JP4121764B2 - 血栓形成傾向素因の検査方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血栓形成傾向(thrombophilia)素因を検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０%の患者が3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。現在では血漿交換によって、予後が大幅に改善されるようになっている。
【０００３】
最近、TTPの病因としてvon Willebrand因子(VWF)切断酵素活性の低下が報告された。すなわち、後天性のTTPは、VWF切断酵素に対するIgG型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた(Furlan M.,et al., New Engl. J. Med. 339,1578-1584,1998; Tsai H-M.,et al.,New Engl. J. Med.339,1585-1594,1988)。また先天的なTTPであるUpshaw-Schulman症候群(USS)では、遺伝的にVWF切断酵素が欠損していることが判明した(Kinoshita S.et al.,Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【０００４】
更に、VWF切断酵素をコードする遺伝子は、ADAMTS13であることが判明した(Soejima K. et al., J Biochem.130,475-480,2001; Zheng X.et al.,J. Biol. Chem.276,41059-41063,2001)。またUSS患者と、ADAMTS13遺伝子におけるスプライシングの異常や塩基の欠失等の遺伝子異常との関連が報告された(Levy GG.et al.Nature,413,488-494,2001)。この報告では、ADAMTS13遺伝子におけるSNPsの存在も明らかにされている。しかしSNPsと何らかの疾患を結びつける知見は得られていない。
【０００５】
一方、血栓症には、USSのような先天性の疾患のみならず、様々な要因で誘導される後天的な疾患も知られている。たとえば抗血小板性の薬剤の投与が、血栓症の副作用をもたらすことが知られている。塩酸チクロピジンは、血管手術や虚血性脳血管障害等に伴う血栓・塞栓の治療や慢性動脈閉塞症に伴う症状の改善などに使用されている抗血小板剤である。副作用としてTTPが伴う可能性があるので、同剤の投与には注意が必要とされている。
【０００６】
より副作用の少ない抗血小板剤としてクロピトグレルが開発されている。しかし、このような新しい薬剤においても、副作用の危険性を無視することはできない。また、副作用であるTTPの危険性を予測することができれば、塩酸チクロピジンのような薬剤であっても安全に使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血栓形成傾向素因の検査方法、および血栓形成傾向素因を改善することができる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血栓形成傾向に関連する遺伝的な素因を明らかにすれば、血栓を伴う様々な疾患の危険性の予測、あるいは予防が可能になると考えた。たとえば抗血小板剤の副作用であるTTPも、投与される患者の血栓形成傾向を予め知ることができれば、未然に防止できるのではないかと考えた。
【０００９】
そして血栓形成傾向素因の指標を幅広く探索した結果、ADAMTS13遺伝子の多型と、血栓形成傾向素因の関連性とを見出した。そして、ADAMTS13遺伝子の多型を指標として、血栓形成傾向を検査できることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の検査方法、およびスクリーニング方法に関する。
〔１〕被検者から生体試料を採取し、該試料を解析してVWF切断酵素の活性低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型を検出する工程を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
〔２〕多型が、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位における多型である〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕多型が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンをセリンに変異させる多型である〔２〕に記載の検査方法。
〔４〕多型が、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcからtへの置換である、〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕次の工程(ａ)〜(ｃ)を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
（ａ）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ）生体試料中に含まれるゲノムDNA、mRNA、およびそれらの増幅産物のいずれかを、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する塩基がtに置換された塩基配列を含む領域にハイブリダイズするプローブとハイブリダイズ可能な条件下で接触させる工程、および
（ｃ）工程（ｂ）におけるプローブのハイブリダイズを血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔６〕次の工程(ａ’)〜(ｃ’)を含む、〔５〕に記載の検査方法。
（ａ’）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ’）生体試料中に含まれるゲノムDNA、mRNA、およびそれらの増幅産物のいずれかを、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域にハイブリダイズするプローブとハイブリダイズ可能な条件下で接触させる工程、および
（ｃ’）工程（ｂ）および（ｂ’）におけるプローブのハイブリダイズを血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔７〕次の工程(ａ)〜(ｃ)を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
（ａ）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ）生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質を検出する工程、および
（ｃ）４７５位のプロリンがセリンに変異した蛋白質の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔８〕次の工程(ａ’)〜(ｃ’)を含む、〔７〕に記載の検査方法。
（ａ’）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ’）生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を検出する工程、および
（ｃ’）４７５位のプロリンがセリンに変異した蛋白質、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔９〕配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補鎖にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１０〕配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するためのプライマーセットを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１１〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質に結合する抗体を含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質を、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に識別する抗体。
〔１３〕次の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質および／または該蛋白質を発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）前記蛋白質および／または細胞に対し被験化合物を接触させる工程、および
（ｃ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出し、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用と関連付ける工程
〔１４〕 次の工程（１）〜（２）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（１）〔１３〕に記載の方法によって、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する工程、および
（２）（１）で評価された作用が、被験化合物を接触させない場合の活性と比較して大きい被験化合物を選択する工程
〔１５〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を含む、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンのセリンへの変異を含むVWF切断酵素の活性促進剤。
〔１６〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物、および血栓形成傾向を誘導する薬剤を含む、血栓形成傾向の副作用が軽減された抗血小板医薬組成物。
〔１７〕配列番号：３に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド。
〔１８〕次の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質。
（Ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列から選択され、４７５位のセリンを含み、かつ連続した少なくとも７アミノ酸からなるアミノ酸配列を含む蛋白質
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検者から生体試料を採取し、該試料を解析してVWF切断酵素の活性低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型を検出する工程を含む、血栓形成傾向素因の検査方法に関する。
【００１１】
本発明において、血栓形成傾向(thrombophilia)とは、血栓を形成しやすい状態にあることを意味する。血栓を生じやすい状態とは、言いかえれば、血栓による疾患のリスクが高まった状態とも言うことができる。また血栓形成傾向素因(thrombophilic diathesis)とは、正常なヒトとの比較において、遺伝的に血栓を生じやすい体質を言う。血栓形成傾向素因は、特定の条件下において、血栓を生じやすい場合を含む。したがって、一般的な条件下では血栓の形成傾向に差が無いが、特定の薬剤の投与に伴って、血栓形成のリスクが高まる個体は、血栓形成傾向を有すると言うことができる。
【００１２】
本発明者らにより、ADAMTS13遺伝子を構成する特定のエキソンにおける多型が、血栓形成傾向素因を決定していることが明らかにされた。ADAMTS13遺伝子の構造は既に明らかにされている(GenBank Accession No. AB069698)。また、ADAMTS13遺伝子の欠損がUSSの原因であることも知られている。更に、ADAMTS13遺伝子の多型についての報告もある。たとえばLevyは、１、４、５、６、１２、１５、１６、１８、１９、２１、２３、２４、あるいは２９の各エキソンにSNPsがあることを報告した(Levy GG.et al.Nature,413,488-494,2001)。しかしこれらのSNPsと、血栓形成傾向素因の関連は知られていない。
【００１３】
これらの既知の知見に対して、本発明者らは、エキソン１２の多型が血栓形成傾向と密接に関連していることを見出した。更に本発明者らは、エキソン１２の多型がVWF切断酵素の活性に大きな影響を与えることを明らかにした。VWF切断酵素の活性は、血栓の形成と溶解に深く関わっている。つまり、エキソン１２における多型は、個人の血栓形成傾向素因を左右する重要な要因であることが、本発明者らによって確認された。
【００１４】
ADAMTS13遺伝子は、配列番号：１に示した塩基配列を有する遺伝子である。この遺伝子は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードしている。ADAMTS13遺伝子は、全体で２９のエキソンで構成されていると考えられている。本発明者らは、このうちのエキソン１２に、VWF切断酵素の活性を低下させる原因となる多型が存在することを明らかした。配列番号：１の塩基配列中、1753-1879の１２７塩基からなる塩基配列が、ADAMTS13遺伝子のエキソン１２に相当する。エキソン１２を構成する塩基配列と、その塩基配列によってコードされているアミノ酸配列を図１に示した。なお図１は、１８６７位のcがtとなり、対応するコドンがセリンである多型の塩基配列、およびアミノ酸配列を示している。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には、人口中１%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、頻度が１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。本発明における多型の種類は制限されない。具体的には、例えば、一塩基多型(SNPs)や、あるいは数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等を示すことができる。さらに、多型部位の数についても特に制限されない。したがって複数の多型を検査の対象とすることができる。
【００１６】
ある多型がVWF切断酵素の酵素活性を低下させていることは、配列番号：１に示す塩基配列（野生型）の特定の塩基を変化させた遺伝子改変体の発現産物のVWF切断酵素活性を野生型と比較することによって確認することができる。特定の塩基を置換、欠失、付加、あるいは挿入して遺伝子改変体を得る方法は公知である。たとえば、変異させた塩基配列を含むプライマーを利用したPCRにより、配列番号：１からなる野生型の塩基配列の特定の部位に変異を与えることができる。
あるいは、ADAMTS13遺伝子型が明らかになっている被検者から採取された血漿のVWF切断酵素活性を正常人と比較することによっても、VWF切断酵素活性に与える多型の影響を確認することができる。
【００１７】
遺伝子改変体は、適当な発現ベクターに組み込んで、蛋白質として発現させることができる。あるいは、in vitroにおいて、蛋白質に翻訳する技術も確立されている。発現生成物は、その酵素活性を評価することができる限り、精製する必要はない。あるいは、発現生成物にタグを付加しておいて、精製を容易にすることもできる。得られた、遺伝子改変体によってコードされたアミノ酸配列からなる蛋白質のVWF切断酵素活性を調べれれば、その変異の酵素活性に及ぼす影響を評価することができる。
【００１８】
VWF切断酵素活性を評価する方法は公知である。たとえば、実施例に示した方法(Kinoshita et al., Kinoshita S.et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)により、VWF切断酵素活性を測定することができる。
【００１９】
この方法は、in vitroでVWFを切断させ、その断片をVWFに対する抗体で検出するという原理に基づいている。測定に必要なVWFやその抗体の調製方法は公知である。たとえばこの検査に使用するVWFの精製方法は公知である（藤村吉博、他、日本血栓止血学会雑誌、10（4）：278-284, 1999）。また、抗VWF抗体は市販されている。
【００２０】
こうして特定された、エキソン１２におけるVWF切断酵素の活性を低下させる多型は、本発明における血栓形成傾向素因の指標とすることができる。エキソン１２は、VWF切断酵素活性を決定する重要な領域に相当している。したがって、このエキソンにおけるVWF切断酵素の活性を低下させる多型は、血栓形成傾向素因の重要な指標である。本発明において血栓形成傾向素因の指標とすべき多型として、配列番号：１に示すADAMTS13遺伝子の塩基配列（野生型）中、1867位(c)における多型を示すことができる。
【００２１】
1867位(c)における多型は、血栓形成傾向素因と密接に関連していた。特に、1867位のcがtに変異する場合、この変異は1867位を含むコドン（プロリン）をセリン(P475S)へと変異させる原因となる（図１）。VWF切断酵素におけるP475S変異は、酵素活性の低下をもたらし、その結果、血栓形成傾向素因が誘導されることになる。
日本人３６４人のADAMTS13遺伝子の解析の結果、遺伝子型は次のとおりであった。したがって、日本人におけるTアレルの頻度は５．１%ということになる。
CC:３２８人
CT: ３５人
TT: １人
【００２２】
本発明において、多型の検出とは、遺伝子型の特定を含む。すなわち本発明は、前記指標とする多型について、被験者がホモであるのかヘテロであるのかを解析し、その結果を血栓形成傾向素因と関連付ける工程を含む、検査方法に関する。
【００２３】
たとえば上記の1867位(c)における多型を指標とする場合には、この部位における塩基がtであるとき、被検者は血栓形成傾向素因を有すると判断される。同じ被験者について、この部位における塩基としてcも検出されれば、その被験者が野生型アレルを有していることを知ることができる。つまりこの被験者は、血栓形成傾向素因をヘテロで有すると結論つけられる。このような被験者は、tをホモで有する場合に比較して、血栓形成傾向が弱いと考えられる。このように、遺伝子型を明らかにすることにより、血栓形成傾向素因を、より定量的に予測することができる。
【００２４】
本発明の検査方法において、ADAMTS13遺伝子に生じた多型は、例えば、被検者のADAMTS13遺伝子の塩基配列を直接決定することにより検出することができる。具体的には、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
次いで、ADAMTS13遺伝子を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、ADAMTS13遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うこともできる。本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列は、当業者に公知の方法で決定することができる。
【００２５】
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ADAMTS13遺伝子の塩基配列を言う。たとえばGenBankに野生型として登録されているADAMTS13遺伝子の塩基配列（AB069698）と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のADAMTS13遺伝子の配列において、指標とすべき多型が見出された場合には、被験者は血栓形成傾向素因を有すると判定される。
【００２６】
本発明の検査方法は、直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。そして検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。
【００２７】
また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、ADAMTS13遺伝子を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR−RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
【００２８】
あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRでADAMTS13遺伝子を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２９】
さらに別の方法は、まず、被検者から調製したADAMTS13遺伝子を含むDNA、および該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板とを用意する。次いで、該DNAと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、ADAMTS13遺伝子多型を検出する。
【００３０】
このような方法としては、DNAアレイ法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）が例示できる。被検者からのADAMTS13遺伝子を含むDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該DNA試料の調製の好ましい態様においては、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。染色体DNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えばADAMTS13遺伝子を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNAを鋳型としたPCR等によってADAMTS13遺伝子を含むDNAを調製することも可能である。調製したDNA試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００３１】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレンを使用することができる。
【００３２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００３３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ADAMTS13遺伝子の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のADAMTS13遺伝子、あるいは多型を有するADAMTS13遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するADAMTS13遺伝子を含むDNA、または多型を有するADAMTS13遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100bであり、好ましくは10〜50bであり、さらに好ましくは15〜25bである。
【００３４】
本発明においては、次いで、該cDNA試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNA試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により設定することができる。
【００３５】
本発明においては、次いで、該DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００３６】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。
【００３７】
また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ADAMTS13遺伝子を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだADAMTS13遺伝子cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３８】
その他の本発明の多型の検出が可能な方法としては、
1)質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、
2)Taq-Man PCRによる方法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)、CYPへの応用例：Hiratsuka M et al., Biol. Pharm. Bull. vol.23, pp1131-1135, (2000)）、
3)Pyrosequencingによる方法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）、
4)Invader法による方法（Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)、メディカルドゥ社発行「遺伝子医学」 vol.4, No.1, pp44-51およびpp68-72 (2000)）
を挙げることができる。以上、種々の検出方法を例示したが、これらに限らず、VWF切断酵素活性の低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型の検出を可能にする方法であれば、任意の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明の検査方法は、DNAのみならず、蛋白質の解析によって実施することもできる。本発明において指標とすべき多型は、VWF切断酵素活性の低下をもたらす多型である。このような多型は、通常、アミノ酸配列の変異の原因となる。したがって、このアミノ酸配列の変異を指標として、本発明の検査方法を実施することができる。アミノ酸配列の相違を検出する方法は公知である。
【００４０】
たとえば、１８６７位の塩基cにおける多型が本発明における望ましい指標であることは既に述べた。１８６７位の塩基cは、tへの変異によって、この塩基を含むコドンに対応する４７５位のアミノ酸をプロリンからセリンに変異させる原因となる。変異によって生じる４７５位のアミノ酸残基がセリンに変異したアミノ酸配列からなる蛋白質を、抗体によって検出することができる。この変異蛋白質と野生型の蛋白質とは、構造的には１アミノ酸残基の違いを有する。このような微細な違いを識別する抗体を得る方法は公知である。たとえば、４７５位のアミノ酸残基がセリンに変異したアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを合成し、これを免疫原として、この領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体の中で、野生型の蛋白質と交差しないものを選択し、本発明の検査方法に利用することができる。
【００４１】
抗体を使って蛋白質を検出する方法は公知である。たとえば、変異型と野生型の両方に対して結合活性を有する抗体と、変異型に特異的に結合する抗体を組み合せて、サンドイッチ法を構成することができる。より具体的には、前者を固相抗体に、後者を標識抗体に用いたELISA法により、本発明における指標を検出することができる。抗体を酵素等で標識する方法は公知である。
【００４２】
本発明における指標を、抗体を用いて検出する場合にも、遺伝子型を検出することができる。すなわち、変異型の蛋白質と、野生型の蛋白質の、それぞれに特定的な抗体を用い、いずれか一方のみが反応する場合をホモ、両方の抗体で反応が観察された場合をヘテロと判定することができる。本発明において、蛋白質の解析によって検査を行う場合には、血液試料や、細胞のライセートが生体試料として用いられる。
【００４３】
本発明はまた、血栓形成傾向素因を検査するための検査薬を提供する。すなわち本発明は、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補鎖にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬である。これは遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
【００４４】
該オリゴヌクレオチドは、ADAMTS13遺伝子を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出するADAMTS13遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００４５】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15b〜100bであり、好ましくは17b〜30bである。プライマーは、多型部分を含むADAMTS13遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ADAMTS13遺伝子の１８６７位の塩基を含む領域に対応するDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15b以上の鎖長を有する。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００４７】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ADAMTS13遺伝子の１８６７位の塩基を含む領域に対応するDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる、血栓形成傾向素因の検査薬である。これは遺伝子多型を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
【００４８】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ADAMTS13遺伝子の１８６７位を含む領域に対応するDNAを増幅するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、血栓形成傾向素因の検査用試薬である。プライマーの長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、多型部分を含むADAMTS13遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４９】
上記の検査試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５０】
上記試薬には、検査に用いられる付加的な要素を組み合せることもできる。このような要素としては、たとえば以下のようなものを示すことができる。
陰性対照
陽性対照
野生型検出用プローブ
解析手順を記載した指示書
【００５１】
本発明の検査用試薬は、免疫学的な分析に必要な要素によって構成することもできる。すなわち本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む蛋白質に結合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しない抗体を含む、血栓形成傾向素因の検査試薬に関する。
【００５２】
本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む蛋白質に結合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しない抗体に関する。本発明において、抗体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しないとは、この抗体が野生型の蛋白質とは実質的に反応しないことを言う。より具体的には、たとえば、変異蛋白質との結合が観察されるのと同じ条件下において、野生型の蛋白質との結合が検出限界に満たないとき、その抗体は野生型の蛋白質とは実質的に反応しないと言うことができる。
【００５３】
このような抗体は、先に述べたように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む、オリゴペプチドを免疫原として得ることができる。免疫原は、通常、適当なキャリアー蛋白質に結合し、更にアジュバントに懸濁させて動物に免疫される。キャリアー蛋白質としては、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。
【００５４】
抗体がモノクローナル抗体であれば、免疫原として用いたオリゴペプチドや、変異型の蛋白質を固定化したプレートを使ったELISA法によって、変異型蛋白質に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。更に、変異型蛋白質に対する結合活性を有する抗体の中から、野生型の蛋白質に対して交差しないものを選択すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００５５】
また本発明は、次の工程（ａ）−（ｄ）を含む、被験化合物の、塩基の置換によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を評価する方法を提供する。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質および／または該蛋白質を発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）前記蛋白質および／または細胞に対し被験化合物を接触させる工程、
（ｃ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出する工程、および
（ｄ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出し、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用と関連付ける工程
【００５６】
前記評価方法において、工程（ｃ）で検出される酵素活性が、被験化合物を接触させなかった対照と比較して差が見られた場合、この差は、当該化合物の（ａ）に記載の蛋白質のVWF切断酵素活性に対する作用と関連付けることができる。すなわち、対照と比較して（ｃ）で検出される酵素活性が対照と比較して大きい場合、その大きさは、当該化合物の（ａ）に記載の蛋白質のVWF切断酵素活性を上昇させる作用のレベルを示している。
【００５７】
複数の化合物の間で前記（ａ）−（ｃ）の工程を行って、化合物間で前記作用の大きさを比較することもできる。更に、特定の化合物の作用を基準として、より大きな作用を有する化合物を同定することもできる。
本発明の評価方法は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質の活性を上昇させる化合物のスクリーニング方法に有用である。
【００５８】
また本発明は、次の工程（１）〜（２）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
（１）前記工程（ａ）−（ｄ）を含む被験化合物の、塩基の置換によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を評価する方法によって、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する工程、および
（２）（１）で評価された作用が、被験化合物を接触させない場合の活性と比較して大きい被験化合物を選択する工程
【００５９】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質は、塩基の置換によってもたらされた、VWF切断酵素活性が低下した変異体である。当該変異体の酵素活性を上昇させる活性を有する化合物は、血栓形成傾向素因を有する患者の、血栓形成傾向を改善するための薬剤として有用である。
本発明は、当該変異体が血栓形成傾向素因の原因となっていることを見出した。したがって、当該変異体の活性の制御によって、血栓形成傾向素因の治療が実現することは、本発明によってもたらされた新規な知見である。
【００６０】
本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法は、VWF切断酵素の酵素活性を指標とする方法である。本方法においては、まず、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列からなる蛋白質、および／またはこの蛋白質を発現する細胞を発現する細胞に、被験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられるが、これらの由来に制限されない。
【００６１】
このような細胞としては、前記蛋白質をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列中、そのコード領域を含み、１８６７位のcに相当する塩基がtに置換された遺伝子を導入した細胞は、本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法に用いることができる。このような細胞は、通常、該遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ形質転換することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００６２】
あるいはこうして得られた形質転換細胞が発現する前記蛋白質を精製して本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法に用いることができる。形質転換細胞、あるいはその培養上清から、発現生成物を精製する方法は公知である。まず形質転換体を、導入した変異体をコードする遺伝子が発現可能な条件下で培養する。次いで、たとえば、プロテアーゼ阻害剤などのたんぱく質保護剤の存在下で形質転換体を破砕し、塩析などによって蛋白質を分取する。得られた蛋白質画分は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、各種アフィニティクロマトグラフィー等の精製技術を使って精製することができる。変異体蛋白質に、更に親和性を有するタグを付加した蛋白質を発現させれば、このタグを利用したアフィニティ精製を利用することもできる。
【００６３】
また本方法に用いる被験化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００６４】
４７５位のアミノ酸残基がセリンであるVWF切断酵素変異体、またはそれを発現する細胞への被験化合物の「接触」は、通常、該遺伝子を発現する細胞の培養液に被験化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。たとえば被験化合物が蛋白質の場合には、該蛋白質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、両者を「接触」させることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、次いで、該遺伝子の発現産物であるVWF切断酵素の活性を測定する。VWF切断酵素の活性は、たとえば実施例に示したような方法により測定することができる(Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【００６５】
次いで、被験化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、VWF切断酵素活性を上昇させる化合物を選択する。
【００６６】
また本発明は、配列番号：３に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいはその断片の製造に有用である。あるいは、上記評価方法またはスクリーニング方法に用いるための細胞を得るために用いることができる。
【００６７】
更に本発明は、次の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質に関する。
（Ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列から選択され、４７５位のセリンを含み、かつ連続した少なくとも７アミノ酸からなるアミノ酸配列を含む蛋白質
（Ａ）に記載の蛋白質は、実際にヒトにおいて見出されたVWF切断酵素活性の低下の原因となる多型を含むＤＮＡによってコードされた蛋白質である。この蛋白質はVWF切断酵素活性が低下している。この蛋白質を用いて、前記の評価方法やスクリーニング方法により、低下した活性を上昇させる作用を有する化合物を選択することができる。
【００６８】
また前記（Ｂ）の蛋白質は、野生型の蛋白質と変異型の蛋白質を識別し得る抗体を得るための免疫原として有用である。一般に、７アミノ酸を越える連続したアミノ酸配列が、異なる蛋白質の間で一致する可能性はきわめて低い。したがって、前記少なくとも７アミノ酸残基からなる蛋白質は、変異型の蛋白質を識別する抗体の免疫原として有用である。
【００６９】
本発明のスクリーニングによって得ることができる化合物は、その化合物自体、VWF切断酵素活性の促進剤として有用である。本発明のスクリーニング方法により取得される化合物は、その化合物自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。例えば経口投与の場合、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等、経皮投与の場合、ハップ剤等を示すことができるが、これらに制限されない。投与方法として、投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。
【００７０】
これらの化合物がDNAである場合、該DNAを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター、或いは、naked DNAの形態で利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。
【００７１】
あるいは本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物を、副作用として血栓形成傾向をもたらす可能性がある薬剤に配合して、副作用が軽減された医薬品製剤とすることもできる。たとえば、抗血小板性の医薬品には、血栓形成傾向が副作用として現れる場合があることが報告されている。より具体的には、チクロピジンを血栓形成傾向素因を有する患者に投与した場合、TTPを引き起こす可能性が指摘されている。TTPは、血栓形成傾向を背景として生じる、血栓性の病態である。しがって、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物を、このような血栓形成の副作用を伴う薬剤に配合することにより、安全性の高い薬剤とすることができる。
【００７２】
本発明のスクリーニングによって得ることができる化合物の投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき0.1 mgから500 mgの範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【００７３】
【実施例】
（１）ADAMTS13遺伝子エキソン１２の塩基配列解析
血栓性血小板減少性紫斑病患者家系4名（患者、父、母、姉）、および一般人364名の全血からゲノムDNAを抽出した（クラボウ社の自動核酸精製装置NA-3000を使用）。いずれも当該倫理委員会の承認を得た試料である。これを鋳型に、エキソン１２をはさむイントロンの配列から作成した２本のオリゴヌクレオチド5'-TGAGGCCACACCCACATCTTG-3'（配列番号：５）および5'-ATGCCAGAGCCTGAACCACTT-3'（配列番号：６）をプライマーとして、Roche社のFastStart Taq DNA polymeraseでPCRを行った。反応条件は、95℃/4分、(95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/1分)×30サイクル、72℃/3分であった。反応産物の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Kitおよび3700 DNA Analyzerで解析した。
【００７４】
（２）血漿中VWF切断酵素活性の測定
上述の血栓性血小板減少性紫斑病患者家系からクエン酸ナトリウム法で血漿を採取した。この血漿10 μlに、終濃度10 μg/mlの精製 von Willebrand因子、10 mM BaCl2および1 mM phenylmethylsulfonyl fluorideを加えた尿素含有低イオン強度緩衝液（1.5 M尿素、5 mM Tris-HCl、pH 8.0）90 μlを加えて37℃で24時間加温した。その後、SDSアガロース電気泳動を行い、さらにウェスタンブロットによりPVDF膜に転写した。抗von Willebrand因子抗体によりvon Willebrand因子を可視化し、その切断程度を定量評価した(Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【００７５】
（３）結果
一般人３６４名の遺伝子解析の結果、１２７塩基対からなるエキソン１２の１１５位（cDNA全体では１８６７位）のCがTに変異した多型を見出した。CCホモ接合体を有する者が３２８名、CTヘテロ接合体を有する者が３５名、TTホモ接合体を有する者が１名であった。
【００７６】
一方、血栓性血小板減少性紫斑病患者家系4名のVWF切断酵素活性は、正常血漿を100%として、患者3%未満（検出限界以下）、父5.6%、母36%、姉30%であった（Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001）。遺伝子解析の結果、患者および両親にはエキソン１２以外に責任変異が見出されたが、姉には上述のC/T多型（475位のプロリンからセリンへの変異）がヘテロ接合体として見出されたのみであった。すなわち、活性と併せて考えると、この変異はVWF切断酵素の活性に重大な欠陥をもたらすことがわかった。
以上の結果から、一般人の約10%はエキソン１２に変異を有し、VWF切断酵素活性が低下していることが示された。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、血栓形成傾向素因の検査方法を提供した。本発明の検査方法は、血栓形成傾向の原因となるVWF切断酵素の酵素活性の変化の原因となっている多型を指標としているため、この素因を直接的に検出することができる。また、本発明における検査指標は、遺伝子の多型であることから、DNAの解析技術を使って、容易に検出することができる。あるいは、本発明者らが見出した多型はアミノ酸配列の変異を伴っていることから、蛋白質の免疫学的な解析によって、血栓形成傾向素因を明らかにすることもできる。
【００７８】
血栓形成傾向素因を遺伝子の塩基配列や、蛋白質の構造的な相違に基づいて検査できることは、実用上、大きな利点である。たとえば、VWF切断酵素の活性を測定して血栓形成傾向素因と関連付ける方法が可能かもしれない。しかし、VWF切断酵素の活性測定には、基質となる蛋白質や、それを認識する抗体が必要である。そのため日常的な検査方法として採用するには、経済的とは言いにくい。またその操作も煩雑であるため、普及を妨げる要因となる。
【００７９】
これに対して本発明の検査方法によれば、遺伝子の塩基配列や蛋白質の構造の違いによって、血栓形成傾向素因を検査することができる。遺伝子の塩基配列は、DNAチップやPCR法を使って簡便に、かつ安価に解析することができる。あるいは、蛋白質の構造の違いも、イムノアッセイなどによって、迅速に、かつ安価に解析することができる。このように、特定のエキソンにおける多型と血栓形成傾向素因との間の関連性を特定したことによって、より容易に、かつ安価に血栓形成傾向素因を検査することが可能となった。
【００８０】
血栓形成傾向素因は、様々な血栓性疾患の基礎を構成する重要な素因である。たとえば、抗血小板性の医薬品の投与によって引き起こされる、血栓性血小板減少性紫斑病においては、患者の血栓形成傾向が病態形成に果たす役割は大きい。しかしこれまでは血栓形成傾向の適切な指標が無かったために、投与前に、血栓形成傾向を予測することは困難であった。一方本発明の指標を用いれば、遺伝子型やVWF切断酵素蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、血栓形成傾向素因を、正しく評価することができる。このように、血栓形成傾向素因の適切な指標を提供した本発明の有用性は明らかである。
【００８１】
更に本発明は、変異によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供した。本発明のスクリーニング方法によって、血栓形成傾向素因の原因となっている、VWF切断酵素の活性を促進する化合物を選択することができる。このような化合物は、VWF切断酵素活性の促進剤として有用である。あるいは本発明によって選択される化合物を抗血小板性の製剤に配合することによって、血栓形成性の副作用が軽減された薬剤とすることができる。
【００８２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> MIYATA, TOSHIYUKI
<120> A Method for testing of thrombophilic diathesis
<130> NCV-A0201
<140> JP 2002-111241
<141> 2002-04-12
<160> 6
<170> PatentIn version 2.1
<210> 1
<211> 4933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaccacgatg tctttggcac agcctctcat ctgtcagatg ggagcgggga ccccggagag 60
ggagtcagcc gaggtcctgg cattccttgt gaacccccgt ctgtgggttt ctggtccagt 120
gtcccttctc cagattagat ggcttaggcc tcctctaagg gggtgggcgt gcacatccgg 180
agagctgtct ggtgtgcagg actgggctgc aggttaccct gaactgcaac catcttagag 240
caaggcccag cttgcagcag gaggagctgc aggccgccca ccctagccac ggcccctgcc 300
ctggcaggaa gcttccaaga gtaaacactg cctaatcgtc ccgcccagta gtgagcaggc 360
ctgtcccatt ccatactgac cagattccca gtcaccaagg ccccctctca ctccgctcca 420
ctcctcgggc tggctctcct gaggatgcac cagcgtcacc cccgggcaag atgccctccc 480
ctctgtgtgg ccggaatcct tgcctgtggc tttctcctgg gctgctgggg accctcccat 540
ttccagcaga gttgtcttca ggctttggag ccacaggccg tgtcttctta cttgagccct 600
ggtgctccct taaaaggccg ccctccttcc cctggcttcc agaggcagag gcagaggcag 660
aggcgggctg caggcggcat cctacacctg gagctgctgg tggccgtggg ccccgatgtc 720
ttccaggctc accaggagga cacagagcgc tatgtgctca ccaacctcaa catcggggca 780
gaactgcttc gggacccgtc cctgggggct cagtttcggg tgcacctggt gaagatggtc 840
attctgacag agcctgaggg tgctccaaat atcacagcca acctcacctc gtccctgctg 900
agcgtctgtg ggtggagcca gaccatcaac cctgaggacg acacggatcc tggccatgct 960
gacctggtcc tctatatcac taggtttgac ctggagttgc ctgatggtaa ccggcaggtg 1020
cggggcgtca cccagctggg cggtgcctgc tccccaacct ggagctgcct cattaccgag 1080
gacactggct tcgacctggg agtcaccatt gcccatgaga ttgggcacag cttcggcctg 1140
gagcacgacg gcgcgcccgg cagcggctgc ggccccagcg gacacgtgat ggcttcggac 1200
ggcgccgcgc cccgcgccgg cctcgcctgg tccccctgca gccgccggca gctgctgagc 1260
ctgctcagcg caggacgggc gcgctgcgtg tgggacccgc cgcggcctca acccgggtcc 1320
gcggggcacc cgccggatgc gcagcctggc ctctactaca gcgccaacga gcagtgccgc 1380
gtggccttcg gccccaaggc tgtcgcctgc accttcgcca gggagcacct ggatatgtgc 1440
caggccctct cctgccacac agacccgctg gaccaaagca gctgcagccg cctcctcgtt 1500
cctctcctgg atgggacaga atgtggcgtg gagaagtggt gctccaaggg tcgctgccgc 1560
tccctggtgg agctgacccc catagcagca gtgcatgggc gctggtctag ctggggtccc 1620
cgaagtcctt gctcccgctc ctgcggagga ggtgtggtca ccaggaggcg gcagtgcaac 1680
aaccccagac ctgcctttgg ggggcgtgca tgtgttggtg ctgacctcca ggccgagatg 1740
tgcaacactc aggcctgcga gaagacccag ctggagttca tgtcgcaaca gtgcgccagg 1800
accgacggcc agccgctgcg ctcctcccct ggcggcgcct ccttctacca ctggggtgct 1860
gctgtaccac acagccaagg ggatgctctg tgcagacaca tgtgccgggc cattggcgag 1920
agcttcatca tgaagcgtgg agacagcttc ctcgatggga cccggtgtat gccaagtggc 1980
ccccgggagg acgggaccct gagcctgtgt gtgtcgggca gctgcaggac atttggctgt 2040
gatggtagga tggactccca gcaggtatgg gacaggtgcc aggtgtgtgg tggggacaac 2100
agcacgtgca gcccacggaa gggctctttc acagctggca gagcgagaga atatgtcacg 2160
tttctgacag ttacccccaa cctgaccagt gtctacattg ccaaccacag gcctctcttc 2220
acacacttgg cggtgaggat cggagggcgc tatgtcgtgg ctgggaagat gagcatctcc 2280
cctaacacca cctacccctc cctcctggag gatggtcgtg tcgagtacag agtggccctc 2340
accgaggacc ggctgccccg cctggaggag atccgcatct ggggacccct ccaggaagat 2400
gctgacatcc aggtttacag gcggtatggc gaggagtatg gcaacctcac ccgcccagac 2460
atcaccttca cctacttcca gcctaagcca cggcaggcct gggtgtgggc cgctgtgcgt 2520
gggccctgct cggtgagctg tggggcaggg ctgcgctggg taaactacag ctgcctggac 2580
caggccagga aggagttggt ggagactgtc cagtgccaag ggagccagca gccaccagcg 2640
tggccagagg cctgcgtgct cgaaccctgc cctccctact gggcggtggg agacttcggc 2700
ccatgcagcg cctcctgtgg gggcggcctg cgggagcggc cagtgcgctg cgtggaggcc 2760
cagggcagcc tcctgaagac attgccccca gcccggtgca gagcaggggc ccagcagcca 2820
gctgtggcgc tggaaacctg caacccccag ccctgccctg ccaggtggga ggtgtcagag 2880
cccagctcat gcacatcagc tggtggagca ggcctggcct tggagaacga gacctgtgtg 2940
ccaggggcag atggcctgga ggctccagtg actgaggggc ctggctccgt agatgagaag 3000
ctgcctgccc ctgagccctg tgtcgggatg tcatgtcctc caggctgggg ccatctggat 3060
gccacctctg caggggagaa ggctccctcc ccatggggca gcatcaggac gggggctcaa 3120
gctgcacacg tgtggacccc tgcggcaggg tcgtgctccg tctcctgcgg gcgaggtctg 3180
atggagctgc gtttcctgtg catggactct gccctcaggg tgcctgtcca ggaagagctg 3240
tgtggcctgg caagcaagcc tgggagccgg cgggaggtct gccaggctgt cccgtgccct 3300
gctcggtggc agtacaagct ggcggcctgc agcgtgagct gtgggagagg ggtcgtgcgg 3360
aggatcctgt attgtgcccg ggcccatggg gaggacgatg gtgaggagat cctgttggac 3420
acccagtgcc aggggctgcc tcgcccggaa ccccaggagg cctgcagcct ggagccctgc 3480
ccacctaggt ggaaagtcat gtcccttggc ccatgttcgg ccagctgtgg ccttggcact 3540
gctagacgct cggtggcctg tgtgcagctc gaccaaggcc aggacgtgga ggtggacgag 3600
gcggcctgtg cggcgctggt gcggcccgag gccagtgtcc cctgtctcat tgccgactgc 3660
acctaccgct ggcatgttgg cacctggatg gagtgctctg tttcctgtgg ggatggcatc 3720
cagcgccggc gtgacacctg cctcggaccc caggcccagg cgcctgtgcc agctgatttc 3780
tgccagcact tgcccaagcc ggtgactgtg cgtggctgct gggctgggcc ctgtgtggga 3840
cagggtacgc ccagcctggt gccccacgaa gaagccgctg ctccaggacg gaccacagcc 3900
acccctgctg gtgcctccct ggagtggtcc caggcccggg gcctgctctt ctccccggct 3960
ccccagcctc ggcggctcct gcccgggccc caggaaaact cagtgcagtc cagtgcctgt 4020
ggcaggcagc accttgagcc aacaggaacc attgacatgc gaggcccagg gcaggcagac 4080
tgtgcagtgg ccattgggcg gcccctcggg gaggtggtga ccctccgcgt ccttgagagt 4140
tctctcaact gcagtgcggg ggacatgttg ctgctttggg gccggctcac ctggaggaag 4200
atgtgcagga agctgttgga catgactttc agctccaaga ccaacacgct ggtggtgagg 4260
cagcgctgcg ggcggccagg aggtggggtg ctgctgcggt atgggagcca gcttgctcct 4320
gaaaccttct acagagaatg tgacatgcag ctctttgggc cctggggtga aatcgtgagc 4380
ccctcgctga gtccagccac gagtaatgca gggggctgcc ggctcttcat taatgtggct 4440
ccgcacgcac ggattgccat ccatgccctg gccaccaaca tgggcgctgg gaccgaggga 4500
gccaatgcca gctacatctt gatccgggac acccacagct tgaggaccac agcgttccat 4560
gggcagcagg tgctctactg ggagtcagag agcagccagg ctgagatgga gttcagcgag 4620
ggcttcctga aggctcaggc cagcctgcgg ggccagtact ggaccctcca atcatgggta 4680
ccggagatgc aggaccctca gtcctggaag ggaaaggaag gaacctgagg gtcattgaac 4740
atttgttccg tgtctggcca gccctggagg gttgacccct ggtctcagtg ctttccaatt 4800
cgaacttttt ccaatcttag gtatctactt tagagtcttc tccaatgtcc aaaaggctag 4860
ggggttggag gtggggactc tggaaaagca gcccccattt cctcgggtac caataaataa 4920
aacatgcagg ctg 4933
<210> 2
<211> 1427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro Ser His
20 25 30
Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly
50 55 60
Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu
65 70 75 80
His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro Asp Val Phe Gln Ala His
85 90 95
Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu
115 120 125
Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr
130 135 140
Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr
145 150 155 160
Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu
165 170 175
Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val
180 185 190
Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys
195 200 205
Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His
210 215 220
Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro
245 250 255
Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro
275 280 285
Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr
290 295 300
Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val
305 310 315 320
Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser
325 330 335
Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val
340 345 350
Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys
355 360 365
Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His
370 375 380
Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys
385 390 395 400
Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro
405 410 415
Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met
420 425 430
Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln
435 440 445
Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly
450 455 460
Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Pro His Ser Gln Gly Asp
465 470 475 480
Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met
485 490 495
Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly
500 505 510
Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg
515 520 525
Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg
530 535 540
Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly
545 550 555 560
Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val
565 570 575
Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile Ala Asn His Arg Pro Leu Phe
580 585 590
Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys
595 600 605
Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly
610 615 620
Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu
625 630 635 640
Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln
645 650 655
Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp
660 665 670
Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp
675 680 685
Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg
690 695 700
Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu
705 710 715 720
Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala
725 730 735
Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly
740 745 750
Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg
755 760 765
Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg
770 775 780
Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn
785 790 795 800
Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys
805 810 815
Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val
820 825 830
Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser
835 840 845
Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys
850 855 860
Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala
865 870 875 880
Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val
885 890 895
Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu
900 905 910
Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val
915 920 925
Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu
930 935 940
Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala
945 950 955 960
Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr
965 970 975
Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp
980 985 990
Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser
995 1000 1005
Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser Leu Gly Pro
1010 1015 1020
Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala
1025 1030 1035
Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val Asp Glu Ala
1040 1045 1050
Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu
1055 1060 1065
Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met Glu
1070 1075 1080
Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr
1085 1090 1095
Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys
1100 1105 1110
Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys Trp Ala Gly
1115 1120 1125
Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro His Glu Glu
1130 1135 1140
Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser
1145 1150 1155
Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro
1160 1165 1170
Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn Ser Val Gln
1175 1180 1185
Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ile
1190 1195 1200
Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val Ala Ile Gly
1205 1210 1215
Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser
1220 1225 1230
Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu
1235 1240 1245
Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser
1250 1255 1260
Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys Gly Arg Pro
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu
1280 1285 1290
Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly
1295 1300 1305
Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly
1310 1315 1320
Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile Ala
1325 1330 1335
Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala
1340 1345 1350
Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr
1355 1360 1365
Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser
1370 1375 1380
Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln
1385 1390 1395
Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro
1400 1405 1410
Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1415 1420 1425
<210> 3
<211> 4933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (445)..(4728)
<400> 3
aaccacgatg tctttggcac agcctctcat ctgtcagatg ggagcgggga ccccggagag 60
ggagtcagcc gaggtcctgg cattccttgt gaacccccgt ctgtgggttt ctggtccagt 120
gtcccttctc cagattagat ggcttaggcc tcctctaagg gggtgggcgt gcacatccgg 180
agagctgtct ggtgtgcagg actgggctgc aggttaccct gaactgcaac catcttagag 240
caaggcccag cttgcagcag gaggagctgc aggccgccca ccctagccac ggcccctgcc 300
ctggcaggaa gcttccaaga gtaaacactg cctaatcgtc ccgcccagta gtgagcaggc 360
ctgtcccatt ccatactgac cagattccca gtcaccaagg ccccctctca ctccgctcca 420
ctcctcgggc tggctctcct gagg atg cac cag cgt cac ccc cgg gca aga 471
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg
1 5
tgc cct ccc ctc tgt gtg gcc gga atc ctt gcc tgt ggc ttt ctc ctg 519
Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu
10 15 20 25
ggc tgc tgg gga ccc tcc cat ttc cag cag agt tgt ctt cag gct ttg 567
Gly Cys Trp Gly Pro Ser His Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu
30 35 40
gag cca cag gcc gtg tct tct tac ttg agc cct ggt gct ccc tta aaa 615
Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys
45 50 55
ggc cgc cct cct tcc cct ggc ttc cag agg cag agg cag agg cag agg 663
Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg
60 65 70
cgg gct gca ggc ggc atc cta cac ctg gag ctg ctg gtg gcc gtg ggc 711
Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly
75 80 85
ccc gat gtc ttc cag gct cac cag gag gac aca gag cgc tat gtg ctc 759
Pro Asp Val Phe Gln Ala His Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu
90 95 100 105
acc aac ctc aac atc ggg gca gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc ctg ggg 807
Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly
110 115 120
gct cag ttt cgg gtg cac ctg gtg aag atg gtc att ctg aca gag cct 855
Ala Gln Phe Arg Val His Leu Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro
125 130 135
gag ggt gct cca aat atc aca gcc aac ctc acc tcg tcc ctg ctg agc 903
Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser
140 145 150
gtc tgt ggg tgg agc cag acc atc aac cct gag gac gac acg gat cct 951
Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro
155 160 165
ggc cat gct gac ctg gtc ctc tat atc act agg ttt gac ctg gag ttg 999
Gly His Ala Asp Leu Val Leu Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu
170 175 180 185
cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc gtc acc cag ctg ggc ggt gcc 1047
Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala
190 195 200
tgc tcc cca acc tgg agc tgc ctc att acc gag gac act ggc ttc gac 1095
Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp
205 210 215
ctg gga gtc acc att gcc cat gag att ggg cac agc ttc ggc ctg gag 1143
Leu Gly Val Thr Ile Ala His Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu
220 225 230
cac gac ggc gcg ccc ggc agc ggc tgc ggc ccc agc gga cac gtg atg 1191
His Asp Gly Ala Pro Gly Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met
235 240 245
gct tcg gac ggc gcc gcg ccc cgc gcc ggc ctc gcc tgg tcc ccc tgc 1239
Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys
250 255 260 265
agc cgc cgg cag ctg ctg agc ctg ctc agc gca gga cgg gcg cgc tgc 1287
Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys
270 275 280
gtg tgg gac ccg ccg cgg cct caa ccc ggg tcc gcg ggg cac ccg ccg 1335
Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro
285 290 295
gat gcg cag cct ggc ctc tac tac agc gcc aac gag cag tgc cgc gtg 1383
Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val
300 305 310
gcc ttc ggc ccc aag gct gtc gcc tgc acc ttc gcc agg gag cac ctg 1431
Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu
315 320 325
gat atg tgc cag gcc ctc tcc tgc cac aca gac ccg ctg gac caa agc 1479
Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser
330 335 340 345
agc tgc agc cgc ctc ctc gtt cct ctc ctg gat ggg aca gaa tgt ggc 1527
Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly
350 355 360
gtg gag aag tgg tgc tcc aag ggt cgc tgc cgc tcc ctg gtg gag ctg 1575
Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu
365 370 375
acc ccc ata gca gca gtg cat ggg cgc tgg tct agc tgg ggt ccc cga 1623
Thr Pro Ile Ala Ala Val His Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg
380 385 390
agt cct tgc tcc cgc tcc tgc gga gga ggt gtg gtc acc agg agg cgg 1671
Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg
395 400 405
cag tgc aac aac ccc aga cct gcc ttt ggg ggg cgt gca tgt gtt ggt 1719
Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly
410 415 420 425
gct gac ctc cag gcc gag atg tgc aac act cag gcc tgc gag aag acc 1767
Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr
430 435 440
cag ctg gag ttc atg tcg caa cag tgc gcc agg acc gac ggc cag ccg 1815
Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro
445 450 455
ctg cgc tcc tcc cct ggc ggc gcc tcc ttc tac cac tgg ggt gct gct 1863
Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala
460 465 470
gta tca cac agc caa ggg gat gct ctg tgc aga cac atg tgc cgg gcc 1911
Val Ser His Ser Gln Gly Asp Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala
475 480 485
att ggc gag agc ttc atc atg aag cgt gga gac agc ttc ctc gat ggg 1959
Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly
490 495 500 505
acc cgg tgt atg cca agt ggc ccc cgg gag gac ggg acc ctg agc ctg 2007
Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu
510 515 520
tgt gtg tcg ggc agc tgc agg aca ttt ggc tgt gat ggt agg atg gac 2055
Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp
525 530 535
tcc cag cag gta tgg gac agg tgc cag gtg tgt ggt ggg gac aac agc 2103
Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser
540 545 550
acg tgc agc cca cgg aag ggc tct ttc aca gct ggc aga gcg aga gaa 2151
Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu
555 560 565
tat gtc acg ttt ctg aca gtt acc ccc aac ctg acc agt gtc tac att 2199
Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile
570 575 580 585
gcc aac cac agg cct ctc ttc aca cac ttg gcg gtg agg atc gga ggg 2247
Ala Asn His Arg Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly
590 595 600
cgc tat gtc gtg gct ggg aag atg agc atc tcc cct aac acc acc tac 2295
Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr
605 610 615
ccc tcc ctc ctg gag gat ggt cgt gtc gag tac aga gtg gcc ctc acc 2343
Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr
620 625 630
gag gac cgg ctg ccc cgc ctg gag gag atc cgc atc tgg gga ccc ctc 2391
Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu
635 640 645
cag gaa gat gct gac atc cag gtt tac agg cgg tat ggc gag gag tat 2439
Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr
650 655 660 665
ggc aac ctc acc cgc cca gac atc acc ttc acc tac ttc cag cct aag 2487
Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys
670 675 680
cca cgg cag gcc tgg gtg tgg gcc gct gtg cgt ggg ccc tgc tcg gtg 2535
Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val
685 690 695
agc tgt ggg gca ggg ctg cgc tgg gta aac tac agc tgc ctg gac cag 2583
Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln
700 705 710
gcc agg aag gag ttg gtg gag act gtc cag tgc caa ggg agc cag cag 2631
Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln
715 720 725
cca cca gcg tgg cca gag gcc tgc gtg ctc gaa ccc tgc cct ccc tac 2679
Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr
730 735 740 745
tgg gcg gtg gga gac ttc ggc cca tgc agc gcc tcc tgt ggg ggc ggc 2727
Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly
750 755 760
ctg cgg gag cgg cca gtg cgc tgc gtg gag gcc cag ggc agc ctc ctg 2775
Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu
765 770 775
aag aca ttg ccc cca gcc cgg tgc aga gca ggg gcc cag cag cca gct 2823
Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala
780 785 790
gtg gcg ctg gaa acc tgc aac ccc cag ccc tgc cct gcc agg tgg gag 2871
Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu
795 800 805
gtg tca gag ccc agc tca tgc aca tca gct ggt gga gca ggc ctg gcc 2919
Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala
810 815 820 825
ttg gag aac gag acc tgt gtg cca ggg gca gat ggc ctg gag gct cca 2967
Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro
830 835 840
gtg act gag ggg cct ggc tcc gta gat gag aag ctg cct gcc cct gag 3015
Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu
845 850 855
ccc tgt gtc ggg atg tca tgt cct cca ggc tgg ggc cat ctg gat gcc 3063
Pro Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala
860 865 870
acc tct gca ggg gag aag gct ccc tcc cca tgg ggc agc atc agg acg 3111
Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr
875 880 885
ggg gct caa gct gca cac gtg tgg acc cct gcg gca ggg tcg tgc tcc 3159
Gly Ala Gln Ala Ala His Val Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser
890 895 900 905
gtc tcc tgc ggg cga ggt ctg atg gag ctg cgt ttc ctg tgc atg gac 3207
Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp
910 915 920
tct gcc ctc agg gtg cct gtc cag gaa gag ctg tgt ggc ctg gca agc 3255
Ser Ala Leu Arg Val Pro Val Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser
925 930 935
aag cct ggg agc cgg cgg gag gtc tgc cag gct gtc ccg tgc cct gct 3303
Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala
940 945 950
cgg tgg cag tac aag ctg gcg gcc tgc agc gtg agc tgt ggg aga ggg 3351
Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly
955 960 965
gtc gtg cgg agg atc ctg tat tgt gcc cgg gcc cat ggg gag gac gat 3399
Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp
970 975 980 985
ggt gag gag atc ctg ttg gac acc cag tgc cag ggg ctg cct cgc ccg 3447
Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro
990 995 1000
gaa ccc cag gag gcc tgc agc ctg gag ccc tgc cca cct agg tgg 3492
Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp
1005 1010 1015
aaa gtc atg tcc ctt ggc cca tgt tcg gcc agc tgt ggc ctt ggc 3537
Lys Val Met Ser Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly
1020 1025 1030
act gct aga cgc tcg gtg gcc tgt gtg cag ctc gac caa ggc cag 3582
Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln
1035 1040 1045
gac gtg gag gtg gac gag gcg gcc tgt gcg gcg ctg gtg cgg ccc 3627
Asp Val Glu Val Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro
1050 1055 1060
gag gcc agt gtc ccc tgt ctc att gcc gac tgc acc tac cgc tgg 3672
Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp
1065 1070 1075
cat gtt ggc acc tgg atg gag tgc tct gtt tcc tgt ggg gat ggc 3717
His Val Gly Thr Trp Met Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly
1080 1085 1090
atc cag cgc cgg cgt gac acc tgc ctc gga ccc cag gcc cag gcg 3762
Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala
1095 1100 1105
cct gtg cca gct gat ttc tgc cag cac ttg ccc aag ccg gtg act 3807
Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr
1110 1115 1120
gtg cgt ggc tgc tgg gct ggg ccc tgt gtg gga cag ggt acg ccc 3852
Val Arg Gly Cys Trp Ala Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro
1125 1130 1135
agc ctg gtg ccc cac gaa gaa gcc gct gct cca gga cgg acc aca 3897
Ser Leu Val Pro His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr
1140 1145 1150
gcc acc cct gct ggt gcc tcc ctg gag tgg tcc cag gcc cgg ggc 3942
Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly
1155 1160 1165
ctg ctc ttc tcc ccg gct ccc cag cct cgg cgg ctc ctg ccc ggg 3987
Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly
1170 1175 1180
ccc cag gaa aac tca gtg cag tcc agt gcc tgt ggc agg cag cac 4032
Pro Gln Glu Asn Ser Val Gln Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His
1185 1190 1195
ctt gag cca aca gga acc att gac atg cga ggc cca ggg cag gca 4077
Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ile Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala
1200 1205 1210
gac tgt gca gtg gcc att ggg cgg ccc ctc ggg gag gtg gtg acc 4122
Asp Cys Ala Val Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr
1215 1220 1225
ctc cgc gtc ctt gag agt tct ctc aac tgc agt gcg ggg gac atg 4167
Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met
1230 1235 1240
ttg ctg ctt tgg ggc cgg ctc acc tgg agg aag atg tgc agg aag 4212
Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys
1245 1250 1255
ctg ttg gac atg act ttc agc tcc aag acc aac acg ctg gtg gtg 4257
Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val
1260 1265 1270
agg cag cgc tgc ggg cgg cca gga ggt ggg gtg ctg ctg cgg tat 4302
Arg Gln Arg Cys Gly Arg Pro Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr
1275 1280 1285
ggg agc cag ctt gct cct gaa acc ttc tac aga gaa tgt gac atg 4347
Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met
1290 1295 1300
cag ctc ttt ggg ccc tgg ggt gaa atc gtg agc ccc tcg ctg agt 4392
Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser
1305 1310 1315
cca gcc acg agt aat gca ggg ggc tgc cgg ctc ttc att aat gtg 4437
Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val
1320 1325 1330
gct ccg cac gca cgg att gcc atc cat gcc ctg gcc acc aac atg 4482
Ala Pro His Ala Arg Ile Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met
1335 1340 1345
ggc gct ggg acc gag gga gcc aat gcc agc tac atc ttg atc cgg 4527
Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg
1350 1355 1360
gac acc cac agc ttg agg acc aca gcg ttc cat ggg cag cag gtg 4572
Asp Thr His Ser Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val
1365 1370 1375
ctc tac tgg gag tca gag agc agc cag gct gag atg gag ttc agc 4617
Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser
1380 1385 1390
gag ggc ttc ctg aag gct cag gcc agc ctg cgg ggc cag tac tgg 4662
Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp
1395 1400 1405
acc ctc caa tca tgg gta ccg gag atg cag gac cct cag tcc tgg 4707
Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp
1410 1415 1420
aag gga aag gaa gga acc tga gggtcattga acatttgttc cgtgtctggc 4758
Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1425
cagccctgga gggttgaccc ctggtctcag tgctttccaa ttcgaacttt ttccaatctt 4818
aggtatctac tttagagtct tctccaatgt ccaaaaggct agggggttgg aggtggggac 4878
tctggaaaag cagcccccat ttcctcgggt accaataaat aaaacatgca ggctg 4933
<210> 4
<211> 1427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro Ser His
20 25 30
Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly
50 55 60
Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu
65 70 75 80
His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro Asp Val Phe Gln Ala His
85 90 95
Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu
115 120 125
Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr
130 135 140
Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr
145 150 155 160
Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu
165 170 175
Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val
180 185 190
Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys
195 200 205
Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His
210 215 220
Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro
245 250 255
Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro
275 280 285
Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr
290 295 300
Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val
305 310 315 320
Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser
325 330 335
Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val
340 345 350
Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys
355 360 365
Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His
370 375 380
Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys
385 390 395 400
Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro
405 410 415
Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met
420 425 430
Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln
435 440 445
Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly
450 455 460
Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Ser His Ser Gln Gly Asp
465 470 475 480
Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met
485 490 495
Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly
500 505 510
Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg
515 520 525
Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg
530 535 540
Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly
545 550 555 560
Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val
565 570 575
Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile Ala Asn His Arg Pro Leu Phe
580 585 590
Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys
595 600 605
Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly
610 615 620
Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu
625 630 635 640
Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln
645 650 655
Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp
660 665 670
Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp
675 680 685
Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg
690 695 700
Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu
705 710 715 720
Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala
725 730 735
Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly
740 745 750
Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg
755 760 765
Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg
770 775 780
Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn
785 790 795 800
Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys
805 810 815
Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val
820 825 830
Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser
835 840 845
Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys
850 855 860
Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala
865 870 875 880
Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val
885 890 895
Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu
900 905 910
Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val
915 920 925
Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu
930 935 940
Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala
945 950 955 960
Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr
965 970 975
Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp
980 985 990
Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser
995 1000 1005
Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser Leu Gly Pro
1010 1015 1020
Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala
1025 1030 1035
Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val Asp Glu Ala
1040 1045 1050
Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu
1055 1060 1065
Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met Glu
1070 1075 1080
Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr
1085 1090 1095
Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys
1100 1105 1110
Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys Trp Ala Gly
1115 1120 1125
Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro His Glu Glu
1130 1135 1140
Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser
1145 1150 1155
Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro
1160 1165 1170
Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn Ser Val Gln
1175 1180 1185
Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ile
1190 1195 1200
Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val Ala Ile Gly
1205 1210 1215
Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser
1220 1225 1230
Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu
1235 1240 1245
Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser
1250 1255 1260
Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys Gly Arg Pro
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu
1280 1285 1290
Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly
1295 1300 1305
Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly
1310 1315 1320
Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile Ala
1325 1330 1335
Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala
1340 1345 1350
Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr
1355 1360 1365
Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser
1370 1375 1380
Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln
1385 1390 1395
Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro
1400 1405 1410
Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1415 1420 1425
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 5
tgaggccaca cccacatctt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 6
atgccagagc ctgaaccact t 21
【図面の簡単な説明】
【図１】ADAMTS13遺伝子のエキソン１２における、１８６７位のcがtとなり、対応するコドンがセリンである多型の塩基配列と、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。１８６７位のtを大文字で示し矢印を付けた。また対応するコドンSerを線で囲んで示した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血栓形成傾向(thrombophilia)素因を検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０%の患者が3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。現在では血漿交換によって、予後が大幅に改善されるようになっている。
【０００３】
最近、TTPの病因としてvon Willebrand因子(VWF)切断酵素活性の低下が報告された。すなわち、後天性のTTPは、VWF切断酵素に対するIgG型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた(Furlan M.,et al., New Engl. J. Med. 339,1578-1584,1998; Tsai H-M.,et al.,New Engl. J. Med.339,1585-1594,1988)。また先天的なTTPであるUpshaw-Schulman症候群(USS)では、遺伝的にVWF切断酵素が欠損していることが判明した(Kinoshita S.et al.,Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【０００４】
更に、VWF切断酵素をコードする遺伝子は、ADAMTS13であることが判明した(Soejima K. et al., J Biochem.130,475-480,2001; Zheng X.et al.,J. Biol. Chem.276,41059-41063,2001)。またUSS患者と、ADAMTS13遺伝子におけるスプライシングの異常や塩基の欠失等の遺伝子異常との関連が報告された(Levy GG.et al.Nature,413,488-494,2001)。この報告では、ADAMTS13遺伝子におけるSNPsの存在も明らかにされている。しかしSNPsと何らかの疾患を結びつける知見は得られていない。
【０００５】
一方、血栓症には、USSのような先天性の疾患のみならず、様々な要因で誘導される後天的な疾患も知られている。たとえば抗血小板性の薬剤の投与が、血栓症の副作用をもたらすことが知られている。塩酸チクロピジンは、血管手術や虚血性脳血管障害等に伴う血栓・塞栓の治療や慢性動脈閉塞症に伴う症状の改善などに使用されている抗血小板剤である。副作用としてTTPが伴う可能性があるので、同剤の投与には注意が必要とされている。
【０００６】
より副作用の少ない抗血小板剤としてクロピトグレルが開発されている。しかし、このような新しい薬剤においても、副作用の危険性を無視することはできない。また、副作用であるTTPの危険性を予測することができれば、塩酸チクロピジンのような薬剤であっても安全に使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血栓形成傾向素因の検査方法、および血栓形成傾向素因を改善することができる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血栓形成傾向に関連する遺伝的な素因を明らかにすれば、血栓を伴う様々な疾患の危険性の予測、あるいは予防が可能になると考えた。たとえば抗血小板剤の副作用であるTTPも、投与される患者の血栓形成傾向を予め知ることができれば、未然に防止できるのではないかと考えた。
【０００９】
そして血栓形成傾向素因の指標を幅広く探索した結果、ADAMTS13遺伝子の多型と、血栓形成傾向素因の関連性とを見出した。そして、ADAMTS13遺伝子の多型を指標として、血栓形成傾向を検査できることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の検査方法、およびスクリーニング方法に関する。
〔１〕被検者から生体試料を採取し、該試料を解析してVWF切断酵素の活性低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型を検出する工程を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
〔２〕多型が、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位における多型である〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕多型が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンをセリンに変異させる多型である〔２〕に記載の検査方法。
〔４〕多型が、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcからtへの置換である、〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕次の工程(ａ)〜(ｃ)を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
（ａ）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ）生体試料中に含まれるゲノムDNA、mRNA、およびそれらの増幅産物のいずれかを、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する塩基がtに置換された塩基配列を含む領域にハイブリダイズするプローブとハイブリダイズ可能な条件下で接触させる工程、および
（ｃ）工程（ｂ）におけるプローブのハイブリダイズを血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔６〕次の工程(ａ’)〜(ｃ’)を含む、〔５〕に記載の検査方法。
（ａ’）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ’）生体試料中に含まれるゲノムDNA、mRNA、およびそれらの増幅産物のいずれかを、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域にハイブリダイズするプローブとハイブリダイズ可能な条件下で接触させる工程、および
（ｃ’）工程（ｂ）および（ｂ’）におけるプローブのハイブリダイズを血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔７〕次の工程(ａ)〜(ｃ)を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。
（ａ）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ）生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質を検出する工程、および
（ｃ）４７５位のプロリンがセリンに変異した蛋白質の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔８〕次の工程(ａ’)〜(ｃ’)を含む、〔７〕に記載の検査方法。
（ａ’）被検者から生体試料を採取する工程、
（ｂ’）生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を検出する工程、および
（ｃ’）４７５位のプロリンがセリンに変異した蛋白質、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程
〔９〕配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補鎖にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１０〕配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するためのプライマーセットを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１１〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質に結合する抗体を含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。
〔１２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質を、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に識別する抗体。
〔１３〕次の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質および／または該蛋白質を発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）前記蛋白質および／または細胞に対し被験化合物を接触させる工程、および
（ｃ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出し、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用と関連付ける工程
〔１４〕 次の工程（１）〜（２）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（１）〔１３〕に記載の方法によって、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する工程、および
（２）（１）で評価された作用が、被験化合物を接触させない場合の活性と比較して大きい被験化合物を選択する工程
〔１５〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を含む、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンのセリンへの変異を含むVWF切断酵素の活性促進剤。
〔１６〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物、および血栓形成傾向を誘導する薬剤を含む、血栓形成傾向の副作用が軽減された抗血小板医薬組成物。
〔１７〕配列番号：３に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド。
〔１８〕次の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質。
（Ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列から選択され、４７５位のセリンを含み、かつ連続した少なくとも７アミノ酸からなるアミノ酸配列を含む蛋白質
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検者から生体試料を採取し、該試料を解析してVWF切断酵素の活性低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型を検出する工程を含む、血栓形成傾向素因の検査方法に関する。
【００１１】
本発明において、血栓形成傾向(thrombophilia)とは、血栓を形成しやすい状態にあることを意味する。血栓を生じやすい状態とは、言いかえれば、血栓による疾患のリスクが高まった状態とも言うことができる。また血栓形成傾向素因(thrombophilic diathesis)とは、正常なヒトとの比較において、遺伝的に血栓を生じやすい体質を言う。血栓形成傾向素因は、特定の条件下において、血栓を生じやすい場合を含む。したがって、一般的な条件下では血栓の形成傾向に差が無いが、特定の薬剤の投与に伴って、血栓形成のリスクが高まる個体は、血栓形成傾向を有すると言うことができる。
【００１２】
本発明者らにより、ADAMTS13遺伝子を構成する特定のエキソンにおける多型が、血栓形成傾向素因を決定していることが明らかにされた。ADAMTS13遺伝子の構造は既に明らかにされている(GenBank Accession No. AB069698)。また、ADAMTS13遺伝子の欠損がUSSの原因であることも知られている。更に、ADAMTS13遺伝子の多型についての報告もある。たとえばLevyは、１、４、５、６、１２、１５、１６、１８、１９、２１、２３、２４、あるいは２９の各エキソンにSNPsがあることを報告した(Levy GG.et al.Nature,413,488-494,2001)。しかしこれらのSNPsと、血栓形成傾向素因の関連は知られていない。
【００１３】
これらの既知の知見に対して、本発明者らは、エキソン１２の多型が血栓形成傾向と密接に関連していることを見出した。更に本発明者らは、エキソン１２の多型がVWF切断酵素の活性に大きな影響を与えることを明らかにした。VWF切断酵素の活性は、血栓の形成と溶解に深く関わっている。つまり、エキソン１２における多型は、個人の血栓形成傾向素因を左右する重要な要因であることが、本発明者らによって確認された。
【００１４】
ADAMTS13遺伝子は、配列番号：１に示した塩基配列を有する遺伝子である。この遺伝子は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードしている。ADAMTS13遺伝子は、全体で２９のエキソンで構成されていると考えられている。本発明者らは、このうちのエキソン１２に、VWF切断酵素の活性を低下させる原因となる多型が存在することを明らかした。配列番号：１の塩基配列中、1753-1879の１２７塩基からなる塩基配列が、ADAMTS13遺伝子のエキソン１２に相当する。エキソン１２を構成する塩基配列と、その塩基配列によってコードされているアミノ酸配列を図１に示した。なお図１は、１８６７位のcがtとなり、対応するコドンがセリンである多型の塩基配列、およびアミノ酸配列を示している。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には、人口中１%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、頻度が１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。本発明における多型の種類は制限されない。具体的には、例えば、一塩基多型(SNPs)や、あるいは数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等を示すことができる。さらに、多型部位の数についても特に制限されない。したがって複数の多型を検査の対象とすることができる。
【００１６】
ある多型がVWF切断酵素の酵素活性を低下させていることは、配列番号：１に示す塩基配列（野生型）の特定の塩基を変化させた遺伝子改変体の発現産物のVWF切断酵素活性を野生型と比較することによって確認することができる。特定の塩基を置換、欠失、付加、あるいは挿入して遺伝子改変体を得る方法は公知である。たとえば、変異させた塩基配列を含むプライマーを利用したPCRにより、配列番号：１からなる野生型の塩基配列の特定の部位に変異を与えることができる。
あるいは、ADAMTS13遺伝子型が明らかになっている被検者から採取された血漿のVWF切断酵素活性を正常人と比較することによっても、VWF切断酵素活性に与える多型の影響を確認することができる。
【００１７】
遺伝子改変体は、適当な発現ベクターに組み込んで、蛋白質として発現させることができる。あるいは、in vitroにおいて、蛋白質に翻訳する技術も確立されている。発現生成物は、その酵素活性を評価することができる限り、精製する必要はない。あるいは、発現生成物にタグを付加しておいて、精製を容易にすることもできる。得られた、遺伝子改変体によってコードされたアミノ酸配列からなる蛋白質のVWF切断酵素活性を調べれれば、その変異の酵素活性に及ぼす影響を評価することができる。
【００１８】
VWF切断酵素活性を評価する方法は公知である。たとえば、実施例に示した方法(Kinoshita et al., Kinoshita S.et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)により、VWF切断酵素活性を測定することができる。
【００１９】
この方法は、in vitroでVWFを切断させ、その断片をVWFに対する抗体で検出するという原理に基づいている。測定に必要なVWFやその抗体の調製方法は公知である。たとえばこの検査に使用するVWFの精製方法は公知である（藤村吉博、他、日本血栓止血学会雑誌、10（4）：278-284, 1999）。また、抗VWF抗体は市販されている。
【００２０】
こうして特定された、エキソン１２におけるVWF切断酵素の活性を低下させる多型は、本発明における血栓形成傾向素因の指標とすることができる。エキソン１２は、VWF切断酵素活性を決定する重要な領域に相当している。したがって、このエキソンにおけるVWF切断酵素の活性を低下させる多型は、血栓形成傾向素因の重要な指標である。本発明において血栓形成傾向素因の指標とすべき多型として、配列番号：１に示すADAMTS13遺伝子の塩基配列（野生型）中、1867位(c)における多型を示すことができる。
【００２１】
1867位(c)における多型は、血栓形成傾向素因と密接に関連していた。特に、1867位のcがtに変異する場合、この変異は1867位を含むコドン（プロリン）をセリン(P475S)へと変異させる原因となる（図１）。VWF切断酵素におけるP475S変異は、酵素活性の低下をもたらし、その結果、血栓形成傾向素因が誘導されることになる。
日本人３６４人のADAMTS13遺伝子の解析の結果、遺伝子型は次のとおりであった。したがって、日本人におけるTアレルの頻度は５．１%ということになる。
CC:３２８人
CT: ３５人
TT: １人
【００２２】
本発明において、多型の検出とは、遺伝子型の特定を含む。すなわち本発明は、前記指標とする多型について、被験者がホモであるのかヘテロであるのかを解析し、その結果を血栓形成傾向素因と関連付ける工程を含む、検査方法に関する。
【００２３】
たとえば上記の1867位(c)における多型を指標とする場合には、この部位における塩基がtであるとき、被検者は血栓形成傾向素因を有すると判断される。同じ被験者について、この部位における塩基としてcも検出されれば、その被験者が野生型アレルを有していることを知ることができる。つまりこの被験者は、血栓形成傾向素因をヘテロで有すると結論つけられる。このような被験者は、tをホモで有する場合に比較して、血栓形成傾向が弱いと考えられる。このように、遺伝子型を明らかにすることにより、血栓形成傾向素因を、より定量的に予測することができる。
【００２４】
本発明の検査方法において、ADAMTS13遺伝子に生じた多型は、例えば、被検者のADAMTS13遺伝子の塩基配列を直接決定することにより検出することができる。具体的には、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
次いで、ADAMTS13遺伝子を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、ADAMTS13遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うこともできる。本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列は、当業者に公知の方法で決定することができる。
【００２５】
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ADAMTS13遺伝子の塩基配列を言う。たとえばGenBankに野生型として登録されているADAMTS13遺伝子の塩基配列（AB069698）と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のADAMTS13遺伝子の配列において、指標とすべき多型が見出された場合には、被験者は血栓形成傾向素因を有すると判定される。
【００２６】
本発明の検査方法は、直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。そして検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。
【００２７】
また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、ADAMTS13遺伝子を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR−RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
【００２８】
あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRでADAMTS13遺伝子を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２９】
さらに別の方法は、まず、被検者から調製したADAMTS13遺伝子を含むDNA、および該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板とを用意する。次いで、該DNAと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、ADAMTS13遺伝子多型を検出する。
【００３０】
このような方法としては、DNAアレイ法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）が例示できる。被検者からのADAMTS13遺伝子を含むDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該DNA試料の調製の好ましい態様においては、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。染色体DNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えばADAMTS13遺伝子を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNAを鋳型としたPCR等によってADAMTS13遺伝子を含むDNAを調製することも可能である。調製したDNA試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００３１】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレンを使用することができる。
【００３２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００３３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ADAMTS13遺伝子の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のADAMTS13遺伝子、あるいは多型を有するADAMTS13遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するADAMTS13遺伝子を含むDNA、または多型を有するADAMTS13遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100bであり、好ましくは10〜50bであり、さらに好ましくは15〜25bである。
【００３４】
本発明においては、次いで、該cDNA試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNA試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により設定することができる。
【００３５】
本発明においては、次いで、該DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００３６】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。
【００３７】
また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ADAMTS13遺伝子を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだADAMTS13遺伝子cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３８】
その他の本発明の多型の検出が可能な方法としては、
1)質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、
2)Taq-Man PCRによる方法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)、CYPへの応用例：Hiratsuka M et al., Biol. Pharm. Bull. vol.23, pp1131-1135, (2000)）、
3)Pyrosequencingによる方法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）、
4)Invader法による方法（Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)、メディカルドゥ社発行「遺伝子医学」 vol.4, No.1, pp44-51およびpp68-72 (2000)）
を挙げることができる。以上、種々の検出方法を例示したが、これらに限らず、VWF切断酵素活性の低下をもたらすADAMTS13遺伝子のエキソン１２における多型の検出を可能にする方法であれば、任意の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明の検査方法は、DNAのみならず、蛋白質の解析によって実施することもできる。本発明において指標とすべき多型は、VWF切断酵素活性の低下をもたらす多型である。このような多型は、通常、アミノ酸配列の変異の原因となる。したがって、このアミノ酸配列の変異を指標として、本発明の検査方法を実施することができる。アミノ酸配列の相違を検出する方法は公知である。
【００４０】
たとえば、１８６７位の塩基cにおける多型が本発明における望ましい指標であることは既に述べた。１８６７位の塩基cは、tへの変異によって、この塩基を含むコドンに対応する４７５位のアミノ酸をプロリンからセリンに変異させる原因となる。変異によって生じる４７５位のアミノ酸残基がセリンに変異したアミノ酸配列からなる蛋白質を、抗体によって検出することができる。この変異蛋白質と野生型の蛋白質とは、構造的には１アミノ酸残基の違いを有する。このような微細な違いを識別する抗体を得る方法は公知である。たとえば、４７５位のアミノ酸残基がセリンに変異したアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを合成し、これを免疫原として、この領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体の中で、野生型の蛋白質と交差しないものを選択し、本発明の検査方法に利用することができる。
【００４１】
抗体を使って蛋白質を検出する方法は公知である。たとえば、変異型と野生型の両方に対して結合活性を有する抗体と、変異型に特異的に結合する抗体を組み合せて、サンドイッチ法を構成することができる。より具体的には、前者を固相抗体に、後者を標識抗体に用いたELISA法により、本発明における指標を検出することができる。抗体を酵素等で標識する方法は公知である。
【００４２】
本発明における指標を、抗体を用いて検出する場合にも、遺伝子型を検出することができる。すなわち、変異型の蛋白質と、野生型の蛋白質の、それぞれに特定的な抗体を用い、いずれか一方のみが反応する場合をホモ、両方の抗体で反応が観察された場合をヘテロと判定することができる。本発明において、蛋白質の解析によって検査を行う場合には、血液試料や、細胞のライセートが生体試料として用いられる。
【００４３】
本発明はまた、血栓形成傾向素因を検査するための検査薬を提供する。すなわち本発明は、配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補鎖にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬である。これは遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
【００４４】
該オリゴヌクレオチドは、ADAMTS13遺伝子を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出するADAMTS13遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００４５】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15b〜100bであり、好ましくは17b〜30bである。プライマーは、多型部分を含むADAMTS13遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ADAMTS13遺伝子の１８６７位の塩基を含む領域に対応するDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15b以上の鎖長を有する。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００４７】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ADAMTS13遺伝子の１８６７位の塩基を含む領域に対応するDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる、血栓形成傾向素因の検査薬である。これは遺伝子多型を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
【００４８】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ADAMTS13遺伝子の１８６７位を含む領域に対応するDNAを増幅するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、血栓形成傾向素因の検査用試薬である。プライマーの長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、多型部分を含むADAMTS13遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４９】
上記の検査試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５０】
上記試薬には、検査に用いられる付加的な要素を組み合せることもできる。このような要素としては、たとえば以下のようなものを示すことができる。
陰性対照
陽性対照
野生型検出用プローブ
解析手順を記載した指示書
【００５１】
本発明の検査用試薬は、免疫学的な分析に必要な要素によって構成することもできる。すなわち本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む蛋白質に結合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しない抗体を含む、血栓形成傾向素因の検査試薬に関する。
【００５２】
本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む蛋白質に結合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しない抗体に関する。本発明において、抗体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とは交差反応しないとは、この抗体が野生型の蛋白質とは実質的に反応しないことを言う。より具体的には、たとえば、変異蛋白質との結合が観察されるのと同じ条件下において、野生型の蛋白質との結合が検出限界に満たないとき、その抗体は野生型の蛋白質とは実質的に反応しないと言うことができる。
【００５３】
このような抗体は、先に述べたように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中４７５位のプロリン残基がセリンに変異したアミノ案配列を含む、オリゴペプチドを免疫原として得ることができる。免疫原は、通常、適当なキャリアー蛋白質に結合し、更にアジュバントに懸濁させて動物に免疫される。キャリアー蛋白質としては、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。
【００５４】
抗体がモノクローナル抗体であれば、免疫原として用いたオリゴペプチドや、変異型の蛋白質を固定化したプレートを使ったELISA法によって、変異型蛋白質に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。更に、変異型蛋白質に対する結合活性を有する抗体の中から、野生型の蛋白質に対して交差しないものを選択すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００５５】
また本発明は、次の工程（ａ）−（ｄ）を含む、被験化合物の、塩基の置換によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を評価する方法を提供する。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質および／または該蛋白質を発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）前記蛋白質および／または細胞に対し被験化合物を接触させる工程、
（ｃ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出する工程、および
（ｄ）被験化合物を接触させた前記蛋白質および／または細胞におけるVWF切断酵素活性を検出し、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用と関連付ける工程
【００５６】
前記評価方法において、工程（ｃ）で検出される酵素活性が、被験化合物を接触させなかった対照と比較して差が見られた場合、この差は、当該化合物の（ａ）に記載の蛋白質のVWF切断酵素活性に対する作用と関連付けることができる。すなわち、対照と比較して（ｃ）で検出される酵素活性が対照と比較して大きい場合、その大きさは、当該化合物の（ａ）に記載の蛋白質のVWF切断酵素活性を上昇させる作用のレベルを示している。
【００５７】
複数の化合物の間で前記（ａ）−（ｃ）の工程を行って、化合物間で前記作用の大きさを比較することもできる。更に、特定の化合物の作用を基準として、より大きな作用を有する化合物を同定することもできる。
本発明の評価方法は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質の活性を上昇させる化合物のスクリーニング方法に有用である。
【００５８】
また本発明は、次の工程（１）〜（２）を含む、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
（１）前記工程（ａ）−（ｄ）を含む被験化合物の、塩基の置換によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を評価する方法によって、被験化合物のVWF切断酵素活性を上昇させる作用を評価する工程、および
（２）（１）で評価された作用が、被験化合物を接触させない場合の活性と比較して大きい被験化合物を選択する工程
【００５９】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列中、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列を含む蛋白質は、塩基の置換によってもたらされた、VWF切断酵素活性が低下した変異体である。当該変異体の酵素活性を上昇させる活性を有する化合物は、血栓形成傾向素因を有する患者の、血栓形成傾向を改善するための薬剤として有用である。
本発明は、当該変異体が血栓形成傾向素因の原因となっていることを見出した。したがって、当該変異体の活性の制御によって、血栓形成傾向素因の治療が実現することは、本発明によってもたらされた新規な知見である。
【００６０】
本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法は、VWF切断酵素の酵素活性を指標とする方法である。本方法においては、まず、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、４７５位のプロリンがセリンに変異したアミノ酸配列からなる蛋白質、および／またはこの蛋白質を発現する細胞を発現する細胞に、被験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられるが、これらの由来に制限されない。
【００６１】
このような細胞としては、前記蛋白質をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列中、そのコード領域を含み、１８６７位のcに相当する塩基がtに置換された遺伝子を導入した細胞は、本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法に用いることができる。このような細胞は、通常、該遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ形質転換することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００６２】
あるいはこうして得られた形質転換細胞が発現する前記蛋白質を精製して本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法に用いることができる。形質転換細胞、あるいはその培養上清から、発現生成物を精製する方法は公知である。まず形質転換体を、導入した変異体をコードする遺伝子が発現可能な条件下で培養する。次いで、たとえば、プロテアーゼ阻害剤などのたんぱく質保護剤の存在下で形質転換体を破砕し、塩析などによって蛋白質を分取する。得られた蛋白質画分は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、各種アフィニティクロマトグラフィー等の精製技術を使って精製することができる。変異体蛋白質に、更に親和性を有するタグを付加した蛋白質を発現させれば、このタグを利用したアフィニティ精製を利用することもできる。
【００６３】
また本方法に用いる被験化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００６４】
４７５位のアミノ酸残基がセリンであるVWF切断酵素変異体、またはそれを発現する細胞への被験化合物の「接触」は、通常、該遺伝子を発現する細胞の培養液に被験化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。たとえば被験化合物が蛋白質の場合には、該蛋白質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、両者を「接触」させることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、次いで、該遺伝子の発現産物であるVWF切断酵素の活性を測定する。VWF切断酵素の活性は、たとえば実施例に示したような方法により測定することができる(Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【００６５】
次いで、被験化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、VWF切断酵素活性を上昇させる化合物を選択する。
【００６６】
また本発明は、配列番号：３に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいはその断片の製造に有用である。あるいは、上記評価方法またはスクリーニング方法に用いるための細胞を得るために用いることができる。
【００６７】
更に本発明は、次の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質に関する。
（Ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列から選択され、４７５位のセリンを含み、かつ連続した少なくとも７アミノ酸からなるアミノ酸配列を含む蛋白質
（Ａ）に記載の蛋白質は、実際にヒトにおいて見出されたVWF切断酵素活性の低下の原因となる多型を含むＤＮＡによってコードされた蛋白質である。この蛋白質はVWF切断酵素活性が低下している。この蛋白質を用いて、前記の評価方法やスクリーニング方法により、低下した活性を上昇させる作用を有する化合物を選択することができる。
【００６８】
また前記（Ｂ）の蛋白質は、野生型の蛋白質と変異型の蛋白質を識別し得る抗体を得るための免疫原として有用である。一般に、７アミノ酸を越える連続したアミノ酸配列が、異なる蛋白質の間で一致する可能性はきわめて低い。したがって、前記少なくとも７アミノ酸残基からなる蛋白質は、変異型の蛋白質を識別する抗体の免疫原として有用である。
【００６９】
本発明のスクリーニングによって得ることができる化合物は、その化合物自体、VWF切断酵素活性の促進剤として有用である。本発明のスクリーニング方法により取得される化合物は、その化合物自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。例えば経口投与の場合、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等、経皮投与の場合、ハップ剤等を示すことができるが、これらに制限されない。投与方法として、投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。
【００７０】
これらの化合物がDNAである場合、該DNAを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター、或いは、naked DNAの形態で利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。
【００７１】
あるいは本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物を、副作用として血栓形成傾向をもたらす可能性がある薬剤に配合して、副作用が軽減された医薬品製剤とすることもできる。たとえば、抗血小板性の医薬品には、血栓形成傾向が副作用として現れる場合があることが報告されている。より具体的には、チクロピジンを血栓形成傾向素因を有する患者に投与した場合、TTPを引き起こす可能性が指摘されている。TTPは、血栓形成傾向を背景として生じる、血栓性の病態である。しがって、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物を、このような血栓形成の副作用を伴う薬剤に配合することにより、安全性の高い薬剤とすることができる。
【００７２】
本発明のスクリーニングによって得ることができる化合物の投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき0.1 mgから500 mgの範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【００７３】
【実施例】
（１）ADAMTS13遺伝子エキソン１２の塩基配列解析
血栓性血小板減少性紫斑病患者家系4名（患者、父、母、姉）、および一般人364名の全血からゲノムDNAを抽出した（クラボウ社の自動核酸精製装置NA-3000を使用）。いずれも当該倫理委員会の承認を得た試料である。これを鋳型に、エキソン１２をはさむイントロンの配列から作成した２本のオリゴヌクレオチド5'-TGAGGCCACACCCACATCTTG-3'（配列番号：５）および5'-ATGCCAGAGCCTGAACCACTT-3'（配列番号：６）をプライマーとして、Roche社のFastStart Taq DNA polymeraseでPCRを行った。反応条件は、95℃/4分、(95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/1分)×30サイクル、72℃/3分であった。反応産物の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Kitおよび3700 DNA Analyzerで解析した。
【００７４】
（２）血漿中VWF切断酵素活性の測定
上述の血栓性血小板減少性紫斑病患者家系からクエン酸ナトリウム法で血漿を採取した。この血漿10 μlに、終濃度10 μg/mlの精製 von Willebrand因子、10 mM BaCl2および1 mM phenylmethylsulfonyl fluorideを加えた尿素含有低イオン強度緩衝液（1.5 M尿素、5 mM Tris-HCl、pH 8.0）90 μlを加えて37℃で24時間加温した。その後、SDSアガロース電気泳動を行い、さらにウェスタンブロットによりPVDF膜に転写した。抗von Willebrand因子抗体によりvon Willebrand因子を可視化し、その切断程度を定量評価した(Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001)。
【００７５】
（３）結果
一般人３６４名の遺伝子解析の結果、１２７塩基対からなるエキソン１２の１１５位（cDNA全体では１８６７位）のCがTに変異した多型を見出した。CCホモ接合体を有する者が３２８名、CTヘテロ接合体を有する者が３５名、TTホモ接合体を有する者が１名であった。
【００７６】
一方、血栓性血小板減少性紫斑病患者家系4名のVWF切断酵素活性は、正常血漿を100%として、患者3%未満（検出限界以下）、父5.6%、母36%、姉30%であった（Kinoshita et al., Int. J. Hematol.74,101-108,2001）。遺伝子解析の結果、患者および両親にはエキソン１２以外に責任変異が見出されたが、姉には上述のC/T多型（475位のプロリンからセリンへの変異）がヘテロ接合体として見出されたのみであった。すなわち、活性と併せて考えると、この変異はVWF切断酵素の活性に重大な欠陥をもたらすことがわかった。
以上の結果から、一般人の約10%はエキソン１２に変異を有し、VWF切断酵素活性が低下していることが示された。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、血栓形成傾向素因の検査方法を提供した。本発明の検査方法は、血栓形成傾向の原因となるVWF切断酵素の酵素活性の変化の原因となっている多型を指標としているため、この素因を直接的に検出することができる。また、本発明における検査指標は、遺伝子の多型であることから、DNAの解析技術を使って、容易に検出することができる。あるいは、本発明者らが見出した多型はアミノ酸配列の変異を伴っていることから、蛋白質の免疫学的な解析によって、血栓形成傾向素因を明らかにすることもできる。
【００７８】
血栓形成傾向素因を遺伝子の塩基配列や、蛋白質の構造的な相違に基づいて検査できることは、実用上、大きな利点である。たとえば、VWF切断酵素の活性を測定して血栓形成傾向素因と関連付ける方法が可能かもしれない。しかし、VWF切断酵素の活性測定には、基質となる蛋白質や、それを認識する抗体が必要である。そのため日常的な検査方法として採用するには、経済的とは言いにくい。またその操作も煩雑であるため、普及を妨げる要因となる。
【００７９】
これに対して本発明の検査方法によれば、遺伝子の塩基配列や蛋白質の構造の違いによって、血栓形成傾向素因を検査することができる。遺伝子の塩基配列は、DNAチップやPCR法を使って簡便に、かつ安価に解析することができる。あるいは、蛋白質の構造の違いも、イムノアッセイなどによって、迅速に、かつ安価に解析することができる。このように、特定のエキソンにおける多型と血栓形成傾向素因との間の関連性を特定したことによって、より容易に、かつ安価に血栓形成傾向素因を検査することが可能となった。
【００８０】
血栓形成傾向素因は、様々な血栓性疾患の基礎を構成する重要な素因である。たとえば、抗血小板性の医薬品の投与によって引き起こされる、血栓性血小板減少性紫斑病においては、患者の血栓形成傾向が病態形成に果たす役割は大きい。しかしこれまでは血栓形成傾向の適切な指標が無かったために、投与前に、血栓形成傾向を予測することは困難であった。一方本発明の指標を用いれば、遺伝子型やVWF切断酵素蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、血栓形成傾向素因を、正しく評価することができる。このように、血栓形成傾向素因の適切な指標を提供した本発明の有用性は明らかである。
【００８１】
更に本発明は、変異によって活性が低下したVWF切断酵素の酵素活性を上昇させる作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供した。本発明のスクリーニング方法によって、血栓形成傾向素因の原因となっている、VWF切断酵素の活性を促進する化合物を選択することができる。このような化合物は、VWF切断酵素活性の促進剤として有用である。あるいは本発明によって選択される化合物を抗血小板性の製剤に配合することによって、血栓形成性の副作用が軽減された薬剤とすることができる。
【００８２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> MIYATA, TOSHIYUKI
<120> A Method for testing of thrombophilic diathesis
<130> NCV-A0201
<140> JP 2002-111241
<141> 2002-04-12
<160> 6
<170> PatentIn version 2.1
<210> 1
<211> 4933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaccacgatg tctttggcac agcctctcat ctgtcagatg ggagcgggga ccccggagag 60
ggagtcagcc gaggtcctgg cattccttgt gaacccccgt ctgtgggttt ctggtccagt 120
gtcccttctc cagattagat ggcttaggcc tcctctaagg gggtgggcgt gcacatccgg 180
agagctgtct ggtgtgcagg actgggctgc aggttaccct gaactgcaac catcttagag 240
caaggcccag cttgcagcag gaggagctgc aggccgccca ccctagccac ggcccctgcc 300
ctggcaggaa gcttccaaga gtaaacactg cctaatcgtc ccgcccagta gtgagcaggc 360
ctgtcccatt ccatactgac cagattccca gtcaccaagg ccccctctca ctccgctcca 420
ctcctcgggc tggctctcct gaggatgcac cagcgtcacc cccgggcaag atgccctccc 480
ctctgtgtgg ccggaatcct tgcctgtggc tttctcctgg gctgctgggg accctcccat 540
ttccagcaga gttgtcttca ggctttggag ccacaggccg tgtcttctta cttgagccct 600
ggtgctccct taaaaggccg ccctccttcc cctggcttcc agaggcagag gcagaggcag 660
aggcgggctg caggcggcat cctacacctg gagctgctgg tggccgtggg ccccgatgtc 720
ttccaggctc accaggagga cacagagcgc tatgtgctca ccaacctcaa catcggggca 780
gaactgcttc gggacccgtc cctgggggct cagtttcggg tgcacctggt gaagatggtc 840
attctgacag agcctgaggg tgctccaaat atcacagcca acctcacctc gtccctgctg 900
agcgtctgtg ggtggagcca gaccatcaac cctgaggacg acacggatcc tggccatgct 960
gacctggtcc tctatatcac taggtttgac ctggagttgc ctgatggtaa ccggcaggtg 1020
cggggcgtca cccagctggg cggtgcctgc tccccaacct ggagctgcct cattaccgag 1080
gacactggct tcgacctggg agtcaccatt gcccatgaga ttgggcacag cttcggcctg 1140
gagcacgacg gcgcgcccgg cagcggctgc ggccccagcg gacacgtgat ggcttcggac 1200
ggcgccgcgc cccgcgccgg cctcgcctgg tccccctgca gccgccggca gctgctgagc 1260
ctgctcagcg caggacgggc gcgctgcgtg tgggacccgc cgcggcctca acccgggtcc 1320
gcggggcacc cgccggatgc gcagcctggc ctctactaca gcgccaacga gcagtgccgc 1380
gtggccttcg gccccaaggc tgtcgcctgc accttcgcca gggagcacct ggatatgtgc 1440
caggccctct cctgccacac agacccgctg gaccaaagca gctgcagccg cctcctcgtt 1500
cctctcctgg atgggacaga atgtggcgtg gagaagtggt gctccaaggg tcgctgccgc 1560
tccctggtgg agctgacccc catagcagca gtgcatgggc gctggtctag ctggggtccc 1620
cgaagtcctt gctcccgctc ctgcggagga ggtgtggtca ccaggaggcg gcagtgcaac 1680
aaccccagac ctgcctttgg ggggcgtgca tgtgttggtg ctgacctcca ggccgagatg 1740
tgcaacactc aggcctgcga gaagacccag ctggagttca tgtcgcaaca gtgcgccagg 1800
accgacggcc agccgctgcg ctcctcccct ggcggcgcct ccttctacca ctggggtgct 1860
gctgtaccac acagccaagg ggatgctctg tgcagacaca tgtgccgggc cattggcgag 1920
agcttcatca tgaagcgtgg agacagcttc ctcgatggga cccggtgtat gccaagtggc 1980
ccccgggagg acgggaccct gagcctgtgt gtgtcgggca gctgcaggac atttggctgt 2040
gatggtagga tggactccca gcaggtatgg gacaggtgcc aggtgtgtgg tggggacaac 2100
agcacgtgca gcccacggaa gggctctttc acagctggca gagcgagaga atatgtcacg 2160
tttctgacag ttacccccaa cctgaccagt gtctacattg ccaaccacag gcctctcttc 2220
acacacttgg cggtgaggat cggagggcgc tatgtcgtgg ctgggaagat gagcatctcc 2280
cctaacacca cctacccctc cctcctggag gatggtcgtg tcgagtacag agtggccctc 2340
accgaggacc ggctgccccg cctggaggag atccgcatct ggggacccct ccaggaagat 2400
gctgacatcc aggtttacag gcggtatggc gaggagtatg gcaacctcac ccgcccagac 2460
atcaccttca cctacttcca gcctaagcca cggcaggcct gggtgtgggc cgctgtgcgt 2520
gggccctgct cggtgagctg tggggcaggg ctgcgctggg taaactacag ctgcctggac 2580
caggccagga aggagttggt ggagactgtc cagtgccaag ggagccagca gccaccagcg 2640
tggccagagg cctgcgtgct cgaaccctgc cctccctact gggcggtggg agacttcggc 2700
ccatgcagcg cctcctgtgg gggcggcctg cgggagcggc cagtgcgctg cgtggaggcc 2760
cagggcagcc tcctgaagac attgccccca gcccggtgca gagcaggggc ccagcagcca 2820
gctgtggcgc tggaaacctg caacccccag ccctgccctg ccaggtggga ggtgtcagag 2880
cccagctcat gcacatcagc tggtggagca ggcctggcct tggagaacga gacctgtgtg 2940
ccaggggcag atggcctgga ggctccagtg actgaggggc ctggctccgt agatgagaag 3000
ctgcctgccc ctgagccctg tgtcgggatg tcatgtcctc caggctgggg ccatctggat 3060
gccacctctg caggggagaa ggctccctcc ccatggggca gcatcaggac gggggctcaa 3120
gctgcacacg tgtggacccc tgcggcaggg tcgtgctccg tctcctgcgg gcgaggtctg 3180
atggagctgc gtttcctgtg catggactct gccctcaggg tgcctgtcca ggaagagctg 3240
tgtggcctgg caagcaagcc tgggagccgg cgggaggtct gccaggctgt cccgtgccct 3300
gctcggtggc agtacaagct ggcggcctgc agcgtgagct gtgggagagg ggtcgtgcgg 3360
aggatcctgt attgtgcccg ggcccatggg gaggacgatg gtgaggagat cctgttggac 3420
acccagtgcc aggggctgcc tcgcccggaa ccccaggagg cctgcagcct ggagccctgc 3480
ccacctaggt ggaaagtcat gtcccttggc ccatgttcgg ccagctgtgg ccttggcact 3540
gctagacgct cggtggcctg tgtgcagctc gaccaaggcc aggacgtgga ggtggacgag 3600
gcggcctgtg cggcgctggt gcggcccgag gccagtgtcc cctgtctcat tgccgactgc 3660
acctaccgct ggcatgttgg cacctggatg gagtgctctg tttcctgtgg ggatggcatc 3720
cagcgccggc gtgacacctg cctcggaccc caggcccagg cgcctgtgcc agctgatttc 3780
tgccagcact tgcccaagcc ggtgactgtg cgtggctgct gggctgggcc ctgtgtggga 3840
cagggtacgc ccagcctggt gccccacgaa gaagccgctg ctccaggacg gaccacagcc 3900
acccctgctg gtgcctccct ggagtggtcc caggcccggg gcctgctctt ctccccggct 3960
ccccagcctc ggcggctcct gcccgggccc caggaaaact cagtgcagtc cagtgcctgt 4020
ggcaggcagc accttgagcc aacaggaacc attgacatgc gaggcccagg gcaggcagac 4080
tgtgcagtgg ccattgggcg gcccctcggg gaggtggtga ccctccgcgt ccttgagagt 4140
tctctcaact gcagtgcggg ggacatgttg ctgctttggg gccggctcac ctggaggaag 4200
atgtgcagga agctgttgga catgactttc agctccaaga ccaacacgct ggtggtgagg 4260
cagcgctgcg ggcggccagg aggtggggtg ctgctgcggt atgggagcca gcttgctcct 4320
gaaaccttct acagagaatg tgacatgcag ctctttgggc cctggggtga aatcgtgagc 4380
ccctcgctga gtccagccac gagtaatgca gggggctgcc ggctcttcat taatgtggct 4440
ccgcacgcac ggattgccat ccatgccctg gccaccaaca tgggcgctgg gaccgaggga 4500
gccaatgcca gctacatctt gatccgggac acccacagct tgaggaccac agcgttccat 4560
gggcagcagg tgctctactg ggagtcagag agcagccagg ctgagatgga gttcagcgag 4620
ggcttcctga aggctcaggc cagcctgcgg ggccagtact ggaccctcca atcatgggta 4680
ccggagatgc aggaccctca gtcctggaag ggaaaggaag gaacctgagg gtcattgaac 4740
atttgttccg tgtctggcca gccctggagg gttgacccct ggtctcagtg ctttccaatt 4800
cgaacttttt ccaatcttag gtatctactt tagagtcttc tccaatgtcc aaaaggctag 4860
ggggttggag gtggggactc tggaaaagca gcccccattt cctcgggtac caataaataa 4920
aacatgcagg ctg 4933
<210> 2
<211> 1427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro Ser His
20 25 30
Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly
50 55 60
Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu
65 70 75 80
His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro Asp Val Phe Gln Ala His
85 90 95
Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu
115 120 125
Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr
130 135 140
Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr
145 150 155 160
Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu
165 170 175
Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val
180 185 190
Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys
195 200 205
Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His
210 215 220
Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro
245 250 255
Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro
275 280 285
Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr
290 295 300
Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val
305 310 315 320
Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser
325 330 335
Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val
340 345 350
Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys
355 360 365
Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His
370 375 380
Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys
385 390 395 400
Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro
405 410 415
Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met
420 425 430
Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln
435 440 445
Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly
450 455 460
Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Pro His Ser Gln Gly Asp
465 470 475 480
Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met
485 490 495
Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly
500 505 510
Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg
515 520 525
Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg
530 535 540
Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly
545 550 555 560
Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val
565 570 575
Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile Ala Asn His Arg Pro Leu Phe
580 585 590
Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys
595 600 605
Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly
610 615 620
Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu
625 630 635 640
Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln
645 650 655
Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp
660 665 670
Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp
675 680 685
Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg
690 695 700
Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu
705 710 715 720
Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala
725 730 735
Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly
740 745 750
Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg
755 760 765
Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg
770 775 780
Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn
785 790 795 800
Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys
805 810 815
Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val
820 825 830
Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser
835 840 845
Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys
850 855 860
Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala
865 870 875 880
Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val
885 890 895
Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu
900 905 910
Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val
915 920 925
Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu
930 935 940
Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala
945 950 955 960
Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr
965 970 975
Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp
980 985 990
Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser
995 1000 1005
Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser Leu Gly Pro
1010 1015 1020
Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala
1025 1030 1035
Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val Asp Glu Ala
1040 1045 1050
Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu
1055 1060 1065
Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met Glu
1070 1075 1080
Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr
1085 1090 1095
Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys
1100 1105 1110
Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys Trp Ala Gly
1115 1120 1125
Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro His Glu Glu
1130 1135 1140
Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser
1145 1150 1155
Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro
1160 1165 1170
Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn Ser Val Gln
1175 1180 1185
Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ile
1190 1195 1200
Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val Ala Ile Gly
1205 1210 1215
Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser
1220 1225 1230
Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu
1235 1240 1245
Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser
1250 1255 1260
Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys Gly Arg Pro
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu
1280 1285 1290
Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly
1295 1300 1305
Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly
1310 1315 1320
Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile Ala
1325 1330 1335
Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala
1340 1345 1350
Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr
1355 1360 1365
Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser
1370 1375 1380
Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln
1385 1390 1395
Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro
1400 1405 1410
Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1415 1420 1425
<210> 3
<211> 4933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (445)..(4728)
<400> 3
aaccacgatg tctttggcac agcctctcat ctgtcagatg ggagcgggga ccccggagag 60
ggagtcagcc gaggtcctgg cattccttgt gaacccccgt ctgtgggttt ctggtccagt 120
gtcccttctc cagattagat ggcttaggcc tcctctaagg gggtgggcgt gcacatccgg 180
agagctgtct ggtgtgcagg actgggctgc aggttaccct gaactgcaac catcttagag 240
caaggcccag cttgcagcag gaggagctgc aggccgccca ccctagccac ggcccctgcc 300
ctggcaggaa gcttccaaga gtaaacactg cctaatcgtc ccgcccagta gtgagcaggc 360
ctgtcccatt ccatactgac cagattccca gtcaccaagg ccccctctca ctccgctcca 420
ctcctcgggc tggctctcct gagg atg cac cag cgt cac ccc cgg gca aga 471
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg
1 5
tgc cct ccc ctc tgt gtg gcc gga atc ctt gcc tgt ggc ttt ctc ctg 519
Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu
10 15 20 25
ggc tgc tgg gga ccc tcc cat ttc cag cag agt tgt ctt cag gct ttg 567
Gly Cys Trp Gly Pro Ser His Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu
30 35 40
gag cca cag gcc gtg tct tct tac ttg agc cct ggt gct ccc tta aaa 615
Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys
45 50 55
ggc cgc cct cct tcc cct ggc ttc cag agg cag agg cag agg cag agg 663
Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg
60 65 70
cgg gct gca ggc ggc atc cta cac ctg gag ctg ctg gtg gcc gtg ggc 711
Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly
75 80 85
ccc gat gtc ttc cag gct cac cag gag gac aca gag cgc tat gtg ctc 759
Pro Asp Val Phe Gln Ala His Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu
90 95 100 105
acc aac ctc aac atc ggg gca gaa ctg ctt cgg gac ccg tcc ctg ggg 807
Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly
110 115 120
gct cag ttt cgg gtg cac ctg gtg aag atg gtc att ctg aca gag cct 855
Ala Gln Phe Arg Val His Leu Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro
125 130 135
gag ggt gct cca aat atc aca gcc aac ctc acc tcg tcc ctg ctg agc 903
Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser
140 145 150
gtc tgt ggg tgg agc cag acc atc aac cct gag gac gac acg gat cct 951
Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro
155 160 165
ggc cat gct gac ctg gtc ctc tat atc act agg ttt gac ctg gag ttg 999
Gly His Ala Asp Leu Val Leu Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu
170 175 180 185
cct gat ggt aac cgg cag gtg cgg ggc gtc acc cag ctg ggc ggt gcc 1047
Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala
190 195 200
tgc tcc cca acc tgg agc tgc ctc att acc gag gac act ggc ttc gac 1095
Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp
205 210 215
ctg gga gtc acc att gcc cat gag att ggg cac agc ttc ggc ctg gag 1143
Leu Gly Val Thr Ile Ala His Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu
220 225 230
cac gac ggc gcg ccc ggc agc ggc tgc ggc ccc agc gga cac gtg atg 1191
His Asp Gly Ala Pro Gly Ser Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met
235 240 245
gct tcg gac ggc gcc gcg ccc cgc gcc ggc ctc gcc tgg tcc ccc tgc 1239
Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys
250 255 260 265
agc cgc cgg cag ctg ctg agc ctg ctc agc gca gga cgg gcg cgc tgc 1287
Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys
270 275 280
gtg tgg gac ccg ccg cgg cct caa ccc ggg tcc gcg ggg cac ccg ccg 1335
Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro
285 290 295
gat gcg cag cct ggc ctc tac tac agc gcc aac gag cag tgc cgc gtg 1383
Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val
300 305 310
gcc ttc ggc ccc aag gct gtc gcc tgc acc ttc gcc agg gag cac ctg 1431
Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu
315 320 325
gat atg tgc cag gcc ctc tcc tgc cac aca gac ccg ctg gac caa agc 1479
Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser
330 335 340 345
agc tgc agc cgc ctc ctc gtt cct ctc ctg gat ggg aca gaa tgt ggc 1527
Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly
350 355 360
gtg gag aag tgg tgc tcc aag ggt cgc tgc cgc tcc ctg gtg gag ctg 1575
Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu
365 370 375
acc ccc ata gca gca gtg cat ggg cgc tgg tct agc tgg ggt ccc cga 1623
Thr Pro Ile Ala Ala Val His Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg
380 385 390
agt cct tgc tcc cgc tcc tgc gga gga ggt gtg gtc acc agg agg cgg 1671
Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg
395 400 405
cag tgc aac aac ccc aga cct gcc ttt ggg ggg cgt gca tgt gtt ggt 1719
Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly
410 415 420 425
gct gac ctc cag gcc gag atg tgc aac act cag gcc tgc gag aag acc 1767
Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr
430 435 440
cag ctg gag ttc atg tcg caa cag tgc gcc agg acc gac ggc cag ccg 1815
Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro
445 450 455
ctg cgc tcc tcc cct ggc ggc gcc tcc ttc tac cac tgg ggt gct gct 1863
Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala
460 465 470
gta tca cac agc caa ggg gat gct ctg tgc aga cac atg tgc cgg gcc 1911
Val Ser His Ser Gln Gly Asp Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala
475 480 485
att ggc gag agc ttc atc atg aag cgt gga gac agc ttc ctc gat ggg 1959
Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly
490 495 500 505
acc cgg tgt atg cca agt ggc ccc cgg gag gac ggg acc ctg agc ctg 2007
Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu
510 515 520
tgt gtg tcg ggc agc tgc agg aca ttt ggc tgt gat ggt agg atg gac 2055
Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp
525 530 535
tcc cag cag gta tgg gac agg tgc cag gtg tgt ggt ggg gac aac agc 2103
Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser
540 545 550
acg tgc agc cca cgg aag ggc tct ttc aca gct ggc aga gcg aga gaa 2151
Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu
555 560 565
tat gtc acg ttt ctg aca gtt acc ccc aac ctg acc agt gtc tac att 2199
Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile
570 575 580 585
gcc aac cac agg cct ctc ttc aca cac ttg gcg gtg agg atc gga ggg 2247
Ala Asn His Arg Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly
590 595 600
cgc tat gtc gtg gct ggg aag atg agc atc tcc cct aac acc acc tac 2295
Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr
605 610 615
ccc tcc ctc ctg gag gat ggt cgt gtc gag tac aga gtg gcc ctc acc 2343
Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr
620 625 630
gag gac cgg ctg ccc cgc ctg gag gag atc cgc atc tgg gga ccc ctc 2391
Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu
635 640 645
cag gaa gat gct gac atc cag gtt tac agg cgg tat ggc gag gag tat 2439
Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr
650 655 660 665
ggc aac ctc acc cgc cca gac atc acc ttc acc tac ttc cag cct aag 2487
Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys
670 675 680
cca cgg cag gcc tgg gtg tgg gcc gct gtg cgt ggg ccc tgc tcg gtg 2535
Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val
685 690 695
agc tgt ggg gca ggg ctg cgc tgg gta aac tac agc tgc ctg gac cag 2583
Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln
700 705 710
gcc agg aag gag ttg gtg gag act gtc cag tgc caa ggg agc cag cag 2631
Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln
715 720 725
cca cca gcg tgg cca gag gcc tgc gtg ctc gaa ccc tgc cct ccc tac 2679
Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr
730 735 740 745
tgg gcg gtg gga gac ttc ggc cca tgc agc gcc tcc tgt ggg ggc ggc 2727
Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly
750 755 760
ctg cgg gag cgg cca gtg cgc tgc gtg gag gcc cag ggc agc ctc ctg 2775
Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu
765 770 775
aag aca ttg ccc cca gcc cgg tgc aga gca ggg gcc cag cag cca gct 2823
Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala
780 785 790
gtg gcg ctg gaa acc tgc aac ccc cag ccc tgc cct gcc agg tgg gag 2871
Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu
795 800 805
gtg tca gag ccc agc tca tgc aca tca gct ggt gga gca ggc ctg gcc 2919
Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala
810 815 820 825
ttg gag aac gag acc tgt gtg cca ggg gca gat ggc ctg gag gct cca 2967
Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro
830 835 840
gtg act gag ggg cct ggc tcc gta gat gag aag ctg cct gcc cct gag 3015
Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu
845 850 855
ccc tgt gtc ggg atg tca tgt cct cca ggc tgg ggc cat ctg gat gcc 3063
Pro Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala
860 865 870
acc tct gca ggg gag aag gct ccc tcc cca tgg ggc agc atc agg acg 3111
Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr
875 880 885
ggg gct caa gct gca cac gtg tgg acc cct gcg gca ggg tcg tgc tcc 3159
Gly Ala Gln Ala Ala His Val Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser
890 895 900 905
gtc tcc tgc ggg cga ggt ctg atg gag ctg cgt ttc ctg tgc atg gac 3207
Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp
910 915 920
tct gcc ctc agg gtg cct gtc cag gaa gag ctg tgt ggc ctg gca agc 3255
Ser Ala Leu Arg Val Pro Val Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser
925 930 935
aag cct ggg agc cgg cgg gag gtc tgc cag gct gtc ccg tgc cct gct 3303
Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala
940 945 950
cgg tgg cag tac aag ctg gcg gcc tgc agc gtg agc tgt ggg aga ggg 3351
Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly
955 960 965
gtc gtg cgg agg atc ctg tat tgt gcc cgg gcc cat ggg gag gac gat 3399
Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp
970 975 980 985
ggt gag gag atc ctg ttg gac acc cag tgc cag ggg ctg cct cgc ccg 3447
Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro
990 995 1000
gaa ccc cag gag gcc tgc agc ctg gag ccc tgc cca cct agg tgg 3492
Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp
1005 1010 1015
aaa gtc atg tcc ctt ggc cca tgt tcg gcc agc tgt ggc ctt ggc 3537
Lys Val Met Ser Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly
1020 1025 1030
act gct aga cgc tcg gtg gcc tgt gtg cag ctc gac caa ggc cag 3582
Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln
1035 1040 1045
gac gtg gag gtg gac gag gcg gcc tgt gcg gcg ctg gtg cgg ccc 3627
Asp Val Glu Val Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro
1050 1055 1060
gag gcc agt gtc ccc tgt ctc att gcc gac tgc acc tac cgc tgg 3672
Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp
1065 1070 1075
cat gtt ggc acc tgg atg gag tgc tct gtt tcc tgt ggg gat ggc 3717
His Val Gly Thr Trp Met Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly
1080 1085 1090
atc cag cgc cgg cgt gac acc tgc ctc gga ccc cag gcc cag gcg 3762
Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala
1095 1100 1105
cct gtg cca gct gat ttc tgc cag cac ttg ccc aag ccg gtg act 3807
Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr
1110 1115 1120
gtg cgt ggc tgc tgg gct ggg ccc tgt gtg gga cag ggt acg ccc 3852
Val Arg Gly Cys Trp Ala Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro
1125 1130 1135
agc ctg gtg ccc cac gaa gaa gcc gct gct cca gga cgg acc aca 3897
Ser Leu Val Pro His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr
1140 1145 1150
gcc acc cct gct ggt gcc tcc ctg gag tgg tcc cag gcc cgg ggc 3942
Ala Thr Pro Ala Gly Ala Ser Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly
1155 1160 1165
ctg ctc ttc tcc ccg gct ccc cag cct cgg cgg ctc ctg ccc ggg 3987
Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly
1170 1175 1180
ccc cag gaa aac tca gtg cag tcc agt gcc tgt ggc agg cag cac 4032
Pro Gln Glu Asn Ser Val Gln Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His
1185 1190 1195
ctt gag cca aca gga acc att gac atg cga ggc cca ggg cag gca 4077
Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ile Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala
1200 1205 1210
gac tgt gca gtg gcc att ggg cgg ccc ctc ggg gag gtg gtg acc 4122
Asp Cys Ala Val Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr
1215 1220 1225
ctc cgc gtc ctt gag agt tct ctc aac tgc agt gcg ggg gac atg 4167
Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met
1230 1235 1240
ttg ctg ctt tgg ggc cgg ctc acc tgg agg aag atg tgc agg aag 4212
Leu Leu Leu Trp Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys
1245 1250 1255
ctg ttg gac atg act ttc agc tcc aag acc aac acg ctg gtg gtg 4257
Leu Leu Asp Met Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val
1260 1265 1270
agg cag cgc tgc ggg cgg cca gga ggt ggg gtg ctg ctg cgg tat 4302
Arg Gln Arg Cys Gly Arg Pro Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr
1275 1280 1285
ggg agc cag ctt gct cct gaa acc ttc tac aga gaa tgt gac atg 4347
Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met
1290 1295 1300
cag ctc ttt ggg ccc tgg ggt gaa atc gtg agc ccc tcg ctg agt 4392
Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser
1305 1310 1315
cca gcc acg agt aat gca ggg ggc tgc cgg ctc ttc att aat gtg 4437
Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val
1320 1325 1330
gct ccg cac gca cgg att gcc atc cat gcc ctg gcc acc aac atg 4482
Ala Pro His Ala Arg Ile Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met
1335 1340 1345
ggc gct ggg acc gag gga gcc aat gcc agc tac atc ttg atc cgg 4527
Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg
1350 1355 1360
gac acc cac agc ttg agg acc aca gcg ttc cat ggg cag cag gtg 4572
Asp Thr His Ser Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val
1365 1370 1375
ctc tac tgg gag tca gag agc agc cag gct gag atg gag ttc agc 4617
Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser
1380 1385 1390
gag ggc ttc ctg aag gct cag gcc agc ctg cgg ggc cag tac tgg 4662
Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp
1395 1400 1405
acc ctc caa tca tgg gta ccg gag atg cag gac cct cag tcc tgg 4707
Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp
1410 1415 1420
aag gga aag gaa gga acc tga gggtcattga acatttgttc cgtgtctggc 4758
Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1425
cagccctgga gggttgaccc ctggtctcag tgctttccaa ttcgaacttt ttccaatctt 4818
aggtatctac tttagagtct tctccaatgt ccaaaaggct agggggttgg aggtggggac 4878
tctggaaaag cagcccccat ttcctcgggt accaataaat aaaacatgca ggctg 4933
<210> 4
<211> 1427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro Ser His
20 25 30
Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gly
50 55 60
Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ile Leu
65 70 75 80
His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro Asp Val Phe Gln Ala His
85 90 95
Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu
115 120 125
Val Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr
130 135 140
Ala Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr
145 150 155 160
Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu
165 170 175
Tyr Ile Thr Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val
180 185 190
Arg Gly Val Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys
195 200 205
Leu Ile Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His
210 215 220
Glu Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala Pro
245 250 255
Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro
275 280 285
Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln Pro Gly Leu Tyr
290 295 300
Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val
305 310 315 320
Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp Met Cys Gln Ala Leu Ser
325 330 335
Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val
340 345 350
Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys
355 360 365
Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His
370 375 380
Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys
385 390 395 400
Gly Gly Gly Val Val Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro
405 410 415
Ala Phe Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met
420 425 430
Cys Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln
435 440 445
Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly
450 455 460
Ala Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Ser His Ser Gln Gly Asp
465 470 475 480
Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met
485 490 495
Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro Ser Gly
500 505 510
Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly Ser Cys Arg
515 520 525
Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg
530 535 540
Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly
545 550 555 560
Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr Val Thr Phe Leu Thr Val
565 570 575
Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile Ala Asn His Arg Pro Leu Phe
580 585 590
Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys
595 600 605
Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly
610 615 620
Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu
625 630 635 640
Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln
645 650 655
Val Tyr Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp
660 665 670
Ile Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp
675 680 685
Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg
690 695 700
Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu
705 710 715 720
Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala
725 730 735
Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly
740 745 750
Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg
755 760 765
Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Arg
770 775 780
Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala Leu Glu Thr Cys Asn
785 790 795 800
Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys
805 810 815
Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val
820 825 830
Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser
835 840 845
Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys
850 855 860
Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala
865 870 875 880
Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val
885 890 895
Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu
900 905 910
Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val
915 920 925
Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu
930 935 940
Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala
945 950 955 960
Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu Tyr
965 970 975
Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu Leu Asp
980 985 990
Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu Ala Cys Ser
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Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser Leu Gly Pro
1010 1015 1020
Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg Ser Val Ala
1025 1030 1035
Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val Asp Glu Ala
1040 1045 1050
Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu
1055 1060 1065
Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met Glu
1070 1075 1080
Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg Arg Asp Thr
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Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly
1310 1315 1320
Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile Ala
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr
1355 1360 1365
Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser
1370 1375 1380
Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln
1385 1390 1395
Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro
1400 1405 1410
Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu Gly Thr
1415 1420 1425
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 5
tgaggccaca cccacatctt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 6
atgccagagc ctgaaccact t 21
【図面の簡単な説明】
【図１】ADAMTS13遺伝子のエキソン１２における、１８６７位のcがtとなり、対応するコドンがセリンである多型の塩基配列と、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。１８６７位のtを大文字で示し矢印を付けた。また対応するコドンSerを線で囲んで示した。
Claims (7)
- 被検者から採取した生体試料を解析して下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるVWF切断酵素における４７５位のプロリンのセリンへの変異；または
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるVWF切断酵素をコードするADAMTS13遺伝子における、配列番号：１に記載の塩基配列における
1867位のｃに相当する塩基のｔへの変異；
を検出する工程を含む、血栓形成傾向素因の検査方法。 - 次の工程(ａ)および（ｂ）を含む、血栓形成傾向素因の検査方法：
（ａ）被検者から採取した生体試料中に含まれるゲノムDNA、mRNA、およびそれらの増幅産物のいずれかを用いて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列か
らなるVWF切断酵素をコードするADAMTS13遺伝子における、配列番号：１に記載の塩基配列における１８６７位のｃに相当する塩基のｔへの変異を検
出する工程、および
（ｂ）該変異の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程。 - 次の工程(ａ)および（ｂ）を含む、血栓形成傾向素因の検査方法：
（ａ）被検者から採取した生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるVWF切断酵素において４７５位のプロリンがセリンに変異した
アミノ酸配列を含む蛋白質を検出する工程；および
（ｂ）４７５位のプロリンがセリンに変異した該（ａ）の蛋白質の存在を血栓形成傾向素因と関連付ける工程。 - 次の工程(ａ')および（ｂ’）をさらに含む、請求項３に記載の検査方法：
（ａ'）被検者から採取した生体試料中に含まれる、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるVWF切断酵素を検出する工程；および
（ｂ’）４７５位のプロリンがセリンに変異した該（ａ）の蛋白質、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる該（ａ’）のVWF切断酵素の存在を血
栓形成傾向素因と関連付ける工程。 - 配列番号：１に記載の塩基配列中、１８６７位のcに相当する領域を含む塩基配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するためのプライ
マーセットを含む、血栓形成傾向素因の検査試薬。 - 配列番号：３に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
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