KR20050053761A - Ｐ2ｙ₁₂수용체의 ｈ２ 일배체형과 혈전증 및 말초 동맥질환에 대한 위험도 증가와의 연관성을 측정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 검사대상의 혈전증 발병 위험도를 결정하는 생체외 방법 및 티에노피리딘 치료법에 대한 검사대상의 민감성을 결정하는 생체외 방법에 관한 것이다. 상기 방법들은 P2Y₁₂ 수용체 유전자의 특정 일배체형을 동정하는 것을 포함한다.

Description

Ｐ2Ｙ₁₂수용체의 Ｈ２ 일배체형과 혈전증 및 말초 동맥 질환에 대한 위험도 증가와의 연관성을 측정하는 방법{ASSOCIATION OF THE H2 HAPLOTYPE OF THE P2Y12 RECEPTOR WITH AN INCREASED RISK FOR THROMBOSIS AND PERIPHERAL ARTERIAL DISEASE}

본 발명은 혈소판 응집 및 혈전 위험도와 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 다형성 동정에 관한 것이다.

ADP(adenosine 5' -diphosphate)는 지혈(hemostasis)과 혈전증(thrombosis)의 가장 중요한 매개체들 중 하나이다(Storey etal. (2000)). 혈소판에 대한 ADP 작용은 P2Y₁ 및 P2Y₁₂라 불리우는 두개의 P2Y 수용체에 의해 매개된다. P2Y₁₂ 수용체는 지혈 플러그(plug) 형성과 동맥의 혈전증 발병에 주된 역할을 수행하는 것을 암시하는 상당한 증거자료들이 있다(Mills et al. (1996); Cattaneo etal. (1999)). 동맥 혈전증에서 P2Y₁₂의 주된 기능은, 티에노피리딘(thienopyridine) 항혈전성 약물, 예컨대 P2Y₁₂ 수용체를 표적으로 하는 클로피도그렐(clopidogrel) 및 티클로피딘(ticlopidine)이, 발작, 심근경색증(myocardial infarction) 및 말초 혈관 질환과 같은 다양한 혈전성 질환에 유리하게 작용하는 효과에 의해 확인되었다(Hollopeter (2001); Quinn et al. (1999); CAPRIE Steering Committee. Lancet. 1996 ; 348: 1329-1339). ADP 신호 전달은, Gq - 커플링된 P2Y₁ 수용체에 의해 매개되는 일시적인 Ca⁺⁺ 상승과(Jin et al. (1998)), Gi-커플링된 P2Y₁₂ 수용체에 의해 매개되는 아데닐레이트 사이클레이즈의 저해를 수반한다(Hollopeter (2001); Foster et al. (2001)). ADP에 의한 Gq 및 Gi 경로의 동시 활성화는, 정상적인 응집에 필수적이다(Jin et al. (1998b); Hechler et al.(1998a)). P2Y₁을 통한 Gq 신호전달과정의 활성화는 혈소판 모양 변화와 신속한 가역적 혈소판 응집 파장을 유도하지만(Jin et al. (1998a); Hechler et al.(1998a)), 반면에 P2Y₁₂를 통한 Gi 신호전달과정의 활성화는 완만한 진행성 및 지속성 혈소판 응집을 유도한다(Hechler et al.(1998b)). P2Y₁₂의 효과는 아데닐레이트 사이클레이즈의 저해와 그에 후숙되는 세포내 cAMP 함량 감소에 국한되어 있지 않다. 더욱이, P2Y₁₂ 수용체는 포스포이노시티드 3-(PI 3-)키나제 경로(Kauffenstein (2001); Daniel etal., (1999)) 및/또는 그외 미확인된 G 단백질을 통하여 당단백질(GP) IIbIIIa 인테그린을 활성화하는 것으로 알려져 있다. 즉, P2Y₁₂는 ADP에 노출시 발생되는 비가역적 혈소판 응집 파장에 중추적인 작용을 하는 것으로 나타났다.

P2Y₁₂ 유전자는 342개의 아미노산으로 이루어진 수용체를 암호화하는 것으로, 두 팀에 의하여 최근 동정되었다(Hollopeter (2001); Foster et al. (2001); Zhang et al. (2001)). 혈소판증을 앓고 있는 4명의 환자들에 대한 시험한 결과, ADP에 노출되면 가역적 응집이 극히 일부 또는 전혀 발생되지 않았으며, 프로스트글란딘 E₁(PGE₁)-자극성 혈소판에 대한 정상적인 아데닐레이트 사이클레이즈 저해가 감소되는 것으로 나타났다(Hollopeter (2001)). 한 환자에 있어서, 이러한 표현형은 P2Y₁₂ 유전자 이상(abnormality)과 연관되어 있었다.

비가역적 응집을 형성하기 위해 요구되는 ADP 농도에 있어서, 개체간의 상당한 다양성이 보고된 바 있다(Feng et al. (1999)).

유전 인자들이 혈소판 응집에 중요한 작용을 하므로(O'Donnell et al. (2001)), 본 발명자들은 ADP에 대한 혈소판 응집 반응에서 개체간의 다양성을 설명할 수 있는 P2Y₁₂ 유전자의 서열 다양성을 조사하였다.

도 1은 P2Y₁₂ 유전자에서 프라이머 및 다형성 위치를 나타낸 도식도이다.

약 3100 bp의 PCR 산물을 프라이머 E 및 J로 실시하여 수득하였다. 이후 서열분석은 하기 프라이머를 이용하여 수행하였다

B:5'TCATGCCAGACTAGACCGAA3'(서열번호 3)

C:5'ATCGATCGCTACCAGAAGACCACC3'(서열번호 4)

E:5'GGCTGCAATAACTACTACTT3'(서열번호 5)

F:5'AATTCCTTTCTGTCCTTAATT3'(서열번호 6)

G:5'TAAATAGGTGAGGAGATGCTG3'(서열번호 7)

H:5'TGCATTTCTTGTTGGTTACCT3'(서열번호 8)

J:5'GTCGTTTGTTTTGCTGCTAATA3'(서열번호 9)

K:5'CATTGAGAATTTCAGCTCCC3'(서열번호 10)

L:5'ATACTAACTACTACAATGAAGAT3'(서열번호 11) 및

M:5'CCTTACACCCTGAGCCAAAC3'(서열번호 12). ATG 및 TAA는 각각 개시 코돈 및 종결 코돈이다. i-C139T, i-T744C, i-ins801A, C34T 및 G52T는 연구 모집단에서 발견된 다형성이다.

도 2는 98명의 건강한 지원자에서 ADP에 대한 최대 혈소판 응집 반응성을 나타낸 그래프이다.

반응 3분 후에, 혈소판(구연산화된 PRP에서 250 x 10⁹/L)은 2 uM ADP로 자극시켰다. 1차 임검 및 2차 임검(일주일 후)에 기록한 응집값 간의 일치계수는 77%였다(P < 0.001).

도 3은 2 uM ADP에 대한 반응시 P2Y₁₂ 일배체형에 따른 최대 응집을 나타낸 그래프이다.

각 지원자에서 임검 일차 및 이차시 기록한 최대 응집치의 평균을 분석하였다. H2 대립유전자 비보균자(H1/H1, n = 74)에서 중간치는 34.7 %였고, 하나의 H2 대립유전자 보균자(H1/H2, n = 21)에서는 67.9%, 두개의 H2 대립 유전자를 가진 3명의 검사대상(H2/H2)에서는 82.4%의 중간치를 나타내었다(P=0.0071).

도 4는 H2 보균자 및 비보균자에서 일로프로스트(iloprost)-유도된 cAMP 형성에 있어서 ADP에 의한 저해를 나타낸 그래프이다.

일로프로스트(20 ug/uL 최종농도)는 37℃에서 반응시킨 후 구연산화된 PRP 에 1분간 첨가하였다. 생리식염수(대조군) 또는 ADP는 1, 2 또는 5 uM로 1분간 후에 첨가하였다. 3분후에 반응을 중지시키고, cAMP 농도를 시판되는 분석 키트로 결정하였다. 삼각형과 원은 각각 H2 일배체형 보균자 및 비보균자를 나타낸다. 평균 ± 표준편차.

본 발명자들은 P2Y₁₂ 수용체 유전자에서 3종의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)과 하나의 염기 삽입을 확인하였고, H1 및 H2의 두 가지 일배체형을 결정하였다. H2 일배체형은 ADP에 대한 반응시 보다 높은 최대 혈소판 응집과 연관성이 있다.

P2Y₁₂ 수용체의 ADP-유도성 혈소판 응집의 증가와 강하게 연관되어 있는 일배체형을 동정하는 것은, 임상적으로 중용한 의미를 갖는데, 보다 상세하게는 환자의 혈전증, 특히 죽상혈전증(atherothrombosis)의 위험도 검정과 티에노피리딘 치료법에 대한 차선책 마련에 영향을 준다.

본 발명자들은 말초 혈관 질환에 고위험도를 나타내는 환자에서의 P2Y₁₂ 수용체의 특이성과 혈소판 응집에서 H2 대립 유전자의 기능 획득(gain of function)을 조사하였고, 또한 사례군-대조군 연구를 통하여 P2Y₁₂ 유전자의 H2 일배체형과 PAD와의 연관성을 조사하였다.

본 발명자들은 P2Y₁₂ 유전자의 H2 일배체형이 PAD와 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다.

이러한 결과를 근간으로, 본 발명은 P2Y₁₂ 수용체의 H1 및 H2 일배체형을 구별하는 방법을 제공하며, 혈전증 발병 위험도 증가 및/또는 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성 감소와의 연관성 측정방법을 제공한다.

따라서, 상기 방법은 검사대상의 혈전증 특히 죽상혈전증의 발병 위험도를 결정하는데 유용하다.

이런 방법은 또한 환자의 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성을 결정하는데 유용하다.

P2Y ₁₂ 수용체

전술한 바와 같이, 인간 P2Y₁₂ 수용체는 클론된 상태이다. 또한 다른 종에서의 다양성 역시 확인되어 있다.

	코드	등록 번호(SWISSPROT)
호모 사피엔스	P2Y12_HUMAN	Q9H244
마카카 패스키큘라리스	P2Y12_MACFA	Q35KC3
무스 무스큘러스	P2Y12_MOUSE	Q9CPV9
라튜스 노르베기쿠스	P2Y12_RAT	Q9EPX4

본 발명에서, "P2Y₁₂ 수용체"는 모든 종, 특히 인간뿐만 아니라 바람직하기로는, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 그외 포유류 또는 척추동물의 P2Y₁₂ 수용체를 의미한다. "검사대상"은 모든 인간 환자 또는 모든 포유류 또는 척추동물을 나타낸다.

인간 P2Y₁₂ cDNA 서열은 유전자은행(등록 번호: AF313449 및 AY136754)으로부터 이용가능하다.

본 발명자들은 건강한 모집단에서 P2Y₁₂ 유전자를 분석하여, 상기 유전자는 2개 이상의 엑손과 엑손 사이에 위치한 약 1700 bp의 인트론을 포함하며, 상기 인트론은 ATG 코돈의 상위에 포함되어 있음을 확인하였다. 엑손2는 전체 342 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩한다. 6개의 뉴클레오타이드 반복 서열(nt)로 인해 (표1), 엑손1의 3' 종결부분과 엑손2의 5' 개시부분은 정확하게 결정할 수 없었다.

표 1:

정확한 엑손1의 3' 종결부분과 엑손2의 5' 개시부분에 대해 가능한 염기서열 패턴. 인트론 서열은 소문자로 나타내었다. 반복서열은 밑줄로 표시하였다. 본 발명자들은 임의적으로 패턴1을 선택하여 이에 따라 염기 순번을 매겼다.

패턴 엑손1 및 3' 플랭킹 부위 엑손2 및 5' 플랭킹 부위

1 ...ACAGTTATCaggtaatgttatttcg... ...tgttctctAGGTAACCAACAAG.

2 ...ACAGTTATCAGGTAAtgttattt... ...ttttgttctctaggtaaCCAACAAG...

3 ...ACAGTTATCAGqtaatgtt.... ...ttctctagGTAACCAACAAG

표 1은 3종의 가능성 있는 서열 패턴에 관한 것으로, 패턴3이 가장 가능성이 있다. 그러나 본 발명자는 임의로 패턴1을 선택하여 연구대상의 다형성을 측정하였다. 따라서 후술하는 부분에서 패턴1을 사용하였다.

패턴1에 따르면, 인트론의 5' 서열은 서열번호 1로 나타내고 엑손2의 5' 서열은 서열번호 2로 나타내었으며, 이들은 본 발명에 있어서 P2Y₁₂ 유전자의 관심대상 부위이다. 이들 서열은 하기 분석한 바에 따르면 H2 일배체형이다. 시작코돈인 ATG의 A는 서열번호 2에서 17번째 뉴클레오타이드이다.

H1/H2 일배체형

본 발명자들은 P2Y₁₂ 유전자의 서열을 분석하여, 3개의 단일 뉴클레오타이드 다형성과 1개의 뉴클레오타이드 삽입을 발견하였다(표 2). 본 발명에선 때때로 상기한 다형성을 "관심대상의 다형성 부위"로 언급하기도 한다.

표 2:

모집단 연구에서 검출된 다형성에 대한 설명. H1/H2 일배체형은 i-C139T, i-T744C(또한 잘못 기재된 i-T745C), i-ins801A(또한 잘못 기재된 i-ins802A) 및 G52T 다형성에 의해 정의된다.

SNP 명 아미노산 위치 대립유전자 빈도

i-C139T - 인트론 C:86.2% T:13.8%i-T744C - 인트론 T:86.2% C:13.8%i-ins801A - 인트론 A 삽입: 13.8%G52T G/G 엑손2 G:86.2% T:13.8%C34T N/N 엑손2 C:72.5% T:27.5%

2개의 변이가 5' 인트론(이하 "i"라 함) 개시부위 이후에, 139nt 및 744nt에 위치하며, 이들 각각은 C에서 T(i-C139T)로의 전이 및 T에서 C(i-t744C)로의 전이로 이루어진다. 다른 다형성은 인트론 801 위치(i-ins801A)에 단일 뉴클레오타이드 삽입(A)이다. 또한 두개의 추가적인 다형성이 엑손2에서 발견되었으며, 이는 ATG 코돈의 첫번째 뉴클레오타이드로부터 각각 17nt 및 35nt 위치에서, C에서 T로 전이(C34T)와 G에서 T로 전위(G52T)로 구성되며; 암호화된 아미노산(Asn⁶ 및 Gly¹² 각각)을 수정(modification)하진 않는다. C34T 다형성은 ADP에 대한 반응시 최대 응집과 관련되어 있지 않다.

i-C139T, i-T744C, i-ins801A 및 G52T 다형성은 100명의 건강한 백인계 지원자에서 완전한 연관불균형(complete linkage disequilibrium) 상태에 해당되므로, 본 발명자들은 주된 대립 유전자(139 위치는 C, 744 위치는 T, 인트론에 i-ins801A는 없으며 엑손2의 52위치에는 G가 존재함)는 H1 일배체형으로 지정하고, 소수 대립 유전자(139 위치는 T, 744 위치는 C, 인트론에 i-ins801A가 있으며, 엑손2의 52위치에는 T가 존재함)는 H2 일배체형으로 지정하였다. H1 및 H2 각각의 대립 유전자 빈도는 86% 및 14%이다. 모든 다형성의 대립 유전자 빈도는 하디-바인베르트 균형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 이룬다.

H2 대립 유전자 비보균자(H1/H1)와 비교하면, H2 대립 유전자 보균자(H1/H2 또는 H2/H2)는 생체외 실험에서 더욱 강력한 ADP-자극성 혈소판 응집 반응을 나타내며, 세포내 cAMP 농도를 차별 조절한다.

H2 일배체형 P2Y₁₂ 수용체 유전자의 분리된 핵산 또한 본 발명의 일측면을 형성한다.

본 발명의 주체는 P2Y₁₂ 수용체를 암호하는 분리된 핵산으로서, 핵산은 인트론의 139 위치에 T가 위치하고, 인트론의 744 위치에 C가 위치하고, 인트론의 801 위치에 A가 삽입되어 있으며, 엑손2의 52 위치에 T가 위치하는 P2Y₁₂ 유전자 서열을 포함한다.

이러한 서열은 바람직하기로는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2를 포함한다.

혈전증 위험도

본 발명은 검사대상으로부터 혈전증 발병 위험도를 결정할 수 있는 생체외 결정방법을 제공하며, 상기 방법은 P2Y₁₂ 수용체의 인트론(서열번호1)의 139, 744 및 801 위치 및 엑손2(서열번호2)의 52 위치에서의 다형성을 동정하는 것을 포함하며, 인트론의 139 위치에 T가 존재, 인트론의 744 위치에 C가 존재, 인트론의 801 위치에 A가 삽입 및 엑손2의 52 위치에 T가 존재가 동시에 이루어진 것을 H2 일배체형이라 하며, 이는 혈전증 발병 위험성이, 대조군 검사대상, 예컨대 대립 유전자의 어느 쪽도 H2 일배체형을 가지지 않는 검사대상(예, H1/H1 검사대상)에 비하여 더 높음을 의미한다.

혈전증 발병 위험도가 더 높다는 것은 H2 대립 유전자 보균자가 비보균자에 비하여 유의적으로 더욱 위험함을 의미한다.

이러한 상대적 위험도는 사례군-대조군 연구와 교차비(Odds ratio: OR)를 통하여 추산된다. OR 1.1은 질환 발병 위험도가 10% 증가하는 것을 의미하고, OR 2.0은 위험도가 100% 증가하는 것을 의미한다.

혈전증 발병 위험도는 혈소판 응집 발병과 연관되어 있다.

혈소판은 특히 동맥 혈전증에 필수적이며, 기능장애 내피세포로의 접합, 성장인자 및 사이토카인들의 방출을 통하여 죽상경화 손상 개시 및 발병에 관여한다. 죽상경화 질환의 가장 주된 표적 혈관은 뇌, 심장 및 하지 동맥반(lower limb arterial beds)이다.

본 발명에서, "혈전증"은 혈관 또는 심장강(heart cavity)에 덩어리가 형성되는 것을 의미한다.

바람직한 실시예로, 죽상혈전증을 포함한다.

용어 "죽상혈전증", " 죽상경화증(atherosclerosis)" 및 "동맥 혈전증"은 동의어이다.

죽상혈전증은 많은 혈전성 질환, 예컨대 마비, 심근경색 및 말초 동맥 질환(PAD)의 주된 현상이다.

말초 동맥 질환(PAD)에서 동맥 혈전증 및 죽상경화증 질환의 수반은 특히 중요하게 여겨진다. 게다가 PAD는 심근 및 뇌혈관 죽상경화증 발생과 연관되어 있으며, 역학 연구에서 75%의 PAD 환자가 혈관성 원인으로 사망하는 것으로 확인되었다.

따라서, 환자에서 P2Y₁₂ 수용체의 H2 일배체형 동정은 특히 PAD와 같은 혈전성 질환의 발병 위험도 증가를 나타낸다.

본 발명에서, 상기 언급한 "혈전증"은 정맥 혈전증 및 정맥 혈전색전성 질환과 혈전미세혈관병증 또는 파종혈관내응고와 같은 그외 혈전 상태를 포함한다.

티에노피리딘 치료법에 대한 민감성

본 발명은 또한 티에노피리딘 치료법에 대한 검사대상의 민감성을 결정하는 생체외 방법을 제공하며, 상기 방법은 P2Y₁₂ 수용체의 인트론(서열번호 1) 139, 744 및 801 위치 및 엑손2(서열번호 2) 52 위치에서의 다형성을 동정하는 것을 포함하며, 인트론 139 위치에 T 존재, 인트론 744 위치에 존재, 인트론 801 위치에 A 삽입 및 엑손 52 위치에 T 존재가 동시에 이루어지는 것을 H2 일배체형이라 하며, 적어도 1종 이상의 대립유전자가 존재하는 경우 티에노피리딘 치료법에 대한 검사대상의 민감성은 대조군, 예컨대 H2 일배체형이 없는 검사대상(예, H1/H1 검사대상)에 비하여 더 낮음을 의미한다.

본 발명에서, "티에노피리딘 치료법"은 현재 시술되는 항혈전 치료법을 나타내는 것으로, 글로피도그렐(clopidogrel) 또는 티클로피딘(ticlopidine), 또는 그외 ADP와 P2Y₁₂ 간의 상호작용을 방해하는 약물을 포함하는 티에노피리딘제의 투약을 포함한다.

"티에노피리딘 치료법에 대한 검사대상의 민감성"은 상기 치료법을 수행하는 동안 검사대상에서 나타나는 다양한 반응을 지칭한다. 상기 치료법에 대한 낮은 민감성은 반응이 약하고 따라서 적절하지 않다는 것이다.

검사대상의 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성 결정은 특히 의사가 환자가 가장 잘 순응할 수 있는 치료전략을 초기에 설계하는데 일조한다는 측면에서 관심을 끈다.

H2 대립유전자의 존재 동정

전술한 방법, 예컨대 혈전 위험도를 결정하는 방법 및 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성을 결정하는 방법은 P2Y₁₂ 수용체 유전자의 H1/H2 일배체형을 동정하는 것을 포함한다.

상기 동정은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 공지된 모든 기술에 의하여 실시될 수 있다.

본 발명의 구체적인 방법으로, H1/H2 일배체형에 관한 개인의 다형성 양상은 개인으로부터 DNA를 수득하고 P2Y₁₂ 수용체 유전자의 관심대상의 다형성 부위의 서열을 결정함으로써 수립될 수 있다.

DNA는 모든 세포원으로부터 수득할 수 있다. 임상실시에서 이용가능한 세포원에 대한 무제한적 예들로는, 혈액 세포, 볼 세포, 자궁경부 세포, 소변에서 분리한 상피 세포, 태아 세포, 머리 또는 바이옵시(biopsy)로부터 수득한 조직내 모든 세포를 포함한다. 세포는 또한 혈액에 한정되지 않고, 침, 땀, 소변, 뇌척수액, 변 및 감염 또는 염증 부위의 조직 삼출물(exudate)을 포함한 체액으로부터 수득할 수 있다. DNA는 세포원 또는 체액으로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 표준화된 다수의 방법에 의하여 추출할 수 있다. DNA 추출에 사용되는 구체적인 방법은 원료의 특징에 좌우될 수 있음은 당연할 것이다. 또다른 예로, DNA 추출없이 예컨대 전혈구에서 분석을 실시할 수 있다(Mercier et al. (1990) Acids Research, 18 (19): 5908).

H1/H2 일배체형의 다형성 부위에 대한 DNA 서열 결정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 실시된다. 유전자형 분석에 관한 다수의 방법을 이용할 수 있다(Antonarakis et al. (1989); Cooper et al. (1991); Grompe, (1993)). 상기 방법은 이에 한정되진 않으나, 직접적인 서열분석, 제한 절편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP), 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드로의 혼성화, 대립 유전자-특이적 PCR, 돌연변이 프라이머를 이용한 PCR, 라이게이즈-PCR, HOT 절단, 변성 구배 겔 전기영동(denaturing gradient gelelectrophoresis, DGGE), 온도 변성 구배 겔 전기영동(temperature denaturing gradient gelelectrophoresis, TGGE), 단일가닥 구조 다형성(single-strandedconformational polymorphism, SSCP) 및 변성 고속액체 크로마토그래피를 포함한다(Kuklin et al. (1997-98)). 직접적인 서열분석은 모든 방법에 의하여 실시될 수 있으며, 이에 한정되진 않으나, 맥삼-길버트 방법(Maxam-Gilbert method)을 이용한 화학적 서열분석; 상거 방법을 이용한 효소적 서열분석; 질량 분광법 서열분석; 칩을 근간으로한 방법을 이용한 서열분석(참조: Little et al. (1996)); 및 실시간 정량 PCR을 포함한다. 바람직하기로는, 검사대상의 DNA는 특이적 증폭 프라이머를 이용한 PCR을 먼저 실시한다. 그러나, 몇몇의 다른 방법들도 이용할 수 있어, DNA를 올리고뉴클레오타이드 라이게이션법(oligonucleotide ligation assay, OLI), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA) 또는 Invader^TM법과 같은 PCR로 독립적으로 연구할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예로, 검사대상에서 혈전증과 관련되거나 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체 일배체형에서 1종이상의 다형성을 동정하는 생체외 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물학적 시료의 게놈 DNA를 P2Y₁₂ 수용체 유전자에 있어서 1종 이상의 부위, 인트론(서열번호 1) 139, 744 및 801 위치 및 엑손2(서열번호 2) 52 위치의 주변부에 대하여 분석하는 것을 포함하며;

상기 인트론 139 위치에 T 존재, 인트론 744 위치에 C 존재, 인트론 801 위치에 A 삽입 및 엑손 52 위치에 T 존재는 H2 일배체형이라 하며, 1종이상의 대립 유전자가 존재하는 경우 대조군 검사대상에 비하여 혈전 발병 위험도가 높거나 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성이 낮음을 표시한다.

상기 분석은 바람직하기로는 게놈 DNA의 상기 부위에 대한 증폭 단계(예, PCR에 의한)를 포함할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 분석은 분리된(즉, 추출된) 게놈 DNA에서 행해질 수 있다.

P2Y₁₂ 수용체의 다형성을 동정하는 바람직한 방법은 서열분석이다.

키트

본 발명의 일측면에 있어서, H1/H2 일배체형은 환자의 DNA에 선택적으로 표지된 핵산 프로브를 접촉시켜 검출한다.

프라이머는 또한 목적한 다형성 부위를 포함하는 P2Y₁₂ 유전자 부위를 증폭하거나 또는 서열분석하는데 유용하다.

상기 프로브 또는 프라이머는 관심대상의 다형성 부위를 포함하는 P2Y₁₂ 유전자 일부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산이다. 즉, 고엄격 조건(conditions of high stringency, Sambrook et al. (1989))에서 상기 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 이러한 조건은 융해온도, Tm 및 높은 이온 강도로부터 결정된다. 바람직하기로는, 가장 유용한 서열은 온도 범위 (Tm- 5 ℃) 내지 (Tm - 30 ℃), 더욱 바람직하기로는 (Tm - 5 ℃) 내지 (Tm - 10 ℃)에서 혼성화되는 것이다. 이온 강도 6X SSC가 더욱 바람직하다. 예를 들면, 고엄격 혼성화 조건은 가장 높은 Tm, 예켠대, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC이다. SCC는 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-사이트레이트이다. 혼성화는 상보적인 서열을 포함하는 두개의 핵산이 요구되며, 혼성화의 엄격성에 의존적이긴 하나, 염기간의 미스매치가 발생될 수 있다. 핵산 혼성화시 적절한 엄격성은 핵산의 길이, 상보성 정도, 본 발명이 속하는 기술분야의 공지된 다수의 것들에 의하여 결정된다. 두 뉴클레오타이드간의 유사성 또는 상동성이 높을수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 혼성시 Tm 값이 증가한다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(높은 Tm에 상응하는)은 하기 순서에 따라 감소한다: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. 100개 이상의 길이를 갖는 뉴클레오타이드의 혼성시, Tm 계산식으로 도출한다(참조: Sambrook etal., supra, 9.50 - 9.51). 더욱 짧은 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오타이드의 혼성화시, 미스매치 부위가 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오타이드의 길이가 이의 특이성을 결정 짓는다(참조: Sambrook et al., supra, 11.7- 11.8). 핵산의 혼성화를 위한 최소한의 길이는 약 10개의 뉴클레오타이드 이상이고; 바람직하기로는 약 15개 이상이고, 및 더욱 바람직하기로는 약 20개의 뉴클레오타이드 이상이다.

바람직한 프로브 또는 프라이머는 도면 설명부 또는 하기 실시예들에서 설명한다.

프라이머가 돌연변이 프라이머인 경우, 혼성화 조건 결정시 상기 규칙을 적용시킬 수 있다. 돌연변이 프라이머의 서열은 특정 대립 유전자가 증폭될때 제한 부위를 도입하기 위하여, 천연형 서열에서 일부 변경될 수 있다. 또한, 상기 돌연변이 프라이머는 흔히 30 내지 40 개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

본 발명은 또한 P2Y₁₂ 수용체 H1/H2 일배체형에서 1종이상의 다형성을 결정하기에 적합한 키트를 제공한다.

상기 키트는 하기 구성요소를 포함한다:

(i) 전술한 프로브, 통상 DNA로 제조된 것으로, 전-표지된 것일 수 있다. 다르게는 상기 프로브는 비표지된 것일 수 있으며, 표지를 위한 성분을 키트내 분리된 용기에 포함할 수 있다; 및

(ii) 혼성 반응시약 : 상기 키트는 또한 다른 적절히 패키지된 반응시약들 및 특정 혼성화 실험 계획에 필요한 기질, 적절한 경우엔 고체상 기질 및 표준물질을 포함할 수 있다.

다른 예로서, 상기 키트는:

(i) 서열 결정 또는 증폭 프라이머 : 서열분석 프라이머는 전-표지될 수 있으며, 또는 친수성 정제 또는 부착된 일부를 포함할 수 있다; 및

(ii) 서열 결정 또는 증폭 반응시약 : 상기 키트는 또한 다른 적합한 패키지된 반응시약 및 특정 서열분석 증폭 실험에 필요한 기질을 포함할 수 있다. 바람직한 일예로, 상기 키트는 각 다형성 서열의 존재를 검출하기 위한 수단과, 서열분석 또는 증폭 프라이머 패널을 포함하며, 이의 서열은 다형성 위치들중 1종 이상의 위치에 인접한 서열과 일치한다.

구체적인 예로, 인트론(서열번호 1) 139, 744 및 801 위치 및/또는 엑손2(서열번호 2) 52 위치들중 1종 이상의 위치를 포함하며, P2Y₁₂ 유전자 전체 또는 일부를 특이적으로 증폭하는 한쌍의 뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 키트를 제공한다.

하기 도면 및 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: P2Y ₁₂ 유전자 서열 다양성 동정

방법

검사대상

18 내지 35세의 98명의 무관한 건강한 백인계 남성 지원자를 모집하여, 호피탈 유럽 조지 폼피도우의 임상연구센터(clinical investigaton center of hopital europeen georges pompidou)에서 실험하였다. 지원자들은 비흡연자로서, 평범한 개인적, 가족적 건강 약력을 지니고 있으며, 혈액 채취전 10일 이상 어떤 약물도 복용하지 않았다. 신체검사와, 일반적인 실험 테스트, 예컨대 백혈구 수, 적혈구 수 및 혈소판 계수, 평균 혈소판 부피, 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 일부 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 혈장 피브리노겐 및 C-반응성 분석을 봉입(inclusion)전에 실시하였다. 모든 지원자들로부터 0일(일차 임검) 및 7일(이차 임검)에 채취한 혈액은 응집 테스트를 수행하였다. 혈소판 cAMP를 분석하고, 구연산화 및 히루딘(hirudin)-항응고된 혈소판-과다 혈장(PRP)에서의 최대 응집을 비교하기 위하여, 3차 혈액 시료를 20명의 지원자들로부터 채혈하였다. 모든 대상로부터 자필 동의서를 받았으며, 연구 계획은 지역 윤리 위원회로부터 승인받았다.

시료 준비

정맥 혈은 하룻밤 공복 후 오전 8시 내지 10시 사이에 19-게이지 바늘을 이용하여 압박띠를 사용하지 않은 상태에서 채혈하고, 0.105M 소듐 사이트레이트(1 vol/9 vol)(BD Vacutainer^®, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) 또는 50 ug/mL의 레피루딘(Refludan^®, Hoechst, Paris, France)중의 어느 하나가 함유된 튜브에 넣었다. 초기 혈액 2 ml은 버렸다. 혈소판-과다 혈장(PRP)는 상온에서 10분간 1000 rpm으로 원심분리하여 수득하였다. 15분간 4000 rpm으로 원심분리하여 수득한 자가 혈소판-부족 혈장은 PRP를 250 x 10⁹/L로 적정하는데 사용하였다.

혈소판 응집 연구

응집 연구는 채혈후 2시간내 실시하였다. 응집은 광도측정법을 이용하여 4개의 채널의 응집계(Regulese Amneville, France)상에서 37℃에서 측정하였다. PRP 280 ul 분주물은 37℃에서 3분간 둔 후 20 uL의 생리식염수 또는 1, 2 또는 5 uM(최종 농도)의 ADP(Sigma-Aldrich, St QuentinFallavier, France)를 첨가하기 전에 2분간 1100 rpm으로 혼합하였다. 혈소판 응집 반응은 5분간 기록하였다.

cAMP 측정

혈소판 cAMP 함량은 20명의 선별된 검사대상에 한하여, PRP 270 uL와 안정한 프로스타사이클린 유사체 일로프로스트(20 ug/L, 최종농도)(Ilomedine^®, Schering-Plough) 용액 10 uL를 1분간 교반반응시킨 후 20 uL의 생리식염수 또는 ADP(1, 2, 또는 5 uM)을 첨가함으로써 측정하였다. 반응은 3분후 12 %의 트리클로로아세트산 20 uL을 가하여 중지시켰다. 이후 cAMP를 추출하고, 제작사의 지시서에 따라, P2Y₁₂ 유전자형에 대한 사전지식 없이, 효소 면역분석법(EIA)으로 측정하였다.

유전자형 연구

말초 혈액 단핵구 세포로부터 Qiamp MaXI Kit^® (Qiagen, Courtaboeuf, France)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다.

P2T ₁₂ 수용체. 본 발명자들은 홀로피터 등.(Hollopeter (2001) Nature 409: 202-207)에 의해 보고된 cDNA 서열을 이용하였으며, 상기 서열은 유전자은행 접속번호 AF313449로 입수할 수 있다. P2Y₁₂ 유전자 구성은 7개의 다른 트랜스멤브레인 도메인 수용체 유전자와 유사하며, 이들 대부분은 두개의 엑손이 하나의 인트론에 의하여 분리된 형태를 포함하고 있는 것으로 추측되어, 본 발명자들은 두개의 올리고뉴클레오타이드, E 및 J, 즉 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 예비 증폭 실험을 수행하였다; 이들은 보고된 DNA의 5' 및 3' 말단에 위치한다(도 1). 증폭 산물은 이후 Pre-시퀀싱 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 정제하였다. 프라이머 E, B 및 J를 이용한 사이클 서열분석 반응을 수행하였다. 그외 프라이머(G, H, K 및 L)를 이용한 연이은 서열분석을 실시하여, 증폭산물의 염기 서열을 결정하였다. 서열분석은 ABI Prism 3700(Applera)로 수행하였다.

모집단에서 40명의 검사대상 검색은, 5 % 또는 그이상의 빈도를 갖으며, 95 %의 신뢰구간(CI)를 갖는 다형성을 결정하기에 충분하다. 따라서, 동일한 48명의 건강한 지원자로 이루어진 첫번째 군에서, 프라이머 K로 엑손1의 58nt를, 프라이머 E 및 G로 3' 플랭킹 부위의 947nt를, 프라이머 L, C 및 M으로 엑손2의 1274nt를, 프라이머H로 5' 플랭킹 부위의 570nt를 서열분석함으로써, P2Y₁₂ 유전자 다형성을 검색하였다. 상기 프라이머는 도 1에 나타낸다. 이후 상기 동일한 다형성을 목적으로 하는 프라이머를 이용하여, 그외 50명의 검사대상의 P2Y₁₂ 유전자 서열을 분석하였다.

혈소판 응집 결과에 대한 인지없이, PCR 및 서열분석 결과를 분석하였다. 유전자형 분석은 모호한 경우 반복실시하였다. 모두 98명의 대상으로부터 성공적으로 유전자형을 분석하였다.

혈소판 RNA 추출 및 역전사

4 mL PRP(10⁹개의 혈소판)은 4000 rpm으로 15분간 원심분리하여 펠렛화하였다. RNeasy^® kit를 이용하여 제조사(Qiagen)의 지시서에 따라 RNA를 추출하였다. 역전사는 10 unit의 RNasin™ 리보뉴클레이즈 저해제(Promega, charbonnieres, France), 100 unit의 Superscript II Rnase H^- 역전사효소(Invitrogen) 및 1.5 mM 랜덤 헥사뉴클레오타이드(Amersham Pharmacia biotech)를 이용하여 실시하였다. cDNA는 -20 ℃에서 보관하였다.

통계 분석

데이타는 비대칭적인 변이체들을 제외하고 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 이를 중간치로 표현하였다. 일차 임검 및 이차 임검에서 취합한 개별 검사대상의 수치는 일치 테스트(concordance teat, Lin et al. (1989) Biometrics 45: 255-268)를 이용하여 비교하였다. x² 테스트는 하디-바인베르그 균형 예측으로 관찰한 대립 유전자와 유전자형 빈도를 비교하는데 이용하였다. 경향에 교차되는 유전형 군은 비매개변수성 크루스칼-웰리스 테스트(non parametric Kruskall-Wallis test)로 조사하였다. 그외 다양성에 대하여 조정한 후, 유전형과 ADP에 대한 최대 혈소판 응집 반응간의 연관성을 다변수의 로지스틱 회귀 모델로 조사하여, 최대 응집 < 50%는 0으로 지정하고, 최대 응집 > 50%는 1로 지정하였다. 돌연변이된 대립 유전자(<7)에 대하여 동종접합성을 갖는 검사대상 소수를 고려하여, 다형성인 경우에도, 이러한 검사대상들은 회귀 분석시 이종접합체와 함께 수집하였다.

통계 테스트는 STATA7.0 소프트웨어 패키지(Stata Corp, College Station, TX)로 수행하였고, P 값 <0.05 차이는 통계학적으로 유의성 있는 것으로 간주하였다.

결과

ADP-유도된 혈소판 응집의 다양성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 98명의 건강한 지원자로부터 일주일 간격으로 수득한 각각 2개의 시료를 테스트하였다. 도 2는 두번의 임검시 구연산화된 PRP상의 2 uM ADP에 대한 최대 응집 반응을 비교한 것이다. 2개 이상의 유전자형 군이 동정되었다. 47명의 검사대상(48.0 %)에서는 두번의 임검 모두에서 50% 이하의 최대 응집을 나타내었다. 또한 상기 군의 43명(91.5%)은 가역적 초기 단계로 일관되는 응집 양상을 나타내었다. 한편, 29명(29.6%)에서는 두번의 임검 모두에서 최대 응집은 50 % 이상이었으며, 이들 군에서의 28명(96.5%)은 ADP-유도성 응집의 비가역적 이차 단계를 나타내었다. 두번의 임검간에 최대 응집이 안정적이므로(r²=77%, P < 0.001), 이후 분석시 각 검사대상에 대한 평균값(이하 최대 응집으로 언급함)을 이용하였다.

시간에 따른 ADP 반응 안정성과 함께 혈소판 응집에서의, 이렇듯 두 종류로 구분되는 표현형 군의 실재는, 혈소판 응집에 대한 ADP 작용을 유전적으로 조절할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 모집단 연구에서 P2Y₁₂ 유전자를 분석하였고, 2개 이상의 엑손은 ATG 코돈 상위에 위치하는 약 1700 bp의 하나의 인트론에 의하여 분리되어 있음을 발견하였다(도 1). 엑손2는 전체 342개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호한다. 6개의 염기(nt) 반복 서열(표 1)로 인하여, 엑손1의 3'말단과 엑손2의 5' 개시 부위를 정확하게 결정할 수 없었다.

본 발명자들은 3개의 SNP와 하나의 단일 뉴클레오타이드 삽입 다형성(표 2), 즉 H1 및 H2 일배체형을 발견하였다.

H2 일배체형은 ADP에 대한 증가된 최대 응집 반응과 연관성이 있어, H2 대립 유전자 비보균자(H1/H1, n=74)의 중간치는 34.7 %이고, 하나의 H2 대립 유전자 보균자(H1/H2, n=21)의 중간치는 67.9 % 이고, 두개의 H2 대립 유전자 보균자(H2/H2)의 중간치는 82.4 % 이다(도 3, P=0.0071). 다변수 로지스틱 회귀 분석은 상기 연관성에 대한 교차비(OR)(OR 3.3, 95% Cl :1. 1-10. 4)는 나이, 체중지수, 혈소판 수치, 평균 혈소판 부피, 백혈구 수치, 피브리노겐, PT, aPTT 및 PI^A1/PI^A2 유전자형에 대한 조정 이후 실제적으로 변화되지 않는 것으로 확인되었다. C34T 다형성은 ADP에 대한 최대 응집 반응과는 연관성이 없었다.

H2 일배체형과 엑손1 및 2 사이에 위치한 인트론의 가능한 스플라이스 다양체를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 H1/H1(n=3), H1/H2(n=3) 및 H2/H2(n=3) 유전형을 갖는 지원자에서 분리한 혈소판 mRNA의 역전사를 통하여 수득하고, P2Y₁₂ cDNA를 증폭 및 서열분석하였다. 뉴클레오타이드 서열 분석으로 변이, 일배체형도 없는 것으로 확인되었다. 게다가 서열 프로파일은 H1/H2 대상에서 두종의 대립유전자가 모두 증폭되는 것과 일관되게 나타나, 두종의 mRNA 변이체가 전사되었음을 시사한다(데이터는 미첨부함).

H2 일배체형과 ADP-자극된 혈소판 응집간의 연관성을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 임의적으로 H2 보균자 10명, 비보균자 10명을 선별하였다. ADP-유도된 혈소판 응집은 세포외 Ca⁺⁺ 농도에 의존적인 것으로 여겨지므로(Packam etal., 1987), 저농도 Ca⁺⁺(citrate-anticoagulated PRP)를 포함하는 배지 및 Ca⁺⁺ 의 생리적 농도(hirudin-anticoagulated PRP)를 포함하는 배지에서 2 uM ADP 에 대한 최대 응집을 측정하였다. 구연산화시킨 혈액은, H2 대립유전자 보균자 및 비보균자 각각 71.5% ± 5.2% 및 50.7% ± 7.2%의 최대 응집을 나타내었다(P=0.023). 이와 유사하게, 히루딘-항응고된 PRP는, H2 대립유전자 보균자 및 비보균자 각각 53.8% ± 3.9% 및 42.8% ± 3.4%의 최대 응집을 나타내었다(P=0.034).

H2 일배체형과 아데닐레이트 사이클레이즈의 P2Y₁₂ 조절 간의 가능성 있는 연결관계를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 동일한 20명의 검사대상로부터 분리한 혈소판을 대상으로, 일로프로스트-자극된 cAMP 축적을 저해할 수 있는 ADP의 활성을 조사하였다. ADP는 H2 비보균자의 혈소판에서 ADP 1, 2 및 5 uM 농도에서 각각 135, 31% 및 37%의 농도 의존적인 방식으로, cAMP 형성을 저해하였으며(도 4), 이는 H2 보균자에서 각각 31%, 39% 및 50%인 것과 비교된다(P=0.028).

고찰

본 발명자들은 3개의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)와 하나의 뉴클레오타이드 삽입을 P2Y₁₂ 수용체 유전자에서 확인하였으며, H1 및 H2의 두가지 일배체형을 결정하였다. H2 일배체형은 ADP에 대한 반응시 최대 혈소판 응집 증가와 연관 있다. 이는 ADP에 의한 cAMP 억제를 조절하는 기작 차이와 일부 관련되어 있다.

거대 모집단 연구에서, ADP-유도된 혈소판 반응은 > 50% 응집의 바이페이직(biphasic) 반응을 생성하는데 필요한 ADP 농도라는 점에서, 중요한 변이성을 보인다(Feng etal., 1999). 본 연구에서, 98명의 건강한 지원자의 1주일을 간격, 즉, 대부분의 혈소판이 재생시 두 번 실시한 측정에서, ADP-유도된 응집은 안정적인 것으로 확인되었다. 이러한 결과들은 ADP-유도된 혈소판 응집이 유전적으로 조절됨을 나타내는 것이다.

H2 일배체형 보균자 및 비보균자간의 ADP에 대한 응집 반응 차이를 더욱 연구하기 위하여, 본 발명자들은 일로프로스트-자극화된 혈소판의 아데닐레이트 사이클레이즈 저해를 실험하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, H2 일배체형과 ADP에 의한 세포내 cAMP 농도 감소는 상호 연관성이 있음을 확인할 수 있었다.

특정 P2Y₁₂ 수용체 저해제, 예컨대 티에노피리딘계 티클로피딘 및 클로피도그렐을 이용한 실험결과, P2Y₁₂는 단지 아데닐레이트 사이클레이즈 저해와 세포내 cAMP의 연이은 감소를 초래하는 혈소판 ADP 수용체임을 확인할 수 있었다(Geiger etal., 1999). 또한 선별적 P2Y₁ 수용체 길항제들은 ADP-유도된 아데릴레이트 사이클레이즈 저해에 별다른 효과를 나타내지 않았다(Jin etal., 1998a). 따라서, 아데닐레이트 사이클레이즈-독립 기작의 관여를 밝히진 못하였으나(Kauffenstein etal., 2001), ADP 자극후 H2 일배체형 보균자 및 비보균자간의 발생되는 혈소판 cAMP 농도 차이는, 두 군에서 관찰된 최대 ADP-유도된 응집 차이에 의한 것으로 설명된다.

ADP-유도된 응집에서의 Ca⁺⁺ 농도 영향은 세척한 혈소판으로 확인되었다(Packam etal., 1987). 히루딘을 항응고제로 이용한 경우, 혈중 Ca⁺⁺ 농도는 약 1.1 mM이고, ADP는 구연산화된 PRP에 비하여 매우 적은 과립 성분 방출을 유도하였다(Mustard etal., 1975). 그러나, 최대 응집이 히루딘-항응고된 PRP에서 더욱 낮음에도 불구하고, H2 대립 유전자는 응집반응과 여전히 연관되어 있다.

ADP에 대한 혈소판 응집 반응이, H2 일배체형에서 증가되는데 관여하는 분자적 기작을 확립하여야 한다. P2Y₁₂ 유전자의 완전한 코딩 서열을 본 모집단 연구에서 스크리닝 하였기에, 단백질 구조에 영향을 미치는 아미노산 치환을 배제할 수 있다. 또한 두가지의 일배체형에 대한 cDNA 분석으로 엑손1-엑손2 정션(junction)에서 정상적인 서열을 확인하여, 스플라이스 다양성을 배제할 수 있었다. 따라서, 혈소판 표면상 수용체 수적 증가는 H2 일배체형과 ADP에 반응하는 혈소판간의 연합을 가장 잘 설명한 것이다. 인트론 및 엑손의 인핸서 부위에서의 다형성은, 전사 효율 및 단백질 합성양을 증대시키는 것으로서, 그외 다른 유전자에서 설명된 바 있다(Scohy etal., 2000; Watakabe etal., 1993).

실시예 2: 최말단 말초 동맥 질환(PAD)과 H2 일배체형간의 연관성

방법

70살 이하의 백인계 PAD 남성 환자를 파리에서 모집하였다. PAD 환자는 발목/팔의 심장 수축기 혈압이 <0.90인 하지에 죽상경화증 증상을 갖거나 또는 이전에 외과적 또는 혈관내 혈관재형성 경험이 있는 하지 죽상경화증 증상 경력을 갖는 특징으로 구분된다. 대조군 검사대상은 정맥 질환 경력이 없으며, 이들은 기존 혈관 질환에서 유전적 위험 인자 연구(Arnaud etal., 2000)에서 설정한 대조군인 703명의 백인 남성들 중에서 임의적으로 선별하였다. 필요한 검사대상 수는 실시예 1에서 언급한 바와 같이, P2Y₁₂ H2 일배체형의 대립 유전자 빈도를 근간으로 산출하였고, 교차비 2 이상을 검출할 목적으로 산출하였다. α=0.05 및 β=0.20을 갖는 150건의 사례와 300건의 대조군이 본 발명에 필요하였다. 2년여간에 거쳐, 185건의 사례를 수집하였고, 331건의 대조군과 매치하였다. 하나의 대조군과 각각 매치한 38건의 사례를 제외하곤, 각 사례는 2건의 대조군과 매치하였다. 사례군과 대조군에 속하는 검사대상들로부터 자필 동의서를 받았으며, 연구 계획은 지역 윤리 위원회로부터 승인받았다.

P2Y₁₂ 유전자의 H2 대립유전자는 실시예 1에 언급한 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 및 서열분석으로 결정하였다.

결과 및 고찰

표 3은 사례군과 대조군의 특징을 요시한 것이다(도 3)

표 3: 검사대상 특징들. 수치는 평균 + 표준편자 또는 각 군에 대한 퍼센트로 나타내었다. LDL 및 HDL, 저 및 고 밀도 지질단백질; BMI, 체중지수.

나이(년)현재 및 과거 흡연자(%)고혈압(%)지질 감소 치료(%)총 콜레스테롤(mmol/L)LDL 콜레스테롤(mmol/L)HDL 콜레스테롤(mmol/L)트리글리세리드(mmol/L)당뇨병(%)공복시 혈당(mmol/L)무증상(%)간헐절뚝거림(%)임계허혈(%)혈관재생 경력(%)발목/팔의 수축기 혈압 비율심장혈관질환(%)뇌혈관질환(%)	사례군 대조군 P n=184 N=330
	57.1 ± 7.2 56.7 ± 7.6 0.6 97.8 47.0 <0.0001 43.5 16.1 <0.0001 43.0 8.4 <0.0001 4.97 ± 1.23 6.10 ± 0.93 <0.0001 3.04 ± 1.03 3.94 ± 0.87 <0.0001 1.09 ± 0.33 1.54 ± 0.41 <0.0001 1.96 ± 1.35 1.41 ± 0.87 <0.0001 24.5 8.5 <0.0001 6.5 ± 2.4 5.9 ± 0.7 <0.0001 10.3 75.6 14.1 55.4 0.64 ± 0.14 23.9 10.4

두 군은 흡연상태, 고혈압 및 당뇨병에서 유의할만한 차이가 있었다. 고콜레스테롤혈증은 양 군에서 거의 유사하였다. 사례군에서는 지질 감소 약물 치료를 받는 경우가 많았으며, 총 및 LDL 콜레스테롤 수치가 낮았다. 간혈절뚝거림과 심장혈관질환 또는 국소 뇌혈관질환을 앓는 PAD 환자는 31%에 해당하였다. PAD 환자들 중, 30%가 1개 이상의 H2 대립 유전자를 보유하고 있으며, 대조군(p=0.03)은 21%이었다. 로지스틱 회귀 결과를 표 4로 나타낸다.

표 4. PAD에서 일정 및 다변수 교차비로 나타낸, 사례군과 대조군에서의 P2Y₁₂ H1/H2 일배체형의 유전자형 빈도. H1/H2 및 H2/H2 군은 OR 계산시 함께 하였다. 다변수 교차비 분석은 방법에서 언급한 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 흡연을 대상으로 조정하였다.

	사례군n=184	대조군n=330	일변수 OR(95% CI)	P 값	다변수 OR(95% CI)	P 값
H1/H1(n)H1/H2(n)H2/H2(n)	129514	262599	1.6(1.1-2.5)	0.019	2.2(1.3-3.7)	0.004

H2 대립유전자는 일변수 분석시 OR=1.6으로, PAD와 관련성이 있었다. 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 흡연과 같은 통상적인 심혈관 위험 인자로 조정하면, 이러한 관련성은 OR=2.2로 더욱 강화된다(P=0.004).

이는 기능적 P2Y₁₂ 유전자 다형성과 죽상경화증간의 연관성을 보인 최초의 연구이다. P2Y₁₂는 PAD 환자에서 혈전성 합병증을 도출하는 연속단계에서 매우 중요한 단계이다.

H2 일배체와 PAD의 연관성은 죽상경화증에서의 혈소판 기능을 부각시킨다.

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Claims (11)

1. 검사대상에 대한 혈전증 발병 위험도의 생체외 결정방법으로서, P2Y₁₂ 수용체의 인트론(서열번호 1)의 139, 744 및 801 위치와 엑손2(서열번호 2)의 52 위치에서의 다형성을 동정하는 단계를 포함하며, 인트론 139, 744 및 801 위치에 각각 T 존재, C 존재 및 A 삽입과, 엑손2의 52위치에 T 존재가 동시에 이루어지는 것을 H2 일배체형이라 하며, 1개 이상의 H2 대립 유전자가 존재하는 경우 H2 대립유전자가 없는 대조군 검사대상에 비하여 높은 혈전증 발병 위험도를 의미하는 것임을 특징으로 하는, 혈전증 발병 위험도의 생체외 결정방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혈전증은 동맥 혈전증인 것을 특징으로 하는 혈전증 발병 위험도의 생체외 결정방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 H2 일배체형이 1개이상의 대립 유전자에 존재한다는 것은 또한 말초 동맥 질환(PAD) 발병 위험도의 증가를 추가로 나타내는 것을 특징으로 하는 혈전증 발병 위험도의 생체외 결정방법.
4. 티에노피리딘 치료법에 민감성을 결정하는 생체외 결정방법으로서, P2Y₁₂ 수용체의 인트론(서열번호 1)의 139, 744 및 801 위치와 엑손2(서열번호 2)의 52 위치에서의 다형성을 동정하는 단계를 포함하며, 인트론 139, 744 및 801 위치에 각각 T 존재, C 존재 및 A 삽입과, 엑손2의 52위치에 T 존재가 동시에 이루어지는 것을 H2 일배체형이라 하며, 1개 이상의 H2 대립 유전자가 존재하는 경우 H2 대립유전자가 없는 대조군 검사대상에 비하여 티네오피리딘 치료법에 대하여 민감성이 낮음을 의미하는 것을 특징으로 하는, 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성을 결정하는 생체외 결정방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 티에노피리딘 치료법은 티클로피딘 또는 클로피도그렐을 이용한 치료법인 것을 특징으로 하는 티에노피리딘 치료법에 대한 민감성을 결정하는 생체외 결정방법.
6. 혈전증 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 1 종 이상의 일배체 다형성을 동정하는 생체외 동정방법으로서, P2Y₁₂ 수용체 유전자의 인트론(서열번호 1) 139, 744 및 801 위치와 엑손2(서열번호 2) 52 위치 주변 부위들 중 1곳 이상의 부위에 대하여 생물학적 시료의 게놈 DNA를 분석하는 단계를 포함하며; 인트론 139, 744 및 801 위치에 각각 T 존재, C 존재 및 A 삽입과, 엑손2의 52위치에 T 존재가 동시에 이루어지는 것을 H2 일배체형이라 하고, 1개 이상의 대립 유전자의 존재한다는 것은 대조군 검사대상에 비하여 높은 혈전증 발병 위험도 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성을 의미하는 것을 특징으로 하는, 혈전증 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 1 종 이상의 일배체 다형성을 동정하는 생체외 동정방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 분석은 생물학적 시료로부터 추출된 게놈 DNA에 대하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 혈전증 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 1 종 이상의 일배체 다형성을 동정하는 생체외 동정방법.
8. 제 6항 또는 7항에 있어서, 상기 분석 단계는 게놈 DNA의 상기 부위(들)를 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전증 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 1 종 이상의 일배체 다형성을 동정하는 생체외 동정방법.
9. 제 6항 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 P2Y₁₂ 수용체의 다형성은 서열분석에 의하여 동정되는 것을 특징으로 하는, 혈전증 또는 티에노피리딘 치료법에 대한 낮은 민감성과 연관된 P2Y₁₂ 수용체의 1 종 이상의 일배체 다형성을 동정하는 생체외 동정방법.
10. 인트론 139, 744 및 801 위치에 각각 T 존재, C 존재 및 A 삽입과, 엑손2의 52위치에 T 존재가 동시에 이루어진 P2Y₁₂ 유전자 서열을 포함하는, P2Y₁₂ 수용체를 암호화하는 분리된 핵산.
11. 제1항 내지 제6항중 어느 한항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 인트론(서열번호 1) 139, 744 및 801 위치, 및/또는, 엑손2(서열번호 2)의 52 위치들 중 1곳 이상을 포함하는 P2Y₁₂ 유전자의 전체 또는 일부를 특이적으로 증폭하는 한쌍의 뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.