JPH11511021A

JPH11511021A - ｔ−ＰＡ多型および血栓関連疾患の危険度の診断におけるその用途

Info

Publication number: JPH11511021A
Application number: JP9508961A
Authority: JP
Inventors: クラフト，コルネリス; ヘロツベー，デイダリツク・エヘベルタス
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1995-08-21
Filing date: 1996-08-19
Publication date: 1999-09-28
Also published as: EP0846185A1; DE69636367D1; EP0846185B1; DE69636367T2; US5994080A; AU6822796A; WO1997007240A1

Abstract

(57)【要約】血餅形成は、心筋梗塞における主要事象である。凝固の増加とは別に、血餅溶解の不全により、望ましくない冠状動脈血栓症が誘発されることがある。プラスミンは、フィブリン凝塊の分解に不可欠である。組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼである。t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu挿入／欠失多型と心筋梗塞の危険度との関連性を評価した。記録された心筋梗塞の病歴を有する被験者（n=162）および対照（n=258）を、ロッテルダム研究（55歳以上の7983人の被験者の集団に基づくコホート研究）から選び出した。対立遺伝子頻度は、挿入対立遺伝子（t-PA Alu-h I）では0.54、欠失対立遺伝子では0.46であり、ハーディー・ワインベルグ平衡にあった。挿入に関してホモ接合である被験者（n=138）では、欠失に関してホモ接合である被験者（n=75）と比較して、心筋梗塞の被験者が２倍を超えていた（2.04の相対危険度（95％ CI 1.03〜4.03）、年齢、性、喫煙、全コレステロール、HDLコレステロール、収縮期および拡張期血圧およびボディ・マス指数に関して補正）。本発明者らの結果は、t-PA遺伝子の特定の対立遺伝子（t-PA Alu-h I）と心筋梗塞の発生との関連性に関する強力な証拠を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】t-PA 多型および血栓関連疾患の危険度の診断におけるその用途緒言血餅形成は、心筋梗塞、末梢血静脈中の血栓、脳梗塞などの血管疾患の急性発現の主要事象である。凝固の増加とは別に、血餅溶解の不全により、望ましくない冠状動脈血栓症が誘発されることがある。血餅による永久的閉鎖の前に、血餅が形成され、ついで溶解されるある程度の期間が認められる場合が多い。血管の閉塞および再開口のこの段階では、血餅溶解または抗凝固の系（フィブリン溶解）が、重要な役割を果たしている。厳密な性質は未だ明らかではないが、明確な梗塞においては、凝固衝撃は、フィブリン溶解系の反応（すなわち血餅溶解反応）より、明らかに強力である。タンパク質分解酵素プラスミンは、フィブリン凝塊の分解に不可欠である。組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼである。t-PAは、今や、急性心筋梗塞の大多数の症例の治療剤として広く受け入れられている¹。それは、高用量で投与されると、閉鎖性血栓を即座に分解する。t-PAは、フィブリン溶解の最も重要な活性化因子の１つとみなされており、抗血栓症活性を有することが公知である（このことは、参照文献25および26などのt-PAに関する多数の特許公報および他の刊行物で示されている）。最近の比較的長期にわたる研究において、血漿中の内因性t-PA活性レベルの減少が、狭心症患者における心筋梗塞の危険度の増加²および再発性心筋梗塞³と関連している可能性があることが示されている。一方、血漿中の内因性t-PA抗原濃度の増加も、再発性心筋梗塞の危険度の増加⁴、狭心症および冠状動脈狭窄症の患者における心臓血管事象^5,6、および健康な男性における心筋梗塞の危険度⁷と関連している。後者を裏付けるものとして、t-PA抗原と遊離t-PAの阻害因子（いわゆるプラスミノーゲン活性化因子阻害因子(PAI-1)抗原⁸）との濃度間の有意な正の関連性が、t-PA抗原濃度の増加がかなりのt-PA/PAI-1複合体が循環していることを表しうることを反映していると示唆されている。したがって、高濃度のt- PA抗原は、フィブリン溶解活性の増加でなく減少を示すのであろう。t-PA阻害因子（PAI-1）の産生の増加により、t-PA活性はほとんど中和されるであろう。したがって、t-PA濃度の増加の大部分はこのように不活性なt-PA-PAI-1複合体をもたらすであろうが、PAI-1の増加が生じ、したがってその増加が、危険度の実際の原因となりうる。実際、血漿濃度およびPAI-1活性の増加は、危険度を予測するものであることが示されている。最近、PAI-1の増加に関する遺伝も、危険度を予測するものであることが示された。Eriksson P.ら²⁴は、例えば、自体公知の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド融解技術によるPAI-1プロモーター領域内の4G/5G多型に関する遺伝子型の決定について記載している。4G対立遺伝子は、より高い血漿PAI-1活性と関連していた。このように、このグループは、心筋梗塞におけるPAI-1の独立した病因学的役割に関する証拠を提供している。 Iacoviello L.らの文献²³には、血栓症の家族歴と急性心筋梗塞（AMI）との関連性が示唆されている。さらに、フィブリン溶解性の変化が、虚血性血管疾患の危険度と相関することが示唆されている。GISSI-2研究集団から選ばれたAMI患者群において、t-PAレベルが調べられた。AMIエピソードの６ヶ月後、血栓症の家族歴を有さないMI患者と平行して、血栓症の家族歴を有する患者（65歳以前にMI および／または発作に罹患した少なくとも２人の１親等親族）が調べられた。その研究の結果は、血栓症の家族歴を有する群におけるt-PA抗原レベル（10.1±0.6ng/ml，平均±SE．n=53）は、家族歴を有さない群におけるレベル（10.4±0.6ng/ml，n=53）と有意差がないというものであった。不思議なことに、これに反して、MIの家族歴のみを有する患者について検討した場合には、t-PA抗原レベルは、それぞれの対照群より有意に低かった(7.5±4.4対11.1±3.5ng/ml，t=2.6，p<0.02，n=16)。調べられたすべての群で、t-PAおよびPAI活性ならびにPAI-1抗原レベルにおける相違は全く認められなかった。 AMI集団におけるt-PA遺伝子のイントロンh内の挿入／欠失（I/D）多型が、Iac ovielloらにより研究されている。予備的データから、両方の対立遺伝子の頻度は、それぞれ、0.51および0.49であり、遺伝子型分布はハーディー・ワインベルグ平衡にあることが示された。I/D多型は、t-PA活性レベルと関連していたが（p <0.03）、t-PA抗原濃度とは関連していなかった。Ｄ対立遺伝子は、より高レベルのt-PA活性と関連していた。不思議なことに、要するに、t-PA抗原レベルの減少が、AMIの家族歴と関連していることが見出されたのである。血栓症の家族歴を有する患者においては、このマーカーの発現は、その血栓症の血管部位により異なるようであった。 t-PAおよびPAI-1の血漿レベルから得られる情報が、限定された不可解なものにすぎないことは、前記から明らかである。それらのデータは、t-PA抗原の増加と虚血性事象の危険度との関連性を集団研究において示しており、一方、心筋梗塞の家族歴を有する家族では、t-PA抗原はより低い。Iacovielloは、疾患と遺伝学との間の関連性を見出していない。家族歴を有するおよび有さない心筋患者におけるDおよびI対立遺伝子の頻度は異ならない。どうやら、家族研究の結果は、集団研究のものと比較できないようである。この研究のもう１つの問題は、より高いt-PA活性とD対立遺伝子との関連性を示すがt-PA抗原に関する結果とならないことを示す分析結果が、すべてのAMI患者（すなわち、家族AMI／血栓症を有するおよび有さないAMI患者）で得られたことである。t-PA抗原はこれらの群内で異なるため、その結果は、患者がこのように混合されている限り議論することができない。血漿中に局所的過程が認められるという仮定が未解決なものであるということのほかに、フィブリン溶解系と動脈疾患との関連性を研究する場合に血漿レベルを用いることには、もう１つの問題がある。t-PA抗原および活性の真の血漿レベルは、他の多数の止血因子と同様、測定が困難である。それらは、他の多数のパラメーター（特にPAI-1）により影響される⁹。このため、動脈疾患の発生を研究する場合にフィブリン溶解性パラメーターの役割を検討する可能性が限定されてしまう。したがって、血管疾患の危険度の増加と関連した潜在的パラメーターを分析するための別のアプローチが必要となる。別のアプローチは、遺伝学のものである。遺伝子型は、信頼度が高く、比較的容易に測定でき、外的要因に影響されない。現代技術においては、遺伝的構成の異常の検出および分析のための広範な信頼しうる技術が提供されている。特に、核酸分析に基づく多数の診断方法が、種々の疾患に関して公知である。100を超える疾患について、疾患性突然変異をＤＮＡ診断技術により示すことができる。具体例としては、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、および血栓溶解性疾患に関連した第V因子ライデン（Leiden）突然変異第V 因子が挙げられる（PCT EP95/00553）。 1991年に、ポリメラーゼ連鎖反応および直接シークエンス法を用いて、Alu t-PA遺伝子のイントロンhについてAlu挿入／欠失（I/D）多型が同定された¹⁰。小さいほうの655bpの対立遺伝子は、イントロンh内に位置する完全な最初のAlu配列の欠失の結果生じたものである。この対立遺伝子の形成の仮説的な過程として、すべり（slipped）誤対合のメカニズムが示されている。t -PA Alu関連RFLPは、PCR産物をアガロースゲル上にローディングし、ついで臭化エチジウム染色することにより、直ちに可視化することができる。ヒトt-PA遺伝子内の多型断片は、EcoRI、XmnIおよびTaqIによる消化で検出できるであろう。イントロンhとエキソンIXとの中に２つのAlu挿入断片を含むヒトt-PA遺伝子断片 25.201〜26.200の配列が得られている。最初のAlu挿入は、25.272〜25.573に位置する。第２のAlu挿入は、25.762〜25.927に位置する。エキソンIXは、25.941 〜26.025に位置する。この遺伝子の構成は、Degenらに記載されている²⁷。また、この文献には、「この遺伝子全体にわたり多数のAluコピーが分布しているにもかかわらず、遺伝的t-PA欠損症の原因となるAlu組換え事象が未だ認められていないことは注目に値する。これは、グロビン遺伝子および低密度リポタンパク受容体遺伝子においてAlu−媒介再編成が頻繁に認められていることに反するものである」と記載されている。そのような多型の診断用途に関しては、何ら言及されていない。その文献は、実際の現象およびそれが生じる様態に関するものであり、その突然変異の機能に関しては何ら記載されていない。 Alu反復の現象に関するより最近の刊行物²⁹では、典型的なAlu要素は、282ヌクレオチド長であり、ポリアデニル尾部で終わる配列を有するアデニンに富むリンカーで接続されたGCに富む２つのサブユニットを含むことが明らかにされている。ヒトの半数体ゲノム１個当たり約700.000コピーのAlu要素が予想されている。実際、Alu要素は、ほとんどすべての公知タンパク質をコードしている遺伝子のイントロン内で見出される。反復配列要素の分散は、ゲノムの進化の一因となる遺伝的多様性の原因となる。Alu反復は、デノボAlu挿入、遺伝子内Alu要素のｍＲＮＡへのスプライシングなどの多数のメカニズムにより遺伝病を引き起こしうることが示唆されている。公知タンパク質コード領域の分析により、15個のコード配列内に17個のAlu挿入断片が示された。これらの３つが遺伝病を引き起こした。イントロン内のAlu要素の関連性については、進化一例以外は教示も示唆もされていない。その文献は、エキソン（すなわち、核酸のコード部分）内へのAlu挿入に関するものである。心筋梗塞の生存者におけるt-PA Alu I/D多型の研究中に全く意外にも、本発明者らは、t-PA Alu-h I対立遺伝子と冠状動脈心疾患との間の関連性を見出した。 t-PA遺伝子内には28個のAlu配列があるため、前記の説明とは別に、その関連性は驚くべきものである。これまで、これらのいずれの配列に対しても、関連付けはなされていない（Degenら，1986）。したがって、これにより、血栓形成関連疾患の危険度が異常に増加した個体または個体群の同定において診断的価値を有する試験への道が開かれたことになる。そのような疾患としては、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血栓、一過性虚血発作、痴呆、血栓症などが挙げられる。本発明方法においては、血栓形成関連疾患の危険があるヒトまたはヒトの一群を同定するために、t-PAAlu-h I対立遺伝子の存在を検出するための自体公知の任意の方法を用いることができる。より詳しくは、 t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復挿入の存在と物理的に相関した虚血性事象の危険度の増加を招く対立遺伝子内の機能的突然変異を検出する方法が、本発明の範囲内に含まれる。本方法は、１つの実施態様において、被検者のt-PA Alu-h I対立遺伝子または該対立遺伝子の一部（該一部は、Alu挿入の存在位置を含む部分である）の存在または不存在に関する被検者の核酸配列の分析を含む。あるいは、該方法は、t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復挿入の存在と物理的に相関した虚血性事象の危険度の増加を招く対立遺伝子内の機能的突然変異の存在または不存在の確認を含む。勿論、本発明の方法はまた、前記の両実施態様の組み合わせを含むものであってもよい。本発明の方法は、例えば、被験者の核酸を自体公知の方法で増幅することを含む。増幅反応は、ＤＮＡの増幅、またはＲＮＡと組み合わせたＤＮＡの増幅を含むものであってもよいし、または単にＲＮＡの増幅を含むものであってもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を増幅しうる増幅反応を用いる場合には、増幅前に自体公知の方法でDNアーゼを用いてＤＮＡを分解することができるし、あるいは、増幅された染色体核酸とｍＲＮＡから増幅された核酸とを識別するために、増幅されたＤＮＡおよび増幅されたＲＮＡの長さおよび組成が、イントロンの存在および不存在により異なるよう、増幅プライマーを選択することができる。例えば、ELGA 検出法を用いる場合は、増幅産物の長さの相違は、少なくとも45ヌクレオチドとなるべきである。したがって、ゲノム核酸よりむしろｍＲＮＡの検出が必要な場合には、増幅された染色体核酸とｍＲＮＡから増幅された核酸とを識別するためには、増幅された配列は、少なくとも１つのエキソン−エキソン結合を含まなくてはならない。NASBAはＲＮＡ標的に特に適した核酸増幅法であるため、NASBA増幅法の使用は、ｍＲＮＡを分析しようとする場合に本発明方法を実施するための好ましい実施態様だと考えられる。NASBAは、ＲＮＡ標的および細胞内ＲＮＡ（例えば、その細胞自体からのリボソームＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ）の増幅に特に適しているため、NASBAが多くのケースで好ましい。t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復挿入の存在と物理的に相関した虚血性事象の危険度の増加を招く対立遺伝子内の機能的突然変異がコード核酸内に存在する場合に、この方法が適用可能であろう。ゲノムＤＮＡの場合は、任意の公知増幅方法で十分であろう。NASBA（核酸配列に基づく増幅）、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、LCR（リガーゼ連鎖反応）およびRCR（修復連鎖反応）を含む多数の標的増幅反応が、当該分野において一般に用いられている。増幅は、例えば、実施例に例示するとおり、十分に確立されたPCR技術により適切に行なうことができる。そのような標的増幅反応は、当業者によく知られている。突然変異が位置しうる核酸伸長の５′および３′末端に隣接した核酸伸長を認識し、突然変異が位置しうる核酸伸長を増幅するのに十分な程度に該核酸伸長とハイブリダイズする特異的な１以上のプライマーを使用する必要がある。要求されるハイブリダーゼーションのストリンジェンシーも、核酸の標的増幅を行なうキットが商業的に入手可能である。また、突然変異自体が位置する核酸伸長を認識しそれとハイブリダイズするのに十分な程度に特異的なプライマーを使用することも可能である。ヒトt-PA遺伝子の核酸配列は、Degenらにより決定されており、その配列を参照して本明細書に組込むこととする。イントロンhの少なくとも一部を含むハイブリダイゼーション用核酸配列を使用すると、t-PA遺伝子内に存在する突然変異の単離および／または増幅および／またはそれに続く検出が、非常に簡単に行なえる。さらに、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅のための核酸配列のプライマーは、t-PA配列とハイブリダイズするものを選択することができる。t-PAの配列が公知であるのと同様、本発明方法でスクリーニングする突然変異の存在および性質を単離および／または増幅および／または確認するのに最適なオリゴヌクレオチド配列を選択することは、当業者の力量の範囲内に含まれる。また、本発明方法は、前記のいずれの実施態様においても、ついで、増幅された配列を検出する工程を含む。使用しうる検出マーカーは、選択する個々の実施態様に左右されるであろう。検出マーカーは、増幅反応で使用するプライマーの２つの認識部位の間のどこかに位置する配列を認識するであろう。そのような検出マーカーは、増幅された配列の一部と特異的にハイブリダイズしうる配列であってもよい。本発明方法の１つの実施態様においては、好ましくは、使用するプライマーのいずれか１つまたは検出マーカーは、t-PA遺伝子のイントロンh内の関連Alu反復の核酸配列の一部、または対立遺伝子（Alu-h I）を他の対立遺伝子から識別しうる他の任意のマーカーまたは突然変異を特異的に認識する能力を有する。好ましくは、少なくともプライマーの１つおよび／または検出マーカーは、t-PA遺伝子のイントロン h内の関連Alu反復挿入の上流または下流の増幅された配列の一部にも特異的である。もう１つの実施態様においては、それ単独で又は前記実施態様と組み合わせて、検出マーカーは、増幅反応で使用するプライマーの２つの認識部位の間のどこかに位置する配列を認識するであろう。使用しうる検出マーカーは、増幅された配列の一部と特異的にハイブリダイズしうる配列であってもよい。本発明方法の１つの実施態様では、好ましくは、使用するプライマーのいずれか１つまたは検出マーカーが、核酸配列の一部（この一部は、t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu 反復挿入の存在と物理的に相関した虚血性事象の危険度の増加を招く対立遺伝子内の関連機能的突然変異を含む）を特異的に認識する能力を有する。該機能的突然変異は、イントロンh内のAluマーカーの1000kb以内に位置するべきである。なぜなら、それは、該マーカーと物理的に連関していなければならないからである。それは、同じ染色体上に存在していなければならない。それは、必ずしもt-PA 遺伝子内に存在する必要はない。それはまた、必ずしも、t-PA遺伝子のコード領域またはt-PA遺伝子の1000kb 以内に位置する他の遺伝子と関連している必要はない。好ましくは、少なくともプライマーの１つおよび／または検出マーカーは、関連突然変異の位置の上流または下流の増幅された配列の一部に特異的である。本発明方法においては、核酸を増幅した後、突然変異の存在および所望によりその性質を検出するための自体公知の方法により、増幅核酸の分析を行なう。増幅工程の後、得られた核酸配列を、正常な配列または突然変異を保持することが知られている配列と比較し、それにより該突然変異の存在または不存在を確認することができ、その存在は、血栓関連疾患の危険度の増加を示すものである。検出すべき配列は、t-PA遺伝子のコード配列内に含まれていたり、あるいは、t-PA Alu-h I対立遺伝子上の他のどこかに含まれているかもしれない。I対立遺伝子の存在を検出することで、血栓関連疾患の危険度の増加を診断するのに十分であるが、好ましくは、Alu Iの存在と物理的に連関した虚血性疾患の危険度の増加を招く機能的突然変異を検出する。増幅すべき核酸内の特異的突然変異の存在または不存在の検出に基づく診断試験のための自体公知方法により本発明方法を実施するために、検出すべき突然変異の各側に位置する対立遺伝子の核酸配列とハイブリダイズしうるプライマーを用いる増幅を利用することができる。Ludwig らが使用したプライマーは、DおよびIイントロンh Alu対立遺伝子の両方を検出するのに十分なものである。Ludwigによる５′プライマーの５′側に位置する任意のプライマーおよびLudwigによる３′プライマーの３′側に位置する任意の３ ′プライマーも、十分なはずである。増幅を行なう当業者であれば、公知の配列データに基づき、適当なプライマーを案出することができるであろう。実施例において、本発明者らは、Ludwigが使用しているのと同様のプライマーを使用しており、使用しているプライマーは、Ludwigらが使用しているt-PA対立遺伝子の部分配列の一部に対応する。核酸のコード部分内に位置する機能的突然変異の場合、分析は、ゲノム核酸の評価に限られる必要はなく、自体公知の方法によるｍＲＮＡの分析を含んでいてもよい。 t-PA遺伝子のイントロンhのAlu反復の挿入と物理的に連関した機能的突然変異を含む突然変異対立遺伝子またはその発現産物に関してスクリーニングする場合、突然変異核酸配列またはタンパク質の存在を確認するために、ＤＮＡ技術を利用したり、あるいは抗体を使用することが可能となった。したがって、本発明は、血栓関連疾患の危険度の増加と関連した遺伝的欠損の存在に関してスクリーニングする方法であって、対立遺伝子の核酸物質内の突然変異の存在を自体公知の方法により、または該対立遺伝子の発現産物内の突然変異の存在を自体公知の方法による該発現産物の分析または該発現産物のタンパク質分解断片の分析により確認することを含んでなる方法に向けられている。したがって、本方法による分析は、該対立遺伝子の核酸レベル（例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡレベル）で、および該対立遺伝子の任意の発現産物についてタンパク質レベルで行なうことができる。本発明の方法は、核酸またはタンパク質のいずれかまたは両方のレベルにおける、機能的突然変異を含む対立遺伝子内またはその発現産物内の１以上の突然変異の検出に向けられている。前記のとおり、本発明の方法は、タンパク質をコードする核酸配列でなくタンパク質を分析することにより実施することもできる。突然変異したタンパク質の検出を、特異的抗体を使用することにより行なう場合、突然変異の存在および所望によりその性質を検出するために、突然変異を含む発現産物に対する特異的抗体を使用することが可能である。あるいは、分析すべきタンパク質をタンパク質分解により切断し、それにより、発現産物の一次核酸配列内の突然変異に対して特異的な抗体の使用を可能にする線状なまたは部分的に線状な構造を得ることも可能である。突然変異の検出のためのさらなる可能性は、アミノ酸配列分析の、より古い技術にある。突然変異していない発現産物のアミノ酸配列が判明すれば、分析すべき因子のアミノ酸配列を決定し、その配列を、対応する非突然変異因子の公知配列と比較することは非常に簡単である。しかしながら、抗体を使用することが、例えば、ELISASまたはRIASまたは当業者に公知の他の種々の免疫学的試験により突然変異の存在に関してタンパク質を分析するための簡便で効率的な方法である。突然変異を検出するためには、突然変異発現産物に対する結合能または突然変異を含む突然変異発現産物の線状タンパク質分解断片に対する結合能を有し、突然変異していない発現産物または突然変異していない発現産物の対応タンパク質分解断片に対してより低い結合親和性を有する特異的抗体を使用することができる。また、別法として、突然変異していない発現産物に対する結合能を有し、対応する発現産物および／または突然変異を含むそのタンパク質分解断片に対してより低い結合親和性を有する抗体を使用することも可能である。この場合、単離されたタンパク質またはタンパク質分解断片に対して抗体が結合しないことにより突然変異の存在が示される試験の開発が可能となる。用いる方法は、その場合の状況および試験目的にも左右されるであろう。例えば、大集団をスクリーニングする場合には、最も安価な方法を用いるのが好ましいであろう。いくつかの場合には、検出すべき突然変異を、抗体を使用して確認するのは困難であるため、核酸配列または制限断片の分析を利用するのが好ましいかもしれない。また、制限断片試験用に使用する酵素が安価な場合には、そのような試験は非常に簡単かつ安価に行なうことができ、適当であることは明らかであろう。本発明はまた、本発明方法の例示されているすべての実施態様を実施するのに必要な要素を含んでなるキットに向けられている。これは、例えば、前記の特異的抗体の１以上を含む、および／または、前記の標的増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応のための１以上のプライマーまたはプライマー対を含む試験キットを含む。特に、本発明は、t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復の存在による核酸配列の突然変異を含む核酸配列を増幅するための１以上のプライマーを含んでなるキットに向けられている。このキットは、１つの特定の突然変異またはいくつかの突然変異を検出するためのプライマーおよび／または抗体を含むことがある。本発明の方法においては、核酸物質を増幅することなく、突然変異の存在または不存在を確認することが可能である。標的増幅反応が開発される前に用いられていた、核酸上の突然変異の存在を確認するための当業者に公知の多数の技術があり、これらはすべて、本発明方法の種々の実施態様で用いることができる。例えば、分析すべき因子をコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズするのに十分な程度に特異的な少なくとも１つの核酸配列に対するハイブリダイゼーション反応により、確認すべき突然変異を検出し、ついで、このようにして単離された核酸を、該突然変異の存在および所望によりその性質を検出するための自体公知の方法で分析することができる。突然変異の存在の検出および所望により行なうその性質の検列決定反応を利用する配列分析に付して核酸配列を確認し、ついで、突然変異していない因子または突然変異因子のいずれかの公知配列とこの配列決定の結果とを比較することにより行なうことができる。また、単離された核酸配列をさらなるハイブリダイゼーション試験に付すことも可能である。さらなるハイブリダイゼーション試験は、突然変異を含む核酸物質の断片と少なくともハイブリダイズするのに十分な長さおよび特異性の対応相補的配列を有する核酸物質の伸長を使用して行ない、それにより突然変異の存在および所望によりその性質を検出する。第１ハイブリダイゼーション工程では、因子をコードする核酸を、これが突然変異しているか否かに関わらず単離するにすぎない。第２ハイブリダイゼーション工程は、単離された核酸物質上の突然変異の存在または不存在を確認するために、単離された配列を、確認しようとする実際の突然変異核酸配列の相補的配列と実際にハイブリダイズさせることを含む。この後者のハイブリダイゼーション反応は、信頼しうる結果を得るためには、厳密な条件下で行なうべきである。具体例として、特定の核酸上の突然変異の存在を確認するための２つの古典的な方法を本明細書中で説明するが、多数の公知技術が利用可能であることは当業者に明らかであろう。そのような技術は、生化学に関する種々の標準的な書籍、例えば、分子クローニングのハンドブック（例えば、Sambrookら（Sambrook，J．Frits ch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York ））Maniatis a Laboratory Manual for Molecular Cloningにおいて、十分に説明されている。また、増幅反応に付されていない単離された核酸物質の分析に関して既に例示されているとおり、配列決定反応、または突然変異を含む核酸物質の断片と少なくともハイブリダイズするのに十分な長さおよび特異性を有する相補的配列に対するハイブリダイゼーションを利用して、突然変異の存在および所望によりその性質を検出する後続の分析試験を用いて、本発明のスクリーニング方法において得られた増幅された核酸物質を分析することも可能である。あるいは、単離され所望により増幅された核酸物質の分析は、自体公知の方法によるRFLP試験を含むことが可能である。対立遺伝子形態の核酸の制限断片長の相違により、単離され所望により増幅された核酸のゲル電気泳動および染色（例えば、臭化エチジウムによるもの）により、異なる移動度のバンドがゲル上で得られる。本発明方法が、標準的なRFLP法によりt-PA遺伝子のイントロンh内のAlu挿入の存在または不存在を確認することを含む場合には、t-PA遺伝子のイントロンhのAlu I/D多型においては、存在する大きい方の断片はI対立遺伝子に相当し、小さい方の断片はD対立遺伝子に相当する。この原理は、Ludwigらの参照文献および実施例において説明されている。本発明方法は、培養細胞からの全核酸の単離、血液からの全核酸の単離、子頸管掻爬からの全核酸の単離に適用することができる。本発明方法の増幅反応で使用するオリゴヌクレオチオプライマーおよび検出マーカーが満たすべき要件は、当業者に明らかであろう。相同性の度合および適用されるハイブリダイゼーション条件に関する増幅反応プライマーおよびマーカーの通常の要件が、有効である。これは一般的には、プライマーが、増幅すべき配列の対応部分と、通常ないしストリンジェント条件下でハイブリダイズしうる少なくとも 10ヌクレオチドを含むことを意味する。これらの要件は、分子クローニングのハンドブック（例えば、Sambrookら（Sambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989 ）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，New York））に記載されている。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、適当な経費で最も信頼しうる結果を与える相同性を示すものを選択する。一般に、最適な結果は、相同性が10 0％で、オリゴヌクレオチドプローブが15〜25オリゴヌクレオチドの長さを有する場合に得られる。NASBAを用いる場合には、増幅された配列（すなわち産物）は相補鎖であり、したがって、増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドは、もとの核酸の配列に対応することになる。PCRを用いる場合には、増幅された配列（すなわち産物）は、二本鎖ＤＮＡであり、いずれの鎖の検出も行なうことができる。したがって、増幅産物の検出に使用するオリゴヌクレオチドは、増幅すべき核酸のコード鎖または相補鎖のいずれかとハイブリダイズしうる。ここで、PCR法を記載しているいくつかの一般的な参照文献を引用する。PCR反応の実施に関連したそれらの内容を本明細書に組入れることとする（PCR Technology，J. A．Ehrlich編，Stockholm Press，New York（1989）; Molecular Methods for Virus Detection，D.L．WiedbraukおよびD.H．Farkas編，Academic Press，New York(1995)．Nucleic Acid Hybridisation，B.D．HamesおよびS.J ．Higgins編，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)）。本発明はまた、個体または個体群において血栓関連疾患の危険度が増加しているか否かを確認するための診断キットであって、該キットが、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、該プライマーが、真核生物種のt- PA対立遺伝子の核酸を自体公知の方法で増幅させる能力および／またはt-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復挿入の存在と物理的に相関した虚血性事象の危険度の増加を招く対立遺伝子内の機能的変異を含む核酸を増幅させる能力を有し、該真核生物種が、好ましくは、ヒトであることを特徴とする診断キットに向けられている。そのようなキットはさらに、増幅された配列の検出マーカーを含む。本発明のキットの検出マーカーまたは本発明の方法で使用する検出マーカーとしては、増幅された配列とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド配列が適切かもしれない。検出マーカーはまた、増幅された配列を特異的に認識しうる抗体であってもよい。検出マーカーは、核酸配列のマーカーに当該分野において一般的に使用される検出可能な標識（例えば、酵素、色素原基質、放射性同位体、蛍光基など）を有していてもよい。また、増幅された配列を自体公知の方法で特異的に固定化し、ついで、洗浄工程を含むまたは含まない自体公知の方法により、固定化配列に結合するさらなる化合物を使用し、ついで検出可能なシグナルを得ることにより、固定化された増幅配列を検出する能力を、検出マーカーが有することもある。この型の試験の実施は、核酸の検出を行なう当業者には日常的なものである。検出すべき増幅配列のみがサンプル中に存在するよう、あるいはそうでなければ、増幅配列の組み合わせが存在するが、検出すべき増幅配列のみを検出マーカーが検出するよう、該キットは、プライマーおよび検出マーカーの組み合わせを含む。適当な組み合わせは、検出すべき対立遺伝子または検出すべきその特異的部分が判明している核酸配列の比較に基づき、より詳しくは、t-PA対立遺伝子に関する種々の配列の比較に基づき、特に、イントロンh Alu IおよびD対立遺伝子の配列の関連部分の比較に基づき、容易に確認することができる。特に、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を増幅するために本発明のキットを使用しようとする場合には、増幅された配列が少なくとも１つのエキソン−エキソン結合を含むよう、オリゴヌクレオチドプライマー対を選択する。個体または個体群において血栓関連疾患の危険度が増加しているか否かを確認するための本発明の診断キットは、突然変異が存在すると予想される領域を含む核酸を増幅するための１以上のプライマー対を含む。また、そのような増幅反応に通常要求される他の任意の成分（例えば、増幅された核酸を検出するためのプローブ）も含まれる。増幅は、PCR、NASBAまたは当業者に公知の他の任意の核酸増幅反応により行なうことができる。そのような増幅反応を行なう方法は、増幅が必要な他の診断試験の方法と同様であり、その技術に関する一般的な知識、および関心のある遺伝子に関する種々の対立遺伝子（特に、機能的突然変異を含む対立遺伝子）の核酸配列から当業者に明らかであり、本明細書中のどこかで説明されている。個体または個体群において血栓関連疾患の危険度が増加しているか否かを本発明方法で確認するための診断キットもクレームされており、該キットは、RFLP断片サイズ分析（すなわち、被検核酸が、t-PA遺伝子のhイントロン内にAlu挿入を有するI対立遺伝子形態の核酸であるか否かの確認、および／または、被検核酸が、t -PA遺伝子のイントロンh内のAlu挿入の存在と物理的に連関しており血栓関連疾患の危険度の増加を招く機能的突然変異を含むか否かの確認）を可能にする検出マーカーを含む。個体または個体群において血栓関連疾患の危険度が増加しているか否かを本発明方法で確認するための診断キットもクレームされており、該キットは、t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu挿入の存在と物理的に関連した機能的突然変異に関する検出マーカーを含む。そのような診断キットは、t-PA遺伝子のイントロンh内のAlu反復の存在に関する検出マーカーを含むのが適当かもしれない。そのような検出マーカーは、イントロンhの関連部分を特異的に認識するよう、当業者が容易に誘導することができる。検出マーカーはまた、イントロンh内の挿入と関連した機能的突然変異を含む配列を特異的に認識するかもしれない。RFLPを行なうことを意図した診断キットの場合には、検出マーカーは、突然変異を含む断片であると予想される断片の長さに対応した長さを有する核酸断片であってもよい。突然変異の存在の確認に基づき、急性血管疾患の予防的摂生または特異的な抗血栓症治療を強化すべき個体を選択することが可能となる。以下の実施例では、t-PA遺伝子内のAlu挿入断片と、血栓関連疾患の危険度の増加との関連性が得られたことについて例示する。検出方法に加えて、血栓関連疾患の危険度の増加を招く対立遺伝子自体も、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。そのような対立遺伝子は、t-PA遺伝子のイントロンh内の追加的なAluマーカーの存在と物理的に関連しているに違いない。そのような対立遺伝子は、危険度の増加を招く機能的突然変異を含む。そのような対立遺伝子は、Alu-h-I-t-PA対立遺伝子の1000kb以内のゲノム核酸内に位置する。本発明で特許請求する対立遺伝子は、Ludwigらの核酸配列を含まない。Lu dwigらの対立遺伝子を本発明方法で使用することは、保護範囲内に含まれない。実施例方法集団ロッテルダム研究（Rotterdam Study）は、55歳以上の7983 人の被験者の集団に基づく研究である。1990年３月から1993年７月まで、オランダ国ロッテルダムの郊外のオモード（Ommoord）に住む55歳以上のすべての被験者に参加を求めた。全体の回答率は、78％であった。該研究の原理および目的については、他の文献に記載されている¹。症例および対照の選択症例患者（n=162）は、胸痛の病歴とは無関係にModular ECG Analysis System¹² の診断分類系を利用して心電図上の梗塞の存在に基づき、ロッテルダム研究の参加者から選択された。対照被験者（n=258）は、心筋梗塞の症例が見出された同じ５年の年齢層から選び出され、心臓血管疾患の病歴（すなわち、心筋梗塞、狭心症、発作の病歴）がなく、正常な心電図を有し、末梢動脈疾患の病歴がない研究参加者のサンプルを構成した（くるぶし／腕指数＞0.9）¹³。すべての被験者に対する包含基準は、血液サンプルの入手可能性であった。測定被験者全員の家を訪問した。現在の健康状態、病歴（心筋梗塞および発作を含む）、薬物使用および喫煙行動に関する情報を、ローズ心臓血管アンケート（Ro se cardiovascular questionnaire）のオランダ版¹⁴を含むコンピュータ化されたアンケートにより得た。その家庭面談の後、研究センターへ２回訪問してもらった。それらの訪問中に、いくつかの心臓血管の危険指標を測定した。身長および体重を測定し、ボディ・マス指数（kg/m²単位）を計算した。座っている時の血圧を、右上腕でランダムゼロ（random zero）血圧計により測定した。１回で得られた２つの測定値の平均を用いた。くるぶし（後脛骨動脈）の収縮期血圧を、くるぶしの真上の成人サイズの標準カフおよび８MHzドップラートランスドューサにより、半上臥（±45％）位で測定した¹⁵。くるぶし／腕指数は、腕の収縮期圧に対するくるぶしの収縮期血圧の割合である。末梢動脈疾患は、右または左のくるぶし／腕指数が0.9未満であることと定義した。採血および保存については、他の文献¹⁶に記載されている。血清全コレステロールは、自動化酵素的方法により測定した¹⁷。高密度リポタンパクコレステロール濃度は、沈殿後に同様に測定した。該遺伝子をクローニングした後、t-PA遺伝子の第８イントロン内のAlu反復の存在／不存在から生じる挿入／欠失（I/D）多型を、合計420人の被験者で同定した¹⁸。統計分析潜在的交絡因子の平均および比率を、合計３つの遺伝子型について計算し、群間の差を分散の分析で調べた。挿入に関するヘテロ接合体およびホモ接合体についての心筋梗塞の相対危険度（差異比として評価）を、欠失に関するホモ接合体と比較して、ロジスティック回帰を用いて計算した。年齢、性、全およびHDLコレステロール、ボディ・マス指数、収縮期および拡張期血圧、喫煙などの潜在的交絡因子について補正するために、多変量ロジステッィク回帰を用いた。結果は、95％の信頼区間で表す。t-PA遺伝子多型に起因しうる心筋梗塞の症例の比率（母集団寄与危険度）を評価するために、本発明者らは、Miettinen¹⁹が記載している方法を用いた。 t-PA遺伝子の967/655bp断片の増幅は、5′プライマーとして5′-TCCGTAACAGGA CAGCTCA-3′（配列番号１=nt 25.216-25.234）（Isogenから入手）を、3′プライマーとして5′ACCGTGGCTTCAGTCATGGA-3′（配列番号２=nt 26.181-26.162）（ Isogenから入手）を使用して、既に記載されているのと実質的に同じ方法で行なった。該増幅は、20mM TRIS-HCl(Gibco BRLから入手)，pH8.4、50mM KCl、１mM MgCl₂（Gibco BRLから入手）、0.05％（v/v）洗浄剤（ポリオキシエチレンエーテル）（min 99.5%）（Gi bco BRLから入手）、0.05％DMSO（Merckから入手）、0.2mMの各ヌクレオチド三リン酸（Pharmaciaから入手）、100ngの各プライマー、100ngのＤＮＡおよび1U Taqポリメラーゼ（Gibco BRL）を含有する50マイクロリットルの混合物を94℃で４分間の変性に付し、ついで94℃(１分)、58℃（1.5分）、72℃（２分）の32サイクル、ついで最後に72℃、４分に付す。使用したPCR装置は、BiozymのHYBRID Omnigeneであった。２マイクロリットルのSLMローディング混合物を含む20マイクロリットルのPCR産物を、100V/500mAにて２％アガロースゲル（pronaroseゲル）上で分離した。断片の同定は、100bpのラダーのマーカーで行なった。結果 162人の症例被験者および258人の対照被験者について、完全なデータを得ることができた。研究集団の選択されたベースライン特性を、表１に記載する。種々の遺伝子型により分類された群の間で、心臓血管危険因子における有意差は、全く認められなかった。対照被験者では、対立遺伝子頻度は、欠失を有する対立遺伝子については0.46、挿入を有する対立遺伝子については0.54であり、ハーディー・ワインベルグ平衡にあった。致命的でない心筋梗塞の粗相対危険度および補正相対危険度を、表２に記載する。欠失に関してホモ接合である被験者に対する挿入に関してホモ接合である被験者についての心筋梗塞の相対危険度は、2.04（1.03〜4.03）であった（年齢、性、喫煙、ボディー・マス指数、収縮期および拡張期血圧、全およびHDLコレステロールに関して補正）。ヘテロ接合の被験者についての補正相対危険度は、1.42（95％ CI 0.74 〜2.73）であった。心筋梗塞の全症例のうち、33％は、挿入に関するホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかに起因すると評価された。図１は、TPA Alu反復／欠失多型の同定を示す。m：100bpのラダーを有するマーカーレーン、１：陰性PCR対照、２：967bpのPCR断片を示す挿入対立遺伝子に関してホモ接合の個体、３：挿入および欠失の対立遺伝子に関してヘテロ接合の個体、４：655bpのPCR断片を示す欠失対立遺伝子に関してホモ接合の個体。考察本発明者らは、t-PA遺伝子の多型変異が、他の危険因子とは無関係に、致命的でない心筋梗塞の危険度と強く関連しているという証拠を提供する。t-PAは、動脈内フィブリン凝塊の分解においてきわめて重要な役割を果たしているので、この関連性は、十中八九、フィブリン溶解系の、心筋梗塞における冠状動脈血栓症に適切に反応する能力の遺伝的に決定された欠損を反映するものである。本発明者らが知る限りでは、これは、t-PA遺伝子と心筋梗塞との関連性を検討した最初の研究である。本発明者らの結果が母集団の不均質性によるとは考えられないであろう。症例および対照は、7983人の被験者による単一センター集団に基づく研究から選び出した。本発明者らの研究に参加した全被験者はコーカソイドであり、対立遺伝子頻度は、他の研究者ら²⁰により認められているものと相違しなかった。本発明者らの研究の限界は、その断面的計画（cross-sectional design）の性質により、それが致命的でない心筋梗塞に限定されたことである。しかしながら、t-PA遺伝子は、心筋梗塞の致命性に影響を及ぼさないと考えられる。t-PAは、冠状動脈血餅溶解の不全を介して作用すると考えられており、t-PA活性不全の影響は、致命的心筋梗塞の危険度を減少させるよりむしろ増加させるであろう。したがって、認められた関連性は、真の関連性より過小評価されているかもしれない。たとえ本発明者らが、t-PA遺伝子と、致命的でない心筋梗塞との関連性を同定したとしても、危険度の増加の背後にあるメカニズムは依然として未知のままである。t-PAは、フィブリン凝塊溶解において非常に重要であることに加え、細胞移動を含む他の種々の細胞過程においても何らかの役割を果たしている^21,22。いくつかの研究では、血漿中のt-PA抗原の増加およびt-PA活性の減少が、心筋梗塞の危険度の増加と関連していた^4,6,7,2。イントロンh内のAlu反復の多型、挿入または欠失の性質のため、フィブリン分解平衡に対する多型の直接的な機能的影響があるとは考えられない。それよりむしろ、Alu反復挿入は、t-PA遺伝子内またはその近隣の未知の機能的効果を有する突然変異と密接に物理的に連関している可能性があり、それにより心筋梗塞の危険度を増加させる。t-PA遺伝子内またはその近隣に、t-PA 遺伝子の1000kb以内に含まれる。この機能的効果は、局所的または全身的に存在しているかもしれない。本発明者らの知見は、公衆衛生上非常に重要かもしれない。t-PA I対立遺伝子の保有率は高いため、t-PA遺伝子のこの変異体は、集団内の高率の心筋梗塞において何らかの役割を果たしているかもしれない。症例の33％においては、心筋梗塞が、t-PA I対立遺伝子を有することに起因すると推定される。したがって、t-PA I対立遺伝子の存在は、心筋梗塞の危険度を、ヘテロ接合の場合には42％、ホモ接合の場合には２倍増加させる。心筋梗塞のすべての(致命的でない)症例の約33％は、少なくともある程度はt-PA I対立遺伝子に起因するかもしれない。 * 参照危険度（1）⁺ 危険因子は、喫煙（はい／いいえ）、全コレステロール（mmol/l）、HDLコレステロール（mmol/l）、収縮期血圧（mmHg）、拡張期血圧（mmHg）、およびボディ・マス指数（kg/m²）を含む。

Claims

【特許請求の範囲】１．血栓関連疾患の危険度が増加した個体または個体群を診断する方法であって、該個体から核酸を自体公知の方法で取り出し、t-PA Alu-h I対立遺伝子の存在と物理的に関連した少なくとも１つの突然変異の存在に関して、危険度を増加させない正常なt-PA対立遺伝子と比較して、得られた核酸を自体公知の方法で分析することを含んでなり、前記の少なくとも１つの突然変異の検出が該危険度の増加を示すことを特徴とする方法。２．該個体から取り出した核酸を、該個体のt-PA遺伝子内の少なくとも１つの突然変異の存在に関して、危険度を増加させない正常なt-PA対立遺伝子と比較して、自体公知の方法で分析することを含む、請求項１に記載の方法。３．該突然変異が、該個体のt-PA遺伝子のhイントロン内の追加的Alu反復の存在である、請求項１または２に記載の方法。４．該個体のt-PA遺伝子のhイントロン内の追加的Alu反復の存在と物理的に関連した第２の突然変異が存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。５．前記の第２の突然変異が、該個体のt-PA遺伝子の外部に存在する、請求項３に記載の方法。６．前記の第２の突然変異が、該個体のt-PA遺伝子の内部に存在する、請求項５に記載の方法。７．前記の第２の突然変異が、血栓関連疾患の危険度の増加を少なくともある程度招く機能的突然変異である、請求項５に記載の方法。８．通常は少なくとも１つの突然変異が存在することが知られている核酸の一部を含む部分が、該個体のゲノム核酸内のt-PA遺伝子の1000kbの距離に又はそれ以内に位置する、請求項７に記載の方法。９．該方法が、被検個体から取り出した核酸または該核酸の一部の単離および所望により増幅を含み、前記の一部が、通常は少なくとも１つの突然変異が存在することが知られている核酸の一部を含み、前記の単離および所望により行なう増幅の後、増幅された核酸を、検出すべき突然変異の存在または不存在に関して自体公知の方法、例えば配列決定により、RFLPにより、または突然変異特異的プローブを使用することにより分析する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 10．該増幅を、自体公知の方法、例えば、検出すべき核酸配列に関する配列情報に基づき選択されたプライマー対（この場合、一方のプライマーは、検出すべき突然変異の上流のさらなる核酸配列とハイブリダイズする能力を有し、もう一方のプライマーは、検出すべき突然変異の下流のさらなる核酸配列とハイブリダイズする能力を有し、該ハイブリダイゼーションは、通常の増幅条件下で行なうことができる）を使用することにより行なう、請求項９に記載の方法。 11．請求項12〜18のいずれか１項に記載のキットを利用する、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。 12．個体または個体群において血栓関連疾患の危険度が増加しているか否かを請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法で確認するための診断キットであって、 t-PA Alu-h I対立遺伝子の存在と物理的に関連した突然変異の存在または不存在を、危険度を増加させない正常なt-PA対立遺伝子と比較して確認するのに必要な要素を含んでなる診断キット。 13．該要素が、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該オリゴヌクレオチドプライマー対が、血栓関連疾患の危険度の増加と関連した突然変異が存在する場合にそれが位置する領域を含む核酸が増幅されるよう選択される、請求項 12に記載の診断キット。 14．該要素が、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該プライマーが、真核生物種のt-PA対立遺伝子の核酸を自体公知の方法で増幅させる能力を有し、該真核生物種が、好ましくはヒトである、請求項12または13に記載の診断キット。 15．該要素が、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該オリゴヌクレオチドプライマー対が、危険度を増加させない正常なt-PA遺伝子と比べた場合にt-PA遺伝子のhイントロン内に追加的Alu反復を含む核酸がそれが存在すれば増幅されるよう選択される、請求項12〜14のいずれか１項に記載の診断キット。 16．該要素が、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該オリゴヌクレオチドプライマー対が、t-PA遺伝子のhイントロン内にすべてのAlu反復を含む核酸がそれが存在すれば増幅されるよう選択される、請求項12〜15のいずれか１項に記載の診断キット。 17．増幅された配列の検出マーカーをさらに含む、請求項12〜16のいずれか１項に記載の診断キット。 18．該個体のt-PA遺伝子のイントロンh内の追加的Alu反復の存在（危険度を増加させない正常なt-PA遺伝子と比較した場合）に関する検出マーカーを含む、請求項12〜17のいずれか１項に記載の診断キット。 19．t-PA遺伝子のイントロンh内の追加的Alu反復の存在（危険度を増加させない正常なt-PA遺伝子と比較した場合）と関連した機能的突然変異に関する検出マーカーを含む、請求項12〜18のいずれか１項に記載の診断キット。 20．血栓関連疾患の危険度の増加を招き、t-PA遺伝子のイントロンh内の追加的A luマーカーの存在とゲノム内に存在している場合に物理的に関連していることを特徴とする対立遺伝子であって、危険度の増加を招く機能的突然変異を含むが、 Ludwigらのt-PA遺伝子の核酸配列を含まないことを特徴とする対立遺伝子。 21．Alu-h-I-t-PA対立遺伝子の1000kb以内のゲノム核酸内に位置することを特徴とする、請求項20に記載の対立遺伝子。