KR20120066470A

KR20120066470A - 천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20120066470A
Application number: KR1020100127828A
Authority: KR
Inventors: 신형두
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2012-06-22
Also published as: KR101278220B1

Abstract

본 발명은 천식환자에서 비강 폴립의 발생 가능성 및 존재 유무를 검출할 수 있는 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명은 복잡한 데이터 수집을 요구하는 천식환자에서의 비강 폴립 형성의 표현형 결정 과정 없이, 천식환자에서 비강 폴립 형성 가능성 및 존재 유무를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명의 마커는 본 발명은 천식환자에서 비강 폴립의 발생 가능성 및 존재 유무에 대하여 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

Description

천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트 및 이의 이용{Kits for Determining a Presence of Nasal Polyps in Asthmatics and Uses Thereof}

본 발명은 천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트 및 이의 이용에 관한 것이다.

비강 폴립(nasal polyp)은 코과 시누스(sinus)의 측벽의 만성 염증으로부터 발달하여 성장한다¹. 기도 염증의 병인은 상위기도 및 하위기도 질환에서 림프구, 비만 세포와 호산구와 같은 일반적인 병원성 메커니즘으로 확인되었으며², 이로 인하여 비강 폴립, 천식 및 아스피린-과민성과의 관련성에 근간을 두고 있으며, 감염 발생에서 유전자 인자의 역할이 중요한 것으로 부각되었다. 비강 폴립의 확산은 아스피린-과민감성 천식환자(aspirin-intolerant asthma: AIA)에서 31-60% 정도 되는 것으로 보고되었으며^3,4, 아스피린 내성 환자(aspirin-tolerant asthma: ATA)에서는 7-15%정도 되는 것으로 보고되었다⁵. 그러나, 원인 규명이 잘되었는데도 불구하고, 비강 폴립을 가진 천식의 발달을 포함하는 정확한 메커니즘이 명확히 밝혀져야 할 필요가 있다.

HECT(E6-AP carboxyl terminus)-타입 UBE3C(ubiquitin protein ligase E3C) 유전자에 대한 상동성은 림프구의 발달과 분화, T 세포-저항성의 활성, 항원 제시 및 면역 침입에 있어서 중요하다⁶. UBE3C은 천식 및 기도 호산구증에 대한 마커에 해당하는 7q36 유전자좌(locus)에 위치하고 있으며, NOS3(nitric oxide synthase 3) 유전자에 위치한다^7,8. 단백질 분해 경로에 있어서, UBE3C은 E2 유비퀴틴-결합 효소와의 결합을 통하여 폴리유비퀴틴 체인을 조립하고 이미 결합한 유비퀴틴 분자의 Lys48에 활성화된 유비퀴틴 반을 전달한다⁹.

폴리유비퀴틴 체인을 IKβα에 결합시키고 프로테아좀 분해를 위하여 이를 타겟팅함으로써, 유비퀴틴-프로테아좀 경로가 천식에서 염증반응을 포함하는 다수의 세포성 진행과정의 중요한 조절자인 NF-Kβ(nuclear transcription factor Kβ)를 활성화시킨다^10,11. Picado등은 AIA 환자들의 비강 폴립에서 NF-Kβ 활성을 검출한 반면, 타케노등은 비강 폴립 상피에서 호산구의 축적이 NF-Kβ에 의하여 매개된다고 보고하였다^12,13. 다른 많은 E3 유비퀴틴 리가아제 패밀리에 대하여 많이 보고되었을지라도, 인간 질환에 있어서 UBE3C의 기능에 대하여 이해는 미미한 수준이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천식 환자에 있어서 비강폴립의 존재의 유무를 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 천식환자에서의 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP)이 비강 폴립의 발생(존재)에 대한 일관된 상관관계가 있으며, 이와 같은 상관관계를 통하여 천식환자에서의 UBE3C 유전자 단일염기다형성이 비강 폴립의 발생 여부 및 발생 가능성에 대한 마커가 될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 천식환자에서의 비강 폴립 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제2서열의 3382번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs7798816), 서열목록 제3서열의 417번째뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3808316), 서열목록 제4서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802129), 서열목록 제5서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802122), 서열목록 제6서열의 227번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs7802642), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970), 서열목록 제8서열의 503번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6979947), 서열목록 제9서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1636608), 서열목록 제10서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802108), 서열목록 제11서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs2301947), 서열목록 제12서열의 496번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6960676), 서열목록 제13서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3779596), 서열목록 제14서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182392), 서열목록 제15서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271990), 서열목록 제16서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10228373), 서열목록 제17서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182389), 서열목록 제18서열의 223번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182385), 서열목록 제19서열의 349번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182378), 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 및 서열목록 제21서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182414)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 천식환자에서 비강 폴립(nasal polyps) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 천식 환자에 있어서 비강폴립의 존재의 유무를 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 천식환자에서의 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP)가 비강 폴립의 발생(존재)에 대한 일관된 상관관계가 있으며, 이와 같은 상관관계를 통하여 천식환자에서의 UBE3C 유전자 단일염기다형성이 비강 폴립의 발생 여부 및 발생 가능성에 대한 마커가 될 수 있음을 규명하였다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성은 UBE3C 유전자의 상에 존재하는 것을 특징한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 각각의 단일염기다형성은 동형접합체(homozygote) 또는 이형접합체(heterozygote)의 대립 유전자를 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어“비강폴립(nasal polyp)”은 코 내부의 점액을 분비하는 구조물이 커져서 덩어리가 된 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970) 및 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “마커(negative marker)”는 특정한 특징을 갖는 유전자 서열의 존재의 검출을 통해서 대상 물질의 높은 체내 함량 또는 낮은 높은 체내 함량을 확인할 수 있은 유전자 마커를 말한다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어“단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이성은 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 반응하는 가에 영향을 미칠 수 있다. 또한, SNP는 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 도구(key enabler)로 생각된다. 무엇보다도, 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNP는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 또한, SNP 연구는 곡식 및 가축 육성 프로그램에서도 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 UBE3C 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 가진 천식 환자는 비강 폴립의 발생이 높은 천식환자이다.

본 발명은 천식환자, 특히 아스피린 비민감성 천식환자에 있어서 비강 폴립의 존재 동정 및 발생 가능성 예측을 하는 데 특이적이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 천식 환자는 아스피린 비민감성 천식환자인 것을 특징인 것을 특징으로 하는 키트.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 아시아인에게 적용 하는 경우 천식환자로부터 비강 폴립 가능성 및 존재를 특이적으로 검출할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명에서 용어“아시아”는 한국, 중국 및 일본 등을 비롯한 몽골계 인종이 거주하는 극동 지역을 의미한다. “아시아인”이란 조상이 아시아인인 개체군을 의미하며, 바람직하게는 적어도 10대 이상의 조상이 아시아인인 개체군을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아시아인은 한국인이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 천식환자에서 비강 폴립(nasal polyps) 검출 진단에 필요한 정보를 제공하기 대한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제2서열의 3382번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs7798816), 서열목록 제3서열의 417번째뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3808316), 서열목록 제4서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802129), 서열목록 제5서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802122), 서열목록 제6서열의 227번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs7802642), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970), 서열목록 제8서열의 503번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6979947), 서열목록 제9서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1636608), 서열목록 제10서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802108), 서열목록 제11서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs2301947), 서열목록 제12서열의 496번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6960676), 서열목록 제13서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3779596), 서열목록 제14서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182392), 서열목록 제15서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271990), 서열목록 제16서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10228373), 서열목록 제17서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182389), 서열목록 제18서열의 223번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182385), 서열목록 제19서열의 349번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182378), 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 및 서열목록 제21서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182414)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계를 포함하는 천식환자에서 비강 폴립(nasal polyps) 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머를 필수 구성요소로 하는 바, 이들에 대한 상세한 설명은 본 발명의 방법에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어 “분석”은 특정 생체시료 또는 개체 내의 목적물질의 농도, 조성 또는 활성을 판단하거나 예측하는 것 뿐 만 아니라, 이러한 분석결과를 통해 질병 또는 질환에 대한 분석대상 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 천식환자에서 비강폴립의 존재 또는 발생 가능성), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 SNP를 마커로 하여 이의 존재가 상술한 방법을 통해 확인되면 천식환자에 있어서 비강 폴립의 존재 똔느 비강 폴립의 발생 가능성이 높은 것으로 판단된다.

본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계는 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시된다.

본 발명이 유전자 증폭 방식으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 진단한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 게놈 DNA)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 조사하여 MS 또는 DM을 결정할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법이 마이크로어레이 방식에 의하는 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 프로브는 상기 나열한 본 발명의 SNP들을 포함하는 각 유전자상의 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

프로브 제작시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커인 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위는 GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635에 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 네거티브 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 천식환자에서의 비강 폴립이 존재 및 발생가능성을 예측할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 천식환자에서의 비강 폴립이 존재 및 발생가능성이 높은 것으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970) 및 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위검출하는 단계를 포함하는 천식환자에서의 비강 폴립 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 가진 천식 환자는 비강 폴립의 발생이 높은 천식환자로 판단하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 아스피린 비민감성 천식환자에 특이적으로 적용될 수 있는 방법이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 천식환자에서 비강 폴립의 발생 가능성 및 존재 유무를 검출할 수 있는 키트 및 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 복잡한 데이터 수집을 요구하는 천식환자에서의 비강 폴립 형성의 표현형 결정 과정 없이, 천식환자에서 비강 폴립 형성 가능성 및 존재 유무를 신속하게 스크리닝할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 마커는 본 발명은 천식환자에서 비강 폴립의 발생 가능성 및 존재 유무에 대하여 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

도 1a-1b는 UBE3C 유전자의 해플로타입과 LD를 의미한다. 도 1a는 한국사람들의 UBE3C SNPs에서의 LD 계수(|D’|)를 나타낸 것이며, 도 1b는 UBE3C 유전자의 해플로타입을 나타낸 것이다. UTR는 비번역 영역을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험재료 및 방법

연구 대상

천식 유전체 연구센터에 있는 순천향대학교병원으로부터 천식환자를 모집하였다.

GINA(Global Initiative for Asthma)의 가이드라인에 따라, 조사 환자들의 평가는 지난 1년 동안 호흡곤란과 숨이 차는 증상을 가지는 환자들 중 다음과 같은 증상의 하나를 포함하는 환자들을 포함시켰다: 1) 폐기능 검사의 하나인 “1초간 강제 폐활량(forced expiratory volume in the 1^stsecond: FEV₁)”이 15%이상 증가 또는 단기 기관지 확장제 200 ㎖ 흡입 후 FEV₁가 12%이상 증가되는 기도 가역성, 2) PC₂₀메타콜린 10 mg/㎖ 이하에서의 기도 과민반응, 또는 3) 스테로이드와 지속성 기관지 확장제를 흡입한 후 2주째에 FEV₁20% 이상 증가¹⁴. 피부단자 실험(skin-prick test)에 24개 흡입 알러젠(예컨대, 먼지 진드기, 고양이털, 개털, 바퀴벌레, 풀 화분, 나무 화분, 라그위드 화분; Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)을 이용하였다. CAP 시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)을 이용하여 총 이뮤노글로불린 E(immunoglobulin E: Ig E)를 측정하였다. 아토피는 히스타민에 의한 발진반응 또는 그 이상이거나 직경 3 mm인 것으로 정의하였다. ATS(American Thoracic Society)가이드라인에 따라 Vmax Series 2130 Autobox Spirometry (Sensor Medics, YorbaLinda, CA)를 이용하여 폐기능 테스트를 하였다. 폐기능의 기준 값은 Morris/Polgar 기준에 따랐다¹⁵.

ATA 그룹으로부터 AIA 그룹을 선별하기 위하여, 천식 환자들에게 아스피린 투여량을 증가시키면서 아스피린 경구 유발을 실시하였다. 아스피린 과민감성을 가진 환자들에게는 아스피린 30 mg을 경구 투여하였으며 아스피린 비민감성을 가진 환자들에게는 아스피린 100 mg을 경구 투여하였다. 증상, 외적 변화(발진 및 혈관부종) 및 FEV₁을 2시간 동안 매 30분마다 기록하였다. 2시간 후 부작용이 나타날 것 같은 증상 또는 시그날이 없는 경우, 아스피린 60 mg 또는 100 mg을 투여하였으며 환자가 반응할 때까지 아스피린 450 mg을 투여한 후 동일한 측정 방법으로 매 1시간 마다 반복하였다. 아스피린을 최종 투여한 후 5시간 동안 아무런 반응이 나타나지 않는다면 음성으로 평가하였다. 아스피린을 최종 투여한 후 5시간 동안 FEV₁의 변화가 나타났다. FEV₁ 감소율을 반영하여 부하 전의 FEV₁에서 부하 후의 FEV₁ 뺀 후 값에 부하 전의 FEV₁으로 나누어서 아스피린-유도 기관지 경련을 산정하였다. 환자들은 각각의 OAC(oral aspirin challenge) 반응을 기초로 하여 카테고리화하였다. FEV₁가 20% 이상 감소하거나 코-눈 또는 피부 반응을 나타내면서 FEV₁가 1519% 감소를 나타내는 천식환자들을 AIA 그룹으로 나누었으며, 반면 코-눈 또는 피부 반응이 없이 FEV₁가 15% 미만 감소하는 천식환자들은 ATA(aspirin-tolerant asthma) 그룹으로 나타내었다.

프로토콜은 각 병원의 윤리심의위원회으로부터 승인을 받았으며, 환자들에게 서면으로된 피험자 동의서를 받았다.

SNP 선정 및 지노파입핑(genotyping)

UBE3C 유전자에서 24개의 SNPs(single nucleotide polymorphisms)를 선택하였으며 아시아인(중국인 한스와 일본인)에서의 MAF(minor allele frequencies), LD(linkage disequilibrium) 상태 및 유전자의 위치의 중요도(바람직하게는 엑손에서의 SNPs)를 기반으로 하는 국제 HapMap 데이터베이스(release #27)에 스크리닝하였다. 프리즘 7900HT 시퀀스 검출 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서의 TaqMan어세이를 이용하여 SNPs를 지노타입핑하였다¹⁷. 복제 DNA 체킹(n = 10; 복제물에서 일치율 > 99%)을 통하여 지노타이핑된 데이터의 퀄러티를 평가하였다. 유효한 지노타입핑 다형성(polymorphisms)으로부터 해플로타이프를 구성하였으며, 0.05 이상에서의 빈도를 가지는 것을 분석에 포함시켰다.

통계분석

Lewontin's D' (|D'|)를 이용하여 쌍대립형질 유전자좌들(biallelic loci)의 모든 쌍 사이에서 LD를 결정하였으며, Haploview 알고리즘[18]를 이용하여 LD r ² 계수를 검증하였다¹⁸. 비강 폴립 양성을 나타내는 천식환자와 비강 폴립 음성을 나타내는 천식환자에서 UBE3C 다형성 및 해플로타이프의 지노타입 분포에서의 차이를 측정하기 위하여, 승산비(odds ratio; 95% 신뢰 구간)와 이에 상응하는 P-값은 공변량으로서 나이(연속 값), 성(남성=0, 여성=1), 흡연 상태(비흡연자=0, 과거 흡연자=1, 흡연자=2) 및 아토피(무=1, 유=1)로 조정한 로지스틱 분석을 이용하여 계산하였다. 통계 분석 시스템(Statistical Analysis System: SAS) version 9.1 (SAS Inc., Cary, NC). Haplt상에서 데이터를 처리 및 분석하였다.

각각의 LD에서의 SNPs를 나타내는 마커들의 다중 테스트를 위한 최적의 보정을 하기 위하여, 프로그램인 SNPSpD (http://genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD/)를 이용하여 독립마커 유전좌의 유효수를 계산하였으며¹⁹, 이 프로그램은 마커들에서 페어-와이즈(pair-wise) 행렬의 SpD(spectral decomposition)를 기반으로 한다.

실험결과

연구 환자들의 임상적 특성

천식환자에서 UBE3C 유전자 변이와 비강 폴립과의 대조군 분석을 실시하기 위하여 본 연구자들은 UBE3C와 AIA와의 선행 관련 연구에 포함된 529 천식 환자들 중 475 환자들을 선정하여 스크리닝하였다. 환자들에서 161명은 폴립 양성으로 진단된 반면 314명은 폴립음성으로 동정되었다.

아스피린 유발 테스트의 결과에 기초하여 모든 천식환자들을 추가적으로 122명의 AIA 환자와 353명의 ATA 환자들로 분류하였다. 연구 환자들의 임상적 특성을 표 1에 나타내었다(값은 평균 ±표준오차를 의미). 폴립 양성 천식 환자(12.07)와 폴립 음성 대조군(6.74; P <0.0001)에서 FEV₁ 아스피린-유도 감소율면에서 유의적인 차이점을 나타내었다. 또한, 폴립 음성 대조군(15.53; P <0.0001)과 비교하여 폴립 양성 천식환자(41.77)에서 유의적으로 보다 높은 아피린 과민감성을 나타내었다. 결과적으로, 아스피린 과민성의 이력이 음성 환자들(9.39; P <0.0001)과 비교하여 폴립 양성 환자(31.21)들에서 유의적으로 우세한 것으로 확인되었다.

임상 프로파일	폴립양성	폴립음성	P-값
환자수(명)	161	314	-
평균 나이 (연령 범위)	46.09 (17.93-76.86)	46.80 (15.40-77.88)	0.58
남자/여자(명)	57/104	103/211	0.57
총 흡연자 (흡연자; 흡연경력자, %)	27.95 (12.42; 15.53)	28.03 (11.46; 16.56)	0.90
체질량지수(Body mass index: BMI; kg/m²)	23.92 ±3.00	24.50 ±3.50	0.06
아스피린 투여로 인한 FEV₁ 감소율 (%)	12.07 ±14.30	6.74 ±11.38	<0.0001
혈 중산구(%)	6.84 ±6.20	5.92 ±5.97	0.12
PC₂₀ 메타콜린(mg/㎖)	6.06 ±9.05	7.07 ±8.82	0.25
총 Ig E(IU/㎖)	293.50 ±466.51	365.61 ± 649.47	0.17
FEV₁(예측된 %)	89.90 ±15.73	91.91 ±17.30	0.20
FVC (예측된 %)	89.10 ±12.55	87.74 ±14.48	0.29
피부 테스트의 양성율(%)	52.17	57.64	0.26
아스피린 내저항의 양성율(%)	41.77	15.53	<0.0001
아스피린 과민감성 이력의 양성율(%)	31.21	9.39	<0.0001

UBE3C 변이체의 분포

UBE3C 유전자에서 총 24개의 다형성이 유의적으로 지노타핑되었다. 변이체중에서 하나의 SNP는 유전자 프로모터 영역에 위치하였으며 23개는 비코딩 인트론에 위치하였다(표 2; HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium), * HWE의 편차 P-값.). 표 2에 각 SNP의 MAFs(minor allele frequencies)를 나타내었다. SNPs의 지노타입의 패어와이즈(pairwise) 비교로부터 0.05 이상의 빈도를 가지는 3개의 주요한 해플로타입(도 1a)을 얻었으며 비강 폴립 양성 및 음성 천식 환자들과 비교 분석하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이 하나의 LD(linkage disequilibrium) 블록에 해플로타입들이 포함되었다.

유전자 좌(Loci)	영역	대립형질	MAF	HWE*
rs10949635	프로모터	G>T	0.367	0.197
rs7798816	인트론 1	A>G	0.460	0.296
rs3808316	인트론 1	G>C	0.460	0.296
rs733483	인트론 1	T>C	0.066	0.146
rs3802129	인트론 4	C>T	0.468	0.155
rs3802122	인트론 6	A>T	0.444	0.088
rs7802642	인트론 10	A>G	0.399	0.154
rs6955184	인트론 10	T>G	0.064	0.335
rs17837723	인트론 10	C>A	0.064	0.335
rs10271970	인트론 11	A>C	0.377	0.105
rs6979947	인트론 13	A>G	0.442	0.110
rs1636608	인트론 17	T>G	0.403	0.092
rs3802108	인트론 17	A>C	0.378	0.070
rs2301947	인트론 17	A>G	0.401	0.119
rs6960676	인트론 18	G>A	0.465	0.214
rs3779596	인트론 18	C>T	0.354	0.063
rs1182392	인트론 18	A>G	0.460	0.687
rs10271990	인트론 18	C>T	0.381	0.262
rs10228373	인트론 18	A>C	0.381	0.299
rs1182389	인트론 18	C>T	0.465	0.448
rs1182385	인트론 18	A>G	0.482	0.712
rs1182378	인트론 21	C>T	0.465	0.448
rs3757827	인트론 22	G>A	0.372	0.213
rs1182414	인트론 22	T>C	0.382	0.020
UBE3C_ht1	-	-	0.474	0.075
UBE3C_ht2	-	-	0.285	0.074
UBE3C_ht3	-	-	0.054	0.094

천식 환자에서 비강 폴립과 UBE3C 변이체와의 관련성

공변량으로서 나이, 성, 흡연 상태 및 아토피로 수정된 폴립 양성 천식 환자와 폴립 음성 천식 대조군에서 UBE3C 유전자에서의 24개 다형성의 로지스틱 분석에서 21개 SNPs가 공우성, 우성 및 열성 모델(P = 0.05-0.0001; 표 3)에서 유의성이 있음을 확인하였다. 다중 테스트 보정이 열성 모델에서 관련성의 근소한 징표에 대한 값을 감소시킬지라도, 21개 SNP의 관련성 시그날은 공우성 및 우성 유전자 유전에서 강력하였다(P ^corr =0.05-0.001; 표 3). 또한, 테스트된 UBE3C_ht1과 UBE3C_ht2 해플로타입이 천식 환자에서 비강 폴립의 존재와 유의적인 관련성이 있음을 확인하였다(P=0.002-0.0006,P ^corr = 0.02-0.007; 표 3). 표 3에서 *는 최초 진단된 나이, 성, 흡연 상태 및 아토피에 대하여 수정된 0.05 수준에서 P-값이며, **는 다중 수정 테스트한 후 P-값이다(독립적 마커 좌의 유효수 =11.7479; MAF, minor allele frequency; OR, odds ratio; CI, confidence interval; NS, not significant).

유전자 좌(Loci)	MAF		공우성			우성			열성
유전자 좌(Loci)	폴립양성 (n = 161 )	폴립음성 (n = 314)	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **
rs10949635G>T	0.286	0.419	0.57 (0.43-0.76)	0.0001	0.001	0.47 (0.32-0.69)	0.0001	0.001	0.50 (0.28-0.91)	0.02	NS
rs7798816A>G	0.385	0.511	0.62 (0.47-0.81)	0.0005	0.006	0.47 (0.31-0.71)	0.0003	0.004	0.61 (0.38-0.98)	0.04	NS
rs3808316G>C	0.385	0.511	0.62 (0.47-0.81)	0.0005	0.006	0.47 (0.31-0.71)	0.0003	0.004	0.61 (0.38-0.98)	0.04	NS
rs733483T>C	0.071	0.068	1.05 (0.63-1.76)	0.85	-	1.09 (0.62-1.92)	0.76	-	0.64 (0.07-6.25)	0.70	-
rs3802129C>T	0.394	0.518	0.62 (0.48-0.82)	0.0007	0.008	0.46 (0.31-0.70)	0.0002	0.002	0.64 (0.40-1.02)	0.06	-
rs3802122A>T	0.366	0.495	0.61 (0.47-0.80)	0.0004	0.005	0.47 (0.31-0.70)	0.0002	0.002	0.60 (0.37-0.97)	0.04	NS
rs7802642A>G	0.317	0.446	0.59 (0.44-0.78)	0.0003	0.004	0.49 (0.33-0.73)	0.0004	0.005	0.51 (0.29-0.89)	0.02	NS
rs6955184T>G	0.068	0.065	1.05 (0.62-1.79)	0.85	-	1.06 (0.60-1.88)	0.84	-	1.02 (0.09-11.33)	0.99	-
rs17837723C>A	0.068	0.065	1.05 (0.62-1.79)	0.85	-	1.06 (0.60-1.88)	0.84	-	1.02 (0.09-11.33)	0.99	-
rs10271970A>C	0.292	0.426	0.57 (0.43-0.76)	0.0001	0.001	0.48 (0.33-0.71)	0.0003	0.004	0.47 (0.26-0.85)	0.01	NS
rs6979947A>G	0.363	0.492	0.61 (0.47-0.80)	0.0004	0.005	0.47 (0.32-0.71)	0.0003	0.004	0.58 (0.36-0.95)	0.03	NS
rs1636608T>G	0.323	0.452	0.59 (0.45-0.79)	0.0003	0.004	0.48 (0.32-0.71)	0.0002	0.002	0.55 (0.32-0.95)	0.03	NS
rs3802108A>C	0.295	0.427	0.58 (0.44-0.78)	0.0002	0.002	0.49 (0.33-0.72)	0.0003	0.004	0.50 (0.28-0.88)	0.02	NS
rs2301947A>G	0.320	0.449	0.59 (0.45-0.79)	0.0003	0.004	0.49 (0.33-0.72)	0.0003	0.004	0.53 (0.30-0.92)	0.02	NS
rs6960676G>A	0.388	0.514	0.61 (0.47-0.81)	0.0005	0.006	0.45 (0.30-0.68)	0.0002	0.002	0.63 (0.39-1.01)	0.06	-
rs3779596C>T	0.292	0.389	0.66 (0.50-0.88)	0.005	0.05	0.54 (0.37-0.80)	0.002	0.02	0.68 (0.38-1.21)	0.19	-
rs1182392A>G	0.398	0.505	0.65 (0.49-0.85)	0.002	0.02	0.53 (0.35-0.80)	0.003	0.03	0.61 (0.37-0.99)	0.05	NS
rs10271990C>T	0.306	0.424	0.61 (0.45-0.81)	0.0007	0.008	0.51 (0.34-0.75)	0.0007	0.008	0.54 (0.30-0.98)	0.04	NS
rs10228373A>C	0.307	0.424	0.61 (0.46-0.81)	0.0007	0.008	0.51 (0.35-0.76)	0.0008	0.009	0.54 (0.30-0.97)	0.04	NS
rs1182389C>T	0.394	0.511	0.63 (0.47-0.83)	0.0009	0.01	0.48 (0.32-0.73)	0.0005	0.006	0.63 (0.39-1.02)	0.06	-
rs1182385A>G	0.419	0.525	0.65 (0.49-0.86)	0.002	0.02	0.51 (0.33-0.78)	0.002	0.02	0.64 (0.40-1.02)	0.06	-
rs1182378C>T	0.394	0.511	0.63 (0.47-0.83)	0.0009	0.01	0.48 (0.32-0.73)	0.0005	0.006	0.63 (0.39-1.02)	0.06	-
rs3757827G>A	0.292	0.416	0.59 (0.44-0.79)	0.0003	0.004	0.49 (0.33-0.73)	0.0004	0.005	0.52 (0.29-0.94)	0.03	NS
rs1182414T>C	0.301	0.427	0.60 (0.45-0.80)	0.0004	0.005	0.48 (0.33-0.71)	0.0003	0.004	0.55 (0.32-0.97)	0.04	NS
UBE3C_ht1	0.540	0.430	1.52 (1.16-1.99)	0.002	0.02	1.44 (0.94-2.22)	0.10	-	2.17 (1.40-3.36)	0.0006	0.007
UBE3C_ht2	0.224	0.325	0.62 (0.46-0.84)	0.002	0.02	0.54 (0.37-0.80)	0.002	0.02	0.55 (0.27-1.12)	0.10	-
UBE3C_ht3	0.059	0.056	1.07 (0.61-1.88)	0.82	-	1.08 (0.59-2.00)	0.80	-	1.02 (0.09-11.33)	0.99	-

비강 폴립이 천식 환자에서 아스피린-과민감도의 중요한 특성으로서 간주됨에 따라, AIA과 ATA 그룹에서의 폴립 발달에 대한 분석은 공변량인 나이, 성, 흡연상태 및 아토피를 콘트롤하면서 실시되었다. AIA 서브그룹에서, 6개 SNP가 공우성 및 우성 모델에서 최저 관련 시그날을 나타내었다(P = 0.04; 표 4). 그러나, 독립 마커좌들(loci)의 유효 수인 11.7479를 가지는 유효 값들은 다중 테스트 보정 후 유의성의 경계에 도달하지 못하였다. 표 4에서 *는 최초 진단된 나이, 성, 흡연 상태 및 아토피에 대하여 수정된 0.05 수준에서 P-값이며, **는 다중 수정 테스트한 후 P-값(독립적 마커 좌의 유효수 = 11.7479)이다(MAF, minor allele frequency; OR, odds ratio; CI, confidence interval; NS, not significant).

유전자 좌(Loci)	MAF		공우성			우성			열성
유전자 좌(Loci)	폴립 양성 (n = 69)	폴립 음성 (n = 53)	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **
rs10949635G>T	0.290	0.330	0.86 (0.48-1.53)	0.61	-	0.57 (0.27-1.22)	0.15	-	2.54 (0.62-10.39)	0.20	-
rs7798816A>G	0.348	0.462	0.63 (0.37-1.08)	0.10	-	0.43 (0.19-0.95)	0.04	NS	0.80 (0.30-2.16)	0.66	-
rs3808316G>C	0.348	0.462	0.63 (0.37-1.08)	0.10	-	0.43 (0.19-0.95)	0.04	NS	0.80 (0.30-2.16)	0.66	-
rs733483T>C	0.029	0.104	0.27 (0.08-0.92)	0.04	NS	0.25 (0.07-0.96)	0.04	NS	-	0.99	-
rs3802129C>T	0.362	0.462	0.67 (0.39-1.13)	0.13	-	0.45 (0.20-0.99)	0.05	-	0.87 (0.33-2.30)	0.78	-
rs3802122A>T	0.333	0.434	0.67 (0.39-1.15)	0.15	-	0.46 (0.21-1.00)	0.05	-	0.93 (0.33-2.59)	0.89	-
rs7802642A>G	0.326	0.358	0.88 (0.51-1.53)	0.65	-	0.66 (0.31-1.40)	0.28	-	1.55 (0.48-5.05)	0.47	-
rs6955184T>G	0.029	0.094	0.26 (0.07-0.94)	0.04	NS	0.25 (0.07-0.96)	0.04	NS	-	0.99	-
rs17837723C>A	0.029	0.094	0.26 (0.07-0.94)	0.04	NS	0.25 (0.07-0.96)	0.04	NS	-	0.99	-
rs10271970A>C	0.304	0.330	0.92 (0.53-1.60)	0.77	-	0.65 (0.31-1.38)	0.26	-	2.07 (0.58-7.35)	0.26	-
rs6979947A>G	0.333	0.425	0.70 (0.41-1.19)	0.19	-	0.46 (0.21-1.00)	0.05	-	1.07 (0.37-3.06)	0.90	-
rs1636608T>G	0.326	0.368	0.85 (0.49-1.47)	0.55	-	0.61 (0.29-1.30)	0.20	-	1.55 (0.48-5.05)	0.47	-
rs3802108A>C	0.304	0.330	0.92 (0.53-1.60)	0.77	-	0.65 (0.31-1.38)	0.26	-	2.07 (0.58-7.35)	0.26	-
rs2301947A>G	0.326	0.358	0.88 (0.51-1.53)	0.65	-	0.66 (0.31-1.40)	0.28	-	1.55 (0.48-5.05)	0.47	-
rs6960676G>A	0.355	0.453	0.67 (0.40-1.15)	0.15	-	0.43 (0.19-0.95)	0.04	NS	0.98 (0.36-2.67)	0.97	-
rs3779596C>T	0.304	0.340	0.86 (0.50-1.49)	0.59	-	0.55 (0.26-1.17)	0.12	-	2.28 (0.64-8.08)	0.20	-
rs1182392A>G	0.399	0.472	0.73 (0.43-1.25)	0.25	-	0.60 (0.27-1.33)	0.21	-	0.75 (0.29-2.00)	0.57	-
rs10271990C>T	0.331	0.368	0.85 (0.50-1.45)	0.56	-	0.70 (0.33-1.49)	0.35	-	1.08 (0.37-3.18)	0.89	-
rs10228373A>C	0.333	0.368	0.86 (0.50-1.46)	0.56	-	0.71 (0.33-1.51)	0.37	-	1.06 (0.36-3.13)	0.91	-
rs1182389C>T	0.370	0.472	0.65 (0.39-1.10)	0.11	-	0.46 (0.21-1.01)	0.05	-	0.75 (0.29-1.99)	0.57	-
rs1182385A>G	0.413	0.500	0.70 (0.41-1.17)	0.17	-	0.57 (0.25-1.29)	0.18	-	0.66 (0.27-1.65)	0.38	-
rs1182378C>T	0.370	0.472	0.65 (0.39-1.10)	0.11	-	0.46 (0.21-1.01)	0.05	-	0.75 (0.29-1.99)	0.57	-
rs3757827G>A	0.312	0.340	0.88 (0.52-1.50)	0.65	-	0.69 (0.33-1.47)	0.34	-	1.31 (0.43-4.02)	0.64	-
rs1182414T>C	0.319	0.368	0.82 (0.49-1.37)	0.45	-	0.64 (0.30-1.36)	0.25	-	1.04 (0.36-3.00)	0.94	-
UBE3C_ht1	0.522	0.472	1.17 (0.71-1.92)	0.55	-	0.94 (0.41-2.16)	0.88	-	1.63 (0.70-3.78)	0.26	-
UBE3C_ht2	0.210	0.226	0.93 (0.51-1.69)	0.80	-	0.69 (0.32-1.49)	0.35	-	2.73 (0.51-14.66)	0.24	-
UBE3C_ht3	0.022	0.066	0.31 (0.07-1.33)	0.11	-	0.30 (0.07-1.41)	0.13	-	-	0.99	-

이와 반대로, ATA에서 비강 폴립을 가지고 있는 환자와 UBE3C 다형성과의 로지스틱 분석 결과에서는 관련성(P=0.02-0.005; 표 5)의 근소한 징표를 나타내는 11개 다형성을 가지는 공우성 및 우성 모델(P=0.02-0.0002, P ^corr = 0.01-0.002; 표 5)에서의 10개 SNP에 대한 유의적인 관련성 시그날을 나타내었다.

2개의 UBE3C 해플로타입과 ATA 환자들에서 비강 폴립과의 해플로타입 분석에서 유의적인 관련성이 있다하더라도(P=0.02-0.002는 각 모델들에 의존적이다.; 표 5), 다중 비교 후 UBE3C_ht1의 시그날만이 유의적이었다(공우성 모델에서의 P ^corr = 0.02; 표 5). 표 5에서 *는 최초 진단된 나이, 성, 흡연 상태 및 아토피에 대하여 수정된 0.05 수준에서 P-값이며, **는 다중 수정 테스트한 후 P-값(독립적 마커 좌의 유효수 =11.7479)이다(MAF, minor allele frequency; OR, odds ratio; CI, confidence interval; NS, not significant).

유전자 좌(Loci)	MAF		공우성			우성			열성
유전자 좌(Loci)	폴립 양성 (n = 92)	폴립 음성 (n = 261)	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **	OR (95%CI)	P*	P ^corr **
rs10949635G>T	0.283	0.437	0.52 (0.36-0.75)	0.0004	0.005	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.35 (0.16-0.81)	0.01	NS
rs7798816A>G	0.413	0.521	0.65 (0.46-0.91)	0.01	NS	0.51 (0.30-0.85)	0.01	NS	0.45 (0.24-0.85)	0.01	NS
rs3808316G>C	0.413	0.521	0.65 (0.46-0.91)	0.01	NS	0.51 (0.30-0.85)	0.01	NS	0.45 (0.24-0.85)	0.01	NS
rs733483T>C	0.103	0.061	1.77 (0.97-3.22)	0.06	-	1.81 (0.95-3.43)	0.07	-	1.21 (0.11-12.84)	0.88	-
rs3802129C>T	0.418	0.529	0.64 (0.46-0.91)	0.01	NS	0.48 (0.29-0.81)	0.006	NS	0.48 (0.26-0.89)	0.02	NS
rs3802122A>T	0.391	0.508	0.63 (0.45-0.89)	0.008	NS	0.50 (0.30-0.83)	0.007	NS	0.40 (0.20-0.78)	0.007	NS
rs7802642A>G	0.310	0.464	0.52 (0.36-0.74)	0.0004	0.005	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.62 (0.32-1.20)	0.15	-
rs6955184T>G	0.098	0.059	1.71 (0.93-3.14)	0.08	-	1.74 (0.91-3.34)	0.10	-	-	0.99	-
rs17837723C>A	0.098	0.059	1.71 (0.93-3.14)	0.08	-	1.74 (0.91-3.34)	0.10	-	-	0.99	-
rs10271970A>C	0.283	0.446	0.49 (0.34-0.71)	0.0002	0.002	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.49 (0.23-1.02)	0.06	-
rs6979947A>G	0.386	0.506	0.63 (0.45-0.88)	0.006	NS	0.51 (0.31-0.84)	0.009	NS	0.37 (0.18-0.74)	0.005	NS
rs1636608T>G	0.321	0.469	0.54 (0.38-0.77)	0.0007	0.008	0.43 (0.26-0.71)	0.0009	0.01	0.58 (0.30-1.12)	0.11	-
rs3802108A>C	0.288	0.446	0.51 (0.36-0.74)	0.0003	0.004	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.47 (0.22-0.98)	0.05	-
rs2301947A>G	0.315	0.467	0.53 (0.37-0.75)	0.0005	0.006	0.43 (0.26-0.71)	0.0009	0.01	0.59 (0.31-1.15)	0.12	-
rs6960676G>A	0.413	0.527	0.63 (0.45-0.89)	0.009	NS	0.48 (0.29-0.81)	0.006	NS	0.46 (0.24-0.86)	0.02	NS
rs3779596C>T	0.283	0.398	0.60 (0.41-0.86)	0.005	NS	0.53 (0.33-0.86)	0.01	NS	0.56 (0.26-1.17)	0.12	-
rs1182392A>G	0.397	0.511	0.61 (0.43-0.87)	0.006	NS	0.50 (0.30-0.84)	0.008	NS	0.65 (0.36-1.17)	0.15	-
rs10271990C>T	0.288	0.435	0.51 (0.35-0.74)	0.0004	0.005	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.76 (0.39-1.48)	0.42	-
rs10228373A>C	0.288	0.435	0.51 (0.35-0.74)	0.0004	0.005	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.75 (0.38-1.46)	0.39	-
rs1182389C>T	0.413	0.519	0.63 (0.45-0.90)	0.01	NS	0.51 (0.30-0.87)	0.01	NS	0.69 (0.38-1.23)	0.20	-
rs1182385A>G	0.424	0.531	0.63 (0.44-0.89)	0.01	NS	0.49 (0.29-0.84)	0.009	NS	0.73 (0.42-1.27)	0.26	-
rs1182378C>T	0.413	0.519	0.63 (0.45-0.90)	0.01	NS	0.51 (0.30-0.87)	0.01	NS	0.69 (0.38-1.23)	0.20	-
rs3757827G>A	0.277	0.431	0.49 (0.33-0.72)	0.0002	0.002	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.78 (0.40-1.54)	0.48	-
rs1182414T>C	0.288	0.439	0.52 (0.36-0.75)	0.0004	0.005	0.44 (0.27-0.72)	0.001	0.01	0.77 (0.40-1.47)	0.42	-
UBE3C_ht1	0.554	0.421	1.71 (1.21-2.41)	0.002	0.02	1.70 (0.98-2.95)	0.06	-	1.78 (1.10-2.89)	0.02	-
UBE3C_ht2	0.234	0.345	0.58 (0.40-0.86)	0.006	NS	0.55 (0.34-0.89)	0.02	NS	0.43 (0.16-1.13)	0.09	-
UBE3C_ht3	0.087	0.054	1.66 (0.88-3.13)	0.12	-	1.69 (0.85-3.35)	0.13	-	.	0.99	-

검토

코 막힘은 제외하더라도, 비강 관 또는 통로에서 폴립의 발달은 천식을 가진 사람들, 특히 아스피린 과민성을 가진 사람들에게 있어서 위협적이다.

비강 폴립을 발달시키는 유전적인 경향이 여전히 불확실하더라도, 염증 반응을 포함하는 세포성 과정이 비강 폴립을 유발한다는 것을 증명하는 몇 가지 증거들이 보고되어 왔다. 우선, 본 연구자들은 AIA의 위험 요소가 될 수 있는 UBE3C 유전자의 몇 가지 변이체를 동정하였으며²⁰, 조건은 비강 폴립과 아스피린을 포함하는 NSAID(non-steroidal inflammatory drugs)에 의하여 촉진된 천식 유발과의 관련성을 통하여 특성화시켰다. 본 연구는 기도 염증질환에 있어서 UBE3C의 임상학적 암시를 위한 추가적인 증거를 제공하였다.

단백질 유비퀴티네이션은 병원성에 대한 선천적이고 적응적 면역 반응에서의중요한 세포성 작용의 폭 넓은 배열을 의미한다. HECT 도메인을 포함하는 E3 라이게즈의 서브클레스인 Itch 결핍이 비정상적인 면역 및 염증 반응을 유발한다고 보고되었다²¹. 다양한 질병의 발달에 있어서 UBE3C의 관련성을 언급한 선행 보고서가 없음에도 불구하고, UBE3C 유전자는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 NF-Kβ의 중요 조절자이며^10,11, 또한 호흡기 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. 이러한 경로는 낭포성섬유증에 포함되어있으며, 이러한 질환은 비강 폴립의 존재 뿐 만 아니라 기도의 만성 장애 및 염증의 의한 질환으로 보도되었다^22,23.

본 연구자들은 천식 환자에서 비강 폴립이 발달하는데 있어서 UBE3C에서의 변이체 기능에 대하여 조사하였다. UBE3C 변이체의 빈도 분포에서의 차이에 대한 분석을 통하여 대부분의 SNP(24개 중 21개)와 해플로타입(3개중 2개)이 유의성 0.05 수준에서 프로모터 영역에서의 rs10949635G>T와 가장 높은 관련성 시그날(공우성 및 우성 모델에서 P = 0.0001, P ^corr = 0.001)을 나타내는 인트론 11에서 rs10271970A>C를 가지는 한국 천식 환자에서 비강 폴립의 존재와 관련성이 있음을 확인하였다. 우리의 가설 선상에서 이와 같은 결과는 UBE3C 유전자가 천식의 발병에 있어서 비강 폴립의 존재의 유무에 있어서 중요한 유전적인 마커임을 제시한다. 다중 SNP가 질병의 발생을 증가시키는데 동시에 작용하기 때문에, UBE3C_ht1 와 UBE3C_ht2에 의해 유도된 유의적인 시그날들이 대립유전자가 천식 환자에서의 비강 폴립의 발달을 콘트롤하는 조절 구성 요소로서 해플로타입 기능을 구성하고 있음을 제시한다. 추가적으로 관련성 시그날의 특성을 구체화시키기 위하여, AIA 하위 그룹과 ATA 하위그룹으로 구성된 보다 동종의 천식 피노타입을 분석하였다. 전체 천식 환자들에서 결과 값보다 현저하게 작을 지라도, 가장 높은 관련성 신호들(공우성 모델에서의 P = 0.0002, P ^corr = 0.002)을 나타내는 rs10271970A>C(전체 천식 환자의 분석결과에서 일정한 패턴을 나타냄)와 rs3757827G>A를 가지는 ATA 환자들에서 UBE3C 변이체에서의 유의적인 차이가 검출되었다. 유사한 SNP가 전체 환자들의 분석결과와 ATA 피노타입 모두에 있어서의 다중 비교들과 상이한 관련 시그날을 나타내었으며, 이러한 변이체들이 천식 환자에서 비강 폴립의 발달을 강하게 기여하는 것으로 나타났다. 반면, 근소한 관련 징표들만이 UBE3C 다형성 및 AIA 그룹에서 비강 폴립의 존재에서 동정되었으며, 이러한 결과는 테스트한 유전적 변이체들이 아스피린-과민감성 천식환자들에서 폴립 발달에 영향을 주지 않음을 제시하는 하는 것이다. 프로모터 영역은 전사인자의 결합 친화성과 유전자 발현 조절과 관련이 있으며 기능적으로 관련된 SNP를 포함한다. 또한, 최초에 인트론에 있어서의 다형성이 단백질 서열 코딩에 있어서 중요한 역할을 가지지 않는다고 생각하였더라도, 다른 질병-유발 유전자들에 대한 보고한 바에 따라 유전자의 비-코딩 인트론 영역에 위치하는 다형성이 선택적인 스프라이싱, 스플라이싱율 또는 메신져 RNA 턴오버(turnover)에 영향을 나타낼 수 있다²⁵.

결론적으로, 본 연구자들은 UBE3C 변이체가 한국 천식 환자에서 비강 폴립의 존재에 대한 유전적인 마커임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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tggtgttatt tctgtagtat attaacaatg agggaacaat atacagcaat 480 tattttaggt ttagggagca ctttactaga ttaaaagctg taagtggcag acattacatt 540 tcagaatagt ggtctcatca tatagtgaga ttggttgtta gccatggtat taatatcaga 600 atgataataa gttagaagga aagatgataa aattaattta gccaccaaat catgctggga 660 aaacaccca 669 <210> 20 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gtcttaagtg ctcccagaga tgaaatgcac gcatgagaaa atgttctccc tcctttaggt 60 ttaaaattga gacggtgagc acattggaca cagtattccg tgccgtgctt ttctcatctg 120 ataatgggtc tcgctcatct tgcctattaa tggtgaggct atatggtgtt ccatgcacac 180 gcgcggcacg acgtgttgct gggcacttct ctcagctttt tacaaaaaat gatgcaatga 240 atacgtacct rgttttcaca gttgtgcaaa tgtatctgta ggcaaaaacc gtgttaggga 300 ttgctcaacg cagacttaat gcatgagacc tatgggcgtg tcggtcctct gatggccacg 360 aagaaccggt gactccacct tcctcgtata cacaaacacc attagctatt tgcctcacat 420 ttgagatacg tgatttatgt gttctcttcc aacaggaaga caataaggca cagatcgccc 480 tcagtctgct cactgtcgca g 501 <210> 21 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atgcatgatg aaaagtggct tgcttgtgcc agaatttaaa taattgttaa caaaaaagaa 60 agatgatcag ggaaatttga atattgtttt tcagatgtgt tcatgacgtt ctggtattta 120 aaggtacagt gtgaaaattc tcatccctgt atcacagata cccagttccc attcccactg 180 gcaaccaacg cttcagcgtc ttaagtgctc ccagagatga aatgcacgca tgagaaaatg 240 ttctccctcc tttaggttta aaattgagac ggtgagcaca ttggacacag tattccgtgc 300 ygtgcttttc tcatctgata atgggtctcg ctcatcttgc ctattaatgg tgaggctata 360 tggtgttcca tgcacacgcg cggcacgacg tgttgctggg cacttctctc agctttttac 420 aaaaaatgat gcaatgaata cgtacctggt tttcacagtt gtgcaaatgt atctgtaggc 480 aaaaaccgtg ttagggattg ctcaacgcag acttaatgca tgagacctat gggcgtgtcg 540 gtcctctgat ggccacgaag aaccggtgac tccaccttcc tcgtatacac aaacaccatt 600 a 601

Claims

UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제2서열의 3382번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs7798816), 서열목록 제3서열의 417번째뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3808316), 서열목록 제4서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802129), 서열목록 제5서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802122), 서열목록 제6서열의 227번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs7802642), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970), 서열목록 제8서열의 503번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6979947), 서열목록 제9서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1636608), 서열목록 제10서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802108), 서열목록 제11서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs2301947), 서열목록 제12서열의 496번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6960676), 서열목록 제13서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3779596), 서열목록 제14서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182392), 서열목록 제15서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271990), 서열목록 제16서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10228373), 서열목록 제17서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182389), 서열목록 제18서열의 223번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182385), 서열목록 제19서열의 349번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182378), 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 및 서열목록 제21서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182414)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 천식환자에서 비강 폴립(nasal polyps) 검출용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 UBE3C 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970) 및 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식환자에서 비강 폴립 검출용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 가진 천식 환자는 비강 폴립의 발생이 높은 천식환자인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 천식 환자는 아스피린 비민감성 천식환자인 것을 특징인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 아시아인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 분석용 키트.
천식환자에서 비강 폴립 검출 진단에 필요한 정보를 제공하기 대한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제2서열의 3382번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs7798816), 서열목록 제3서열의 417번째뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3808316), 서열목록 제4서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802129), 서열목록 제5서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802122), 서열목록 제6서열의 227번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs7802642), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970), 서열목록 제8서열의 503번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6979947), 서열목록 제9서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1636608), 서열목록 제10서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3802108), 서열목록 제11서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs2301947), 서열목록 제12서열의 496번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs6960676), 서열목록 제13서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3779596), 서열목록 제14서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182392), 서열목록 제15서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271990), 서열목록 제16서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10228373), 서열목록 제17서열의 201번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182389), 서열목록 제18서열의 223번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182385), 서열목록 제19서열의 349번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182378), 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 및 서열목록 제21서열의 301번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs1182414)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 검출하는 단계를 포함하는 천식환자에서 비강 폴립 검출 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs10949635), 서열목록 제7서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs10271970) 및 서열목록 제20서열의 251번째 뉴클레오타이드 위치에 G를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs3757827) 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 UBE3C (ubiquitin protein ligase E3C) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 가진 천식 환자는 비강 폴립의 발생이 높은 천식환자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 천식 환자는 아스피린 비민감성 천식환자인 것을 특징인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 아시아인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.