JP5327978B2

JP5327978B2 - フォンビルブラント因子切断酵素遺伝子解析による血栓性疾患関連の遺伝子変異検出方法

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Publication number: JP5327978B2
Application number: JP2010111671A
Authority: JP
Inventors: 康夫池田; 満村田; 宏朗石原; 敏弘内田
Original assignee: Keio University; Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Keio University; Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2024-04-23
Also published as: JP2010213716A

Description

本発明は、ヒトのフォンビルブラント因子切断酵素遺伝子の１塩基変異の解析による、血栓性疾患、例えば血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、冠動脈疾患または脳卒中を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、該検出方法を利用する血栓性疾患罹患危険率の検査方法、該変異を有する遺伝子、並びに前記方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットに関する。

フォンビルブラント因子切断酵素（以下、ｖＷＦ切断酵素と略称することもある。）は、高重合体として形成されるフォンビルブラント因子を切断して低重合体にする作用を有する酵素である。ｖＷＦ切断酵素遺伝子は、第９染色体ｑ３４遺伝子座に存在する遺伝子であり（非特許文献１）、ＡＤＡＭＴＳ１３〔ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎｔｙｐｅ）ｗｉｔｈｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｔｙｐｅ１ｍｏｔｉｆ，１３〕とも称される。当該遺伝子は、２９のエキソンを含み、その全長は約３７ｋｂであり、その塩基配列から推定される１４２７アミノ酸からなる蛋白質をコードしている（特許文献１）。当該遺伝子の変異や多型についても報告されている（非特許文献２）。

フォンビルブラント因子（以下、ｖＷＦと略称することもある。）は、血管内皮細胞および骨髄巨核球で産生される蛋白質であり、血小板膜蛋白質ＧＰＩｂと血管内皮下組織の間に介在してこれらを結合させる接着因子として、止血初期の血小板粘着に係わる。また、循環血液中では、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成し、第ＶＩＩＩ因子の安定化に寄与する。

ｖＷＦ切断酵素により、血管内皮細胞から血中に放出された血小板凝集惹起能が強い高重合ｖＷＦは徐々に切断されて、血小板凝集惹起能が弱い低重合体になる。ｖＷＦ切断酵素活性が低い場合には、相対的に高重合ｖＷＦが多くなることが知られている。つまり、ｖＷＦ切断酵素活性が低下して血漿中ｖＷＦ重合度が高くなった状態で、微小循環などの血管内皮細胞が傷害を受けると血小板血栓が形成され易くなる。形成された血小板血栓の周辺において、さらに血液凝固過程が進行してフィブリンクロットが形成され、強固な止血血栓ができる。血栓は通常、線溶活性により除去される。

生体内では血管が損傷した場合、血管の機能、血小板機能、凝固・線溶系などの密接な相互作用のもとに生理的な止血機構が働く。止血機構の異常は各種の出血性疾患や血栓性疾患などの原因になる。例えば、活性酸素による血管内皮細胞の障害と剥離、血流の変化（低下）および血液凝固能の亢進などにより血栓性疾患が引き起こされる。

血栓性疾患は、血栓による血管の狭窄あるいは閉塞に起因する疾患であり、血栓症と塞栓症とに分類できる。血栓症は、血栓がその形成箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状であり、塞栓症は血栓がその形成箇所から剥がれて血流により移動し、他の箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状をいう。

冠状動脈の閉塞による疾患として冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＡＤと略称する。）が知られている。ＣＡＤは虚血性心疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、心筋への血液供給が著しく減少するため、心筋梗塞、狭心症あるいは不整脈などの症状が引き起こされる。

脳動脈の閉塞による疾患としては脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）が挙げられる。脳卒中は、虚血性脳血管障害と出血性脳血管障害の総称である。出血性脳血管障害には脳内出血やくも膜下出血などが、虚血性脳血管障害には脳梗塞や一過性脳虚血発作などが含まれる。脳梗塞は、脳卒中のなかに占める割合が高い。脳梗塞はその原因により２つ、すなわち脳血栓によるものと脳塞栓によるものとに大別される。脳血栓は脳の血管が動脈硬化などの変化により狭窄し、血流が悪くなって血栓を形成することに起因する。脳塞栓は心臓内や頚動脈において形成された血栓が血流により脳血管に運ばれた結果、脳血管の閉塞を起こすことに起因する。

近年、ｖＷＦ切断酵素の活性低下が、血栓性血小板減少性紫斑病（以下、ＴＴＰと略称することもある。）に関与していることが報告された（非特許文献３−５）。また、ＴＴＰ患者の血液中において、ｖＷＦ切断酵素に対する阻害物質や抗体の存在が報告されている（非特許文献６）。さらに、ＴＴＰを伴う７家系において、ｖＷＦ切断酵素の変異が同定されている（非特許文献１）。ｖＷＦ切断酵素活性の低下により高重合ｖＷＦが増加した状態で、微小循環などの血管内皮細胞が傷害されるとＴＴＰが発症すると考えられる。血管内皮細胞の傷害の成因は様々であるが、例えば、感染症においては細菌が産生する毒素が成因の１つとして知られている。また、抗癌剤や免疫抑制剤などの薬剤によっても血管内皮細胞が傷害されることが知られている。

ＴＴＰは、広範囲の微小血管障害に伴う血栓形成が本態であり、特に、脳、腎臓および冠状動脈などの細小動脈における血栓形成が原因となって発症する。ＴＴＰは全身性重篤疾患であり、血小板減少性紫斑、微小血管傷害性溶血、変動する精神神経症状、発熱、および腎機能障害の５兆候を特徴とする。病型は、特発性と二次性に分類され、特発性はさらに経過により急性、慢性、再発性に分類される。二次性のものとして、妊娠、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎、多発性筋炎、および多発性動脈炎など）、悪性腫瘍疾患（例えば、悪性リンパ腫、白血病、胃癌など）、感染症（例えば、ウイルスおよび細菌など）、あるいはワクチン接種に続発する例、各種薬剤（ペニシリン、サルファ剤、および各種抗癌剤など）の使用による例などが報告されている。ＴＴＰの治療法としては、ｖＷＦ切断酵素の補充療法またはｖＷＦ切断酵素活性の阻害物質除去療法、および正常ｖＷＦ切断酵素遺伝子の血管内皮細胞への導入療法が考えられている。

ＴＴＰと同様、血小板減少症、溶血性貧血および腎機能障害を３徴候とする疾患として、溶血性尿毒症症候群（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ、以下、ＨＵＳと略称する。）が知られている。ＴＴＰとＨＵＳはその類似症状のため、ＴＴＰ／ＨＵＳあるいは血栓性細小血管障害症（ＴＭＡ）と総称されることがある。ＨＵＳは細小動脈の内壁が何らかの原因で障害され、血管内皮細胞の抗血小板機能が低減して、同所での血小板凝集および血小板消費により発症すると考えられている。好発原因となる因子は知られておらず、種々の疾患と感染に伴って引き起こされることが報告されている。

その他、ｖＷＦの異常に起因する疾患としては、遺伝的なｖＷＦの欠乏に起因する出血を主徴とするフォンビルブラント病が知られている。フォンビルブラント病の臨床的所見としては、出血時間延長、血漿ｖＷＦ抗原の低下、ｖＷＦの質的異常、リストセチン惹起血小板凝集の低下が挙げられる。フォンビルブラント病は、ｖＷＦの定量的欠乏症を１型、その質的異常症を２型、その完全欠損症を３型として、３つの病型に分類される。さらに、２型にはｖＷＦの欠損による機能低下を示す２Ａ型、血小板膜蛋白質ＧＰＩｂとの親和性の異常亢進を示す２Ｂ型がある。また、第ＶＩＩＩ因子との親和性が低下している質的異常症をＮ型という。治療には、血漿中ｖＷＦ濃度を高める方法、例えば、ｖＷＦ含有量の高い血漿由来第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ複合体製剤や、合成抗利尿剤ホルモンである酢酸デスモプレシンの投与が行なわれる。

以下に、本明細書において引用した文献を列記する。
国際公開第ＷＯ０２／４２４４１号パンフレット。レビー（Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｇ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１３巻、ｐ．４８８−４９４。コカメ（Ｋｏｋａｍｅ，Ｋ）ら、「プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエンスオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳＯＦＴＨＥＮＡＴＩＯＮＡＬＡＣＡＤＥＭＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥＳＯＦＴＨＥＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ）」、２００２年、第９９巻、ｐ．１１９０２−１１９０７。ファーラン（Ｆｕｒｌａｎ，Ｍ．）ら、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年、第８９巻、ｐ．３０９７−３１０３。ファーラン（Ｆｕｒｌａｎ，Ｍ．）ら、「ニューイングランドジャーナルオブメディシン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第３３９巻、ｐ．１５７８−１５８４。ビアンキ（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｖ．）ら、「ブラッド」、２００２年、第１００巻、ｐ．７１０−７１３。ツァイ（Ｔｓａｉ，Ｈ．−Ｍ．）ら、「ニューイングランドジャーナルオブメディシン」、１９９８年、第３３９巻、ｐ．１５８５−１５９４。

血栓形成に起因する血栓性疾患、例えば冠動脈疾患や脳卒中はヒトの死因において多くの割合を占める疾患である。冠動脈疾患や脳卒中は、これら疾患のリスクを高める因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレスなどの是正により、その発症の危険率を低下させることができる。また、血栓性血小板減少性紫斑病は、その発症原因が多様であり、その原因に適した治療の選択が必要であり、種々の治療法の開発により発症後の予後が非常に改善しているが、治療抵抗例あるいは再発例が多い。したがって、これら疾患の発症リスクの回避、早期治療および各種病因に応じた治療法の選択を可能にするため、当該疾患の早期診断が望まれる。

本発明の課題は、血栓性疾患、例えば血栓性血小板減少性紫斑病、冠動脈疾患および脳卒中などの早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供することである。

本発明者らは、血栓形成の初期段階である血小板凝集に係るｖＷＦ切断酵素の遺伝子において見出した１塩基変異を、血栓性疾患、例えばＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤあるいはＳｔｒｏｋｅなどを引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に利用すること、並びにこれら疾患の早期診断および罹患危険率判定のための検査方法に利用することにより本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
１．ヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子内の第１７８６位の塩基がグアニンである１塩基変異を検出することを特徴とする、冠動脈疾患または脳卒中を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法（ここで、第１７８６位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載された該遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として定義する。）、
２．ヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子内の第１７８６位の塩基がグアニンである１塩基変異の検出を以下の工程を含む方法で行なうことを特徴とする、前記１．に記載の検出方法；
（ｉ）配列番号１１および配列番号１２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、配列番号１３および配列番号１４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行なう工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１３および配列番号１４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
３．前記１．または２．に記載の検出方法を用いる冠動脈疾患または脳卒中の罹患可能性の検査方法、
４．冠動脈疾患または脳卒中を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出用の対立遺伝子特異的な核酸プローブであって、ヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子のゲノム塩基配列における第１７８６位の塩基がグアニンである１塩基変異を検出可能な１７個ないし３０個の塩基からなる対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（ここで、第１７８６位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載された該遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として定義する。）、
５．冠動脈疾患または脳卒中を引き起こす可能性を有するヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子内の第１７８６位の塩基がグアニンである１塩基変異の検出用ポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ここで、第１７８６位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載された該遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として定義する。）、
６．前記４．に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブおよび前記５．に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む試薬キット、
からなる。

本発明によれば、ｖＷＦ切断酵素の活性低下によるｖＷＦの異常に起因する疾患、例えば血栓性疾患、具体的にはＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤあるいはＳｔｒｏｋｅなどの罹患危険率の判定および早期診断の実施が可能になる。そのため、ＣＡＤあるいはＳｔｒｏｋｅなどの罹患危険率が高いと判定された場合、発症する前にそれらの危険因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレスなどの是正を行なうことができる。また、ＴＴＰの罹患危険率が高いと判定された場合、当該疾患の誘発を回避できる治療法を選択することが可能になる。例えば、ＴＴＰ罹患危険率が高いと判定された場合、ＴＴＰの発症を誘発する可能性のあるワクチン接種あるいは各種薬剤（ペニシリン、サルファ剤および各種抗癌剤など）の使用を避けて他の治療方法を選択することができる。または、ＴＴＰが発症した場合に、その病因を決定し、適切な治療方法を選択することができる。例えば、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の１塩基変異が検出された場合、１塩基変異による当該遺伝子の発現異常および／または当該酵素の量的異常若しくは質的異常が病因として考えられるので、ｖＷＦ切断酵素の補充療法の選択が可能になる。１塩基変異が検出されなければ、ＴＴＰの発症は他の異常に起因すると考えて、それに適した療法を選択することが可能になる。例えば、病因がｖＷＦ切断酵素活性の阻害物質によるものと判断されれば、該阻害物質の除去療法を選択することができる。
このように本発明は、血栓性疾患、具体的にはＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤあるいはＳｔｒｏｋｅなどの診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用である。

ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム由来の野生型エキソン３−エキソン４断片を発現させた細胞において予想されるサイズのｍＲＮＡ（エキソン３＋エキソン４）が検出されたが、イントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片を発現させた細胞では野生型よりも大きいサイズのｍＲＮＡが検出されたことを説明する図である。レーン３および４は、野生型エキソン３−エキソン４断片およびイントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片をそれぞれ発現させた細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として、ｍＲＮＡ内のエキソン３由来部分を検出し得るプライマーセット１を用いて得たＰＣＲ産物を示す。レーン６および７は、上記各細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として、ｍＲＮＡ内のエキソン３−エキソン４由来部分を検出し得るプライマーセット２を用いて得たＰＣＲ産物を示す。レーン２および５は、上記断片をいずれも導入しない細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として、それぞれプライマーセット１およびプライマーセット２を用いてＰＣＲにより得た増幅産物を示す。レーン１は１００ｂｐマーカーである。（実施例３）ｖＷＦ切断酵素遺伝子の野生型エキソン３−エキソン４断片を発現させた細胞において正常なスプライシングが行なわれたことを説明する図である。（実施例３）ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム由来において、エキソン３に続くイントロン３の５´末端（ゲノムＤＮＡ配列中第３０６６５３９位）の塩基がＧからＡに変異することにより、イントロン３の５´−スプライス部位が２７塩基下流に変化し、それによりｍＲＮＡのスプライシングバリアントが生じたことを説明する図である。検討は、イントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片を用いたミニジーン発現系で行なった。（実施例３）ｖＷＦ切断酵素遺伝子において、エキソン３に続くイントロン３の５´末端（ゲノムＤＮＡ配列中第３０６６５３９位）の塩基がＧからＡに変異することにより、イントロン３の５´−スプライス部位が１０５塩基下流に変化し、それによりｍＲＮＡのスプライシングバリアントが生じたことを説明する図である。検討は、イントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片を用いたミニジーン発現系で行なった。（実施例３）

本発明は、血栓性血小板減少性紫斑病において見出したｖＷＦ切断酵素遺伝子における１塩基変異を、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法として利用することにより達成したものである。さらに、本発明においては、該検出方法を用いることを特徴とする、血栓性疾患の罹患危険率の検査方法を提供することができる。血栓性疾患としては、例えばｖＷＦ切断酵素遺伝子の発現異常および／または当該酵素の量的異常若しくは質的異常に起因する血栓性疾患を挙げることができる。具体的にはＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤおよびＳｔｒｏｋｅなどが例示できる。

本発明においては、エキソンにおける１塩基変異を判断する基準の配列として、ＮＭ＿１３９０２５に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いた。イントロンにおける１塩基変異を判断する基準の配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３の第９染色体コンティグ配列に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列を用いた。これら基準の配列を参照配列と呼称することもある。１塩基変異が存在する塩基の位置は、これら参照配列における塩基の位置として定義する。

ｖＷＦ切断酵素遺伝子における１塩基変異は、上記ゲノム塩基配列または上記ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における１塩基変異の位置を示す数字と、１塩基変異を有する遺伝子における該位置の塩基を表わす記号の組合わせで示すことがある。例えば１１９３Ｔは、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）の第１１９３位に１塩基変異が存在し、該位置の塩基がチミン（Ｔ）であることを意味する。

１塩基変異を含むコドンがコードするアミノ酸は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載のｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）がコードするアミノ酸配列（配列番号２）における該アミノ酸の位置を示す数字とアミノ酸を表わす記号との組合わせで示すことがある。この場合、アミノ酸表記は１文字表記する。例えばＱ４４８Ｅは、第４４８番目のアミノ酸が、１塩基変異の無いｖＷＦ切断酵素ではグルタミン（Ｑ）であるが、１塩基変異によりグルタミン酸（Ｅ）に変異していることを示す。

ＴＴＰ患者由来のｖＷＦ切断酵素遺伝子において見出した１塩基変異は、アミノ酸変異を伴う１塩基変異４種〔１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）〕、スプライシングバリアントを生じる１種（イントロン３Ｇ／Ａ）、およびアミノ酸変異のみられない１塩基変異３種〔１９９２Ａ（Ｔ５０６Ｔ）、２１６０Ａ（Ｔ５７２Ｔ）および２７２４Ｃ（Ｇ７６０Ｇ）〕である（表１および２参照。）。イントロン３Ｇ／Ａは、イントロン３の５´末端の塩基（上記ゲノム塩基配列中第３０６６５３９位）のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を意味する。

参照配列である上記ゲノム塩基配列において、第３０６６５３９位に相当する塩基はＧである。また、参照配列である上記ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）において、第１１９３位、第１７８６位、第１９９２位、第２１６０位、第２７２４位、第３０５０位および第３１５２位に相当する塩基はそれぞれ、Ｃ、Ｃ、Ｃ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＣである（表１および２参照。）。
但し、本発明者らの知見では、日本人は、第２１６０位の塩基はＧがドミナントであり、Ａに変異することがＴＴＰの発症に強く関連すると考えられる。また、第２７２４位の塩基は、日本人においてこの位置の塩基がＴであるアレルが多く、Ｃに変異することがＴＴＰの発症に強く関連すると考えられる。

イントロン３Ｇ／Ａ、１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）、１９９２Ａ（Ｔ５０６Ｔ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）は、ＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子データベース検索を行ったところ、いずれも今までに報告されていない新規１塩基変異であった。一方、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、２１６０Ａ（Ｔ５７２Ｔ）および２７２４Ｃ（Ｇ７６０Ｇ）は既に報告されている〔コカメ（Ｋｏｋａｍｅ，Ｋ）ら、「プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエンスオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳＯＦＴＨＥＮＡＴＩＯＮＡＬＡＣＡＤＥＭＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥＳＯＦＴＨＥＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ）」、２００２年、第９９巻、ｐ．１１９０２−１１９０７〕。しかし、報告されている１塩基変異とＴＴＰとの関連性は知られていない。

上記塩基の変異以外に、ＴＴＰ／ＨＵＳ患者由来のＷＦ切断酵素遺伝子において、第１４６０位および第第２２９６位の１塩基変異を見出した。具体的には、ＴＴＰ／ＨＵＳ患者１例由来のｖＷＦ切断酵素遺伝子において、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位および第２２９６位にあたる全ての塩基の変異を見出した。さらに、ＴＴＰ／ＨＵＳ患者２例の各ｖＷＦ切断酵素遺伝子において、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位、第２２９６位および第２７２４位にあたる全ての塩基の変異を見出した。これら変異のうち、第１４６０位の塩基の変異は、アミノ酸変異を伴う１塩基変異〔１４６０Ｇ（Ｔ３３９Ｒ）〕である。第１７８６位、第２１６０位および第２７２４位の各塩基の変異は、上記同様、それぞれグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）への変異であった。第２２９６位の塩基の変異は、アミノ酸変異を伴う１塩基変異〔２２９６Ｇ（Ｐ６１８Ａ）〕であった。参照配列であるｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）において、第１４６０位および第２２９６位に相当する塩基は、それぞれＣおよびＣである（表５参照）。

１４６０Ｇ（Ｔ３３９Ｒ）は、ＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子データベース検索を行ったところ、今までに報告されていない新規１塩基変異であった。一方、２２９６Ｇ（Ｐ６１８Ａ）およびこの変異とＴＴＰとの関連の可能性は既に報告されている〔アントニー（ＡｎｔｏｎｉｅＧ．）ら、「ブリティッシュジャーナルオブヘマトロジー（ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ」、２００３年、第１２０巻、ｐ．８２１−８２４〕。

イントロン３Ｇ／Ａは、イントロン３の５´末端の塩基における変異である。そのため該変異によりイントロン３の５´−スプライス部位が、変異の無い遺伝子におけるスプライス部位より下流に変化し、スプライシングバリアントが生じることが判明した。すなわち、イントロン３Ｇ／Ａを有するｖＷＦ切断酵素遺伝子からは、該遺伝子のエキソン３由来の塩基配列の３´末端とエキソン４由来の塩基配列の５´末端との間に、該遺伝子のイントロン３由来の塩基配列が挿入されてなるスプライシングバリアントが生じる。イントロン３由来の塩基配列として、具体的には例えば、配列番号４０に記載の２７塩基からなる塩基配列または配列番号４１に記載の１０５塩基からなる塩基配列を挙げることができる。このようなスプライシングバリアントは、ｖＷＦ切断酵素のアミノ酸配列に変異を生じさせる。

アミノ酸変異を伴う蛋白質は、構造変化に伴い、正常なｖＷＦ切断酵素の機能を減弱ないし消失させることが予想される。例えば、エキソン３を含む領域にはメタロプロテアーゼドメインが存在するため、イントロン３Ｇ／Ａが当該ドメイン機能を変え、ひいては正常なｖＷＦ切断酵素の機能を減弱ないし消失させると考えられる。また、スプライシングバリアントのＲＮＡ安定性についても低いと考えられ、遺伝子から遺伝子産物発現およびその機能に至るまで正常と比べ生体制御的観点では不利益が生じる。

１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）は、ｖＷＦ切断酵素が属するＡＤＡＭＴＳファミリー酵素の活性部位のアミノ酸配列において高度に保存されているメチオニン残基の隣に位置している〔キャル（Ｃａｌ，Ｓ．）ら、「ジーン（Ｇｅｎｅ）」、２００２年、第２８３巻、ｐ．４９−６２〕。当該メチオニン残基が含まれるメチオニンターン（Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）構造はメタロプロテアーゼなどの亜鉛ペプチダーゼに特徴的な配列で、３つのヒスチジン残基と共に、Ｚｎ^２＋の結合に必須である〔ボウド（Ｂｏｕｄ，Ｗ．）ら、「フェブスレターズ（ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ）」、１９９３年、第３３１巻、ｐ．１３４−１４０〕。ｖＷＦ切断酵素における１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）は、このメチオニンターン構造に影響を及ぼすことによってＺｎ^２＋の結合の変化または不結合状態を与え、プロテアーゼ活性を低下させる可能性が高いと考えられる。

３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）は、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）ドメインに存在する。ＴＳＰ１は、他の蛋白質、例えばヘパリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびスルファチドなどと結合することが知られている。このことから、この１塩基変異はｖＷＦ切断酵素の基質との特異的結合性や結合能に影響すると考えている。

一方、アミノ酸変異を伴わない１塩基変異であっても、例えば遺伝子転写産物の安定性が低下するなどの異常が起きることが考えられる。ｖＷＦ切断酵素遺伝子は１塩基変異が高頻度に存在する遺伝子であり、既に幾つかの１塩基変異が報告されている。しかし、今までに報告されている１塩基変異は、遺伝子発現や遺伝子産物の性質に影響しないサイレントミューテーションか、遺伝子産物のアミノ酸変異を伴うとしても、性質の類似したアミノ酸間の変異である。このことから、本発明に係る１塩基変異は、従来報告されている１塩基変異と比較して、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の転写・翻訳やその遺伝子産物の活性の変化に重要な影響を与えるものであり、当該遺伝子産物の異常に起因する疾患と深く関連すると考えている。

本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、これら知見に基づいて達成したものであり、ヒトのｖＷＦ切断酵素遺伝子内の１塩基変異が存在する位置における塩基を決定し、その塩基の種類を正常遺伝子のものと比較することにより、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することを特徴とする。

塩基の決定は、ヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列の次の位置に相当する塩基について行なう：好ましくは上記ゲノム塩基配列における第３０６６５３９位、並びに上記ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における第１１９３位、第１４６０位、第１７８６位、第１９９２位、第２１６０位、第２７２４位、第３０５０位および第３１５２位であり、より好ましくは、第３０６６５３９位、第１１９３位、第１７８６位、第１９９２位、第３０５０位および第３１５２位である。塩基の決定はこれら位置の１つまたは２つ以上について行なう。

塩基の決定方法は、自体公知の方法を使用して実施可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する。）により、所望の位置の塩基を含むｖＷＦ切断酵素遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシーケンス法、例えばダイレクトシーケンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシーケンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型解析法などが利用できる。本発明に係る１塩基変異の解析はこれら方法に限らず、自体公知の方法を適用して実施可能である。１塩基変異の解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ〔リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャーバイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６〕やルミネックス法〔チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノムリサーチ（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７〕が知られている。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。かかる方法としては、ピンポイントアッセイ〔ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャーバイオテクノロジー」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１〕やプローブ法〔ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカルケミストリー（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８〕などが例示できる。さらに、ドールアッセイ〔ＤＯＬａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエンスオブザユナイテッドステーツオブアメリカ」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１〕、スナイパーアッセイ〔ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャーバイオテクノロジー」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３〕およびタグアレイ法〔ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノムリサーチ（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０〕なども使用可能である。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。

被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは組織などから調製した核酸試料を用いる。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。本発明に係る１塩基変異のうちエキソンに存在する１塩基変異の検出には、核酸試料として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれも使用可能である。また、イントロン３Ｇ／Ａはスプライシングバリアントを生じる変異であるため、その検出に用いる核酸試料として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれも使用可能である。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する。）またはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ｃＤＮＡまたはＲＮＡを用いて１塩基変異を検出する場合は、ゲノム塩基配列において１塩基変異が存在する位置に対応する、ｃＤＮＡまたはＲＮＡにおける位置の塩基の決定を行なう。

本発明に係る遺伝子変異の検出方法の１例として、第３０６６５３９位の１塩基変異の検出は、例えば、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡについて、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の配列を配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いて再度ＰＣＲを行い、ついで２回目のＰＣＲに用いたプライマーを使用してシーケンス法で塩基を決定することにより実施できる。同様に、第１１９３位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号９および配列番号１０に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第１７８６位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号１１および配列番号１２に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号１３および配列番号１４に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第１９９２位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号１５および配列番号１６に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号１７および配列番号１８に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第２１６０位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号１９および配列番号２０に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号２１および配列番号２２に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第２７２４位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号２３および配列番号２４に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号２５および配列番号２６に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第３０５０位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号２７および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号２９および配列番号３０に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。第３１５２位の１塩基変異の検出は、第１ＰＣＲ用プライマーとして配列番号３１および配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを用い、第２ＰＣＲ用プライマーおよびシーケンス用プライマーとして配列番号３３および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドを用いて実施できる。あるいは、これら１塩基変異の検出は、それぞれ上記各第１ＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、該プライマーをシーケンス用プライマーとして用いてシーケンス法により塩基を決定することにより実施できる。第１４６０位の１塩基変異の検出は、例えば、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡについて、配列番号４２および配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の配列を、該プライマーを用いてシーケンス法で塩基を決定することにより実施できる。

第３０６６５３９位の１塩基変異の検出はまた、該変異によりスプライシングバリアントが生じることを利用して、該スプライシングバリアントを検出することにより実施できる。すなわち、被検試料からＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡ試料について配列番号３７および配列番号３９に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いて逆転写ポリメラーゼ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、得られた増幅産物の塩基配列の決定あるいは大きさの測定により、当該変異の検出が可能である。増幅産物が、当該１塩基変異をもたない遺伝子を鋳型として同様にＲＴ−ＰＣＲを行なった増幅産物と比較して、そのサイズが大きい場合、被検試料にはスプライシングバリアントが存在する、すなわち第３０６６５３９位の１塩基変異が存在すると判定できる。増幅産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動法などの公知方法により決定できる。

第３０６６５３９位、第１１９３位、第１４６０位、第１７８６位、第１９９２位、第２１６０位、第２７２４位、第３０５０位または第３１５２位における１塩基変異はまた、対立遺伝子特異的核酸プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法により検出することも可能である。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ塩基配列の差に基づく差異を有する２個以上の遺伝子をいう。

核酸プローブとしては、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列において３０６６５３９Ａ、１１９３Ｇ、１４６０Ｇ、１７８６Ｇ、１９９２Ａ、２１６０Ａ、２７２４Ｃ、３０５０Ａまたは３１５２Ｔで表わされる１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、被検試料中において１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー〕などに従うことができる。

第３０６６５３９位における変異は、エキソン３とエキソン４との間にイントロン３由来の塩基配列が挿入されたスプライシングバリアントを生じるため、該スプライシングバリアントを検出することにより変異の検出が可能である。したがって、該挿入された塩基配列を特異的に検出可能な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーション法により変異の検出が可能である。かかるプローブとしては、イントロン３由来の塩基配列、例えば配列番号４０または配列番号４１に記載の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。

プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、３０６６５３９Ａ、１１９３Ｇ、１４６０Ｇ、１７８６Ｇ、１９９２Ａ、２１６０Ａ、２７２４Ｃ、３０５０Ａまたは３１５２Ｔで表わされる１塩基変異を有するｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成などにより作製可能である。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。また、イントロン３Ｇ／Ａを検出するためのプローブを、イントロン３の塩基配列、例えば配列番号４０または配列番号４１に記載の塩基配列に基づいて設計し、同様に取得可能である。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体などで標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブと対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであれば用いることができる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。

本発明に係る１塩基変異は、ＴＴＰにおいて見出した変異であり、ゆえに上記１塩基変異の１つまたは２つ以上を検出することにより、ＴＴＰを引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出が可能である。

本発明に係る１塩基変異のうち第３０６６５３９位の塩基のアデニンへの変異および第１１９３位のチミンへの変異がＨＵＳ患者由来のゲノムＤＮＡ試料で見出された。このことから、第３０６６５３９位および／または第１１９３位における１塩基変異を検出することにより、ＨＵＳを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。これら１塩基変異が認められた患者におけるｖＷＦ切断酵素活性は３％以下（健常人の酵素活性を１００％とする。）であった。該患者の両親のｖＷＦ切断酵素活性は父親４６％、母親４６％であるものの、ＴＴＰ／ＨＵＳ様症状は認められなかった。遺伝子解析の結果、患者のｖＷＦ切断酵素遺伝子はこれら変異をヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）に有し、その母親は第３０６６５３９位の変異をヘテロに有するが第１１９３位の変異はもたないことが明らかになった。この患者はこれら両方の変異を有することにより、病態が発症したと考えられる。

本発明に係る１塩基変異のうち第１７８６位の塩基のグアニンへの変異がＣＡＤまたはＳｔｒｏｋｅの発症と関連することを統計的手法により明らかにした。すなわち、該１塩基変異が、ＣＡＤまたはＳｔｒｏｋｅの危険因子の１つであると考えられる。したがって、第１７８６位における１塩基変異を検出することにより、ＣＡＤまたはＳｔｒｏｋｅを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。

本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、血栓性疾患の罹患危険率を判定するための検査方法に利用することができる。疾患罹患危険率は、試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列を、対照と比較することにより判定できる。対照として、好ましくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いることができる。あるいは、健常人またはｖＷＦ切断酵素遺伝子の異常が無い疾患の患者由来の核酸試料に含まれるｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列を用いることがより好ましい。すなわち、被検試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列第３０６６５３９位、並びに該遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）第１１９３位、第１７８６位、第１９９２位、第２１６０位、第２７２４位、第３０５０位および第３１５２位に相当する位置の塩基から選択される１つまたは２つ以上の塩基を決定し、当該各位置における塩基の種類を対照と比較した結果、対照とは異なる塩基、例えばそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ａ、Ｃ、ＡおよびＴであることが認められたときには、疾患罹患率が高いと判定することができる。これらの変異は対立遺伝子の双方で検出されてもよく、一方のみで検出されてもよい。

本検査方法により罹患危険率を判定できる疾患は、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の１塩基変異による、当該遺伝子の発現の異常および／または当該酵素の量的異常若しくは質的異常に起因する疾患である。例えば、好ましくはこれらの異常が関連する血栓性疾患、具体的にはＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤまたはＳｔｒｏｋｅの罹患危険率の検出に用いる。あるいは、ｖＷＦの量的および／または質的異常に起因するフォンビルブラント病、中でもｖＷＦ重合体の質的異常による２型フォンビルブラント病の罹患危険率を検出することも可能である。

ＴＴＰ／ＨＵＳ患者由来のゲノムＤＮＡ試料においてｖＷＦ切断酵素遺伝子の第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位および第２２９６位の塩基全ての変異が見出されたことから、これらを検出することにより、ＨＵＳを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。さらに、ＴＴＰ／ＨＵＳ患者２例の各ゲノムＤＮＡ試料において、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位、第２２９６位および第２７２４位の塩基全ての変異が見出されたことから、これら変異を検出することにより、血栓性疾患、例えばＨＵＳを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。例えば、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位、第２２９６位および第２７２４位の塩基のうちの少なくとも１つ塩基の変異を検出することにより、血栓性疾患を惹き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。好ましくは、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位および第２２９６位の塩基全ての変異を検出することによりＨＵＳを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。また、第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位、第２２９６位および第２７２４位の塩基全ての変異を検出することによりＨＵＳを引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。

第２２９６位の１塩基変異の検出は、例えば、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡについて、配列番号４４および配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の配列を配列番号４４および配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを使用してシーケンス法で決定することにより実施できる。

ＴＴＰ／ＨＵＳ患者由来のゲノムＤＮＡ試料においてこれら変異が見出されたことから、該変異の検出方法はＨＵＳ罹患危険率を判定するための検査方法に利用することができる。具体的には、被検試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）の第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位および第２２９６位に相当する位置の塩基を決定し、当該各位置における塩基の種類を対照と比較した結果、これら全ての位置の塩基が対照とは異なる塩基、例えばそれぞれＧ、Ｇ、ＡおよびＧであることが認められたときには、ＨＵＳ罹患率が高いと判定することができる。また、被検試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）第１４６０位、第１７８６位、第２１６０位、２２９６位および第２７２４位に相当する位置の塩基を決定し、これら全ての位置の塩基が対照とは異なる塩基、例えばそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであることが認められたとき、ＨＵＳ罹患率が高いと判定することができる。

本発明はまた、本発明に係る１塩基変異の少なくとも１つを有するｖＷＦ切断酵素遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、本発明に係る１塩基変異によるスプライシング異常により生じたポリヌクレオチドを提供することも可能である。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供可能である。本発明において、ポリヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドからなるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチドからなるポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）が含まれる。リボヌクレオチドは修飾されたリボヌクレオチドであってもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体的な塩基配列に関わる情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照〕により容易に取得することができる。具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得可能である。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施可能である。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。その他、ポリメラーゼ連鎖反応〔以下、ＰＣＲと略称する、ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。また、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）や５´−ＲＡＣＥ法〔フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２〕等を利用することも可能である。このような方法で得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法〔「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７〕やマキサム−ギルバート法〔「メソッズインエンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０〕等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。

上記ポリヌクレオチド、上記プロ−ブおよび上記プライマーは、いずれも試薬として使用できる。また、これらの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、１塩基変異検出用の標識物質、緩衝液、並びに塩など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。かかる試薬および試薬キットは、本発明に係る検出方法および検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用可能である。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
また、実施例に記載した実験は、試料提供者である患者のインフォームドコンセントを得て行なったものである。

（ｖＷＦ切断酵素遺伝子の各エキソン塩基配列の解析）
ｖＷＦ切断酵素遺伝子の２９エキソンについて、各エキソンの塩基配列における変異の検出をゲノムＤＮＡ試料を用いて行なった。ゲノムＤＮＡ試料は７例のＴＴＰ患者から供与を受けた。検出は、試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡから標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシーケンシング法を用いて決定することにより実施した。

標的領域の増幅はＰＣＲにより行なった。ＰＣＲ用プライマーは、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３）の各エキソンの上流および下流の塩基配列に基づいて設計し作製した（下記参照。）。

ＰＣＲ反応液４８μｌ、第１ＰＣＲプライマー（１０μＭ）１μｌおよびＤＮＡ試料１μｌ（合計５０μｌ）を混合し、第１ＰＣＲを以下の条件で行なった。
ＰＣＲ条件
１）９５℃ １分間
２）９５℃ ３０秒間
３）４８℃ ３０秒間
４）７２℃ ２．５分間
２）から４）の工程は３０サイクル行なった。
５）７２℃ １０分間

次いで、ＰＣＲ反応液４８μｌ、第２ＰＣＲプライマー（１０μＭ）１μｌおよび第１ＰＣＲの増幅産物１μｌ（合計５０μｌ）を混合し、第１ＰＣＲの条件と同じ条件で第２ＰＣＲを行なった。

第２ＰＣＲの増幅産物の塩基配列の決定を、ＡＢＩ３１００シーケンサーを用い、ＡＢＩ測定マニュアルにしたがってシーケンス反応を行うことにより実施した。シーケンシング用プライマーは第２ＰＣＲに用いたプライマーと同一のものを用いた。その結果を表１に示す。

^＊：塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列における位置として示す。
^＊＊：塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として示す。
^＃：配列番号１に記載のｃＤＮＡ塩基配列第２１６０位に相当する塩基はＡである。但し、日本人ではこの位置の塩基はＧがドミナントである。
^＃＃：配列番号１に記載のｃＤＮＡ塩基配列第２７２４位に相当する塩基はＣである。但し、日本人においてはこの位置の塩基がＴであるアレルが多い。

表１に示したように、アミノ酸変異を伴う１塩基変異３種（Ｑ４４８Ｅ、Ｇ８６９ＳおよびＳ９０３Ｌ）、スプライシングバリアントを生じると予想される１種（イントロン３Ｇ／Ａ）、およびアミノ酸変異を伴わない１塩基変異３種（Ｔ５０６Ｔ、Ｔ５７２ＴおよびＧ７６０Ｇ）を見出した。エキソン３については、エキソン３自体の塩基配列には変異が検出されず、エキソン３の３´末端に続くイントロンの５´末端に当るヌクレオチドの変異が１例において検出された。この変異によりスプライス部位が変化し、スプライシングバリアントが生じると予想された。検出された上記変異のうち、イントロン３Ｇ／Ａ、１９９２Ａ（Ｔ５０６Ｔ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）は今までに報告されていない新規１塩基変異であった。一方、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、２１６０Ａ（Ｔ５７２Ｔ）および２７２４Ｃ（Ｇ７６０Ｇ）は既に報告されているが、これら１塩基変異と血栓性疾患との関連性については知られていない。

表１に示した１塩基変異を検出するために用いたプライマーを、以下に示す。
エキソン３の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号３
リバースプライマー；配列番号４
エキソン３の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号５
リバースプライマー；配列番号６
エキソン１２の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１１
リバースプライマー；配列番号１２
エキソン１２の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１３
リバースプライマー；配列番号１４
エキソン１３の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１５
リバースプライマー；配列番号１６
エキソン１３の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１７
リバースプライマー；配列番号１８
エキソン１５の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１９
リバースプライマー；配列番号２０
エキソン１５の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号２１
リバースプライマー；配列番号２２
エキソン１９の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号２３
リバースプライマー；配列番号２４
エキソン１９の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号２５
リバースプライマー；配列番号２６
エキソン２０の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号２７
リバースプライマー；配列番号２８
エキソン２０の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号２９
リバースプライマー；配列番号３０
エキソン２１の第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号３１
リバースプライマー；配列番号３２
エキソン２１の第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号３３
リバースプライマー；配列番号３４

ｖＷＦ切断酵素遺伝子エキソン７についての変異の検出を、実施例１と同じＤＮＡ試料を各２μｌ用いて、試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡから標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシーケンシング法を用いて決定することにより実施した。

標的領域の増幅はＰＣＲにより行なった。ＰＣＲ用プライマーは、ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノム塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３）のエキソン７の上流および下流の塩基配列に基づいて設計した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用い、ＤＭＳＯを最終濃度５％となるように添加して、以下の条件で行なった。
ＰＣＲ条件
１）９４℃ ４分間
２）９４℃ ３０秒間
３）６４℃ ３０秒間
４）７２℃ １分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）７２℃ ３分間

反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、推定産物長のバンドを確認した後、ＰＣＲ増幅産物をＥｘｏＳＡＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製した。

精製した増幅産物を鋳型とし、ダイターミネータ法による塩基配列解析を行った。シーケンス反応は、下記シーケンスプライマー、ＭｅｇａＢＡＣＥＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＤＹＥｎａｍｉｃＥＴｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｋｉｔ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製）またはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０によるゲルろ過精製法により反応産物を精製した。シーケンサーはＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。結果を表２に示す。

^＊：塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として示す。

表２に示したように、エキソン７においてアミノ酸変異を伴う１塩基変異（Ａ２５０Ｖ）を見出した。この変異は今までに報告されていない新規１塩基変異であった。

エキソン７における１塩基変異を検出するために用いたプライマーを、以下に示す。
エキソン７のＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号７
リバースプライマー；配列番号８
エキソン７のシーケンス用プライマー
フォワードプライマー；配列番号９
リバースプライマー；配列番号１０

イントロン３Ｇ／ＡがｖＷＦ切断酵素表現型に及ぼす影響を、ミニジーン（ｍｉｎｉ−ｇｅｎｅ）発現系を構築して検討した。

ミニジーン発現系の構築は以下のように行なった。ｖＷＦ切断酵素遺伝子のエキソン３からエキソン４までの領域（以下、エキソン３−エキソン４断片と呼称する。）を、ＰＣＲにてヒトゲノムＤＮＡからクローニングした。ＰＣＲは、ＰＣＲ反応液９８μｌ、第１ＰＣＲプライマー各０．５μｌ（最終濃度０．５μＭ）、およびＤＮＡ試料１μｌ（合計１００μｌ）を混合し、第１ＰＣＲを以下の条件で行った。酵素はＫＯＤを使用した。
第１ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号３
リバースプライマー；配列番号３５
ＰＣＲ条件
１）９８℃ ５分間
２）９８℃ １分間
３）５０℃ １分間
４）７２℃ １分間
２）から４）の工程は３０サイクル行なった。
５）７２℃ ５分間

次いで、ＰＣＲ反応液９８μｌ、第２ＰＣＲプライマー各０．５μｌ（最終濃度０．５μＭ）、および第１ＰＣＲの増幅産物１μｌ（合計１００μｌ）を混合し、第１ＰＣＲの反応条件と同じ条件で第２ＰＣＲを行った。ただし、酵素はＥｘ−Ｔａｑを使用した。
第２ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号５
リバースプライマー；配列番号３６

得られたエキソン３−エキソン４断片に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてイントロン３Ｇ／Ａ変異を導入した。野生型エキソン３−エキソン４断片およびイントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１（＋）に導入して各発現ベクターを作成した。これらベクターをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞からＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ反応はオリゴｄＴプライマーを用いて行なった。ＰＣＲは、エキソン３に由来するｍＲＮＡを検出するためにプライマーセット１を、またエキソン３からエキソン４に由来するｍＲＮＡを検出するためにプライマーセット２を用いて実施した。

プライマーセット１
フォワードプライマー；配列番号３７
リバースプライマー；配列番号３８
プライマーセット２
フォワードプライマー；配列番号３７
リバースプライマー；配列番号３９

野生型エキソン３−エキソン４断片を導入した細胞では予想されるサイズのｍＲＮＡの発現が確認できたが、イントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片を導入した細胞では野生型よりも大きいサイズのｍＲＮＡが発現していた（図１）。

上記ベクターをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したＲＮＡを鋳型としてプライマーセット２を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった増幅産物について、ＱＩＡＧＥＮＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いてＴＡクローニングした後、塩基配列の解析を行った。

その結果、野生型エキソン３−エキソン４断片を導入した細胞から得たｍＲＮＡは予想通りのスプライシングが起こっていた（図２-Ａ参照。）。イントロン３Ｇ／Ａ変異型エキソン３−エキソン４断片を導入した細胞から得たｍＲＮＡから得られたクローン（５６個）においては、野生型のｃＤＮＡに２７塩基挿入されたもの（１１個）と、１０５塩基挿入されたもの（３８個）が認められた（図２-Ｂおよび図２-Ｃ参照。）。他の７クローンはＴＡクローニングベクターのセルフライゲーション（ｓｅｌｆｌｉｇａｔｉｏｎ）産物であった。変異型エキソン３−エキソン４断片を導入した細胞から得たｃＤＮＡに挿入された２７塩基および１０５塩基の配列はそれぞれ配列番号４０および４１に記載した。

これらから、イントロン３Ｇ／Ａ変異はスプライシングバリアントを生じさせることが明らかとなり、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の異常に起因する病態発症の原因となる可能性が示唆された。

実施例１および２において検出されたｖＷＦ切断酵素遺伝子の変異のうち、アミノ酸変異を伴う１塩基変異４種〔１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）〕およびスプライシングバリアントを生じる１種（イントロン３Ｇ／Ａ）について疾患との関連を検討した。変異の検出は実施例１および２と同様の方法で実施した。

その結果、１例の患者においてイントロン３Ｇ／Ａおよび１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）の両方の変異が検出された（表１および２において、試料番号３に相当する。）。該患者は、ＨＵＳ症状を頻繁に示す５１歳男性であり、そのｖＷＦ切断酵素活性は３％以下（健常人の酵素活性を１００％とする。）であった。該患者の両親のｖＷＦ切断酵素活性は父親４６％、母親４６％であり、ＴＴＰ／ＨＵＳ様症状は認められなかった。遺伝子解析の結果、患者はイントロン３Ｇ／Ａおよび１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）をヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）に有することが明らかになった。その母親のｖＷＦ切断酵素遺伝子はイントロン３Ｇ／Ａをヘテロに有するが、１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）はもたないことが明らかになっている。父親は遺伝子試料が得られておらず、未解析である。このことから、該患者のイントロン３Ｇ／Ａは母親由来（ｍａｔｅｒｎａｌ）の変異であり、１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）は父親由来（ｐａｔｅｒｎａｌ）の変異であると考えられる。

今回解析対象となったＨＵＳ患者はイントロン３Ｇ／Ａと１１９３Ｔ（Ａ２５０Ｖ）の両方の変異を有することにより、病態が発症したと考えられる。

実施例１および２において検出されたｖＷＦ切断酵素遺伝子の変異のうち、アミノ酸変異を伴う１塩基変異３種〔１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）〕およびスプライシングバリアントを生じる１種（イントロン３Ｇ／Ａ）について、ＣＡＤおよび脳血管障害（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＶＤと略称する。）との関連を検討した。変異の検出は実施例１および２と同様の方法で実施した。

健常人３４２例、ＣＡＤ患者１９１例、ＣＶＤ患者２３３例のゲノムＤＮＡを用いてタイピング研究を行った。その結果、各１塩基変異の発現頻度は下記のとおりであった。３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）およびイントロン３Ｇ／Ａの発現は今回検討した試料では認められなかった。

実施例１および２において検出されたｖＷＦ切断酵素遺伝子の変異のうち、アミノ酸変異を伴う１塩基変異３種〔１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）〕およびスプライシングバリアントを生じる１種（イントロン３Ｇ／Ａ）について、ＣＡＤとの関連を検討した。変異の検出は実施例１および２と同様の方法で実施した。

健常人およびＣＡＤ患者それぞれ１４０例のゲノムＤＮＡを用いてタイピング研究を行なった。健常人および患者は性別比および年齢（±２歳）が同一になるように調製した。すなわち、健常人および患者における性別比はいずれも男性９３．６％および女性６．４％であった。年齢の平均は、健常人で５５．８±６．３歳、患者では５５．４±６．５歳であった。

その結果、エキソン１２における変異〔１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）〕がＣＡＤと関連することが統計的に明らかになった。野生型ＣＣ、ヘテロ接合体ＣＧおよびホモ接合体ＧＧの発現は、ＣＡＤにおいてそれぞれ８８例（６２．９％）、４５例（３２．１％）および７例（５．０％）で認められた。一方、健常人においてはそれぞれ９８例（７０．０％）、３６例（２５．７％）および６例（４．３％）で認められた。統計手法としてマックネーマー法（ＭｃＮｅｍｅｒ’ｓＴｅｓｔ）を用い、健常人および患者における変異の発現頻度を解析した。その結果、ＣＡＤにおいて野生型ＣＣとヘテロ接合体ＣＧの間でオッズ比（Ｏｄｄｓｒａｔｉｏ）１．６６７、９０％信頼区間（１．０２６−１．７４８）で関連を認めた。

このことから、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）変異はＣＡＤ発症の危険因子の１つである可能性が考えられる。

実施例１および２において検出されたｖＷＦ切断酵素遺伝子の変異のうち、アミノ酸変異を伴う１塩基変異３種〔１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、３０５０Ａ（Ｇ８６９Ｓ）および３１５２Ｔ（Ｓ９０３Ｌ）〕およびスプライシングバリアントを生じる１種（イントロン３Ｇ／Ａ）について、Ｓｔｒｏｋｅとの関連について検討を行なった。

健常人およびＳｔｒｏｋｅ患者それぞれ１９５例のゲノムＤＮＡを用いてタイピング研究を行なった。健常人および患者は性別比および年齢（±２歳）が同一になるように調製した。すなわち、健常人および患者における性別比はいずれも男性８１．０％および女性１９．０％であった。年齢の平均は、健常人で５７．７±５．７歳、患者では５７．８±６．１歳であった。

その結果、エキソン１２における変異〔１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）〕がＳｔｒｏｋｅと関連することを示唆するデータが得られた。野生型ＣＣ、ヘテロ接合体ＣＧおよびホモ接合体ＧＧの発現は、Ｓｔｒｏｋｅにおいてそれぞれ１３０例（６６．７％）、５３例（２７．２％）および１２例（６．２％）で認められた。一方、健常人においてはそれぞれ１４５例（７４．４％）、４２例（２１．５％）および８例（４．１％）で認められた。統計手法としてマックネーマー法を用い、健常人および患者における変異の発現頻度を解析した。その結果、Ｓｔｒｏｋｅにおいてヘテロ接合体ＣＧでオッズ比１．０３４、ホモ接合体ＧＧでオッズ比４．０００が得られ、遺伝子型相対危険度が高くなった。

このことから、１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）変異はＳｔｒｏｋｅ発症の危険因子の１つである可能性が考えられる。

ＴＴＰ／ＨＵＳ患者由来のゲノムＤＮＡ試料について、ｖＷＦ切断酵素遺伝子の変異の検出を行なった。検出は、試料中のｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡから標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイターミネーター法にて決定することにより実施した。

ＤＮＡ試料２μｌに、ＰＣＲ反応液およびＰＣＲプライマーを添加し、ＰＣＲを以下の条件で行なった。ＰＣＲ用のポリメラーゼは、Ｅｘ−ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲにより得られた溶液は４℃で保存した。ＰＣＲにより得られた溶液の一部をアガロースゲルで展開し、増幅産物が推定長であることを確認した。その後、ＰＣＲにより得られた溶液から増幅産物をＥｘｏＳＡＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製した。
ＰＣＲ条件
１）９４℃ ４分間
２）９４℃ ３０秒間
３）６０℃ ３０秒間
４）７２℃ １分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）７２℃ ３分間

ＰＣＲ増幅産物の塩基配列の決定を、ＰＣＲ産物を鋳型にしてダイターミネータ法にて実施した。シーケエンスは、シーケンシング用プライマーおよびＭｅｇａＢＡＣＥＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて実施し、得られた反応産物をＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製）またはセファデックスＧ５０にて精製した。シーケンシング用プライマーはＰＣＲに用いたプライマーと同一のものを用いた。シーケンサーにはＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。その結果を表５に示す。

^＊＊：塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９０２５に記載されたヒトｖＷＦ切断酵素遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における位置として示す。
^＃：配列番号１に記載のｃＤＮＡ塩基配列第２１６０位に相当する塩基はＡである。但し、日本人ではこの位置の塩基はＧがドミナントである。
^＃＃：配列番号１に記載のｃＤＮＡ塩基配列第２７２４位に相当する塩基はＣである。但し、日本人においてはこの位置の塩基がＴであるアレルが多い。

表５に示したように、ＴＴＰ／ＨＵＳ患者のｖＷＦ切断酵素遺伝子において、アミノ酸変異を伴う１塩基変異４種（Ｔ３３９Ｒ、Ｑ４４８ＥおよびＰ６１８Ａ）およびアミノ酸変異を伴わない１塩基変異１種（Ｔ５７２ＴおよびＧ７６０Ｇ）が検出された。検出された上記変異のうち、１４６０Ｇ（Ｔ３３９Ｒ）は今までに報告されていない新規１塩基変異であった。一方、２２９６Ｇ（Ｐ６１８Ａ）およびこの変異とＴＴＰとの関連の可能性については既に報告されている。１７８６Ｇ（Ｑ４４８Ｅ）、２１６０Ａ（Ｔ５７２Ｔ）および２７２４Ｃ（Ｇ７６０Ｇ）は、実施例１でＴＴＰ患者のｖＷＦ切断酵素遺伝子において検出された変異である。

表１に示した１塩基変異を検出するために用いたプライマーを以下に示す。
エキソン９のプライマー
フォワードプライマー；配列番号４２
リバースプライマー；配列番号４３
エキソン１２のプライマー
フォワードプライマー；配列番号１１
リバースプライマー；配列番号１２
エキソン１５のＰＣＲプライマー
フォワードプライマー；配列番号１９
リバースプライマー；配列番号２０
エキソン１６のプライマー
フォワードプライマー；配列番号４４
リバースプライマー；配列番号４５
エキソン１９のプライマー
フォワードプライマー；配列番号２３
リバースプライマー；配列番号２４

本発明によれば、ｖＷＦ切断酵素の活性低下によるｖＷＦの異常に起因する疾患、例えば血栓性疾患、具体的にはＴＴＰ、ＨＵＳ、ＣＡＤあるいはＳｔｒｏｋｅなどの罹患危険率の判定および早期診断の実施が可能になる。本発明は、血栓性疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用であり、医薬分野において多大に寄与するものである。

配列番号３：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号４：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号５：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号６：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号７：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン７の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号８：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン７の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号９：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン７の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１０：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン７の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１１：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１２の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１２：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１２の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１３：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１２の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１４：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１２の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１５：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１３の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１６：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１３の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１７：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１３の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１８：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１３の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号１９：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１５の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２０：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１５の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２１：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１５の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２２：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１５の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２３：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１９の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２４：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１９の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２５：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１９の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２６：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１９の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２７：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２０の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２８：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２０の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号２９：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２０の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３０：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２０の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３１：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２１の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３２：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２１の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３３：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２１の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３４：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン２１の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３５：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン４の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３６：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン４の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３７：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３８：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン３の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号３９：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン４の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号４０：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のイントロン３由来の塩基配列。
配列番号４１：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のイントロン３由来の塩基配列。
配列番号４２：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン９の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号４３：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン９の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号４４：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１６の上流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。
配列番号４５：ｖＷＦ切断酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿０３５０１４．３に記載）のエキソン１６の下流の塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチド。

Claims

ヒトのフォンビルブラント因子切断酵素遺伝子（以下、ｖＷＦ−ＣＰ遺伝子と略称する）内の塩基であって、配列表の配列番号１に記載のｃＤＮＡにおける位置として第１７８６位の塩基であると定義される塩基がグアニンである１塩基変異を検出することを特徴とする、冠動脈疾患または脳卒中を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法。
ヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子内の塩基であって、配列表の配列番号１に記載のｃＤＮＡにおける位置として第１７８６位の塩基であると定義される塩基がグアニンである１塩基変異の検出を以下の工程を含む方法で行なうことを特徴とする、請求項１に記載の検出方法；
（ｉ）配列番号１１および配列番号１２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、配列番号１３および配列番号１４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行なう工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１３および配列番号１４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
請求項１または２に記載の検出方法を用いて、被検試料中のヒトｖＷＦ−ＣＰ遺伝子内の塩基であって、配列表の配列番号１に記載のｃＤＮＡにおける位置として第１７８６位の塩基であると定義される塩基を決定し、当該位置における塩基がグアニンであるときに、冠動脈疾患または脳卒中を罹患する可能性があると判定する、冠動脈疾患または脳卒中の罹患可能性の検査方法。