関係のある遺伝子欠陥を有しているかが分か
っているため、APC耐性を調べるためのChromogenixテス
ト以外の方法で集団を実際にスクリーニングすることが
可能となった。 APC耐性に関連した変異を受けた第Ｖ因子又は第VIII
因子についてスクリーニングする時に、突然変異タンパ
ク質の存在を調べるためにDNA技術を使用するか又は抗
体を使用することが可能になった。本発明は、血栓症及
び／又は活性化プロテインＣ（APC）に対する弱い抗凝
血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングす
る方法に関する。前記遺伝性欠陥は、患者の血栓症発生
の危険が高いことを示すか、又は実際に血栓症を生起さ
せるようなものである。該方法は、それ自体公知の方法
で第Ｖ因子又は第VIII因子をコードする核酸物質の突然
変異の存在を測定することからなり、但し核酸物質発現
時の前記突然変異は、APCによる前記第Ｖ因子及び／又
は第V a因子（前記第Ｖ因子の活性化産物）、あるいは
前記第VIII因子及び／又は第VIII a因子（前記第VIII因
子の活性化産物）の不活化の度合いの低下に関係してお
り、及び／又は、該方法は、タンパク質第Ｖ因子及び／
又は第V a因子中に存在する突然変異、及び／又はタン
パク質第VIII因子及び／又は第VIII a因子中に存在する
突然変異を、それ自体公知の方法で、前記第Ｖ因子及び
／又は第V a因子あるいは第VIII因子及び／又は第VIII
a因子の分析、又は前記第Ｖ因子及び／又は前記第V a因
子、及び／又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子のタ
ンパク分解フラグメントの分析により調べることからな
り、但し前記突然変異はAPCによる前記第Ｖ因子及び／
又は前記第V a因子及び／又は第VIII因子及び／又は第V
III a因子の不活化の度合いの低下に相関するものであ
る。本発明は特に、第Ｖ因子及び／又は第VIII因子をコ
ードする核酸配列における突然変異が、第Ｖ及び／又は
第V a因子及び／又は第VIII及び／又は第VIII a因子上
のAPCの結合部位又は開裂部位をコードする核酸配列部
分内に存在し、該突然変異が、APCによって弱く不活化
された第Ｖ因子及び／又は第V a因子及び／又は第VIII
因子及び／又は第VIII a因子を生成させる場合の方法に
関する。第Ｖ因子、第VIII因子、第V a因子及び第VIII
a因子中のAPCの結合及び開裂部位は多数存在することが
知られている（表１、Ref.34、35、36、48、49、52、J.
Biol.Chem.262,11233−11238（1987）に記載のOdegaard
Ｂ及びMann K.G.の論文、並びにBlood 82,Suppl.1,
p.58a,1993に記載のKalafatis M.,Haley P.E.及びMan
n K.G.のアブストラクト参照）。 結合部位は必ずしも開裂部位ではない。しかしなが
ら、この種の因子へのAPCの結合を弱めるあらゆる効果
がこの種の因子のAPC耐性にも作用することはかなり明
白である。なぜなら、一般的に、該因子はAPCと結合し
た後でなければAPCによって開裂することができないか
らである。結合及び／又は開裂部位に作用する突然変異
は、結合部位に位置するアミノ酸の一次アミノ酸配列中
に存在し得、又はAPC結合及び／又は開裂に対する親和
性が小さい三次構造を形成させる分子中の別の場所の突
然変異に起因し得る。多数のAPC結合及び／又は開裂部
位が明らかにされているため、分子全体ではなく、これ
らの位置の突然変異についてスクリーニングを行うのが
最も簡単であることは明白である。多くのAPC開裂部位
が第Ｖ、第V a、第VIII及び第VIII a因子のＨ鎖上に存
在することが知られているため、検出すべき突然変異
は、Ｈ鎖上のAPC開裂部位をコードする核酸配列部分内
の位置に存在するのが好ましい。 第Ｖ及び第VIII因子の活性化はトロンビン因子X aに
よって生起し得、第Ｖ因子の場合はある種のヘビ毒によ
っても生起し得る。当業者は、「特定因子によって
（で）活性化された（した）」という表現を、「特定因
子を介して活性化された（した）」と解釈することもで
きる。その結果得られる活性化因子は、それぞれの活性
化方法に起因して少しだけ異なる。従って、トロビンで
活性化した第V a因子のAPCによる結合及び／又は開裂を
低下させる突然変異が、X aで活性化した第V a因子のAP
Cによる結合及び／又は開裂を低下させないことは可能
であり、その逆も可能である。第Ｖ因子は次のドメイン
構造A1A2/BA3C1C2を有し、X aで活性化した第V a因子は
構造A1A2/B′A3C1C2を有し、トロビンで活性化した第V
a因子は構造A1A2/A3C1C2を有する。三次構造の相違はお
そらく、異なる方法で活性化された時に生じるこれら因
子のＬ鎖の構造変化に起因する。本明細書に記載の実施
例では、活性化がX aを介して開始され、トロビンを介
して活性化された第V a因子のAPC不活化に作用しなかっ
た時には、説明されている特定の突然変異が実際に、第
V a因子のAPC不活化のみを抑制したことが明らかにされ
ている。この特定の突然変異は、第Ｖ因子のＨ鎖上に存
在していたため、トロビンを介して活性化した第V a因
子及びX aを介して活性化した第V a因子の両方に存在す
るが、おそらくは、二つの形態の活性化因子Ｖの三次構
造の相違のためにこれら二つの形態の活性化因子内で同
じ作用を発揮することはない。 通常は、APCによる不活化は活性化第Ｖ因子又は活性
化第VIII因子上で生起するため、本発明の方法は、好ま
しくは、第V a因子及び第VIII a因子上のAPCに対する結
合親和性の低下及び／又はAPCによる開裂の低下を引き
起こす突然変異の検出に適用される。一般的には、第V
a因子及び第VIII a因子に存在する突然変異は、これら
の活性化産物の由来源である第Ｖ因子又は第VIII因子上
にも存在する。従って、第Ｖ因子又は第VIII因子をコー
ドする核酸配列を分析すれば、活性化因子V a又はVIII
aにも存在し得る突然変異が検出されることになる。従
って、本発明の方法による分析は、第Ｖ及び第VIII因子
の核酸レベル、例えばDNA及び／又はmRNAレベル、並び
に第V a、第VIII a、第Ｖ及び第VIII因子のうちのいず
れか、又はこれらの因子に由来するフラグメント上のタ
ンパク質レベルで実施することができる。 第V a因子DNAは、HepG2細胞（Ref.20）及びヒト胎児
肝臓（Ref.21及び22）からクローニングされた。第Ｖ因
子の完全アミノ酸配列は既知であり（Ref.20、23）、第
Ｖ因子遺伝子の構造も解明されている（Ref.23）。Shen
らは（The Journal of Immunology,Vol.150,2992−3
001,No.7,1993年４月１日）、どのようにしてヒト第Ｖ
因子の細胞供給源を発見したかを記述している。彼ら
は、逆転写とそれに次ぐポリメラーゼ連鎖反応（RT−PC
R）とを用いて、ヒトリンパ球内の第Ｖ因子mRNAを同定
した。PCRで得られた結果は、Ｔ細胞 cDNAライブラリ
ーからの第Ｖ因子cDNAの独立クローニングによって確認
された。第Ｖ因子cDNAの配列は、肝臓第Ｖ因子mRNAとほ
ぼ同じであった。第Ｖ因子タンパク質の連結領域の一部
をコードする限定された長さのmRNAが、６個のヌクレオ
チド置換に基づくヌクレオチド多形性を有することが判
明した。Shenらは、増幅後に誘導された14個の独立クロ
ーン内に存在する増幅F7/F8第Ｖ因子cDNAフラグメント
が、６個のヌクレオチドベース置換を有すると記述して
いる。２個の置換は、それぞれ位置2209及び2236でのチ
ミンからシトシン及びシトシンからチミンへの置換であ
り、これらはサイレント（silent）突然変異であった。
４個の置換は、位置2302でやはりサイレント突然変異を
生起させるグアニンからアデニンベースの置換、並びに
位置2573でのアルギニンからリシンへのアミノ酸変化、
位置2595でのアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸変
化、位置2773でのグルタミン酸からリシンへのアミノ酸
変化であった。これらの推定上のアミノ酸変化は、前記
論文で、第Ｖ因子機能に重大に作用しない保存的置換で
あると記述されている。クローンのうちの半分（14個の
うち７個）は更に、位置2290でアデニンからグアニンへ
の置換を示した。これは、EcoR I部位を消滅させる別の
サイレント置換であった。これらの突然変異の中には、
APC結合又は開裂に対する親和性の低下に関与している
ものはなかった。 Shenらの論文には、第Ｖ因子mRNAを、例えばポリメラ
ーゼ連鎖反応を生起させるのに十分な量で、ヒトリンパ
球から回収できると記述されている。この情報に基づい
て、当業者は、本発明の方法を実施するのに十分な量の
核酸をヒトから容易に回収できる。Shenらの論文には、
ヒト第Ｖ因子核酸の核酸増幅に使用できるオリゴヌクレ
オチドが多数紹介されている。 Bruce Odegaard及びMannは（The Journal of Bio
logical Chemistry,Vol.262,No.23,1987年８月15日,p
p.11233−11238）、第Ｖ及び第V a因子の両方につい
て、トロンビンによる第Ｖ因子の開裂が、Mr＝94,000の
Ｈ鎖（Ｄ鎖）及びMr＝74,000のＬ鎖（Ｅ鎖）を形成させ
ると記述している。各鎖自体は、活性化プロテインＣ及
び第X a因子によるタンパク質分解を受け易い。活性化
プロテインＣ又は第X a因子によるＥ鎖の開裂は、二つ
の主要フラグメント、Mr＝30,000及びMr＝48,000を与え
る。彼らはまた、活性化プロテインＣ及び第X a因子が
Ｅ鎖を同じ位置で開裂すると記述している。Ｄ鎖の活性
化プロテインＣ開裂では、二つの産生物Mr＝70,000及び
Mr＝24,000が得られる。Mr＝70,000フラグメントは、無
傷Ｄ鎖と同じNH2末端配列を有するが、Mr＝24,000フラ
グメントはそうではない。彼らは、活性化プロテインＣ
によるＤ鎖の開裂が第V a因子の部分的不活化の原因で
あることを明らかにした。Ｌ鎖の開裂はより遅いため、
第V a因子の不活化がそのＨ鎖の開裂に関係があるとい
う証拠は、Ref.10、12、13、14及び48にも示されてい
る。 Odegaard及びMannは、第V a因子と第VIII a因子との
間に大きな類似性があることも明らかにした。第VIII a
因子は、タンパ分解によって活性が調節される凝固カス
ケード（clotting cascade）の別の補因子である。第V
III a及び第V a因子は多くの類似した構造的及び機能的
特性を有する。どちらもトロンビン又は第X a因子によ
る開裂を介して大きなプロコファクターから産生され、
どちらもほぼ同じ大きさを有し、Ｈ鎖とＬ鎖とからな
る。どちらももタンパク分解複合体の活性に大きく寄与
する一方で、それ自体はタンパク分解活性を発揮しな
い。また、どちらもも活性化プロテインＣにより不活化
される。この共通の特徴の根底には、一次構造の明らか
な相同もある（Ref.24,25及び26）。Odegaardらはま
た、第Ｖ因子と第VIII因子との間の更に大きな配列相同
を同定した。彼らは特に、開裂が生起する第Ｖ因子分子
内の位置に十分妥当に対応する第VIII因子分子内の位置
で、ウシ第Ｖ因子とヒト第VIII因子との間に配列相同セ
グメントが明らかに存在すると記述している。ヒト第Ｖ
因子について（実施例１で）我々が明らかにした作用
は、特定の面における第Ｖ因子と第VIII因子との同等性
に起因して、第VIII及び／又は第VIII a因子についても
付随的に期待できる。Odegaard及びMannは更に、APCに
よる第V a因子の開裂後にＨ鎖が残らない場合でも、残
留補因子活性が残ると記述している。これは、第V a因
子の不活化が、単一結合の単なる開裂より複雑な事象で
あることを意味する。これは、第Ｖ因子分子のAPC結合
及び／又は開裂部位の突然変異が、実際にAPCによる不
活化に対する親和性を低下させるのに十分であるという
本明細書の実施例の説明を更に驚くべきものとするもの
である。第VIII因子の場合は、APC開裂部位はArg 56
2、Arg 336及びArg 740にあると想定され（Ref.4
9）、APC結合部位は残基2009−2018上でA3ドメイン内に
存在すると想定された（Ref.35、36）（表１も参照のこ
と）。 本発明の方法は、第Ｖ因子及び／又は第V a因子又は
第VIII因子及び／又は第VIII a因子のAPC開裂及び／又
は結合部位のうちの一つ以上において、核酸もしくはタ
ンパク質のいずれかのレベル又は両方のレベルで、一つ
以上の突然変異を検出するために適用される。特に、タ
ンパク質のＨ鎖上、又はＨ鎖をコードする核酸上に位置
するAPC結合及び／又は開裂部位が関連部位とみなされ
る。 Kalafatisらは（Blood 82,Suppl.1,p.58A,1993）、
膜結合ヒト第V a因子が、Arg 506及びArg 306でのＨ
鎖の開裂後に、活性化プロテインＣによって不活化され
ることを明らかにした。彼らは、ヒト第V a因子のＨ鎖
の開裂パターンが、PCPS小胞の存在又は不在に依存する
と記述している。膜表面の不在下、又はPCのみからなる
リン脂質小胞の存在下では、開裂の結果として、残基１
−506からなるフラグメントと残基507で始まるフラグメ
ントとが得られ、後者のフラグメントはCOOH末端でAPC
により更に開裂される。これと対照的に、PCPS小胞の存
在下では、活性の完全な喪失は、Mr＝75,000フラグメン
トの開裂、並びにMr＝40,000及びMr＝30,000フラグメン
トの出現に関係している。Mr＝30,000フラグメントは残
基307〜506に対応する。これは、Arg 306でのAPCによ
る開裂を示すものである。APCと共にインキュベートし
た後は、PCPS小胞の存在下でも不在下でも、補因子のＬ
鎖の開裂は観察されない。このようにして、補因子がPC
PSに結合した時に特定のAPC開裂部位が明らかにされ
る。膜の存在は、APCによるヒト第V a因子の完全不活化
にとって必須であり、Arg 506での開裂は補因子を部分
的に不活化するだけであり、Arg 306での開裂はアニオ
ン脂質依存性であって、ヒト第V a因子の完全不活化に
必要とされる。APCによるウシ第V a因子の不活化に関し
ても類似のデータが最近発表された（Ref.48）。このよ
うに、当業界の現状から、ヒト第V a因子にはAPCによる
潜在的開裂部位が少なくとも二つ存在することが明らか
である。Kalafatisらは更に、ヒト第Ｖ因子のリシン994
に別のAPC開裂部位を検出した（Ref.52）。従って、本
発明の方法は、核酸もしくはタンパク質のレベルで、又
はこれら両方のレベルで、第Ｖ及び／又は第V a因子内
のこれらのAPC開裂部位のうちの一つ以上における突然
変異を検出するために適用される。APC開裂部位は、Ｈ
鎖上のArg 506及びArg 306に位置する。アミノ酸Arg
679及びLys 994にも別の部位が存在することが判明
した。 以上の説明に鑑みて、本発明の方法、即ち血栓症及び
／又は活性化プロテインＣ（APC）に対する弱い抗凝血
応答に関連した遺伝性欠陥、即ち患者の血栓症発生の危
険が高いことを示すか又は実際に血栓症を発生させる遺
伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法であって、そ
れ自体公知の方法で、第Ｖ因子をコードする核酸物質の
突然変異、即ち核酸物質の発現時に前記第Ｖ因子及び／
又は第V a因子のAPCによる不活化の度合いの低下に関与
する突然変異の存在を調べることからなる本発明の方法
は、第Ｖ因子がX aで活性化した第Ｖ因子に由来するも
のである場合に特に有利である。 本発明の方法は特に、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸50
6に対応する位置に変化したアミノ酸を含む突然変異ア
ミノ酸配列を有するヒト第Ｖ又は第V a因子をコードす
る核酸配列内の突然変異を検出するために適用される
（Ref.21）。特に、前記突然変異が、アミノ酸アルギニ
ンを血漿因子Ｖの配列のアミノ酸506でアミノ酸グルタ
ミンにより置換させた突然変異である場合に適用され
る。特に、アミノ酸506に対応するアミノ酸のコドンの
第二ヌクレオチド、ヌクレオチドＧが突然変異を起こし
た場合がこれに相当する。ヌクレオチドＧが、血漿因子
Ｖの配列のアミノ酸506に対応するアミノ酸のコドンの
第二ヌクレオチドに対応する位置でＡに突然変異した場
合が特にそうである。 実施例で明らかにされるように、本発明は、被験者が
第Ｖ因子及び／又は第V a因子又は第VIII因子及び／又
は第VIII a因子における突然変異に対して同型であるか
又は異型であるかを調べる方法にも関する。この方法
は、APCに対する抗凝血応答に欠陥が存在するかどうか
を調べるそれ自体公知の方法を実施し、次いで、欠陥の
診断に有用であることが知られているパラメーターの
値、例えば（APTT＋APC）／（APTT−APC）の値を算出
し、得られた値を、正常な個体又は同型もしくは異型で
あることがわかっている個体に由来する試料について同
じ方法で得た値と比較し、それによって被験者がAPCに
対する抗凝血応答の欠陥に関して同型であるか又は異型
であるかを確認することからなり、特に実施例１に記載
の具体例、並びに、最も特定的にはAPC結合及び／開裂
部位の突然変異に起因してAPCに対する抗凝血応答を変
化させる第Ｖ、第V a、第VIII及び／又は第VIII a因子
の別の突然変異に関する任意の同等の具体例では、第Ｖ
因子及び／又は第V a因子、又は第VIII因子及び／又は
第VIII a因子における突然変異の存在及び任意にその種
類を決定するための任意の公知の方法と組合わせて使用
される。 本発明の方法は、核酸標的増幅反応の実施により突然
変異を検出することによって達成できる。このような標
的増幅反応は当業者によく知られている。突然変異が存
在し得る特定長さの核酸の５′及び３′末端に隣接する
種々の長さの核酸を認識しこれにハイブリダイズする特
異的プライマーを一つ以上使用する必要がある。前記ハ
イブリダイゼーションは、突然変異が存在し得る特定長
さの核酸の増幅に十分な程度まで実施される。要求され
るハイブリダイゼーションのストリンジェンシーも、核
酸標的増幅の当業者にはよく知られている。当業界で一
般的に行われている標的増幅反応は多数あり、NASBA（N
ucleic Acid Seqence Based Amplification、核酸
配列ベースの増幅）、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、L
CR（リガーゼ連鎖反応）及びPCR（Repair Chain Reac
tion、修復連鎖反応）が挙げられる。PCR標的増幅方法
の場合は、市販のAmplicor（登録商標）反応キットを使
用し得る。突然変異が存在し得る特定長さの核酸を認識
しこれにハイブリダイズするのに十分な特異性を有する
プライマーを使用することも可能である。別の増幅方法
は、Chironによって商業的に開発されたような分枝鎖増
幅からなり、この場合は標的ではなくプローブが増幅さ
れる。 核酸の増幅後は、突然変異の存在及び任意に種類を検
出するためのそれ自体公知の方法による増幅核酸分析を
本発明の方法で実施する。 核酸物質を増幅せずに突然変異を決定することも可能
である。核酸上の突然変異の存在を調べるために標的増
幅反応が開発される前に使用されていた当業者に公知の
方法は多数存在し、これらの方法は総て本発明の方法の
種々の具体例で使用できる。例えば、正常〜ストリンジ
ェントのハイブリダイゼーション条件、例えばブロッテ
ィング方法を使用し、次いで単離した核酸の分析をそれ
自体公知の方法で実施して突然変異の存在及び任意に種
類を検出する場合には、分析すべき因子をコードする核
酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズするのに十
分な特異性を有する少なくとも一つの核酸配列に対する
ハイブリダイゼーション反応によって、決定すべき突然
変異を検出することができる。 突然変異の存在及び任意に種類の検出は、このように
して単離した核酸を例えばサンガー配列反応を用いて配
列分析にかけ、それによって核酸配列を確認し、次いで
この配列決定の結果を非突然変異因子の既知の配列と比
較することにより実施できる。単離した核酸配列を更に
別のハイブリダイゼーション検査にかけることも可能で
ある。この別のハイブリダイゼーション検査は、突然変
異の存在及び任意に種類を検出するために、突然変異を
含む核酸物質のフラグメントに少なくともハイブリダイ
ズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応する相補
配列を含む、適当な長さの核酸配列を用いて実施する。
最初のハイブリダイゼーションステップは、因子が突然
変異を起こしているか否かに関係なく、因子をコードす
る核酸を単離するだけであり、第二のハイブリダイゼー
ションステップは、単離核酸物質上の突然変異の存在の
有無を決定するために、確認したいと思う実際の突然変
異核酸配列の相補配列に、単離した配列を実際にハイブ
リダイズさせることからなる。この後者のハイブリダイ
ゼーション反応は、信頼できる結果を得るためにストリ
ンジェント条件下で実施する必要があり、その他のハイ
ブリダイゼーションステップは、正常〜ストリンジェン
ト条件下で実施し得る。以上、特定核酸上の突然変異の
存在を調べるための従来の方法を二つ説明したが、当業
者には明らかなように、多くの公知の方法が使用可能で
ある。分子生物学に関する種々の標準的文献には、この
種の方法が広く記述されている。例えば、Sambrook,J.,
Fritsch,E.F.Maniatis,T.,Molecular Cloning:a Labo
ratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory
Press,Cold Spring Harbor,New York,1989）参照。 本発明のスクリーニング方法で得た増幅核酸物質は、
その後、配列決定反応を用いるか、又は増幅反応にかけ
られなかった単離核酸物質の分析について前述したよう
に、突然変異の存在及び任意に種類を検出するために突
然変異を含む核酸物質のフラグメントに少なくともハイ
ブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応
する相補配列へのハイブリダイゼーションを用いる分析
検査を使用することによって分析することも可能であ
る。 特に、第Ｖ因子の突然変異の存在を分析する場合は、
単離した及び／又は増幅した核酸物質を、配列表の配列
番号12及び13の配列から選択した適当な長さの核酸物質
に対するハイブリダイゼーション検査にかけ得る。例え
ば、ハイブリダイゼーションに極めて適しているプライ
マー又は核酸配列は、ヒト第Ｖ因子をコードする核酸配
列のイントロン10の少なくとも一部分、又はストリンジ
ェント条件下でイントロン10の前記部分にハイブリダイ
ズすることができる誘導体を含む。このような誘導体
は、イントロン10の対応する部分に対して90％以上の相
同を有するのが好ましい。ヒト第Ｖ因子の核酸配列は既
知であり、ヒト第Ｖ因子をコードする核酸配列は配列表
の配列番号１に示されている。該配列はRef.21から誘導
される。イントロン10の少なくとも一部分を含むハイブ
リダイゼーション用核酸配列を使用すれば、第Ｖ因子を
コードする核酸内に存在する突然変異、特にAPC結合及
び／又は開裂部位をコードする核酸の突然変異を単離し
及び／又は増幅し及び／又はその後検出することがかな
り簡単になる。これは、Ｈ鎖上に位置する突然変異を検
出するのに特に適している（配列番号10、14参照）。ま
た、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅用の核酸配
列のプライマーは、配列表の配列番号２〜11の配列から
選択できる。前述のように、当業界では他の多くのオリ
ゴヌクレオチドプライマーが知られている。これらのプ
ライマーは、第Ｖ及び／又は第V a因子をコードする核
酸を単離するために、増幅の目的又はハイブリダイゼー
ション反応に使用することも可能である。正常因子をコ
ードする配列は突然変異因子の配列と同様に既知である
ため、当業者は、本発明の方法でスクリーニングする突
然変異の単離及び／又は増幅及び／又は存在及び種類の
決定に最も適したオリゴヌクレオチド配列を選択するこ
とができる。 本発明の方法では、特に分析すべき核酸を標的増幅に
かけた場合には、単離した及び／又は増幅した及び／又
はハイブリダイズした核酸物質を配列分析にかけ、次い
で配列を対応する非突然変異因子の核酸配列と比較す
る。増幅又は単離した及び／又はハイブリダイズした核
酸物質を、制限フラグメント分析によって分析すること
も可能である。特に、突然変異を起こした第Ｖ因子に関
する実施例で説明する突然変異の場合には、使用できる
酵素はMnl Ｉである。制限フラグメント分析に使用で
きる制限酵素は当然、検出すべき突然変異の種類とその
位置とに依存する。当業者は、別の新しいステップを用
いずに、過度の負担がかからないルーチンの実験だけ
で、前記酵素を選択できる。 前述のように、本発明の方法は、タンパク質をコード
する核酸配列ではなくタンパク質を分析することによっ
て実施することもできる。これは特に、タンパク質の突
然変異が、第Ｖもしくは第V a因子上にAPC結合及び／又
は開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内に存在し、APC
によってあまり不活化されない第Ｖ因子及び／又は第V
a因子の形成を引き起こすか、又は第VIIIもしくは第VII
I a因子上にAPC結合及び／又は開裂部位を与える核酸配
列部分内に存在し、APCによってあまり不活化されない
第VIII因子及び／又は第VIII a因子の形成を引き起こす
場合の、本発明の有用な具体例である。 前述のように、第Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因
子上にAPC開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内の突然
変異の存在は、APCによる不活化に対する突然変異因子
の耐性を明らかに変える突然変異であり、従ってこのよ
うな突然変異の検出は本発明の方法の好ましい具体例で
ある。当業界で既に明らかにされているように、第V a
又は第VIII a因子の不活化は通常、APCが因子のＨ鎖を
開裂した時にその結果として生起する。従って、突然変
異因子の開裂度を変えることになるような開裂部位にお
ける突然変異の検出は、本発明の好ましい具体例であ
る。タンパク質を突然変異に関して分析する時は、開裂
部位自体の一次アミノ酸配列が関係するだけでなく、タ
ンパク質の三次構造も、結合及び／又は開裂部位と直接
関係のない一次配列のどこかの突然変異に起因して変形
し得る。周知のように、タンパク質の実際の結合部位又
は開裂部位から遠く離れて位置する突然変異は、タンパ
ク質の三次構造に大きく作用し得、それによって、前記
タンパク質への結合、この場合はAPCによる結合を抹消
又は低下させ得る。従って、本発明の方法は、APCによ
る開裂及び／又は結合部位の一次核酸配列における突然
変異の検出だけでなく、APCによる因子の結合及び／又
は開裂を低下させる変化した三次構造を有する突然変異
因子の発生を引き起こす突然変異の検出にも適用され
る。 第Ｖ及び第VIII因子は互いに異なるメカニズムで活性
化でき、その結果得られる因子はどちらもその由来源で
ある因子とは異なる三次構造を有することが知られてい
るため、第Ｖ因子又は第VIII因子の突然変異が前記分子
のAPC結合及び／又は開裂部位には影響し得ず、活性化
因子のそれに影響し得ることは明らかであり、その逆も
明らかである。それにもかかわらず、活性化第Ｖ又は第
VIII因子の結合及び／又は開裂の変化に関与する一次ア
ミノ酸配列の突然変異は、第Ｖ又は第VIII因子上にも存
在する。特異的抗体の使用によって突然変異タンパク質
の検出を行う場合は、突然変異の存在及び任意に種類を
検出するために、突然変異を含む活性化因子に対して特
異的な抗体を使用することが可能である。あるいは、分
析すべきタンパク質をタンパク分解によって開裂し、そ
れによって、第Ｖ及び／又は第V a因子又は第VIII及び
／又は第VIII a因子の一次アミノ酸配列における突然変
異に対して特異的な抗体の使用を可能にする線状又は部
分的線状構造を得ることも可能である。従って、該突然
変異検出方法は活性化因子の分析に限定する必要はな
く、実際、まだ活性化されていない第Ｖ因子又は第VIII
因子についても実施できる。 突然変異がAPC結合及び／又は開裂部位に存在する時
は、第Ｖ、第V a、第VIII、第VIII a因子をAPCで処理
し、次いでフラグメントを公知の方法で分析すれば、因
子が正常な場合とは異なるフラグメントが明らかにされ
る筈である。 例えば、第Ｖ因子の場合は、アミノ酸506の突然変異
がその位置でのAPCの開裂及び／又は結合を阻止する。
従って、活性化APCでの処理の結果、部位306、679及び9
94で開裂が生起し、一つのフラグメントaa307−aa679
と、配列１−306、680−994及び995−末端を含む三つの
別のフラグメントとが得られる。所期のフラグメントは
307−679である。正常第Ｖ因子はこのフラグメントを含
まず、aa506の活性開裂部位に起因して、別の二つのフ
ラグメント、即ちaa307−506及びaa507−679を含む。従
って、aa307−aa679の検出は、アミノ酸506における突
然変異APC部位の存在を示す。 極めてエレガントな検査は、第Ｖ因子をAPC処理後に
二つの抗体の存在にかける操作を含み得る。このような
APC処理は血清の調製中に自然に生起する。この検査で
は一方の抗体がアミノ酸506の上流のタンパク質の部位
に対して特異的であり、前記部位が、aa506の上流の最
も隣接した開裂部位、aa306の下流に位置する。もう一
方の抗体は、アミノ酸506の下流のタンパク質の部位に
対して特異的であり、前記部位は、aa506の下流の最も
隣接したAPC開裂部位、aa679の上流に位置する。該検査
は、両方の抗体によって検出されるフラグメントの検出
を含む。この種の検査はサンドイッチ・イムノアッセイ
であり得る。好ましくは、一方の抗体を固定するか又は
固定し得、他方の抗体に、イムノアッセイの当業者に公
知の方法で検出可能マーカーを具備する。この種の検査
における、フラグメント307−506の一部分を特異的に認
識する抗体の使用は、本発明の範囲内に含まれる。フラ
グメント507−679の一部分を特異的に認識する抗体自
体、及び前述のような検査における該抗体の使用も、本
発明の範囲に含まれる。抗体はモノクローナル抗体が好
ましい。一方の抗体がフラグメント１−306の一部分に
対して特異的であり、他方の抗体がフラグメント307−5
06の一部分に対して特異的である二つの抗体を用いて、
類似の方法で、Arg306に位置するAPC開裂部位の突然変
異を検出するために適当な検査を実施し得る。この種の
検査における、フラグメント307−506の一部分を特異的
に認識する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フ
ラグメント１−306の一部分を特異的に認識する抗体自
体、及び前述のような検査における該抗体の使用も本発
明の範囲に含まれる。アミノ酸679に位置するAPC開裂部
位の突然変異の検出にも、前述と類似の方法で検査を実
施し得る。この突然変異の場合は、フラグメント507−6
79の一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされると
共に、アミノ酸680の下流のフラグメントの一部分に対
して特異的な抗体が一つ必要とされる。この種の検査に
おける、フラグメント507−679の一部分を特異的に認識
する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フラグメ
ント507−569の一部分を特異的に認識する抗体及びフラ
グメント570−994の一部分を特異的に認識する抗体、並
びに前記と類似の検査におけるこれらの抗体のうちの一
つ以上の使用も、本発明の範囲に含まれる。リシン994
のAPC開裂部位における突然変異を検出するための検査
も同様に説明し得る。フラグメント994−末端及び680−
994は関連フラグメントであり、これらのフラグメント
を認識することができる抗体も関連がある。 一般的には、第Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因子
の突然変異に関する検査は、それ自体公知の方法による
イムノアッセイで二つの抗体を使用して、特定のAPC開
裂部位でのAPCによる開裂を低下又は阻止する突然変異
の存在又は不在を検出することからなり得る。この場
合、一方の抗体は前記APC開裂部位の上流のフラグメン
トを認識し、もう一方の抗体は前記APC開裂部位の下流
のフラグメントを認識し、いずれかの抗体が認識する因
子の部分と、突然変異の存在又は不在の決定が行われる
べき特定のAPC開裂部位との間に別のAPC開裂部位は存在
しない。この突然変異検出原理に基づく種々の具体例
は、イムノアッセイの当業者には明らかであろう。例え
ば、更に別の一つ以上のプロテアーゼをAPCと組合せて
使用し得ることは明らかであろう。前記APCは、使用す
る試料の種類に応じて、試料に加えるべきもの、又は試
料中に既に存在しているものである。前述の更に別の一
つ以上のプロテアーゼは、因子上の検出すべき活性APC
開裂部位が存在しない場合には、不活性APC開裂部位を
含むタンパク分解フラグメントに両抗体が結合すること
になり、検出すべき活性APC開裂部位が存在する場合に
は、どちらの抗体もタンパク分解フラグメントに結合で
きないようにタンパク分解フラグメントが形成されるこ
とになる。これは、分析すべきAPC開裂部位の上流及び
下流で因子の開裂を引き起こす一つ以上のプロテアーゼ
を選択することにより最も簡単に達成できる。二つの抗
体のうちの一方は、決定すべきAPC開裂部位の上流、且
つAPC開裂部位の上流でプロテアーゼが開裂する位置の
下流のフラグメントの一部分を認識し、二つの抗体のう
ちのもう一方は、決定すべきAPC開裂部位の下流、且つA
PC開裂部位の下流でプロテアーゼが開裂する位置の上流
のフラグメントの一部分を認識し、前記一つ以上のプロ
テアーゼは、その開裂部位が、決定すべきAPC開裂部位
と、非突然変異因子上に存在するような隣接APC開裂部
位との間に位置するように、因子を開裂する。更に別の
具体例では、突然変異APC開裂部位の開裂を行うことは
できるが非突然変異APC開裂部位の開裂を行うことはで
きない、又はその逆のプロテアーゼを、APCの代わりに
使用し得る。決定すべき突然変異の種類が確認されれ
ば、当業者は、適当なプロテアーゼに関して、プロテア
ーゼについて知られている認識部位をスクリーニングす
るためのルーチンの実験を行いさえすればよい。 突然変異の検出の別の可能性は、もっと以前から使用
されているアミノ酸配列分析技術にある。非突然変異因
子のアミノ酸配列がわかれば、分析すべき因子のアミノ
酸配列を決定して、その配列を対応する非突然変異因子
の既知の配列と比較することは比較的簡単である。しか
しながら、突然変異の存在についてタンパク質を分析す
るための簡単で効果的な方法は、抗体の使用、例えばEL
ISAもしくはRIA、又は当業者に公知の他の種々の免疫学
的検査の使用である。 第Ｖ因子及び第VIII因子の活性化形態が、ある特定の
メカニズムによって活性化されたものである場合には、
APC結合及び／又は開裂の低下のみを示すことも可能で
ある。これは、第Ｖ因子に関して実施例１で明らかにす
る。実施例１では、トロンビンを用いて活性化した活性
化形態がAPCの結合及び／又は開裂能力の変化を示さな
いのに対し、第X a因子で活性化した活性化形態はAPCに
よる結合及び／又は開裂の低下を示す。しかしながら、
前述のように、突然変異の影響が活性化形態のうちの一
つで生起するだけであるかどうかに関係なく、第Ｖ因
子、トロンビンで活性化した第V a因子、又はX aで活性
化した第V a因子のいずれかに突然変異の存在を検出す
ることは、もちろん可能である。 実施例１で説明するように、原因不明の血栓発現傾向
を示す患者の大部分に代表的に見られる、第Ｖ因子の特
異的突然変異が検出された。これは、血漿因子Ｖのアミ
ノ酸配列のアミノ酸506に対応する位置のアミノ酸の突
然変異であった（Ref.21に開示）。従って、アミノ酸50
6の突然変異を決定することができる方法は、本発明の
好ましい具体例を構成する。一般的に、検出すべき突然
変異が、特に第Ｖ（ａ）因子及び／又は第VIII（ａ）因
子のＨ鎖上で、APC開裂部位に位置するアルギニンアミ
ノ酸の変化を含む場合の方法は、適切に実施し得る本発
明の方法の具体例である。 突然変異を検出するためには、突然変異タンパク質第
Ｖ因子及び／又は第V a因子に結合することができる
か、又は突然変異タンパク質第Ｖ因子及び／又は第V a
因子の線状タンパク分解フラグメントに結合することが
できる特異的抗体を使用し得る。前記抗体は、非突然変
異タンパク質又は非突然変異タンパク質の対応するタン
パク分解フラグメントに対する結合親和性が低い。抗体
を用いて行う方法は、タンパク質第VIII及び／又は第VI
II a因子、並びに前記突然変異タンパク質第VIII及び／
又は第VIII a因子の線状タンパク分解フラグメントにも
使用し得る。 別の方法として、タンパク質第Ｖ及び／又は第V a因
子、又はタンパク質の第VIII及び／又は第VIII a因子に
結合することができる抗体を使用することも可能であ
る。前記タンパク質はAPCによる不活化の度合いの低下
を示さず、前記抗体は、APCによる不活化の度合いの低
下を示す突然変異タンパク質を産生させる突然変異を含
む、対応する因子及び／又は該因子のタンパク分解フラ
グメントに対する結合親和性が低い。この場合は、単離
タンパク質又はタンパク分解フラグメントに対する抗体
の非結合が突然変異の存在を示すことになるようなテス
トを開発し得る。本発明は、前述のような抗体を使用し
て実施する方法に関するだけでなく、抗体自体にも関す
る。 本発明の方法では、最初に、正常血漿標準と比較した
APC添加時の凝固時間の変化について試料をスクリーニ
ングし、次いで、試料が示すAPC耐性が標準と比べて変
化していると診断された場合には、第Ｖ因子又は第VIII
因子をコードする核酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第
V a、第VIIIもしくは第VIII a因子のアミノ酸配列の分
析、及び／又は第Ｖ、第V a、第VIIIもしくは第VIII a
因子自体の分析を行う。試料を、特異的突然変異の存在
に関する分析、例えば後述の実施例で説明する第Ｖ因子
の突然変異に関する分析に直接かけることも可能であ
る。使用する方法は、事例の状況と、検査の対象とに依
存する。例えば、大きな集団をスクリーニングする場合
は、コストが最も低い方法を使用するのが好ましい。検
出すべき突然変異が抗体を用いて決定するのが困難な時
もあり、その場合は好ましくは核酸配列又は制限フラグ
メント分析を使用し得る。また、制限フラグメント検査
に使用すべき酵素が廉価であればこのような検査の実施
は極めて簡単であり、実施コストが低く、明らかに適し
たものと言える。従って本発明は、試料が、正常第Ｖ因
子及び／又は第VIII因子及び／又は第VIII a因子及び／
又は第V a因子を含む試料と比べて、APCによる結合及び
／又は開裂の変化を示すかどうかを決定し、次いで前述
の方法で前記変化を引き起こす突然変異を更に分析する
検査の使用にも関する。 本発明の別の目的は、被験者の同型又は異型である第
Ｖ、第V a、第VIII又は第VIII a因子の突然変異を検出
することにある。これは、KosterらによりLancet,1993
年12月18日,Vol.34に記述されているような、被験者がA
PC耐性を示すかどうかを調べるための検査プロトコルを
用いて実施し得る。基本的には、Kosterは、33mM CaCl
2と25mMトリス（pH7.5）と50mM NaClと0.05％オボアル
ブミンとを含む試薬（APTT−APC）50μｌ、又は2.0μg/
mlのヒトAPC及び0.6％グリセロールも含む前記試薬（AP
TT＋APC）50μｌで凝血塊の形成を開始させる前に、50
μｌのAPTT試薬（Cephotest（登録商標）、バッチ10302
9）と共に37℃で360秒間インキュベートした50μｌの非
希釈血漿の使用について記述している。彼はその結果
を、APTT（＋APC）及びAPTT（−APC）の比であると定義
されるAPC感度比（APC sensitivity ratio）（APC−S
R）として表した。これらの条件下では、正常血漿のAPC
−SRが示される。プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の
濃度が減少すると（＜0.5U/ml）、APC−SRは増加する。
従ってこの方法は、経口抗凝血剤で治療している患者の
評価には使用できない。Kosterは更に、このテストによ
って、彼が得た結果と、前文で述べたChromogenixアッ
セイを使用して得られた結果との間に、良好な相関（Pe
arson相関係数0.54）が存在することが判明したと記述
している。驚くべきことに、我々は、Kosterテストが、
被験者が第Ｖ因子の突然変異について同型であるか又は
異型であるかを調べるために適用した場合には、異型の
ほぼ半分を検出できないChromogenixテストより遥かに
良く異常を検出することを発見した。第14図はKosterテ
スト、第11図はChromogenixテストを示している。我々
は、Kosterの方法及び市販のChromogenixテストを用い
て、1691 GG（正常）又は1691 AG（異型）であると遺
伝子型決定された（genotyped）個体の無作為抽出試料
の検査を２回実施した。Chromogenixテストでは、正常
被験者及び異型被験者で得られた感度比の間に大きな重
複が存在しており、そのため異型の50％以上がChromoge
nixテストではAPC耐性であると同定できなかった。そこ
で我々は、被験者が、APC耐性を引き起こす第Ｖ因子突
然変異に関して異常であるか又は正常であるかを決定す
るのに適した別のテストを発見した。Kosterテストは従
来、被験者がAPC耐性一般について正常であるか又は異
常であるかを決定するのに有用であると見なされていた
だけであるが、我々は、該テストが実際には、APC耐性
につながる第Ｖ因子突然変異を検出し、それもChromoge
nixテストより遥かに大きい信頼度で検出することを発
見した。われわれのテストでは0.84以下の値が異常であ
り、正常被験者と同型被験者との間に重複は生じない。
これは、Chromogenixテストと比べて大きな改善であ
る。我々はこの改善が、Chromogenixテストの場合と異
なる活性化剤の使用、そしてより重要なことに、異なる
カルシウム濃度の使用に起因すると考える。この改善さ
れたテストでは、25mM CaCl2以上の試料中カルシウム
濃度を適用する。好ましくは、45mM以下、より好ましく
は30〜40mM、特に31〜35mMとする。このより高い濃度は
おそらく、試料中のクエン酸塩をChromogenix配合の場
合より十分に中和する。別の改良点は、Cephotest試薬
を活性化剤として使用することにある。この方法はまた
Chromogenixテストと類似しており、該テストをかなり
改善したものとみなすべきものである。APC感度比につ
いて得られた値を正規化した場合は（実施例１参照）、
特に第Ｖ因子突然変異に関して、0.84未満の値がAPC耐
性に関して異常であることを表し、0.84を超える値がAP
C耐性に関して正常であることを表す。同型決定の場合
は、0.50未満の値が記録されなければならない。異型は
0.50〜0.70の値を示す。しかしながら、この改善された
方法は、抗凝血剤で治療した患者には適用できない。 この実施例では、検出された突然変異が、第Ｖ因子の
アミノ酸506のコドンにおけるＧ→Ａ突然変異であっ
た。突然変異の発生頻度及びこれに関連した血栓症発生
の危険度の高さは、被験者が同型であるか又は異型であ
るかの決定が、親から子孫への突然変異因子の遺伝に関
する危険性を評価する時に大きな問題となることを意味
する。実施例２で、我々は、第Ｖ因子における突然変異
の存在、特にＧ→Ａ突然変異が、実際に、血栓症を発生
させる危険因子であることを説明する。また、初めて心
筋梗塞にかかった患者の６％が1691 Ｇ−Ａ突然変異の
キャリヤーであるという先に観察された事実は、この突
然変異が動脈血栓症の弱い危険因子（相対危険度1.5〜
2.0）であることを意味し得る。心臓発作の危険の増加
が適時に検出されれば、被験者は生活様式を調整し、こ
のような発作を防ぐように注意することができる。静脈
血栓症に関して重要なことは、前文で既に説明した。 本発明は、ここで説明する全ての具体例で本発明の方
法を実施するのに必要な要素を含むキットにも関する。
これには例えば、前述の特異的抗体のうちの一つ以上、
特にAPC開裂及び／又は結合部位を認識する前述の抗体
対を含み、及び／又は前述のような標的増幅反応及び／
又はハイブリダイゼーション反応のための一つ以上のプ
ローブ又はプライマーもしくはプライマー対を含む検査
キットが含まれる。本発明は特定的には、第Ｖ因子及び
／又は第V a因子のアミノ酸506をコードする核酸配列の
突然変異を含む核酸配列を増幅するための一つ以上のプ
ライマーを含むキットに関する。このキットは、一つの
特定の突然変異又は複数の突然変異を検出するためのプ
ライマー及び／又は抗体を含み得る。該キットは、好ま
しくは、特定集団に多く見られるAPCによる結合及び／
又は開裂の低下及び／又は抹消を引き起こす主要突然変
異の検出に必要な構成要素を含む。 実施例１ 血栓症を有する無作為抽出した一連の患者の21％（La
ncet,1993年12月18日,vol.342,pp.1503−1506,Koster
ら）、及び個人的に又は家族に血栓症の病歴がある選択
した患者の約50％（Ref.8及びBlood,Vol.82,No.7（1993
年10月１日）:pp.1989−1993,J.H.Griffinら）の血漿中
で、APCに対する弱い抗凝血結応答（「APC耐性」（Ref.
2））が最近発見された。我々はこの実施例で、APC耐性
の表現型が、APCによる不活化に対して耐性である第Ｖ
因子分子−FV（Q506）又はFV Leiden−の合成を予告す
る第Ｖ因子遺伝子の単一点突然変異（1691,G→Ａ）に関
する異型性又は同型性に関連していることを明らかにす
る。オランダ集団における突然変異の対立遺伝子頻度は
約２％であり、血栓症の全ての既知の遺伝性危険因子
（プロテインＣ−（Ref.17）、プロテインＳ−（Ref.3
0）、アンチトロンビンIII（Ref.31）欠失）の頻度の合
計の10倍以上に達する（Ref.32）。 明らかに健康な個体の５％がAPCに対して弱い抗凝血
応答を示し、このAPC耐性が深静脈血栓症発生危険度の
７倍の増加（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,pp.1503
−1506,T.Kosterら）に関係しているという我々の発見
に促されて、我々はこの表現型の分子的基礎を調べた。 APCに対する血漿の応答度は、二つのAPTT、即ちAPCの
存在下で測定したAPTT、及びAPCの不在下で測定したAPT
Tの比として測定される（Lancet,1993年12月18日,Vol.3
42,pp.1503−1506,T.Kosterら、Blood,Vol.82,No.7（19
93年10月１日）;pp.1989−1993,J.H.Griffinら、及びRe
f.2）。標準化のために、前記比（APC感度比又はAPC−S
R）を、基準血漿について得られた比（ｎ−APC−SR）に
合わせて正規化する。APC耐性はｎ−APC−SR＜0.84（外
れ値を除外した後の健康対照100の平均ｎ−APC−SRから
1.96SDを差し引いた値）によって定義される。 14人の関係の無いAPC耐性患者の親の分析の結果、同
型及び異型をｎ−APC−SRに基づいて同定できるAPC耐性
（又はAPC補因子II欠失（Ref.2））の家族的形態の概念
が得られた（第１図の説明文参照）。混合実験により、
この概念の別の裏付けが得られた（第１図）。即ち、１
倍容の正常血漿を、同型APC補因子II欠失（ｎ−APC−SR
0.38）であると分類された患者の血漿１倍容に加える
と、ｎ−APC−SRが0.57になった。これは、前記欠失に
関して異型であると分類された患者の血漿中で発見され
た比（平均ｎ−APC−SR 0.58）と同じである。同型APC
補因子II欠失（平均ｎ−APC−SR 0.40）であると分類
された４人の関係の無い患者の血漿を混合しても前記比
は修正されなかった。これは、４人の患者全員が同じ血
漿タンパク質を欠失又は欠乏していることを意味する
（Ref.2及びBlood,Vol.82,No.7（1993年10月１日）:pp.
1989−1993,J.H.Griffinら参照）。 APC補因子II活性が既知の凝血タンパク質のうちの一
つの機能的特徴である可能性を調べるために、APC補因
子IIレベルを、単一タンパク質が欠乏している一連の血
漿中で測定した（第２図）。これらの血漿はいずれも、
第Ｖ因子欠乏血漿（＜５％）を除いて、正常なAPC補因
子IIレベル（60〜155％）を有していた。第Ｖ因子欠乏
血漿に種々の量の単離ヒト第Ｖ因子を加えると、第Ｖ因
子凝血活性及びAPC補因子II活性の両方が導入された。 第Ｖ因子がAPC補因子IIの候補であることの独立した
裏付けが、APC耐性を有する大家族の連鎖研究から得ら
れた（第３図）。 第Ｖ因子遺伝子（F5）のヒト遺伝子座を染色体１（1q
21−25）についてマッピングした（Ref.33）。便利な
（PCR可能な）多形性F5マーカーについての報告は存在
しない。しかしながら、公表されている第Ｖ因子cDNA及
びゲノム配列の多様性（Ref.20−23及びThe Journal
of Immunology,Vol.150,2992−3001,No.7,1993年４月
１日,N.L.L.Shenら）は、我々が第Ｖ因子遺伝子の二つ
の新しい多形性を同定する助けになった。残念ながら、
前記APC耐性家族では、これらの多形性のどちらも情報
を与えるものではなかった。そこで我々は、この家族の
1q21−25領域（第４図参照）の幾つかの遺伝子座に関す
るマイクロサテライト（microsatellite）・マーカーの
分離（segregation）を検査した。第５図の表は、これ
らのマーカーとAPC耐性の表現型との間の関係に関する
二つ組ロドスコア（pairwise lodscore）を示してい
る。かなり肯定的な結果は、F5遺伝子座から4cM以内に
位置する遺伝子座D1S61（θ＝0.00でZmax 7.27）に関
してだけ得られた。 この時点で我々は、APC耐性が第Ｖ因子遺伝子の欠陥
に関係があるという証拠が、関連突然変異の調査を開始
するのに十分なだけそろっていると考えた。我々は調査
の焦点を、推定上のAPC結合部位（残基1865−1874）（R
ef.35、36）及び推定上のAPC開裂部位（Arg−506）（Re
f.21及びThe Journal of Biological Chemistry,Vo
l.262,No.23,1987年８月15日,pp.11233−11238,Bruce
Odegaard及びKenneth Mann）をそれぞれ含む第Ｖ因子
の二つの領域に絞った。 第一のアプローチとして、末梢血液リンパ球から単離
した第Ｖ因子遺伝子の異所転写体（ectopic transcrip
t）を用いて第一鎖cDNAを合成し、次いでAPC結合及び開
裂部位をコードする二つの領域を増幅した。PCRフラグ
メントの直接的配列決定の結果、APC補因子IIの同型接
合欠失として分類された二人の関係の無い患者の両方
が、1691,G→Ａトランジションに対して同型接合である
ことが判明した（第６図）。この突然変異は、Gln（CA
A）（FA（Q506）又はFV Leiden）によるArg−506（CG
A）の置換を予測させるものである。1691 Ａを包囲す
る225bp、及び推定上のAPC結合部位をコードする領域を
包囲する275bpに、別の配列異常は観察されなかった
（第７図）。 Arg−506の後の開裂がAPCによるヒト第V a因子の不活
化のきっかけであれば、位置506へのGlnの導入が抑制性
（inhibitory）開裂を防止することが予測される。凝固
プロセスの間に、血漿因子Ｖはまず第X a因子によって
活性化され（105/220kDaヘテロダイマーの形成（Ref.3
7））、次いで更にトロンビンによってプロセスされる
（105/74kDaヘテロダイマーの形成（Ref.38））（Ref.3
9）。興味深いことに、我々はGlnによるArg−506の置換
が、第Ｖ因子のX a活性化形態のAPCによる不活化のみを
阻止し（第８図）トロンビン活性化形態の不活化は阻止
しないことを発見した（データ示さず）。 二人の関係の無いAPC耐性患者が同じ突然変異に対し
て同型接合であるという観察事実は、この変化がAPC耐
性患者の大半に存在することを示唆する。この可能性を
調べるために、ゲノムDNAを1691 Ｇ→Ａトランジショ
ンの存在についてスクリーニングするテストを設計し
た。前記突然変異は、イントロン10の開始点から11nt51
のエクソン10に存在し、イントロン10のヌクレオチドは
最初の８個のみが公表されているため（Ref.23）、半ネ
スト型（hemi−nested）逆PCR（Ref.40）によって、よ
り長いイントロン10配列を形成した（配列14も参照）。
この情報に基づいて、遺伝子型決定に使用し得る二つの
重複ゲノムフラグメントを増幅するためのプライマーを
設計した。 Mnl Iでの267bpフラグメントの消化を使用して、正常
（1691 Ｇ）又は突然変異対立遺伝子の存在を明らかに
し、この正常又は突然変異対立遺伝子に対して特異的な
オリゴヌクレオチドと222bpフラグメントとのハイブリ
ダイゼーションを用いて、1691 Ａを正に同定した。こ
のアプローチを用いて、我々はまず第３図の家系の構成
員を総て調べた。この家系の一部について、第10図に示
すように、1691,G→Ａトランジションに関する異型接合
性のAPC耐性（ｎ−APC−SR＜0.84）を用いた完全な同時
分離（cosegregation）が明らかにされた。更に、経口
抗凝血剤で治療したためにｎ−APC−SRが得られない４
人の患者（II.6、II.8、II.14、III.22）は、異型接合
性であることが判明した。 最初の客観的に確認された深静脈血栓を経験したこと
がある301人の患者と、年齢及び性別が適合した301の集
団対照とについて先に行われた検査では、64人のAPC耐
性血栓症患者が同定された（Lancet,1993年12月18日,Vo
l.342,pp.1503−1506,T.Kosterら）。これら64の患者
と、対応する64の対照とを、Ｇ→Ａトランジションの存
在についてスクリーニングした。128の個体のうち70が
ｎ−APC−SR＜0.84を示した（64の患者及び６の対
照）。そのうち56の個体が突然変異を有しており（53の
患者及び３の対照）、患者のうち６人の突然変異が両方
の対立遺伝子にあり（平均ｎ−APC−SR 0.43;範囲0.41
−0.44）、他の50が一つの対立遺伝子にあった（平均ｎ
−APC−SR 0.57;範囲0.50−0.67）。残りの14のAPC耐
性個体は突然変異を有しておらず、わずかに減少したｎ
−APC−SRを有していただけであった（平均ｎ−APC−SR
0.78;範囲0.70−0.83）。58の非APC耐性個体はいずれ
も突然変異を有していなかった（平均ｎ−APC−SR 0.9
9;範囲0.83−1.19）。また、ｎ−APC−SR＞0.84の100人
の血栓症患者の中に突然変異のキャリヤーはいなかった
が、予想した通り、対応する100の適合対照のうち３は
突然変異のキャリヤーであった。この３つは（ｎ−APC
−SRがそれぞれ0.57、0.58及び0.59）、ｎ−APC−SR＜
0.84を有する唯一の対照であった。 我々のデータは、ｎ−APC−SR＜0.84の個体の80％、
及びｎ−APC−SR＜0.70の個体の100％が、1691,G→Ａト
ランジションに関して異型又は同型接合であり、また逆
にすべての突然変異キャリヤーがｎ−APC−SR＜0.7を有
することを示すものである。オランダ集団における突然
変異対立遺伝子の比較的高い頻度（約２％）と、APC耐
性が深静脈血栓症の一般的な強力危険因子であるという
我々の発見（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,T.Koster
ら）とを組合わせるて考えると、この遺伝性の第Ｖ因子
欠乏は現在のところ最も一般的な遺伝性凝血障害という
ことになる。 第１図及び第２図 血漿中のAPC補因子II濃度の測定 第１図．血漿中のAPC補因子II活性のアッセイに関する
検量線 APC補因子IIは、APC耐性を有する個体に欠失又は欠乏
している、APCの想定上の新しい補因子である（Ref.
2）。APC補因子IIが欠乏している同型接合患者の血漿
（APC補因子II ０％）中の正常血漿（APC補因子II 10
0％）希釈物中で、ｎ−APC−SRを測定した。第１図の曲
線は、９回の異なる実験の結果である。APC補因子II欠
乏同型又は異型接合の分類は、APC耐性を有する14のプ
ロバンド（proband）（ｎ−APC−SR＜0.84）に関する親
分析の結果に基づく。２個のプロバンド（ｎ−APC−SR
0.38/0/41）では両親がAPC耐性を有しており（平均ｎ
−APC−SR 0.55）、11個のプロバンド（平均ｎ−APC−
SR 0.57）では、親の一方がAPC耐性である（平均ｎ−A
PC−SR 0.59）のに対し他方がAPC耐性ではなく（平均
ｎ−APC−SR 0.96）、１個のプロバンド（ｎ−APC−SR
0.74）では両親ともAPC耐性ではなかった（ｎ−APC−
SR 0.96/0.99）。我々は、個体のｎ−APC−SRに基づい
て、個体をAPC補因子II欠乏に関し同型又は異型接合で
あると分類できると考える（同型：平均0.40、ｎ＝2;異
型：平均0.58、範囲0.51−0.67、ｎ＝26）。 第２図．単一凝固因子が欠乏している（＜５％）血漿中
のAPC補因子II活性レベル 血漿は、先天性欠乏を有する患者に由来するもの
（ａ、ｇ、ｆ、ｍ、ｇ、ｒ、ｓ、ｔ）、又はイムノデプ
リーション（immunodepletion）によって製造したもの
（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｊ、ｈ、ｉ、ｋ、ｌ、ｐ）である。
血漿は、第II因子欠乏（ａ）、第VII因子欠乏（ｂ）、
第IX因子欠乏（ｃ）、第Ｘ因子欠乏（ｄ）、第XI因子欠
乏（ｅ）、第XII因子欠乏（ｊ）、第XIII因子欠乏
（ｇ）、プロテインＣ欠乏（ｌ）、プロテインＳ欠乏
（ｉ）、β２−糖タンパク質欠乏（ｊ）、抗トロンビン
欠乏（ｋ）、第Ｖ因子欠乏（l,m）、第VIII因子欠乏
（p,q）又はvon Willebrand因子欠乏（ｒ、ｓ、ｔ）で
あった。第Ｖ因子欠乏血漿（ｍ）に精製ヒト第Ｖ因子
（Serbio,Gennevilliers,France）を二つの異なる濃
度、54％（ｎ）及び90％（ｏ）で加え、20mMクエン酸ナ
トリウム、150mM NaCl、4mM CaCl2に対して透析し、A
PC補因子II活性について検査した。 方法： 二つのAPTT測定、即ちAPCの存在下での測定及び不在
下での測定の結果に基づき、既述の方法と全く同じ方法
（Lancet,1993年12月18日,Vol.342,T.Kosterら）でAPC
−SRを計算した。検査試料のAPC−SRを、プールしてあ
った正常血漿のAPC−SRで割り算して、ｎ−APC−SRを計
算した。第１図に示すような検量線で、APC補因子II欠
乏血漿中の検査血漿の二つの異なる希釈物（1:1、3:4）
のｎ−APC−SRを読み取ることにより、APC補因子II活性
を測定した。 第３図〜第５図.APC耐性を有する家族の連鎖分析 第３図.APC耐性（又はAPC補因子II欠乏）を有する家族
の家系 ●，■:n−APC−SR＜0.84（平均0.65;範囲0.59−0.71、
ｎ＝13）の個体；○，□:n−APC−SR＞0.84（平均1.03;
範囲0.87−1.29、ｎ＝20）の個体； 経口抗凝血剤で治療した患者（これらの患者のｎ−APC
−SR測定は無意味）； 検査しなかった個体。 第４図．染色体ｌのq21−25領域の統合的遺伝連鎖地図 遺伝子座APOA2、D1S104、D1S61、AT3、LAMB及びF13B
の相対位置を、NIH/CEPH Collaborative Mapping Gr
oup連鎖地図（Ref.41）から誘導した。隣接遺伝子座間
の遺伝距離はcMで示す。F5及びD1S61遺伝子座のマーカ
ーの情報を提供する三つのCEPH家族におけるこれら２個
のマーカーの分離を調べたところ、F5遺伝子座は、この
地図上で、D1S61遺伝子座から4cM以内に位置していた
（55の減数分裂で、これら二つの遺伝子座の間に組換え
は観察されなかった：θ＝0.00でZmax16.6）。 第５図．染色体１マーカーでのAPC耐性の二つ組ロドス
コア 第３図の家系の検査できる個体総てを分析した。遺伝
子座ApoA2、D1S104、D1S61、LAMB及びF13Bのマーカーの
オリゴヌクレオチド配列はゲノムデータバンクから入手
できる。プライマーはオランダプライマーベースから得
た。AT3遺伝子座の三つの異なる多形性マーカーは、こ
の家族の情報を提供するものではなかった。Dr.J.Ottか
ら入手したLINKAGEパッケージバージョン5.3からのMLIN
Kプログラムを用いて、２点連鎖分析（two point lin
kageanalysis）を実施した。性別平均ロドスコアを示
す。 方法： ApoA2、D1S104、D1S61、LAMB及びF13Bのマイクロサテ
ライト・マーカーをPCRで増幅した。条件:50mM NaCl、
10mMトリス−HCl（pH9.6）、10mM MgCl2、0.01％BSA、
200μＭ、dGTP、dATP及びdTTP、20μＭ dCTP、0.7μCi
α32P dCTP、0.43U Taqポリメラーゼ（Cetus,Emery
ville,CA,USA）、50ngの各プライマー及び30ngのゲノム
DNA。最終延伸（elongation）ステップを10分間にし
て、94℃（１′）、55℃（２′）、72℃（１′）で27サ
イクル実施した。PCR生成物を６％変性用ポリアクリル
アミド配列ゲル上で分離し、その後ゲルを乾燥し、Ｘ線
フィルムに暴露した。 F5多形性：第Ｖ因子遺伝子のエクソン13からの636bp
フラグメント（Ref.23）を、配列表のプライマー番号２
（PR−766、nt2253−2272（Ref.21））及び番号３（PR
−768、nt2870−2899（Ref.21））を用いてPCRで増幅し
た。PCR条件については第10図及び第11図の説明文を参
照されたい。Hinf Ｉで制限すると、nt 2298のC/T二
形性（C:0.68;T:0.32）と、nt2411の稀なA/G二形性（A:
0.98;G:0.02）とが検出される。これらのマーカーのう
ち、第３図の家系で情報提供するものはない。 第６図〜第８図.APC補因子II欠乏同型接合患者の第Ｖ因
子遺伝子突然変異の同定 第６図.APC補因子II同型接合欠乏として分類された患者
のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラム cDNA PCRフラグメント（ヒト第Ｖ因子のアミノ酸417
〜572をコードする（Ref.21））の非コード鎖のヌクレ
オチド配列の一部を、一人の患者（Ｐ）及び一人の非AP
C耐性対照（Ｃ）に関して示す。矢印は、GlnによるArg
506の置換を予告する1691,G→Ａトランジションの位
置を示す。 第７図．第Ｖ因子分子の簡単な説明図 ヒト第Ｖ因子は、数種類の内部反復を含む330kDa糖タ
ンパク質である（Ref.21）。第X a因子での活性化は、1
05/220kDaヘテロダイマー（A1A2/B′A3C1C2）（Ref.3
8）の形成につながり、トロンビンでの活性化は105/74k
Daヘテロダイマー（A1A2/A3C1C2）（Ref.37）の形成に
つながる。APCは第V a因子のA3領域に結合し（Ref.35、
36）、Arg−505後のA2領域内での開裂によってウシ第V
a因子を阻害する（The Journal of Biological Che
mistry,Vol.262,No.23,1987年８月15日,pp.11233−1123
8,Bruce Odegaard及びKenneth Mann）。 ヒト（Arg−506）及びウシ（Arg−505）第V a因子の
推定上の（Ref.43）APC開裂部位を包囲するアミノ酸配
列を示す。APC耐性患者では、Arg−506がGlnで置換され
ている。 第８図.APCによる不活化に対する第X a因子活性化第Ｖ
因子（Q506）の耐性 第Ｖ因子（R506）又は第Ｖ因子（Q506）を含む、Al
（OH）３吸着しフィブリノーゲン欠失した血漿（２時
間、37℃;0.3U/ml-1アーブン）を、30mMCaCl2及び20μ
Ｍ PS/PC（25/75）の存在下で、第X a因子（２ nM）
で処理した。８分後、第Ｖ因子の活性化が終了した時点
で、1.9nMのAPC又は緩衝液を加えた。様々な時間間隔
で、10μｌの試料をストップ緩衝液（50mMトリス−HC
l、pH7.9、180mM NaCl、0.5mg/ml-1OVA、5mM CaCl2）
中で1/100に希釈し、Pietersらの方法（Ref.44）を用い
て、第V a因子活性について直接アッセイした。0.70U/m
l-1FV（R506）（0.64μＭトロンビン分-1）又は0.49U/m
l-1FV（Q506）（0.20μＭトロンビン分-1）の完全な活
性化後に測定した第V a因子活性は、任意に100％とみな
される； ○；−APC;●，＋APC。 方法： cDNA合成：同意した患者及び非APC耐性対照のクエン
酸含有血液10mlのリンパ球フラクションからRNAを単離
した（Ref.45）。１μｇのRNAを鋳型として使用し、ス
ーパースクリプト・キット（BRL,Betheda,Md,U.S.A.）
を用いて、混合ランダムヘキサマーの存在下で第一鎖cD
NAを合成した。cDNAフラグメントの増幅。プライマー配
列４（PR−764,nt 1421−1440（Ref.21））及び配列５
（RP−856,nt 1867−1891（Ref.21））は、推定上のAP
C開裂部位を含む残基417〜572をコードする領域を増幅
し、プライマー配列６（PR−849 nt 5608−5627（Re
f.21））及び配列７（RP−848,nt 6040−6063（Ref.2
1））は、APC結合領域を含むアミノ酸残基1812〜1963を
コードする領域を増幅する。PCR条件は、第９図及び第1
0図の説明文に記載の通りである。PCRフラグメントをゲ
ル化温度が極めて低いアガロース上で精製し、PCR反応
と同じプライマーを用いて前述のように直接配列決定し
た（Ref.42）。APC結合領域の配列決定を補助するため
に、更にもう一つのプライマーを合成した：配列８（PR
−847,nt 5905−5927（Ref.21））。 第９図及び第10図.APC耐性と第Ｖ因子の1691A対立遺伝
子の存在との関係 第９図.1691AのAPC耐性による同時分離 上部は家系（第３図）における個体の位置を示し、可
能であればｎ−APC−SRも示す（II6は経口抗凝血剤治療
に関する）。中間部は、267bp PCRフラグメントのMnl
Ｉ消化の結果を示す。下部は、222bpフラグメント
と、1691A対立遺伝子（PR 1005）に特異的なビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドとのドットブロットハイブリダ
イゼーションの結果を示す。 第10図.n−APC−SR＜0.84の64人の血栓症患者及び対応
する64の対照の222bp PCRフラグメントと、1691A対立
遺伝子（PR 1005）に特異的なビオチニル化オリゴヌク
レオチドとのドットブロットハイブリダイゼーション。 総ての患者（Ｐ）及び対照（Ｃ）は、十分な説明を受
けた上で同意を与えてくれた。スラッシュはこの実験で
失敗したPCR反応の位置を示す。 方法： 1691G/Aを含むゲノムフラグメントの増幅。Mnl−Ｉ消
化のために、配列９（PR−6967;nt 1581−1602（Ref.2
1））を５′プライマーとして使用し、且つ配列10（PR
−990;イントロン10のnt 127〜−146）を３′プライマ
ーとして使用して、267bpフラグメントを増幅した。ド
ットブロットハイブリダイゼーションのために、配列11
（PR−6966、nt1626−1647（Ref.21））を５′プライマ
ーとして使用し、PR−990（配列10）を３′プライマー
として使用して、222bpフラグメントを増幅した。条件:
54mM トリス−HCl（pH8.8）、5.4mM MgCl2、5.4μＭ
EDTA、13.3mM（NH4）2SO4、８％ DMSO、8mM β−メ
ルカプトエタノール、0.4mg/ml-1 BSA、0.8mMの各ヌク
レオシドトリホスフェート、400ngの各プライマー、200
〜500ng DNA及び2UTaqポリメラーゼ（Cetus,Emeryvill
e,CA,USA）を含む混合物125μｌを、91℃（40″）、55
℃（40″）及び71℃（２′）のサイクルに36回かけた。
267bpフラグメント（７−10μｌ）を0.4U Mnl Ｉ（Bi
olabs,Cambridge,Ma,USA）で消化した。1691Gフラグメ
ントは67、37及び163bpのフラグメントを与え、1691Aフ
ラグメントは67及び200bpのフラグメントを与える。222
bpフラグメント（約100ng）を、1691Gを検出するための
ビオチニル化配列特異的オリゴヌクレオチド配列12（PR
1006;nt 1682−1699（Ref.21））、及び1691Aを検出す
るための配列13（PR1005）とのドットブロットハイブリ
ダイゼーションに使用した。手順は全く前述通りである
（Ref.46）。ハイブリダイゼーション後、ストリンジェ
ンシー洗浄を、PR−1006で53℃、PR−1005で52℃で実施
した。 実施例２ 我々は、凝固因子Ｖ（第Ｖ因子Leiden）異常の突然変
異に関して異型及び同型接合の個体における静脈血栓症
発生の危険度を調べた。我々は、最初の客観的に確認さ
れた深静脈血栓症を有する70歳以下の471人の患者、及
び474人の健康な対照の、第Ｖ因子Leiden遺伝子型を決
定した。我々は、血栓症患者の中に85の異型接合個体及
び７の同型接合個体を発見し、対照被験者の中に14の異
型接合個体を発見した。 異型接合個体の場合は相対危険度が７倍増加したのに
対し、同型接合個体の場合は80倍増加した。これらの個
体は遥かに若い年齢で（32歳対44歳）血栓症を経験して
いた。同型接合個体は主に女性であり、殆どが血液型Ａ
であった。 血栓症発生の危険は年齢と共に増加するため、絶対危
険度差は、異型接合個体及び同型接合個体の両方につい
て、年齢のより高い患者で極めて顕著である。同型接合
個体の場合は、絶対危険度が数％／年になる。これは、
第Ｖ因子Leidenに関して同型接合の個体の大半が、一生
のうち少なくとも一回は血栓症を経験することを意味す
る。 突然変異第Ｖ因子遺伝子は対立遺伝子の頻度が高いた
め、同型接合キャリヤーは、別の種類の遺伝性血栓発現
傾向の場合のように極端に稀ではない。同型接合状態が
異型接合状態より大きい危険度を与えるかどうかはこれ
まで知られていなかった。我々は、血栓症発生危険度
と、第Ｖ因子Leidenに関して同型接合である患者の臨床
的特徴とを調べた。これらは、深静脈血栓症に関する大
規模症例対照検査（large case control study）で
確認された（The Leiden Thrombophilia Study:LET
S）（Koster T.ら,Venous thrombosis due to poo
r anticoagulant response to activated protein
C:Leiden Thrombophilia Study.Lancet 1993;342:
1503−1506）。 方法 試験計画 LETSの計画の詳細について以前に開示されている（T.
Koster等，“Venous thrombosis due to poor ant
icoagulant responser to activated protein C:L
eiden Thrombophilia Study,"Lancet 342,pp.1503−
1506,1993）。本発明者は70歳未満の続発患者を考慮下
に置き、既知の悪性障害の不在下に客観的に確認された
最初の深静脈血栓症のエピソード後に前記患者をライデ
ン、アムステルダム及びロッテルダムのanticoagulatio
n Clinicに、抗凝血治療の外来監視のために委託し
た。患者は急性血栓症事象後少なくとも６ヵ月（６〜19
ヵ月）診療した。適格患者の90％が試験への参加を希望
した。474人の血栓症患者に加えて、本発明者は474人の
対照被験者も用意し、これらの被験者は静脈性血栓塞栓
症の履歴を有せず、既知の悪性障害に羅患しておらず、
性別が同じであり、かつ年齢もほぼ同じ（±５歳）であ
った。 データ収集及び研究室分析 全被験者に、指標日付、即ち血栓症事象の日付以前の
特定期間内に限定した過去における後天性危険状況の存
在についての質問を含む標準的な質問票に回答させた。
本発明者が“後天性危険状況”と看做したのは、いずれ
も指標日付の前年に有った手術、手術を行なわない入
院、または自宅の長期不動化（２週間以上）、及び指標
日付時点での妊娠である。 前腕前部静脈から血液を、0.106mmol/lのクエン酸三
ナトリウムを収容したSarstedt Monovette（登録商
標）管内に採取した。白血球から高分子DNAを単離し、
４℃で貯蔵した。突然変異体第Ｖ因子−ライデン遺伝子
（1691;G→Ａトランジション）の存在を既述のように確
認した。この方法によって本発明者は、各患者に関し、
当該患者がホモ接合性正常（GG）であるか、第Ｖ因子ラ
イデン突然変異に関してヘテロ接合性（AG）であるか、
それとも前記異常のホモ接合性保有者（AA）であるかを
確定した。技術者には常に、試料の立場、即ち試料が患
者と対照被験者とのいずれに由来するかを知らせなかっ
た。DNA分析用の細胞は471人の患者及び474人の対照か
ら入手可能であった。 分析及び統計処理 患者（cases）及び対照における第Ｖ因子ライデン突
然変異のヘテロ接合性及びホモ接合性保有者の頻度を、
単純な交叉作表によって比較した。ヘテロ接合状態に関
連する危険の分析では性別及び年齢は、常染色体遺伝異
常に肯定的に作用すると予測されないので交絡（confou
nding）数であるとは考えられなかったため、ヘテロ接
合状態に関する相対的危険度の推定値は非整合暴露オッ
ズ比の計算によって求めた。95％信頼区間をWoolfに従
って設定した（B.Woolf,“On estimating the relat
ion between blood group and disease,"Ann.Hum.
Genet.19,pp.251−253,1955）。 ホモ接合状態に関連する危険度は上述の標準的な方式
では推定できなかったが、これは対照中にホモ接合性個
体が見出されなかったからである。従って、（対照にお
ける）Hardy−Weinberg平衡の仮定下に対照母集団内の
ホモ接合性個体の予測数を計算し、その後オッズ比を標
準的な方式で推定した。ホモ接合状態に関する（log）
オッズ比の分散を、Woolfの方法を改良した方法によっ
て推定した。欄の内容ａ、ｂ、ｃ及びｄを有する２行２
列の表の各欄をPoisson分布の実現と看做せば、log（O
R）の分散は1/a＋1/b＋1/c＋1/dとなる（B.Woolf,“On
estimating the relation between blood group
and disease,"Ann.Hum.Genet.19,pp.251−253,195
5）。遺伝子型GG及びAAを有する個体数を患者では計数
し、対照に関してはHardy−Weinberg平衡から算出し、
必要な二次変換を行なうと、log（OR）の分散は1/AA
（患者）＋1/GG（患者）＋4/A（対照）＋4/A（対照）＋
4/G（対照）となり、その際AA及びGGは遺伝子型（個
体）の数であり、Ａ及びＧは対立遺伝子の数である。 様々な遺伝子型及び年齢における血栓症の絶対的危険
度を、まずHardy−Weinberg平衡の仮定下に（自治体当
局提供の情報から得た）原母集団の人年数を分割するこ
とによって計算した。分割した人年によって患者を各サ
ブグループ（遺伝子型、年齢）に分け、それによって絶
対的危険度の推定値を得た。その後、これらの粗い出現
率データを対数変換後に、三つの年齢群（０〜29歳の25
歳群、30〜49歳の40歳群及び50〜69歳の60歳群）と、各
層の患者数に関して加重したヘテロ接合状態（0,1）及
びホモ接合状態（0,1）に関する指示変数とを有する加
重最少２乗回帰モデルへとモデル化した。層特定的な出
現率をまず推定し、その後加重最少２乗回帰によって平
滑化する［“最終平滑化”（S.Greenland,“Multivaria
te estimation of exposure−specific incidence
from case−control studies,"J.Chron.Dis.34,pp.
445−453,1981）］この方法はGrizzle等が開示している
（J.E.Grizzle,C.F.Starmer及びG.G.Koch,“Analysis
of categorical data by linear models,"Biometr
ics 25,pp.489−504,1969）。Poisson分布では患者数
の分散は患者数に等しいので、この方法はPoisson回帰
モデルを作成するのとほとんど同じである。Poisson回
帰モデルは、ホモ接合状態（及びヘテロ接合状態）に関
する出現率比が当該対数（出現率）に関して年齢層間で
一定であるという仮定の下に、特にホモ接合状態に関し
てより安定な推定値をもたらす。このモデルは log（Ｉ）＝α＋β１＊年齢＋β２＊AG（0,1）＋β３＊AA（0,1） と表記でき、この式は後に、（係数の真数として）絶対
的危険度及び相対的危険度の推定値の計算に用い得る。 結果 471人の患者のうち、欠陥に関してヘテロ接合性であ
ったのは85人（18％）、ホモ接合性であったのは７人
（1.5％）であり、その他の379人（80％）は第Ｖ因子ラ
イデン突然変異を有しなかった。対照では474人のうち
の14人（2.9％）がヘテロ接合性、他の460人は総て正常
であった。対照中にホモ接合性個体は存在しなかった。 ホモ接合性個体は他の患者より甚だしく若年で血栓症
に羅患し、その血栓症羅患平均年齢はヘテロ接合性患者
の44歳、及び突然変異を有しない患者の46歳に対して32
歳であった（表２）。 ホモ接合性患者における深静脈血栓症の臨床経過は平
凡であった。全員が脚の深静脈血栓症に羅患した。４人
はヘパリン化のために短期間入院し、３人は外来患者と
してクマリン誘導体のみでの治療を受けた。７人の患者
のうちで顕性動脈疾患（心筋梗塞、卒中または末梢動脈
疾患）の履歴を有するものは皆無であった（表３）。 ７人のホモ接合性患者のうち６人（86％）は女性であ
り、これに対してヘテロ接合性個体では46人（54％）、
突然変異を有しない個体では217人（57％）が女性であ
った。また、上記７人の患者のうちの６人は血液型がＡ
型であったが、他の464人の患者のうちでＡ型は249人
（54％）であった。45歳以下である５人のホモ接合性女
性患者のうち、３人は血栓症事象の時点で経口避妊薬を
用いており、このことはいずれにせよ現在通常の使用に
類似していた。非Ｏ型の血液型、及び経口避妊薬の使用
はそれ自体が静脈血栓症の危険因子であるので、上記の
数字はこれらの危険因子とホモ接合性第Ｖ因子ライデン
との、複合的な性質を有する相互作用を示唆している。 ７人のホモ接合性患者のうちの２人（29％）には、事
象の前年に血栓症の素因は存在しなかった（１人は血栓
症となる45日前に股関節部の手術を受け、１人は血栓症
事象の60日前に出産後一晩入院した）。85人のヘテロ接
合性個体のうちの25人（29％）の患者、及び379人の正
常な患者のうちの131人（35％）に後天性危険因子が存
在した。 過去の危険状況（手術、妊娠、入院）が血栓症を招か
なかった例は、第Ｖ因子ライデン突然変異に関してホモ
接合性である患者ではその他の患者におけるほど頻繁に
生起しなかった。それでも、７人のホモ接合性患者のう
ち５人は過去に、後に血栓症をもたらさない危険状況に
遭遇していた（２人が手術を受け、４人が５人の子供を
出産）。 上記７人の患者を、最初の血栓症事象後長期経口避妊
を行なわせずに平均２年間追跡した。１人の患者は再発
性血栓症に羅患した（１回/13.4年；年率7.4％）。両親
14人のうちの３人が静脈血栓症の履歴を有したが、これ
は予測の約５倍である。 Hardy−Weinberg平衡下に正常個体：ヘテロ接合性個
体：ホモ接合性個体の相対的頻度はp2:2pg:q2となり、
その際ｐは正常遺伝子の、またｑは異常遺伝子の対立遺
伝子頻度である。p2:2pgが460/474:14/474であったの
で、第Ｖ因子ライデンの対立遺伝子頻度（ｑ）は0.015
となる。ｐ＝0.985及びｑ＝0.015という対立遺伝子頻度
は、非選択個体474人中での459.9人（GG）、14.0人（A
G）及び0.107人（AA）という分布に合致する。 対照474人中のホモ接合性個体の予測数（q2）が0.107
人であることから、ホモ接合性状態に関するオッズ比は
（7/379）／（0.107/460）＝79となる。即ち、ホモ接合
性個体にとっての血栓症の危険度は正常個体の約80倍で
ある（CI95:22〜289）。 表４に三つの年齢群に関して、0.015の対立遺伝子頻
度を用いて各年齢群におけるホモ接合性対照の予測数を
計算した場合のオッズ比を示す。ホモ接合性個体におけ
る高い血栓症の相対的危険度は年齢と共に低下すること
が明らかである。このことは、ヘテロ接合性個体の相対
的危険度が年齢を越えて多かれ少なかれ一定であること
と対照的である。 続いて、異なる年齢群及び遺伝子型における絶対的危
険度（出現率）を、Hardy−Weinberg平衡の仮定下での
原母集団における年齢分布に関するデータを用いて計算
した。表４に示したように、出現率は遺伝子型GGを有す
る最低年齢群での毎年10,000人当たり僅か0.55人という
値から、より高い年齢群のヘテロ接合性個体に関する毎
年10,000人当たり16.3人という値まで上昇する。総ての
年齢群においてホモ接合性個体に関する危険度の方がヘ
テロ接合性個体に関する危険度よりはるかに高いこと
も、表４に示した数値から明らかである（毎年10,000人
当たり78〜176人）。しかし、これらの出現率推定値は
三つの年齢群に分けた僅か７人の個体に基づくものであ
るので不安定であり、かつ最高年齢群では意外にも低下
している。本発明者が用いた回帰モデルはこれらの推定
値を平滑化し、なぜなら該モデルは相対的危険度が年齢
群を越えて一定であると仮定するからである。図12に示
したように、このモデルは正常個体及びヘテロ接合性個
体には良く適合する（係数：定数 −10.06;年齢 0.02
93;AG 1.96;AA 4.52）。ホモ接合性個体に関する平滑
化された出現率推定値は今や、30歳未満での10,000人年
当たり82人から50〜69歳での10,000患者年当たり227人
へと上昇する（図13）。これらの推定値は、ほとんどの
ホモ接合性患者がその人生において少なくとも一つの血
栓症事象を経験することを意味する。 検討 抗APC性は、突然変異体第Ｖ因子遺伝子に関する対立
遺伝子頻度が約1.5％である一般的な異常である。この
ことは、母集団の３％がヘテロ接合性であり、ホモ接合
性個体は出生10,000人当たり約２人と予測可能であるこ
とを意味する。 この試験において本発明者は、ホモ接合性個体の血栓
症の危険度が高く、しかもヘテロ接合性個体の危険度を
甚だしく上回ることを示す。この結論は、ホモ接合性個
体がその最初の血栓症事象を若年時に経験していること
によって支持される。 ホモ接合性第Ｖ因子ライデンがもたらす血栓症の危険
度がホモ接合性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓ欠乏が
もたらす血栓症の危険度に全く近似しないことは明らか
であり、これらの異常は新生児電撃性紫斑病を誘発する
（H.E.Branson等，“Inherited protein Ｃ deficie
ncy and coumarin−reponsive chronic relapsing
purpura fulminans in ａ newborn infant,"Lan
cet ii,p.1165,1983;C.Mahasadana等，“Neonatal pu
rpura fulminans associated with homozygous pr
otein Ｓ deficiency,"Lancet 335,pp.61−62,199
0）。ホモ接合性第Ｖ因子ライデンを有する個体は全員
最初の血栓症事象前に成人に達しており、１人は中年後
期にすら達していた。ほとんどのホモ接合性個体は過去
に、血栓症をもたらさない危険状況を経験しており、そ
のような危険状況（妊娠、産褥）のほとんどに関して抗
凝血性予防法は示されていない。このことは、抗APC性
をホモ接合性タンパク質Ｃ欠乏におけるような定性的欠
陥（タンパク質Ｃ活性の不在）ではなく、定量的欠陥
（第V a因子の不活性化速度の低下）と看做すべきであ
ることを示している。 この試験で目立った発見は、ホモ接合性患者において
女性が優勢であることであった。それらの女性の間では
経口避妊薬が他の患者間でと同様に頻繁に用いられてい
たので、経口避妊薬の使用が抗APC性との相乗作用によ
って一定の役割を果たしたと考えられる。ピルの使用及
び抗APC性はいずれも一般的であるので、特にヘテロ接
合性保有者（全女性の３％）に関しては上記の関連性を
更に別の試験によって調べるべきである。 ヘテロ接合性個体に関する相対的危険度は、異なる年
齢群同士の間で一定であると考えられる。このような観
察は、年齢と共に上昇する背景出現率に照らして理解し
ければならない。上記の事態は、図12及び図13に示した
ように、血栓症の絶対的危険度、または抗APC性によっ
て助長される絶対的危険度がより高齢のヘテロ接合性個
体にとってより重大となることを意味する。 毎年10,000人当たり約２人という、本発明者の得た総
合的な出現率推定値は、1,000人年当たり約0.5〜１人の
通常の推定値より小さいということが留意され得る（H.
E.Branson等，“Inherited protein Ｃ deficiency
and coumarin−responsive chronic relapsing p
urpura fulminans in ａ newborn infant,"Lancet
ii,p.1165,1983;T.Koster,“More objectivediagnos
es of venous thromboembolism,"Neth.J.Med.38,pp.
246−248,1991）。このことは、本発明者の試験での年
齢制限（70歳未満）、確認済みの血栓症への限定、悪性
障害に羅患した患者の除外、及び最初の血栓症事象への
限定によりきわめて容易に説明される。 ホモ接合性患者は80倍大きい血栓症の危険度を有し、
その結果総合的な出現率は毎年約１％となる。より高い
年齢群において観察された出現率低下は、最初の血栓症
事象を未だ経験していない当該年代の個体が母集団内に
ほとんど存在しないことによって説明できる。この出現
率低下はまた、ホモ接合性患者が少数（即ち、最高年齢
群には１人のみ）であることの結果でもあった。いずれ
の場合も、加重回帰モデルから再算出した出現率値が最
良の危険度推定値であると考えられ、この値は50歳以上
の患者では毎年２％より高くなる。 本発明者は、ホモ接合性第Ｖ因子ライデンによって惹
起される抗APC性が深静脈血栓症の危険度を高めると結
論付ける。深静脈血栓症は成人期前には出現しないと考
えられ、更には妊娠及び産褥などの危険状況において必
ず出現するともかぎらない。とはいえ本発明者は、ホモ
接合性患者は危険状況下では、抗凝血剤を用いる短期予
防を受けるべきであると確信する。しかし、第Ｖ因子ラ
イデン突然変異に関してホモ接合性である個体において
持続的な予防を行なうことはかならずしも必要でない。 図12及び図13 年齢に基づき求めた、第Ｖ因子ライデン遺伝子型に関
する粗な（図12）、及び平滑化した（図13）出現率推定
値。 （図中）最下方の線は遺伝子型GGに関する推定値を示
し、上方の線は遺伝子型AGに関する推定値を示す。図13
には遺伝子型AA（ホモ接合性の第Ｖ因子ライデン）に関
する推定値も示す。粗な出現率は記号＋で示し、平滑化
した出現率は記号□で示す。10,000人年当たりの平滑化
した出現率は、GGに関しては0.9（０〜20歳）、1.4（30
〜49歳）及び2.5（50〜69歳）;AGに関しては6.3（０〜2
9歳）、9.8（30〜49歳）及び17.6（50〜69歳）;AAに関
しては81.5（０〜29歳）、126.5（30〜49歳）及び227.3
（50〜69歳）であった。 実施例３ プラスミド及びin vitro RNA １人の健康なヒト（ホモ接合性野生型）並びに２人の
患者ID90及びID137（いずれもホモ接合性突然変異体）
のPBMCから単離したRNAを、オランダ国ライデンの鬱血
及び血栓症研究センター（Hemostatis and Thrombosi
s Research Centre）から入手した。506位のアミノ酸
に存在する突然変異を包含する297ntの断片を、制限酵
素EcoR I及びCsp451を用いてベクターpG30中でクローニ
ングした。得られたプラスミドを、野生型クローンはpG
30/FVwt、突然変異体クローンはpG30/FVmutとそれぞれ
名付けた。 適正配列のクローニングを配列分析によって確認し、
その後プラスミドを、in vitro RNA合成のためにCsCl
濃度勾配によって精製した。ソースとしてプラスミドpG
30/FVwtを用いて系制御プラスミド（pG30/FV E2）を、
プローブ配列（21nt）の欠失及びE2配列（144nt）の挿
入によって構築した。上記３種のプラスミドを、標準的
なプロトコルにおいてT7 RNAポリメラーゼを用いるin
vitro RNA転写に用いた。プラスミドをBamH1で直線
状とし、T7 RNAPでの転写後にこれらのプラスミドか
ら、297ntのwt及びmutクローン並びに420ntの系制御ク
ローンとそれぞれに続く700ntのベクター配列とから成
るRNAが得られ、従ってin vitro RNAの全長は約1kbで
あった。in vitro転写後、RNAをDNアーゼＩで処理し、
Tip 100カラム（Qiagen）プロトコルを用いて精製し、
分光光度計で定量した。適当な連続稀釈を水で行ない、
in vitro RNAを−70℃で貯蔵した。 プライマー及びプローブ NASBA増幅プライマー、及びELGA及びECL検出用の検出
プローブの配列を表５に示す。 P1は第Ｖ因子コーディング配列のエキソン10に位置
し、P2配列はエキソン11に位置する。その結果、このプ
ライマーセットは、スプライシングによりイントロン10
配列が取り出されるmRNA配列しか増幅し得ない。ELGAま
たはECLにおいてより良く機能することから、２種の一
般的（generic）プローブが用いられる。しかし、ELGA
とECLとの両方のために一方の一般的プローブを選択す
ることが可能であるべきである。増幅プライマーは20％
アクリルアミド、7M尿素スラブゲル上で精製した。溶離
及びEtOHからの析出後、プライマーを500μｌのH2Oに溶
解させ、濃度を分光光度計（OD260）によって測定し
た。 ビオチンオリゴを合成機で製造し、これをEtOHから析
出させ、かつH2Oに溶解させて用いた。NH2−オリゴへの
HRPラベルの結合を標準的なプロトコルに従って実現
し、プローブは更に精製することなく用い（一般的ELGA
プローブ）、またはスラブゲル上で精製した（野生型及
び突然変異体特異的ELGAプローブ）。ECLオリゴを合成
し、更に精製することなく用いた。 核酸の単離 核酸の単離は総て、Boom等が述べている方法（J.Cli
n.Microbiol.28,pp.495−503,1990）を用いて行なっ
た。100μｌの全血から核酸を抽出し（臨床試料参
照）、溶離を100μｌのH2Oで行ない、典型的には５μｌ
の溶出液をNASBA増幅のためのインプットとして用い
た。残りの溶出液は−70℃で貯蔵した。 NASBA増幅 NASBA増幅を次のように行なった。５μｌのRNAに、10
μｌの2.5倍NRG緩衝液（１倍緩衝液中での最終濃度:pH
8.5のトリス 40mM;KCl 70mM;各dNTP 1mM;ATP/CTP/UT
P 2mM;GTP 1.5mM;ITP 0.5mM;MgCl2 12mM）と、6.25
μｌの４倍プライマー混合物（１倍緩衝液中での最終濃
度:DMSO 15％ v/v;P1 0.2μM;P2 0.2μＭ）と、1.7
5μｌのH2Oとから成る18μｌのプレミックス溶液を添加
した。試料を65℃で５分間インキュベートし、続いて41
℃で５分間インキュベートした。41℃において可能なか
ぎり多くを管から取り出し、２μｌの酵素混合物（８単
位のAMV−RT、40単位のT7RNAP、0.1単位の大腸菌RNアー
ゼＨ、2.6μｇのBSA、1.5Mのソルビトール）を添加し、
その後穏やかに混合し（即ちタッピングし）、41℃で90
分間インキュベートした。 ELGA検出 ELGA検出のために、一般的プローブ、野生型プローブ
及び突然変異体プローブをそれぞれ含有する３種のプロ
ーブ溶液を用いた。野生型及び突然変異体HRP標識プロ
ーブの特異性を高めるべく、これらの標識プローブを該
プローブと対を成す非標識プローブと混合した（表６参
照）。 増幅後、１μｌの増幅物を４μｌの適当なプローブ混
合物［５μｌ中の最終濃度:SSC、BFB、XCFF １倍；グ
リセロール及び適当なプローブ（表５参照）５％ v/
v］に添加し、混合し、45℃で15分間インキュベートし
た。その後、アクリルアミドゲル（５％アクリル／ビス
アクリル、0.04％デキストラン硫酸、NASBA elfo緩衝
液＝25mMトリス、25mMホウ酸、500μＭ EDTA;pH8.3）
上で2.5μｌの試料を、0.5倍NASBA elfo緩衝液に加え1
50Vで泳動させて分析した。電気泳動後、標準的なTMB/U
P基質溶液（比1:1で混合）を用いてゲルを約６分間染色
した。普通、ゲルを50％メタノール（O/N）中で固定
し、２枚の透明な箔の間で空気乾燥させた。 ECL検出 ECLでも３種のプローブ溶液を用いて増幅物を検出し
た（表７参照）。 ハイブリダイゼーション反応開始のため、10μｌのEC
L混合物（0.1％ w/v BSA、12.5倍SSC、２×1012分子
のECL一般的プローブ）と、10μｌのビーズ混合物（0.1
％ w/v BSA、１倍PBS、２μｌの適当なビーズ溶液及
び適当な非標識プローブ）と、５μｌの（水での）21倍
稀釈増幅物とを混合し、ストーブにおいて常に振盪しつ
つ45℃で30分間インキュベートした。その後、300μｌ
のECLアッセイ緩衝液を添加し、管をECLシグナル読み取
りのためECL装置に設置した。 結果 感度 第Ｖ因子mRNAのNASBA増幅に用いたプライマーは、野
生型及び突然変異体配列に関して長さ182ntの増幅物を
もたらした。プライマーを系制御（SC）in vitro RNA
の増幅に用いると、長さ305ntの増幅物が得られる。in
vitroで生じた野生型、突然変異体及びSC RNAの連続
稀釈物を用いて、増幅の感度を調べた（表８）。 ３種のインプットRNAのいずれにおいても、分析感度
は100分子以上である。10分子のインプットとの反応が
陽性である場合も有り、このことは感度が実際は10分子
と100分子との間であることを示している。 実施例４ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 核酸の単離において野生型または突然変異体RNAが存
在する場合に当該RNAと競合しないように添加するべきS
C RNAの量を決定するべく、幾つかのSC RNA量を分析
した。前記量のSC RNAを、試料を加えずに、また100μ
ｌの全血を加えて単離し、かつ対照としてSC RNAの連
続稀釈物を直接増幅した。増幅後のELGA分析の結果を表
９に示す。明らかに、核酸を単離する間に何等かの核酸
損失が生じる（Ａシリーズのインプット３の行とＣシリ
ーズのインプット３の行とを比較されたい）。 Ａシリーズ（表９）から、溶解緩衝液に加えるべきSC
RNAの最少量は１×105分子であるという結論を得るこ
とができる。この量のSC RNAは、100μｌの全血から単
離した野生型または突然変異体RNAの増幅を抑制しな
い。実際のところ、SC RNAは上記の10倍量で用いて
も、100μｌの全血から単離した野生型または突然変異
体RNAに対して抑制性でない（表９のＢシリーズ）。更
に行なった実験では、適当であれば常に、核酸単離前に
105分子のSC RNAを溶解緩衝液に添加した。 実施例５ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 ＧからＡへの単一塩基突然変異という、第Ｖ因子mRNA
の突然変異の性格に起因して、野生型プローブは突然変
異体増幅物に関して甚だしいバックグラウンドシグナル
を発生し、かつこの逆も成り立つということが予測され
る。このことはELGA検出とECL検出との両方に該当す
る。複雑なハイブリダイゼーションプロトコルを回避す
るためには、標識したプローブを該プローブと対を成す
非標識プローブと混合して、非相同増幅物に関するバッ
クグラウンドハイブリダイゼーションを抑制する。表10
に、ELGA検出によって調べた、プローブ混合物での野生
型及び突然変異体増幅物の特異的検出の結果を示す。 HRP標識野生型プローブの場合、バックグラウンドを
十分低下させるには250倍過剰な非標識突然変異体プロ
ーブを添加するべきであることは明らかである。HRP標
識突然変異体プローブを用いる場合は100倍過剰な非標
識野生型プローブを添加すれば、バックグラウンドを許
容可能なレベルまで低下させるのに十分である。ECL検
出を用いて、多かれ少なかれ同様の実験を行なった。EC
L法では非標識プローブは、磁性ビーズ上の特異的ビオ
チニル化捕捉プローブと競合するはずである。異なる過
剰倍率の非標識プローブ比率を用いて行なったECL検出
の結果を表11に示す。 後でECL検出を行なうためには、ビーズ上のビオチニ
ル化プローブが野生型プローブである場合は10倍過剰な
非標識突然変異体プローブを、またビーズ上のビオチニ
ル化プローブが突然変異体プローブである場合は４倍過
剰な非標識野生型プローブを共に用いるべきであること
が判明した。ELGA及びECL検出を行なう場合に添加しな
ければならない非標識プローブ量同士の相違はハイブリ
ダイゼーション方式に関連するに違いない。ECL方式で
は特異的プローブを磁性ビーズに結合させ、従って該プ
ローブのハイブリダイゼーション反応は液中プローブに
比べて遅い。その結果、標識しない液中プローブは比較
的僅かに過剰な量で添加しなければならない。ELGAでは
２種の液中プローブ間で競合が起こり、それによって比
較的多量の非標識プローブを添加しなければならなくな
る。
配列番号:1 配列の長さ:6909 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:3 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:7 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:DNA 配列 配列番号:11 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:14 配列の長さ:149 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：未知 配列の種類:DNA 配列
フロントページの続き (72)発明者 レイツマ，ピエテル・ヘンドリク オランダ国、エヌ・エル―2333・イツク ス・イエー・レイデン、メレルストラー ト・５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】血栓症の高危険率を示唆し、又は実際に患
者において血栓症を誘発することを特徴とする、血栓症
及び／又は活性化プロテインＣ（APC）に対する低応答
性に関連する遺伝的欠陥の存在をスクリーニングする方
法であり、第Ｖ因子をコードする核酸物質内における突
然変異の存在を検出することを含み、該突然変異がヒト
第Ｖ因子のアミノ酸配列の第506位アミノ酸をコードす
るコドン内における突然変異を含み、該核酸物質の発現
において該突然変異がAPCによる活性化ヒト第Ｖ因子
（第V a因子）の不活性化程度の減弱に相関することを
特徴とする前記方法。 - 【請求項２】血漿第Ｖ因子のアミノ酸配列の第506位ア
ミノ酸をコードするコドンが、アミノ酸グルタミンをコ
ードするコドンに突然変異していることを特徴とする請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】検出される核酸配列内の突然変異が、ヒト
第Ｖ因子の配列の第506位アミノ酸に対応するアミノ酸
をコードするコドンの２番目のヌクレオチドに対応する
位置におけるヌクレオチドＧの突然変異であることを特
徴とする請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】前記ヌクレオチドＧの突然変異がＧからＡ
への突然変異である請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】ヒト第Ｖ因子のアミノ酸配列の第506位ア
ミノ酸をコードするコドン内の突然変異を、該突然変異
を含む核酸鎖の核酸標的増幅反応を実施することにより
検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項６】前記突然変異を含む核酸鎖の５′および
３′末端に隣接する核酸鎖を認識しハイブリダイズする
十分な特異性を有するプライマーを用い、及び／又は前
記突然変異を含む核酸鎖を認識しハイブリダイズする十
分な特異性を有するプライマーを用いて前記増幅反応を
実施し、得られた増幅核酸を分析することを特徴とする
請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】前記突然変異を含む核酸物質の断片と少な
くともハイブリダイズする十分な長さと特異性をもつ対
応する相補配列を有する核酸物質鎖に対するハイブリダ
イゼーション試験に、単離した及び／又は増幅した核酸
物質をかけることを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】単離した及び／又は増幅した核酸物質を、
配列番号12及び配列番号13から選択される核酸物質の鎖
に対するハイブリダイゼーション試験にかける請求項７
に記載の方法。 - 【請求項９】プライマー又はハイブリダイゼーションに
用いる核酸配列が少なくともヒト第Ｖ因子をコードする
核酸配列のイントロン10の一部又は該イントロン10の一
部の誘導体を含むことを特徴とする請求項６または７に
記載の方法。 - 【請求項１０】プライマー又はハイブリダイゼーション
に使用する核酸配列が、少なくとも配列番号１の配列を
有するヒト第Ｖ因子をコードするヌクレオチド配列の一
部若しくは遺伝子コードの縮退による第Ｖ因子をコード
する配列の誘導体の一部、又は、第Ｖ因子をコードする
配列若しくはその誘導体の相補的配列の一部を含み、該
プライマー又はハイブリダイゼーションに使用する核酸
配列が該一部又は該一部の相補的配列と緊縮条件下でハ
イブリダイズすることが可能であり、該一部が少なくと
も10ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは配列番号１
または配列番号１の相補的配列の対応する部分と90％を
超える相同性を有することを特徴とする請求項６、７又
は９に記載の方法。 - 【請求項１１】前記プライマー又はハイブリダイゼーシ
ョンに用いる核酸配列が、配列番号２〜11若しくは14の
配列又はそれらの相補的配列から選択されることを特徴
とする請求項６、７又は９に記載の方法。 - 【請求項１２】−ヒト第Ｖ因子のアミノ酸配列の第506
位アミノ酸をコードするコドン内の突然変異を含む核酸
鎖を認識しハイブリダイズする十分な特異性を有する少
なくとも１つのプライマー、 −配列番号12又は配列番号13から選択される核酸配列の
少なくとも一部を含む少なくとも１つのプローブ、およ
び −適当な増幅試薬を含む請求項１〜11のいずれか一項に
記載の方法に使用するキット。 - 【請求項１３】配列番号14の配列から成るヌクレオチ
ド。 - 【請求項１４】配列番号12の配列から成るヌクレオチ
ド。 - 【請求項１５】配列番号13の配列から成るヌクレオチ
ド。 - 【請求項１６】ヒト第Ｖ因子及び／又は第V a因子のア
ミノ酸配列第506位アミノ酸をコードするコドン内の突
然変異において、被験者が同型接合であるか異型接合で
あるかを決定する方法であり、該突然変異がAPCに対す
る低凝血応答性と関連し、 −既知の方法を用いてAPCに対する抗凝血応答を測定す
る工程、 −（APTT＋APC）／（APTT−APC）値などの、該応答性の
診断に有用であることが知られているパラメーターの値
を求める工程、及び −得られた値を、正常な個人又は該突然変異において同
型接合又は異型接合であることが知られている個人から
のサンプルに対して同一の方法で得られた値と比較し、
その後に該突然変異を請求項１乃至10のいずれかに記載
の方法により確認する工程を含む前記方法。 - 【請求項１７】APCに対する抗凝血応答を測定する方法
が、Cephotest試薬及び25mMを超える濃度であり、好ま
しくは40mM未満、より好ましくは30〜35mMの濃度のCaCl
2を試験するサンプルに添加することを含み、（APTT＋A
PC）／（APTT−APC）値をKoster法に類似の方法で測定
し、得られた値が0.84以下である場合には被験者が異常
であると確認し、より詳細には、得られた値が0.50以下
である場合には突然変異に対して同型接合であり、0.50
〜0.70である場合には異型接合であると確認することを
特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】単離した、及び／又は増幅した、及び／
又はハイブリダイズした核酸物質を制限断片分析にかけ
ることを特徴とする請求項１乃至11に記載の方法。 - 【請求項１９】制限酵素がMnl Ｉであることを特徴と
する請求項18に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94200377.3 | 1994-02-14 | ||
| EP94200377 | 1994-02-14 | ||
| PCT/EP1995/000553 WO1995021938A1 (en) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | A method for screening for the presence of a genetic defect associated with thrombosis and/or poor anticoagulant response to activated protein c |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000400334A Division JP3439458B2 (ja) | 1994-02-14 | 2000-12-28 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08509383A JPH08509383A (ja) | 1996-10-08 |
| JP3163105B2 true JP3163105B2 (ja) | 2001-05-08 |
Family
ID=8216642
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52098395A Expired - Lifetime JP3163105B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
| JP2000400334A Expired - Lifetime JP3439458B2 (ja) | 1994-02-14 | 2000-12-28 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000400334A Expired - Lifetime JP3439458B2 (ja) | 1994-02-14 | 2000-12-28 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6518016B1 (ja) |
| EP (2) | EP0696325B1 (ja) |
| JP (2) | JP3163105B2 (ja) |
| KR (1) | KR100384251B1 (ja) |
| AT (2) | ATE206765T1 (ja) |
| AU (1) | AU690644B2 (ja) |
| CA (1) | CA2159907C (ja) |
| DE (3) | DE69523179T2 (ja) |
| DK (2) | DK0696325T3 (ja) |
| ES (2) | ES2090001T3 (ja) |
| FI (1) | FI117977B (ja) |
| GR (2) | GR960300034T1 (ja) |
| PT (1) | PT807691E (ja) |
| WO (1) | WO1995021938A1 (ja) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5935522A (en) * | 1990-06-04 | 1999-08-10 | University Of Utah Research Foundation | On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling |
| JPH11509722A (ja) * | 1995-03-24 | 1999-08-31 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | Ｖ因子遺伝子の突然変異を同定する方法 |
| AU6822796A (en) * | 1995-08-21 | 1997-03-12 | Akzo Nobel N.V. | T-pa polymorphism and use thereof in diagnosis of risk of thrombus associated disease |
| US20030143759A1 (en) * | 1995-10-20 | 2003-07-31 | Bjorn Dahlback | Assays for determining anticoagulant cofactor activity |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
| GB9604267D0 (en) * | 1996-02-29 | 1996-05-01 | Royal Infirmary Of Edinburgh N | Mutation assay |
| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| AT404993B (de) * | 1997-01-13 | 1999-04-26 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung eines proteins mit einer mutation |
| AU2117599A (en) * | 1998-01-20 | 1999-08-02 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Simplified mutation detection |
| DE19802377A1 (de) | 1998-01-22 | 1999-08-19 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von Inhibitoren für die Behandlung von RTK-Überfunktions-bedingten Störungen, insbesondere von Krebs |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US6391551B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6335162B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-01-01 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US7090975B2 (en) | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| US6235480B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6270973B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6268146B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6312902B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| DE19840897A1 (de) * | 1998-09-08 | 2000-03-09 | Dirk Happich | Faktor V-Leiden-Test |
| US6703228B1 (en) * | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| EP1001037A3 (en) * | 1998-09-28 | 2003-10-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms |
| DE19848665A1 (de) * | 1998-10-22 | 2000-04-27 | Bayer Ag | Ein automatisierbarer Schnelltest zum direkten Nachweis der APC Resistenz Mutation mit spezifischen Primern und Probes |
| EP1155150A1 (en) * | 1999-02-18 | 2001-11-21 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| WO2000062036A1 (en) * | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Amplification and separation of nucleic acid sequences using strand displacement amplification and bioelectronic microchip technology |
| US6238868B1 (en) * | 1999-04-12 | 2001-05-29 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences using ligation-dependant strand displacement amplification and bioelectronic chip technology |
| US6582920B2 (en) | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| CA2426346A1 (en) * | 2000-10-27 | 2002-06-13 | Abbott Laboratories | Genotyping using partially-complementary probes |
| US6855509B2 (en) | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
| WO2003076869A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-18 | Borealis Technology Oy | Apparatus for inspecting deformation of pipes |
| US20030177850A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | The Washington Post Company | System and method for verifying the roll roundness of rolls of paper used for newspapers |
| US20050026168A1 (en) * | 2002-12-13 | 2005-02-03 | Genesis Group Inc. | Method for the detection of risk factors associated with myocardial infarction |
| US20050032066A1 (en) * | 2003-08-04 | 2005-02-10 | Heng Chew Kiat | Method for assessing risk of diseases with multiple contributing factors |
| FR2866349B1 (fr) * | 2004-02-12 | 2008-05-16 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic/pronostic d'une thrombose |
| US20090004175A1 (en) * | 2004-07-16 | 2009-01-01 | Novo Nordick Health Care A/G | Methods for Optimizing Forming Vlla-Based Hemostatic Treatment |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| WO2006027111A1 (en) * | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Zlb Behring Gmbh | Modified coagulation factor viii with enhanced stability |
| KR100655658B1 (ko) * | 2005-07-26 | 2006-12-08 | 삼성전자주식회사 | 게이트 전극 구조물과 그 제조 방법 및 이를 갖는 반도체트랜지스터와 그 제조 방법 |
| CA2636706A1 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | The University Of British Columbia | Protein c pathway associated polymorphisms as response predictors to activated protein c or protein c like compound administration |
| US20070207188A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-09-06 | Miller Debra L | Cocoa products and methods of treating cardiovascular conditions with sugar-free cocoa |
| WO2008020090A1 (es) * | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Laboratorios Indas, S.A. | Método y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa |
| US20090287120A1 (en) | 2007-12-18 | 2009-11-19 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20090292214A1 (en) * | 2008-05-22 | 2009-11-26 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US8636670B2 (en) * | 2008-05-13 | 2014-01-28 | The Invention Science Fund I, Llc | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20090163856A1 (en) * | 2007-12-19 | 2009-06-25 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Treatment indications informed by a prior implant information |
| US9717896B2 (en) * | 2007-12-18 | 2017-08-01 | Gearbox, Llc | Treatment indications informed by a priori implant information |
| US20100036263A1 (en) * | 2008-08-07 | 2010-02-11 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20090292213A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| ES2547075T3 (es) | 2011-06-16 | 2015-10-01 | Gendiag.Exe, S.L. | SNP asociados a enfermedad tromboembólica |
| AR101185A1 (es) * | 2014-07-11 | 2016-11-30 | Novo Nordiks As | Anticuerpos anti-factor v o factor v activado |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5049491A (en) * | 1987-11-19 | 1991-09-17 | The University Of Vermont | Immunologic detection of factor V(VA) fragments in hemorrhagic and thrombotic clinical settings |
| US5051357A (en) * | 1989-07-14 | 1991-09-24 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method and assay using inactivation of factors Va and VIIIa by activated Protein C to diagnose thrombic disease or assay for Protein C and kit therefor |
| JP2562000B2 (ja) * | 1991-11-13 | 1996-12-11 | ダールベツク，ビヨルン | 血液凝固疾患の診断方法 |
| SE470274B (sv) * | 1991-11-13 | 1993-12-20 | Bjoern Dahlbaeck | Användning av en in vitro-metod för diagnos av blodkoagulationssjukdomar |
| WO1994017415A1 (en) | 1993-01-29 | 1994-08-04 | Dahlbaeck Bjoern | Novel anticoagulant cofactor activity |
| US5922855A (en) * | 1993-12-17 | 1999-07-13 | Oregon Health Sciences University | Mammalian DNA mismatch repair genes MLH1 and PMS1 |
| ES2157326T3 (es) | 1994-04-22 | 2001-08-16 | Sanquin Bloedvoorziening | Sistema para el tratamiento de anomalias en la cascada de coagulacion sanguinea. |
| US5639726A (en) * | 1994-09-30 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Peptide mediated enhancement of thrombolysis methods and compositions |
| ATE198772T1 (de) * | 1994-11-10 | 2001-02-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zum spezifischen nachweis eines aktivierten gerinnungsfaktors v mit einer erhöhten stabilität gegenüber aktiviertem protein c |
| US5705395A (en) * | 1994-11-14 | 1998-01-06 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| JPH11509722A (ja) | 1995-03-24 | 1999-08-31 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | Ｖ因子遺伝子の突然変異を同定する方法 |
| US5874256A (en) * | 1995-06-06 | 1999-02-23 | Rijks Universiteit Leiden | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same |
| US5863896A (en) * | 1995-11-09 | 1999-01-26 | Immuno Ag | Evaluation of substances for altering and for increasing APC response |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
-
1995
- 1995-02-14 DE DE69523179T patent/DE69523179T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DE DE0696325T patent/DE696325T1/de active Pending
- 1995-02-14 AT AT97201766T patent/ATE206765T1/de active
- 1995-02-14 EP EP95909724A patent/EP0696325B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 AT AT95909724T patent/ATE166110T1/de active
- 1995-02-14 EP EP97201766A patent/EP0807691B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DK DK95909724T patent/DK0696325T3/da active
- 1995-02-14 CA CA002159907A patent/CA2159907C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 PT PT97201766T patent/PT807691E/pt unknown
- 1995-02-14 JP JP52098395A patent/JP3163105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 ES ES95909724T patent/ES2090001T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DK DK97201766T patent/DK0807691T3/da active
- 1995-02-14 AU AU18091/95A patent/AU690644B2/en not_active Expired
- 1995-02-14 KR KR1019950704470A patent/KR100384251B1/ko active IP Right Grant
- 1995-02-14 US US08/454,353 patent/US6518016B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 ES ES97201766T patent/ES2166948T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 WO PCT/EP1995/000553 patent/WO1995021938A1/en active IP Right Grant
- 1995-02-14 DE DE69502451T patent/DE69502451T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 FI FI954855A patent/FI117977B/fi not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-06-05 US US08/658,340 patent/US5910576A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-30 GR GR960300034T patent/GR960300034T1/el unknown
-
1998
- 1998-08-05 GR GR980401765T patent/GR3027579T3/el unknown
- 1998-09-30 US US09/165,019 patent/US6558913B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-28 JP JP2000400334A patent/JP3439458B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3163105B2 (ja) | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 | |
| Peyvandi et al. | Gene mutations and three‐dimensional structural analysis in 13 families with severe factor X deficiency | |
| Guasch et al. | Molecular characterization of a type I quantitative factor V deficiency in a thrombosis patient that is “pseudo homozygous” for activated protein C resistance | |
| AU2008315938B2 (en) | Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them | |
| US5874256A (en) | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same | |
| JP2007522804A (ja) | 血栓形成傾向の識別のために開発された方法（ｍｅｒｔ） | |
| Formstone et al. | Severe perinatal thrombosis in double and triple heterozygous offspring of a family segregating two independent protein S mutations and a protein C mutation | |
| US7785788B2 (en) | Method for the detection of risk factors associated with myocardial infarction | |
| AU6116399A (en) | Genes for assessing cardiovascular status and compositions for use thereof | |
| US5994080A (en) | Method of diagnosing an increased risk of thrombus associated disease by detecting a certain t-PA polymorphism | |
| EP1456418A2 (en) | Identification of novel polymorphic sites in the human mglur8 gene and uses thereof | |
| US6043035A (en) | Method for determining a risk factor for thrombosis | |
| Zheng et al. | Six missense mutations associated with type I and type II protein C deficiency and implications obtained from molecular modelling | |
| EP1518934A1 (en) | Identification of polymorphisms in the EPCR gene associated with thrombotic risk | |
| Hoerl et al. | The diagnosis and clinical manifestations of activated protein C resistance: a case report and review of the literature | |
| JP5070197B2 (ja) | 深部静脈血栓症に関連する遺伝子欠陥の存在のスクリーニング方法 | |
| Nakabayashi et al. | Protein C Sapporo (protein C Glu 25→ Lys): a heterozygous missense mutation in the Gla domain provides new insight into the interaction between protein C and endothelial protein C receptor | |
| CN105624317B (zh) | 利用基质蛋白变异检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒 | |
| CN115315527A (zh) | 用于治疗il33中存在风险等位基因的受试者的治疗方法 | |
| 宮脇由理 | Thrombosis from a prothrombin mutation conveying antithrombin-resistance | |
| Bathum et al. | Denaturing High-performance Liquid Chromatography mutation analysis in patients with reduced Protein S levels | |
| US20040171004A1 (en) | Chemical compounds | |
| KR20050053761A (ko) | Ｐ2ｙ₁₂수용체의 ｈ２ 일배체형과 혈전증 및 말초 동맥질환에 대한 위험도 증가와의 연관성을 측정하는 방법 | |
| MXPA06010380A (en) | Method of diagnosis of a predisposition to develop thrombotic disease and its uses | |
| JP2006333811A (ja) | 慢性閉塞性肺疾患における体重減少に関連する多型、およびその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080223 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090223 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100223 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100223 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110223 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120223 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120223 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130223 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130223 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140223 Year of fee payment: 13 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |