DE69636367T2

DE69636367T2 - T-pa polymorphismus und dessen verwendung zur risikodiagnose von thrombus assoziierten krankheiten

Info

Publication number: DE69636367T2
Application number: DE69636367T
Authority: DE
Inventors: Cornelis Kluft; Egbertus Diederick GROBBEE
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1995-08-21
Filing date: 1996-08-19
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: EP0846185B1; EP0846185A1; WO1997007240A1; AU6822796A; US5994080A; DE69636367D1; JPH11511021A

Description

Einleitung
Die Blutgerinnselbildung ist das Schlüsselereignis bei akuten Manifestationen von Gefäßerkrankungen wie myokardialem Infarkt, Thromben in peripheren Blutgefäßen und zerebralem Infarkt. Abgesehen von einer erhöhten Koagualtion bzw. Blutgerinnung kann eine Störung der Blutgerinnselauflösung eine unerwünschte Koronarthrombose herbeiführen. In vielen Fällen wurde ein längerer oder kürzerer Zeitraum unterschieden, während welchem das Gerinnsel gebildet wird und anschließend vor dem permanenten Verschluss durch das Gerinnsel aufgelöst wird. Während dieser Verschluss- und Wiederöffnungsphase von Blutgefäßen des Gerinnselauflösungs- oder Antikoagulationssystems spielt die Fibrinolyse eine wichtige Rolle. Die exakte Natur ist jedoch unklar, doch war bei einem eindeutigen Infarkt der Gerinnselbildungsimpuls ganz klar stärker als die Reaktion des fibrinolytischen Systems, zu reagieren, d. h. das Blutgerinnsel aufzulösen.
Das proteolytische Enzym Plasmin ist für den Abbau von Fibrin-Gerinnseln von essentieller Bedeutung. Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) ist eine Serinprotease, die Plasminogen in Plasmin umwandelt. T-PA ist heutzutage als ein therapeutisches Mittel in der großen Mehrzahl der Fälle von akutem myokardialen Infarkt¹ weithin akzeptiert. Wenn es in hohen Dosen verabreicht wird, baut es verschließende Thromben unverzüglich ab. T-PA gilt als einer der bedeutendsten Aktivatoren der Fibrinolyse und ist dafür bekannt, antithrombotische Wirksamkeit zu besitzen (Es gibt zahlreiche t-PA-Patentveröffentlichungen und andere Veröffentlichungen, wie Ref. 25 und 26, welche dies darlegen.)
Die jüngsten Längsstudien gaben einen Hinweis darauf, dass einerseits herabgesetzte endogene t-PA-Aktivitätsniveaus in Plasma mit einem erhöhten Risiko von myokardialem Infarkt bei Patienten mit Angina pectoris² und mit rezidivierendem moykardialen Infarkt³ assoziiert sein können. Andererseits waren erhöhte Konzentrationen von endogenem t-PA-Antigen in Plasma auch mit einem erhöhten Risiko von rezidivierendem moykardialen Infarkt⁴, kardiovaskulären Ereignissen bei Patienten mit Angina pectoris und koronarer Arterienverengung^5,6 und mit dem Risiko eines myokardialen Infarktes bei gesunden Männern assoziiert. Zur Untermauerung des zuvor Gesagten wurde darauf hingewiesen, dass die signifikante positive Assoziierung zwischen Konzentrationen von t-PA-Antigen und dem Inhibitor, von freiem t-PA, dem so genannten Plasminogenaktivator-Inhibitor-(PAI-1)-Antigen⁸, zum Ausdruck bringt, dass erhöhte Konzentrationen von t-PA-Antigen auch für einen zirkulierenden t-PA/PAI-1-Komplex in einem hohen Maße sprechen können. Somit könnte eine hohe Konzentration von t-PA-Antigen eher auf eine herabgesetzte als eine erhöhte fibrinolytische Aktivität hinweisen. Die Steigerung der Produktion von t-PA-Inhibitor, PAI-1, könnte größtenteils die t-PA-Aktivität neutralisieren. Obwohl somit eine Zunahme der t-PA-Konzentration hauptsächlich dem inaktiven Komplex von t-PA-PAI-1 auf diese Weise zuzuschreiben wäre, könnte ein erhöhter PAI-1 sich selbst manifestieren und damit zur eigentlichen Ursache des Risikos werden. Tatsächlich wurden erhöhte Plasmakonzentrationen und PAI-1-Aktivität als ein Risiko vorhersagender Faktor angegeben. Vor kurzem wurde die Erblichkeit für eine erhöhte PAI-1 ebenfalls als ein Risiko vorhersagender Faktor angegeben. Eriksson P.²⁴ et al. z. B. beschreiben die Genotypisierung für den 4G/5G-Polymorphismus in der PAI-1-Promotor-Region mit einer an sich bekannten Allel-spezifischen Oligonukleotid-Schmelztechnik. Das 4G-Allel war mit einer höheren Plasma-PAI-1-Aktivität assoziiert. Damit lieferte diese Gruppe Beweise für eine unabhängige etiologische Rolle von PAI-1 bei myokardialem Infarkt.
Bei Iacoviello L. et al.²³ wurde eine Assoziation zwischen der Familienvorgeschichte mit Thrombose und akutem myokardialen Infarkt (AMI) unterstellt. Darüber hinaus wird für Veränderungen in der Fibrinolyse eine Korrelation mit dem Risiko ischämischer Gefäßerkrankungen unterstellt. Die T-PA-Werte in einer Gruppe von Patienten mit AMI, gewählt aus der GISSI-2-Studienpopulation, wurden untersucht. Patienten mit einer Familienvorgeschichte mit Thrombose (mindestens zwei Verwandte des ersten Grades waren von MI und/oder Schlaganfall vor dem 65. Lebensjahr betroffen) wurden parallel mit MI-Patienten ohne Familienvorgeschichte mit Thrombose 6 Monate nach der AMI-Episode untersucht. Die Ergebnisse der Studie waren, dass die Spiegel von t-PA-Antigen in der Gruppe mit einer Familienvorgeschichte mit Thrombose (10,1 ± 0,6 ng/ml, Mittelwert ±SE, n = 53) sich nicht wesentlich von den Niveaus in der Gruppe ohne Familienvorgeschichte (10,4 ± 0,6 ng/ml, n = 53) unterschieden. Seltsamerweise dagegen waren, als Patienten lediglich mit einer Familienvorgeschichte von MI betrachtet wurden, die t-PA-Antigen-Niveaus wesentlich niedriger als in der jeweiligen Kontollgruppe (7,5 ± 4,4 vs. 11,1 ± 3,5 ng/ml, t = 2,6. p < 0,02. n = 16). Es waren keine Unterschiede in der t-PA- und PAI-Aktivität und in den PAI-1-Antigen-Spiegeln unter allen untersuchten Gruppen festzustellen.
Ein Insertion/Deletion (I/D)-Polymorphismus im Intron h des t-PA-Gens in der AMI-Population wurde von Iacoviello et al. untersucht. Vorläufige Daten zeigten, dass die Häufigkeiten von beiden Allelen 0,51 bzw. 0,49 waren und die Genotyp-Verteilung sich im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht befand. Der I/D-Polymorphismus war mit t-PA-Aktivitätsniveaus (p < 0,03), nicht mit t-PA-Antigen-Konzentrationen, assoziiert. Das D-Allel war mit höheren Niveaus der t-PA-Aktivität assoziiert. Die kuriose Schlussfolgerung ist, dass verringerte Antigen-Niveaus von t-PA, wie sich zeigte, mit einer Familienvorgeschichte mit AMI in Zusammenhang standen. Dieser Marker schien sich bei Patienten mit einer Familienvorgeschichte mit Thrombose in verschiedenen Gefäßgegenden unterschiedlich zu äußern.
Durch das oben Gesagte wird offensichtlich, dass die Plasmaspiegel von t-PA und PAI-1 nur begrenzte und verwirrende Informationen liefern können. Die Daten zeigen Zusammenhänge zwischen einem erhöhten t-PA-Antigen und dem Risiko ischämischer Ereignisse in Populationsstudien, während in Familien mit einer Familienvorgeschichte mit myokardialem Infarkt t-PA-Antigen geringer ist. Iacoviello findet keine Beziehung zwischen einer Erkrankung und der Genetik. Die Häufigkeit von D- und I-Allel bei Myokard-Patienten mit und ohne Familienvorgeschichte unterscheidet sich nicht. Anscheinend lassen sich die Resultate von Familienstudien nicht mit Populationsstudien vergleichen. Ein weiteres Problem mit dieser Studie ist die Tatsache, dass die einen Zusammenhang des D-Allels mit einer höheren t-PA-Aktivität ohne Folgen für das t-PA-Antigen ergebende Analyse bei allen AMI-Patienten, d. h. mit und ohne Familien-AMI/Thrombose, durchgeführt wurde. Da das t-PA-Antigen für diese Gruppen unterschiedlich ist, sind die Ergebnisse aufgrund dieses Mixes von Patienten diskutierbar. Neben der strittigen Annahme, dass ein lokaler Prozess im Plasma beobachtet werden könnte, gibt es eine weitere Schwierigkeit in der Nutzung von Plasmaspiegeln bei der Untersuchung des Zusammenhangs zwischen dem fibrinolytischen System und Arterienerkrankungen. Die tatsächlichen Plasmaspiegel von t-PA-Antigen und die Aktivität sind wie viele andere hämostatische Faktoren schwer zu messen. Sie werden von vielen anderen Parametern beeinflusst, insbesondere PAI-1⁹. Dies schränkt die Möglichkeit ein, die Rolle von fibrinolytischen Parametern zu überprüfen, wenn die Entwicklung einer Arterienerkrankung untersucht wird. Daher ist eine alternative Herangehensweise erforderlich, um potentielle Parameter, die mit einem erhöhten Risiko von Gefäßerkrankungen in Zusammenhang stehen, zu analysieren.
Eine alternative Herangehensweise führt über die Genetik. Genotypen sind zuverlässig und relativ leicht zu messen und werden nicht von externen Faktoren beeinflusst. Die derzeitige Technologie bietet einen breiten Umfang an zuverlässigen Techniken für die Detektion und Analyse von Anomalien im genetischen Aufbau. Insbesondere sind eine Reihe von Diagnoseverfahren auf Basis einer Nukleinsäure-Analyse für verschiedene Erkrankungen bekannt. Für mehr als 100 Erkrankungen kann die Mutation der Erkrankung durch DNA-Diagnosetechniken erkennbar gemacht werden. Beispiele sind die zystische Fibrose, Duchene-Muskeldystrophie, die Huntingtonsche Krankheit und der mit einer thrombolytischen Erkrankung assoziierte Faktor V, Leiden-Mutantfaktor V (PCT EP95/00553).
Ein Alu-Insertion/Deletion-(I/D)-Polymorphismus wurde 1991 für das Intron h des t-PA-Gens mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion und Direktsequenzierung¹⁰ identifiziert. Das kleinere 655 bp-Allel ist das Ergebnis einer Deletion der gesamten ersten Alu-Sequenz, die sich im Intron h befindet. Der Mechanismus der Gleit (slipped)-Fehlpaarung ist als ein hypothetischer Prozess der Bildung dieses Allels angegeben. Die t-PA Alu-assoziierte RFLP kann unmittelbar durch Laden der PCR-Produkte auf ein Agarosegel und anschließende Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht werden. Die polymorphen Fragmente innerhalb des t-PA-Humangens konnten in EcoRI-, XmnI- und TagI-Verdauungen nachgewiesen werden. Die Sequenz des t-PA- Humangen-Fragments 25.201–26.200, welches die zwei Alu-Insertionen in Intron h und Exon IX umfasst, ist bereitgestellt. Die erste Alu-Insertion befindet sich bei 25.272–25.573. Die zweite Alu-Insertion befindet sich bei 25.762–25.927. Exon IX befindet sich bei 25.941–26.025. Die Organisation des Gens ist als diejenige von Degen et al.²¹ beschrieben. Dieser Artikel beschreibt auch "dass es erwähnenswert ist, dass Alu-Rekombinationsereignisse als eine Ursache von ererbtem t-PA-Mangel bislang nicht beobachtet wurden, obwohl eine große Zahl von Alu-Kopien über dieses Gen verteilt sind. Dies widerspricht der häufig gemachten Beobachtung von Alu-vermittelten Neuanordnungen in Globin-Genen und dem Lipoprotein-Rezeptorgen von geringer Dichte." Nichts wird erwähnt, was irgendeine diagnostische Anwendung eines solchen Polymorphismus angeht. Der Artikel befasst sich mit dem tatsächlichen Phänomen und der Art und Weise, wie es entsteht. Nichts wird bezüglich der Funktion der Mutation angegeben.
Eine weitere Veröffentlichung in jüngster Zeit über das Phänomen von Alu-Wiederholungen²⁹ enthüllt, dass ein typisches Alu-Element 282 Nukleotide lang ist und zwei Untereinheiten umfasst, die reich an GC sind, verbunden durch einen Adenin-reichen Linker, wobei die Sequenz in einem Polyadenyl-Schwanz endet. Ungefähr 700 000 Kopien von Alu-Elementen pro Haploid-Humangenom werden vorausgesagt. In der Praxis sind Alu-Elemente in den Introns von nahezu allen bekannten Protein kodierenden Genen zu finden. Die Dispersion von repetitiven Sequenzelementen ist eine Quelle genetischer Variabilität, die zur Genomentwicklung beiträgt. Es wird unterstellt, dass Alu-Wiederholungen erbbedingte Erkrankungen durch eine Reihe von Mechanismen, wie De-novo-Alu-Insertionen und Splicen intragener Alu-Elemente in mRNA verursachen können. Eine Analyse bekannter Proteinkodierungsregionen ergab 17 Alu-Insertionen in 15 Kodierungssequenzen. In drei Fällen verursachten diese genetischen Erkrankungen. Es wird keine Relevanz von Alu-Elementen in anderen Introns als dem evolutionären gelehrt oder unterstellt. Der Artikel befasst sich mit Alu-Insertionen in Exonen, d. h. dem kodierenden Teil von Nukleinsäure.
Ziemlich unerwartet bei der Untersuchung des t-PA-Alu I/D-Polymorphismus bei Überlebenden von myokardialem Infarkt stellten wir eine Beziehung zwischen dem t-PA-Alu-h I Allel und koronarer Herzerkrankung fest. Abgesehen von den weiter oben angeführten Gründen ist die Relevanz hiervon überraschend, da es 28 Aln-Sequenzen im t-PA-Gen gibt. Keine Relevanz wurde vorher irgendeiner dieser Sequenzen zugeschrieben (Degen et al. 1986).
Dies eröffnete damit den Weg zu einem Test, welcher von diagnostischem Wert bei der Identifizierung von Einzelpersonen oder Gruppen von Einzelpersonen mit einem abnormal erhöhten Risiko von mit Thrombusbildung assoziierten Erkrankungen sein kann. Solche Erkrankungen schließen myokardiale Infarkte, zerebrale Infarkte, periphere Thromben, vorübergehende ischämische Attacken, Demens und Thrombose ein. Es kann jedwedes an sich bekannte Verfahren für die Detektion des Anwesenheit von t-PA Alu-h I Allel zum Identifizieren einer Person oder Gruppe von Personen mit dem Risiko einer mit Thrombusbildung assoziierten Erkrankung in dem Verfahren gemäß der Erfindung angewandt werden. Noch spezieller fällt ein Verfahren, durch welches die funktionelle Mutation in dem Allel, das für das erhöhte Risiko ischämicher Ereignisse verantwortlich ist, welche physisch mit dem Vorhandensein des Alu-Wiederholungs-Inserts im Intron h des t-PA-Gens korreliert, detektiert wird, in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Dieses Verfahren beinhaltet in einer Ausführungsform die Analyse einer Nukleinsäuresequenz einer zu testenden Person auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit des t-PA Alu-h I Allels oder eines Teils des Allels der zu testenden Person, wobei der genannte Teil ein Teil ist, innerhalb welchem das Alu-Insert lokalisiert sein kann.
Als eine Alternative umfasst das Verfahren die Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens der funktionellen Mutation in dem Allel, das für das erhöhte Risiko ischämischer Ereignisse verantwortlich ist, welche physisch mit dem Vorhandensein des Alu-Wiederholungs-Inserts im Intron h des t-PA-Gens korreliert.
Natürlich kann das Verfahren gemäß der Erfindung auch beide der oben genannten Ausführungsformen in Kombination umfassen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann zum Beispiel die Amplifikation der Nukleinsäure der zu testenden Person in einer an sich bekannten Weise umfassen. Die Amplifikationsreaktion kann die Amplifikation der DNA oder Amplifikation von DNA in Kombination mit RNA umfasen oder einfach die Amplifikation von RNA umfassen. Bei Anwendung einer Amplifikationsreaktion, in welcher sowohl DNA als auch RNA amplifiziert werden könnte, kann man die DNA unter Verwendung von DNase in einer an sich bekannten Weise vor der Amplifikation zerstören oder man kann die Amplifikations-Primer so auswählen, dass die amplifizierte DNA und amplifizierte RNA sich in der Länge und Zusammensetzung infolge des Vorhandenseins und Fehlens von Introns unterscheiden, um zwischen amplifizierter chromosomaler Nukleinsäure und aus mRNA amplifizierter Nukleinsäure zu unterscheiden. Bei Anwendung eines ELGA-Detektionsverfahrens beispielsweise sollte der Unterschied in der Länge der amplifizierten Produkte mindestens 45 Nukleotide betragen. Daher muss die amplifizierte Sequenz mindestens eine Exon-Exon-Verbindungsstelle umfassen, um zwischen der amplifizierten chromosomalen Nukleinsäure und der aus mRNA amplifizierten Nukleinsäure zu unterscheiden, wenn die Detektion von mRNA, und nicht diejenige der genomischen Nukleinsäure erforderlich ist. Da NASBA ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren ist, das sich besonders für RNA-Targets eignet, gilt die Anwendung des NASBA-Amplifikationsverfahrens als eine bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn mRNA analysiert werden soll. Eine Präferenz für NASBA existiert in einigen Fällen aufgrund der Tatsache, dass sie sich besonders für RNA-Targets und die Amplifikation von intrazellulärer RNA, wie ribosomaler RNA oder Boten-RNAs von der Zelle selbst, eignet. Dieses Verfahren ist anwendbar, wenn die funktionelle Mutation in dem Allel, das für das erhöhte Risiko ischämischer Ereignisse verantwortlich ist, physisch mit dem Vorhandensein des Alu-Wiederholungs-Inserts im Intron h des t-PA-Gens innerhalb der kodierenden Nukleinsäure liegt. Für die genomische DNA reicht irgendeines der bekannten Amplifikationsverfahren aus. Es gibt eine Reihe von Target-Amplifikationsreaktionen, die allgemein im Stand der Technik durchgeführt werden, welche die NASBA (Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation), PCR (Polymerase-Kettenreaktion), LCR (Ligase-Kettenreaktion) und RCR (Reparatur-Kettenreaktion) umfassen. Die Amplifikation kann zum Beispiel geeigneterweise durch die allgemein anerkannte Technik der PCR erfolgen, wie in dem Beispiel erläutert wird. Solche Target-Amplifikationsreaktionen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Es ist erforderlich, einen oder mehrere Primer zu verwenden, welche spezifisch erkennen und zu Abschnitten (stretches) von Nukleinsäure in der Nachbarschaft des 5'- und 3'-Endes des Abschnitts von Nukleinsäure hybridisieren, in welchem die Mutation lokalisiert sein kann, wobei die Hybridisierung in einem Maße erfolgt, das ausreicht für die Amplifikation des Abschnitts von Nukleinsäure, in welchem die Mutation lokalisiert sein kann. Die Stringenz der Hybridisierung, die erforderlich ist, ist Fachleuten auf dem Gebiet der Target-Amplifikation von Nukleinsäure ebenfalls bekannt. Für PCR-Target-Amplifikationsverfahren sind die Amplicor^®-Reaktions-Kits im Handel erhältlich. Es ist auch möglich, einen Primer zu verwenden, welcher ausreichend spezifisch in der Erkennung von dem und Hybridisierung zu dem Abschnitt von Nukleinsäuren ist, in welchem die Mutation selbst lokalisiert werden kann.
Die Nukleinsäuresequenz eines t-PA-Humangens wurde von Degen et al. Bestimmt, und die Sequenz ist hierin durch die Referenz eingeschlossen. Unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz für die Hybridisierung, welche mindestens einen Teil des Intron h umfasst, ist es ziemlich einfach, eine in dem t-PA-Gen vorliegende Mutation zu isolieren und/oder zu amplifizieren und/oder anschließend zu detektieren. Weitere Primer von Nukleinsäuresequenzen für Hybridisierungs- und/oder für Amplifikationszwecke können gewählt werden, um mit der t-PA-Sequenz zu hybridisieren. Es liegt innerhalb des Kenntnisbereichs einer Person mit Erfahrung auf dem Gebiet, Oligonukleotidsequenzen auszuwählen, die sich am besten eignen zum Isolieren und/oder Amplifizieren und/oder Bestimmen des Vorhandenseins und der Natur der Mutation, nach welcher diese in einem Verfahren gemäß der Erfindung screent, da die Sequenz des t-PA-Gens bekannt ist.
Das Verfahren gemäß der Erfindung in irgendeiner der weiter oben offenbarten Ausführungsformen umfasst nachfolgend auch einen Detektionsschritt der amplifizierten Sequenz. Der detektierbare Marker, welcher verwendet werden kann, hängt von der speziell gewählten Ausführungsform ab. Der detektierbare Marker erkennt eine irgendwo zwischen den zwei Erkennungsstellen der in der Amplifikationsreaktion verwendeten Primer befindliche Sequenz. Ein solcher detektierbarer Marker kann eine Sequenz sein, welche zu einer spezifischen Hybridisierung zu einem Teil der amplifizierten Sequenz fähig ist. In einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist vorzugsweise irgendeines aus den eingesetzten Primern oder dem detektierba ren Marker zur spezifischen Erkennung eines Teils der Nukleinsäuresequenz der relevanten Alu-Wiederholung im Intron h des t-PA-Gens oder irgendein anderer Marker oder eine Mutation, durch welche das Allel (Alu-h I) von anderen Allelen unterschieden werden kann, fähig. Vorzugsweise ist einer der Primer zumindest und/oder der detektierbare Marker dann ebenfalls spezifisch für einen Teil der amplifizierten Sequenz stromaufwärts oder stromabwärts der relevanten Alu-Wiederholungsinsertion im Intron h des t-PA-Gens.
In einer alternativen Ausführungsform als solcher oder in Kombination mit der oben genannten Ausführungsform erkennt der detektierbare Marker eine irgendwo zwischen den zwei Erkennungsstellen der in der Amplifikationsreaktion verwendeten Primer befindliche Sequenz. Der detektierbare Marker, welcher verwendet werden kann, kann eine Sequenz sein, welche zu einer spezifischen Hybridisierung zu einem Teil der amplifizierten Sequenz fähig ist. In einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist vorzugsweise irgendeiner aus dem eingesetzten Primer oder dem detektierbaren Marker zur spezifischen Erkennung eines Teils der Nukleinsäuresequenz imstande, wobei der Teil die relevante funktionelle Mutation in dem Allel umfasst, das für das erhöhte Risiko ischämischer Ereignisse verantwortlich ist, welche physisch mit dem Vorhandensein des Alu-Wiederholungs-Inserts im Intron h des t-PA-Gens korreliert. Die funktionelle Mutation sollte sich innerhalb 1000 kb des Alu-Markers im Intron h befinden, da sie physisch mit dem Marker verknüpft sein muss. Sie muss auf demselben Chromosom vorhanden sein. Sie muss nicht notwendigerweise in dem t-PA-Gen vorhanden sein. Sie muss auch nicht notwendigerweise mit der Kodierungsregion des t-PA-Gens oder anderen Gens, das sich innerhalb 1000 kb des t-PA-Gens befindert, assoziiert sein. Vorzugsweise ist einer der Primer zumindest und/oder der detektierbare Marker für einen Teil der amplifizierten Sequenz stromaufwärts oder stromabwärts des Ortes der relevanten Mutation spezifisch.
Nach der Amplifikation der Nukleinsäure ist eine Analyse der amplifizierten Nukleinsäure in einer an sich bekannten Weise zum Detektieren des Vorhandenseins und gegebenenfalls der Natur der Mutation in dem Verfahren der Erfindung durchzuführen. Nach dem Amplifikationsschritt kann die resultierende Nukleinsäuresequenz mit einer normalen Sequenz oder einer zur Durchführung der Mutation bekannten Sequenz verglichen werden, um dadurch das Vorhandensein oder Fehlen der Mutation festzustellen, wobei das Vorhandensein auf ein erhöhtes Risiko einer Thrombus-assoziierten Erkrankung hinweist. Die zu detektierende Sequenz kann innerhalb der Kodierungssequenz des t-PA-Gens umfasst sein oder kann auch an anderer Stelle auf dem t-PA Alu-h I-Allel umfasst sein. Die Detektion des Vorhandenseins des I-Allels ist ausreichend, um ein erhöhtes Risikos einer Thrombus-assoziierten Erkrankung zu diagnostizieren, doch vorzugsweise wird die funktionelle Mutation, die für das erhöhte Risiko für eine ischämische Erkrankung verantwortlich ist, welche physisch mit dem Alu I-Vorhandensein verknüpft ist, detektiert.
Die Amplifikation mit Hilfe von Primern, die zur Hybridisierung zu der Nukleinsäuresequenz des auf jeder Seite der zu detektierenden Mutation lokalisierten Allels fähig sind, kann zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung in einer an sich bekannten Weise für Diagnoseuntersuchungen auf Basis der Detektion des Vorhandenseins oder Fehlens einer spezifischen Mutation in der zu amplifizierenden Nukleinsäure angewandt werden. Die von Ludwig et al. verwendeten Primer reichen aus, um sowohl D- als auch I-Intron h-Alu-Allele zu detektieren. Es sollten jegliche auf der 5'-Seite des 5'-Primers gelegene Primer gemäß Ludwig und jeglicher auf der 3'-Seite des 3'-Primers gelegene Primer gemäß Ludwig ebenfalls ausreichen. Eine Person mit Erfahrung auf dem Gebiet wird in der Lage sein, geeignete Primer auf Basis der bekannten Sequenzdaten zu entwerfen. In dem Beispiel verwendeten wir ähnliche Primer wie sie von Ludwig verwendet wurden, und die verwendeten Primer entsprechen Teilen der Teilsequenz des von Ludwig et al. verwendeten t-PA-Allels.
Im Falle der funktionellen Mutation, die im kodierenden Teil von Nukleinsäure lokalisiert ist, muss die Analyse nicht auf die Auswertung von genomischer Nukleinsäure beschränkt sein, sondern kann die Analyse von mRNA in einer an sich bekannten Weise umfassen.
Es ist möglich geworden, DNA-Techniken anzuwenden oder Antikörper für die Bestimmung des Vorhandenseins von mutanten Nukleinsäuresequenzen oder Proteinen beim Screenen auf das mutierte Allel oder Expressionsprodukten davon zu verwenden, welche die funktionelle Mutation, die physisch mit der Insertion der Alu-Wiederholung von Intron h des t-PA-Gens verknüpft ist, umfassen. Die vorliegende Erfindung zielt daher auf ein Verfahren zum Screenen auf das Vorhandensein eines genetischen Defekts, welcher mit dem erhöhten Risiko einer Thrombus-assoziierten Erkrankung assoziiert ist, wobei das Verfahren die Bestimmung des Vorhandenseins einer Mutation in dem Nukleinsäurematerial des Allels in einer an sich bekannten Weise oder in dem Expressionsprodukt des Allels umfasst, durch die Analyse des Expressionsprodukts oder die Analyse eines proteolytischen Fragmentes des Expressionsprodukts in einer an sich bekannten Weise. Die Analyse gemäß dem vorliegenden Verfahren kann daher auf Nukleinsäureebene, z. B. auf DNA- und/oder mRNA-Ebene des Allels und auf Proteinebene auf irgendeinem der Expressionsprodukte des Allels durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zielt auf das Detektieren von einer oder mehreren Mutationen in dem Allel ab, welches die funktionelle Mutation oder die Expressionsprodukte davon entweder auf Nukleinsäure- oder Proteinebene oder beides umfasst.
Wie weiter oben angegeben, kann das Verfahren gemäß der Erfindung auch durch Analysieren des Proteins anstatt der Nukleinsäuresequenz, welche das Protein kodiert, durchgeführt werden. Wenn die Detektion des mutierten Proteins unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers erfolgt, ist es möglich, einen Antikörper, welcher spezifisch gegen das Expressionsprodukt gerichtet ist, welches die Mutation umfasst, für die Detektion des Vorhandenseins und gegebenen falls der Natur der Mutation zu verwenden. Alternativ ist es auch möglich, proteolytisch das zu analysierende Protein zu spalten, wodurch lineare oder partiell lineare Strukturen erhalten werden, was den Einsatz von Antikörpern ermöglicht, die für die Mutation in der primären Nukleinsäuresequenz des Expressionsprodukts spezifisch sind.
Eine weitere Möglichkeit für die Detektion der Mutation liegt in der älteren Technik der Aminosäuresequenzanalyse. Nachdem die Aminosäuresequenz des nicht-mutierten Expressionsprodukts bekannt ist, ist es ziemlich einfach, die Aminosäuresequenz des zu analysierenden Faktors zu bestimmen und diese Sequenz mit der bekannten Sequenz des entsprechenden nicht-mutierten Faktors zu vergleichen. Allerdings ist die Nutzung von Antikörpern ein einfacher und effizienter Weg, um Proteine auf das Vorhandensein von Mutationen zu analysieren, zum Beispiel mit Hilfe von ELISAS oder RIAS oder einer Vielzahl von anderen immunologischen Tests, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Zum Detektieren der Mutation kann man einen spezifischen Antikörper verwenden, welcher zum Binden an das mutante Expressionsprodukt oder zum Binden an ein lineares proteolytisches Fragment des mutanten Expressionsprodukts, welches eine Mutation umfasst, in der Lage ist, wobei der Antikörper eine geringere Bindungsaffinität zu dem nicht-mutierten Expressionsprodukt oder zu dem entsprechenden proteolytischen Fragment des nicht-mutierten Expressionsprodukts aufweist.
Es ist als Alternative ebenfalls möglich, einen Antikörper zu verwenden, welcher zum Binden an ein nicht-mutiertes Expressionsprodukt fähig ist, wobei der Antikörper eine geringere Bindungsaffinität zu dem entsprechenden Expressionsprodukt und/oder zu dem proteolytischen Fragment davon, welches eine Mutation umfasst, aufweist. In diesem Fall kann ein Test entwickelt werden, wobei eine Nicht-Bindung des Antikörpers an das isolierte Protein oder proteolytische Fragment das Vorhandensein einer Mutation veranschaulicht.
Die anzuwendenden Verfahren hängen von den Umständen des Falles und auch von dem Ziel des Tests ab. Wenn zum Beispiel eine große Population gescreent wird, wird das billigste anzuwendende Verfahren bevorzugt. In einigen Fällen ist die zu detektierende Mutation mit Hilfe von Antikörpern schwer zu bestimmen, und dann kann die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen oder die Restriktions-Fragmentanalyse bevorzugt sein. Auch falls das für einen Restriktons-Fragmenttest verwendete Enzym billig ist, ist die Durchführung eines derartigen Tests sehr einfach und billig und ist ganz klar geeignet.
Die Erfindung zielt auch auf Kits, welche die Elemente umfassen, die zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung in allen veranschaulichten Ausführungsformen erforderlich sind. Dies umfasst zum Beispiel Test-Kits, welche einen oder mehrere der spezifischen Antikörper wie oben beschrieben und/oder einen oder mehrere Primer oder Paare von Primern für Tar get-Amplifikationsreaktionen und/oder Hybridisierungsreaktionen wie oben beschrieben umfassen. Insbesondere zielt die Erfindung auf ein Kit, welches einen Primer oder Primer zum Amplifizieren der Nukleinsäuresequenz umfasst, welche die Mutation der Nukleinsäuresequenz infolge des Vorhandenseins der Alu-Wiederholung im Intron h des t-PA-Gens umfasst. Das Kit kann Primer und/oder Antikörper für die Detektion einer speziellen Mutation oder für eine Reihe von Mutationen umfassen.
Es ist möglich, das Vorhandensein oder Fehlen einer Mutation in einem Verfahren gemäß der Erfindung ohne Amplifikation des Nukleinsäurematerials zu bestimmen. Es gibt eine Reihe von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, welche vor der Target-Amplifikationsreaktion angewandt wurden, die für die Bestimmung des Vorliegens von Mutationen auf Nukleinsäure entwickelt wurde, und diese können alle in verschiedenen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung angewandt werden. Zum Beispiel kann die zu bestimmende Mutation durch eine Hybridisierungsreaktion zu mindestens einer Nukleinsäuresequenz detektiert werden, die spezifisch genug ist, um zu mindestens einem Teil der Nukleinsäuresequenz, die den zu analysierenden Faktor kodiert, zu hybridisieren, gefolgt von einer Analyse der so isolierten Nukleinsäure in einer an sich bekannten Weise, um das Vorhandensein und gegebenenfalls die Natur der Mutation zu detektieren.
Die Detektion des Vorhandenseins und gegebenenfalls der Natur der Mutation kann durch Unterwerfern der so isolierten Nukleinsäure einer Sequenzanalyse durch die Verwendung beispielsweise der Sänger-Sequenzreaktion erfolgen, um die Nukleinsäuresequenz zu ermitteln und anschließend die Ergebnisse dieser Sequenzierung mit der entweder für den nicht-mutierten Faktor oder den mutierten Faktor bekannten Sequenz zu vergleichen. Es ist auch möglich, die isolierte Nukleinsäuresequenz einem weiteren Hybridisierungstest zu unterziehen. Der weitere Hybridisierungstest wir dabei mit einem Abschnitt von Nukleinsäurematerial mit einer entsprechenden komplementären Sequenz von ausreichender Länge und Spezifität durchgeführt, um zumindest zu einem Fragment des die Mutation umfassenden Nukleinsäurematerials zu hybridisieren, um das Vorhandensein und gegebenenfalls die Natur der Mutation zu detektieren. Der erste Hybridisierungsschritt isoliert lediglich den Faktur kodierende Nukleinsäure, ob dieser mutiert ist oder nicht, und der zweite Hybridisierungsschritt umfasst eigentlich das Hybridisieren der isolierten Sequenz an der komplementären Sequenz der tatsächlich mutierten Nukleinsäuresequenz, die man feststellen will, um das Vorhandensein oder Fehlen der Mutation auf dem isolierten Nukleinsäurematerial zu bestimmen. Diese letztere Hybridisierungsreaktion sollte unter stringenten Bedingungen für zuverlässige Resultate durchgeführt werden. Mithin werden zwei klassische Verfahren für die Bestimmung das Vorhandensein einer Mutation auf einer speziellen Nukleinsäure hiermit erläutert, und für einen Fachmann auf dem Gebiet ist klar, dass eine Reihe bekannter Techniken angewandt werden kann. In verschiedenen Standardwerken der Biochemie sind solche Techniken ausführlich zum Beispiel in einem Handbuch des molekularen Klonierens (z. B. Sambrook et al. (Sambrook, J. Fritsch, E. F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, A la boratory manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), zweite Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)), Maniatis, a Laboratory Manual for Molecular Cloning (ein Laborhandbuch für molekulares Klonieren), erläutert. Es ist ebenfalls möglich, das in dem Screening-Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene amplifizierte Nukleinsäurematerial mit Hilfe nachfolgender Analysetests mit Hilfe von Sequenzierungsreaktionen oder Hybridisierung zu einer entsprechenden komplementären Sequenz von ausreichender Länge und Spezifität zu analysieren, um zumindest zu einem Fragment des die Mutation umfassenden Nukleinsäurematerials zu hybridisieren, um das Vorhandensein und gegebenenfalls die Natur der Mutation zu detektieren, wie weiter oben für die Analyse von isoliertem Nukleinsäurematerial erläutert wurde, das keiner Amplifikationsreaktion unterworfen worden war.
Alternativ kann die Analyse von isoliertem und gegebenenfalls amplifiziertem Nukleinsäurematerial RFLP-Tests in einer an sich bekannten Weise umfassen. Aufgrund der Unterschiede bei den Restriktionsfragmentlängen von Nukleinsäure der allelischen Formen liefert die Gel-Elektrophorese und die Anfärbung z. B. mit Ethidiumbromid von isolierter und gegebenenfalls amplifizierter Nukleinsäure Banden in unterschiedlichen Höhen auf dem Gel. Im Fall des Alu I/D-Polymorphismus von Intron h des t-PA-Gens entspricht das Vorhandensein eines größeren Fragments dem I-Allel und ein kleineres Fragment entspricht dem D-Allel, wenn das Verfahren gemäß der Erfindung die Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens der Alu-Insertion im Intron h des t-PA-Gens unter Anwendung von standardmäßigen RFLP-Techniken umfasst. Dieses Prinzip wird in der Referenz von Ludwig et al. und in dem Beispiel erläutert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auf die Isolierung der gesamten Nukleinsäure von kultivierten Zellen, die Isolierung der gesamten Nukleinsäure von Blut, die Isolierung der gesamten Nukleinsäure von zervikalem Abfallmaterial angewandt werden.
Die Anforderungen, welche an die Oligonukleotid-Primer und den detektierbaren Marker, welche in der Amplifikationsreaktion des Verfahrens gemäß der Erfindung eingesetzt werden, gestellt werden, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet klar ersichtlich. Es gelten die normalen Anforderungen für die Amplifikationsreaktion-Primer und -Marker, was den Homologiegrad und die angewandten Hybridisierungsbedingungen angeht. Dies bedeutet allgemein gesagt, dass ein Primer mindestens 10 Nukleotide umfasst, die zur Hybridisierung zu einem entsprechenden Teil der zu amplifizierenden Sequenz unter normalen bis stringenten Bedingungen in der Lage sind. Die Anforderungen sind in einem Handbuch für das molekulare Klonieren (z. B. Sambrook et al. (Sambrook, J. Fritsch, E. F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, A laboratory manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), Zweite Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)), zu finden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oligonukleotid-Sonde so gewählt, um einen Homologiegrad zu zeigen, welcher das zuverlässigste Resultat bei vernünftigen Kosten sicherstellt. Optimale Resultate werden im Allgemeinen erzielt, wenn die Homologie 100% ist und die Oligonukleotid-Sonde eine Länge von 15 bis 25 Oligonukleotiden aufweist. Bei der Anwendung des NASBA ist die amplifizierte Sequenz, d. h. das Produkt, der komplementäre Strang, und somit entspricht das Oligonukleotid zum Detektieren des amplifizierten Produkts der Sequenz der ursprünglichen Nukleinsäure. Bei der Anwendung des PCR ist die amplifizierte Sequenz, d. h. das Produkt, eine doppelsträngige DNA, und die Detektion kann mit jedem der Stränge erfolgen. Somit kann das für die Detektion eines amplifizierten Produkts verwendete Oligonukleotid entweder an dem kodierenden Strang oder dem komplementären Strang von zu amplifizierender Nukleinsäure hybridisieren. Wir führen hiermit einige allgemeine Referenzen an, welche die PCR-Methodik veranschaulichen. Der Inhalt hiervon bezüglich der Durchführung von PCR-Reaktionen ist hiermit eingeschlossen (PCR Technology, J. A. Ehrlich, Hrsg., Stockholm Press, New York (1989); Molecular Methods for Virus Detection (Molekulare Verfahren zum Virusnachweis), D. L. Wiedbrauk and D. H. Farkas, Hrsg., Academic Press, New York (1995). Nukleinsäure-Hybridisierung, B. D., Hames und S. J. Higgins, Hrsg., IRL Press, Oxford, Washington DC (1985).
Die Erfindung zielt auch auf ein Diagnose-Kit zur Bestimmung, ob eine Einzelperson oder eine Gruppe von Einzelpersonen ein erhöhtes Risiko von Thrombus-assoziierten Erkrankungen hat, wobei das Kit mindestens ein Paar von Oligonukleotid-Primern umfasst, wobei die Primer zur Amplifikation von Nukleinsäure eines t-PA-Allels einer eukaryotischen Spezies in einer an sich bekannten Weise in der Lage sind und/oder die Primer zur Amplifikation von Nukleinsäure, welche die funktionelle Mutation in dem Allel, das für das erhöhte Risiko ischämischer Ereignisse verantwortlich ist, welche physisch mit dem Vorhandensein von Alu-Wiederholungs-Inserts im Intron h des t-PA-Gens korreliert, imstande sind, wobei die eukaryotische Spezies vorzugsweise ein Mensch ist. Ein solches Kit umfasst weiter einen detektierbaren Marker der amplifizieren Sequenz. Der detektierbare Marker des Kits gemäß der Erfindung oder für die Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung kann geeigneterweise eine Oligonukleotidsequenz sein, welche zur Hybridisierung an der amplifizieren Sequenz fähig ist. Der detektierbare Marker kann auch ein Antikörper sein, welcher zur spezifischen Erkennung der amplifizierten Sequenz fähig ist. Der detektierbare Marker kann mit einer Markierung versehen sein, die nachweisbar ist, wie dies im Stand der Technik für Marker von Nukleinsäuresequenzen, z. B. ein Enzym, ein chromogenes Substrat, ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe etc. üblich ist. Auch der detektierbare Marker kann zur spezifischen Immobilisierung der amplifizierten Sequenz in einer an sich bekannten Weise fähig sein, gefolgt von einer Detektion der immobilisierten amplifizierten Sequenz in einer an sich bekannten Weise mit oder ohne einen Spülschritt und unter Verwendung einer weiteren Verbindung, die an die immobilisierte Sequenz bindet und anschließend ein detektierbares Signal liefert. Die Ausführung dieses Typs von Tests ist für einen Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäure-Detektion Routine. Das Kit umfasst Primer und detektierbare Marker in einer Kombination, sodass entweder nur die amplifizierte Sequenz, die detektiert werden soll, in der Probe vorliegt oder andernfalls eine Kombination von amplifizierten Sequenzen vorhanden ist, doch der detektierbare Marker nur die zu detektierende amplifizierte Sequenz detektiert. Die Kombinationen, die geeignet sind, können leicht beim Vergleich der Nukleinsäure sequenzen, die für die zu detektierenden Allele oder die spezifischen Teile davon bekannt sind, welche detektiert werden sollen, und noch spezieller beim Vergleich der verschiedenen Sequenzen für die t-PA-Allele, insbesondere der relevanten Teile der Sequenzen der Intron h Alu I- und D-Allele, ermittelt werden.
Insbesondere wenn ein Kit gemäß der Erfindung für die Amplifikation sowohl von DNA als auch von RNA verwendet werden soll, wird das Paar von Oligonukleotid-Primern so gewählt, dass die amplifizierte Sequenz mindestens eine Exon-Exon-Verbindungsstelle umfasst. Ein Diagnose-Kit gemäß der Erfindung zur Bestimmung, ob eine Einzelperson oder eine Gruppe von Einzelpersonen ein erhöhtes Risiko von Thrombus-assoziierten Erkrankungen aufweist, umfasst ein oder mehrere Primer-Paare zum Amplifizieren von Nukleinsäure, welche die Region umfasst, wo die Mutation zu erwartet ist, sofern vorhanden. Es können beliebige andere Komponenten, die normalerweise für eine solche Amplifikationsreaktion erforderlich sind, ebenfalls eingeschlossen werden, wie Sonden für die Detektion der amplifizierten Nukleinsäure. Die Amplifikation kann PCR, NASBA oder irgendeine andere Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion sein, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Die Art und Weise, in der solche Amplifikationsreaktionen durchzuführen sind, ist analog zu denjenigen anderer Diagnosetests, die eine Amplifikation erfordern, und ist für einen Fachmann auf dem Gebiet klar ersichtlich auf der Grundlage allgemeiner Kenntnisse, betreffend die Techniken und die Nukleinsäuresequenz der verschiedenen Allelen für das Gen von Interesse, insbesondere das die funktionelle Mutation umfassende Allel, und ist an anderer Stelle in der Beschreibung erläutert worden.
Ein Diagnose-Kit zur Bestimmung, ob eine Einzelperson oder eine Gruppe von Einzelpersonen ein erhöhtes Risiko von Thrombus-assoziierten Erkrankungen aufweist, in einem Verfahren gemäß der Erfindung, wird ebenfalls beansprucht, wobei das Kit einen detektierbaren Marker umfasst, welcher die RFLP-Fragmentgrößenanalyse ermöglicht, d. h. um zu ermitteln, ob die untersuchte Nukleinsäure eine I-Allel-Form mit einer Alu-Insertion im h Intron des t-PA-Gens aufweist, und/oder um zu ermitteln, ob die untersuchte Nukleinsäure die funktionelle Mutation umfasst, welche physisch mit dem Vorhandensein des Alu-Inserts im Intron h des t-PA-Gens verknüpft ist und für das erhöhte Risiko einer Thrombus-assoziierter Erkrankung verantwortlich ist.
Ein Diagnose-Kit zur Bestimmung, ob eine Einzelperson oder eine Gruppe von Einzelpersonen ein erhöhtes Risiko einer Thrombus-assoziierten Erkrankung in einem Verfahren gemäß der Erfindung aufweist, wird ebenfalls beansprucht, wobei das Kit einen detektierbaren Marker für eine funktionelle Mutation, die physisch mit dem Vorhandensein einer Alu-Insertion in Intron h des t-PA-Gens assoziiert ist. Ein solches Diagnose-Kit kann geeigneterweise einen detektierbaren Marker für das Vorhandensein der Alu-Wiederholung im Intron h des t-PA-Gens umfassen. Ein solcher detektierbarer Marker kann leicht von einer Person mit Erfahrung auf dem Gebiet abgeleitet werden, um den relevanten Teil von Intron h spezifisch zu erkennen. Der detektierbare Marker kann auch spezifisch die Sequenz erkennen, welche die mit der Insertion im Intron h assoziierte funktionelle Mutation umfasst. Für ein Diagnose-Kit, das auf die Durchführung von RFLP zielt, kann der detektierbare Marker ein Fragment von Nukleinsäure mit einer Länge sein, die der Länge des Fragments entspricht, das für das die Mutation umfassende Fragment erwartet wird.
Auf Basis der Ermittlung des Vorhandenseins der Mutation wird es im Anschluss möglich, Einzelpersonen für ein intensiviertes präventives Regime oder eine spezifische antithrombotische Behandlung von akuten vaskulären Erkrankungen auszuwählen.
Das nachstehende Beispiel veranschaulicht, wie die Verknüpfung zwischen der Alu-Insertion in dem t-PA-Gen und dem erhöhten Risiko einer Thrombus-assoziierten Erkrankung erreicht wurde.
Zusätzlich zu den Detektionsverfahren wird von einem Allel, welches für das erhöhte Risiko einer Thrombus-assoziierten Erkrankung als solcher verantwortlich ist, ebenfalls angenommen, dass es in den Umfang der Erfindung fällt. Ein solches Allel muss physisch mit dem Vorhandensein eines zusätzlichen Alu-Markers im Intron h des t-PA-Gens assoziiert sein, und ein derartiges Allel umfasst die funktionelle Mutation, die für das erhöhte Risiko verantwortlich ist. Ein solches Allel ist in der genomischen Nukleinsäure innerhalb 1000 kb des Alu-h-I-t-PA-Allels lokalisiert. Das gemäß der Erfindung beanspruchte Allel umfasst nicht die Nukleinsäuresequenz gemäß Ludwig et al. Die Verwendung des Allels gemäß Ludwig et al. in einem Verfahren gemäß der Erfindung fällt in den Schutzumfang.
BEISPIEL
Verfahren
Population
Die Rotterdam-Studie ist eine Populations-basierte Studie von 7983 Personen im Alter von 55 Jahren und darüber. Zwischen März 1990 und Juli 1993 wurden alle Personen im Alter von 55 Jahren und älter, die in Ommoord, einem Vorort von Rotterdam in den Niederlanden lebten, zu einer Teilnahme eingeladen. Die Gesamt-Antwortrate lag bei 78%. Die Hintergründe und der Aufbau der Studie wurden an anderer Stelle¹ beschrieben.
Auswahl von Fällen und Kontrollen
Fallpatienten (n = 162) wurden aus Teilnehmern der Rotterdam-Studie auf Basis des Vorliegens eines Infarkts auf dem ECG unter Verwendung eines diagnostischen Klassifizierungssystems des Modularen ECG-Analysesystems¹² ausgewählt, und zwar unabhängig von einer Vorgeschichte mit Brustschmerzen; Kontrollpersonen (n = 258) wurden aus den gleichen Fünf-Jahres-Altersschichten hergenommen, wo die Fälle mit myokardialem Infarkt zu finden waren, und bildeten eine Stichprobe von Studienteilnehmern, die keine Vorgeschichte mit einer kardiovaskulären Erkrankung aufwiesen, d. h. keine Vorgeschichte mit myokardialem Infarkt, Angina pectoris, Schlaganfall, einem normalen ECG und keine periphere arterielle Erkrankung (Knöchel/Arm-Index > 0,9)¹³. Das Einschlusskriterium für alle Personen war die Verfügbarkeit einer Blutprobe.
Messungen
Die Personen wurden alle zu Hause besucht. Informationen über den gegenwärtigen Gesundheitszustand, die medizinische Vorgeschichte (einschließlich myokardialem Infarkt und Schlaganfall), Drogen- bzw. Arzneimittelgebrauch und Rauchverhalten wurden durch einen computerisierten Fragebogen erhalten, welcher die holländische Version des kardiovaskulären Fragebogens von Rose¹⁴ einschloss. Dem Interview zu Hause folgten zwei Besuche im Forschungszentrum. Während dieser Besuche wurden mehrere kardiovaskuläre Risikoindikatoren bestimmt. Die Größe und das Gewicht wurden gemessen, und der Body-Mass-Index wurde berechnet (in Kilogramm pro Quadratmeter). Der Blutdruck im Sitzen wurde am rechten Oberarm mit einem Zufall-Null-Sphygmomanometer gemessen. Es wurde der bei einer Sitzung erhaltene Mittelwert von zwei Messungen herangezogen. Es wurde der systolische Blutdruck an den Knöcheln (hintere tibiale Arterie) an der semisupinierten bzw. halb nach außen gedrehten (±45%) Position mit einer normalen Manschette in Erwachsenengröße direkt über den Malleoli bzw. Knöcheln und einem 8-MHz-Doppler-Transdukter¹⁵ gemessen. Der Knöchel/Arm-Index ist das Verhältnis des systolischen Blutdrucks am Knöchel zum systolischen Druck des Arms. Die Erkrankung der peripheren Arterien wurde als ein Rechter- oder Linker-Knöchel/Arm-Index von niedriger als 0,9 definiert. Die Entnahme von Blutproben und die Aufbewahrung wurden an anderer Stelle¹⁶ beschrieben. Das Serum-Gesamtcholesterol wurde mit einem automatisierten enzymatischen Verfahren¹⁷ bestimmt. Die Konzentration von Hoch-Dichte-Lipoprotein-Cholesterol wurde in ähnlicher Weise nach der Ausfällung gemessen. Nachdem das Gen kloniert war, wurde ein Insertion/Deletion-(UD)-Polymorphismus, resultierend aus dem Vorhandensein/Fehlen einer Alu-Wiederholung im 8. Intron des t-PA-Gens, bei allen 420 Personen¹⁸ identifiziert.
Statistische Analyse
Die Mittelwerte und Verhältnisse potenzieller verfälschender Faktoren wurden für alle drei Genotypen berechnet, und es wurden Unterschiede zwischen Gruppen mit einer Varianzanalyse untersucht. Das relative Risiko von myokardialem Infarkt (geschätzt als das Wahrscheinlichkeitsverhältnis) für diese Heterozygote und Homozygote für die Insertion ließ sich mit denjenigen, die für die Deletion homozygot waren, mit Hilfe der logistischen Regression berechnen. Die logistische Multivariaten-Regression wurde für die Anpassung auf potenzielle Confounder bzw. störende Faktoren, wie Alter, Geschlecht, Gesamt- und HDL-Cholesterol, Body-Mass-Index, systolischer und diastolischer Blutdruck und Rauchen, angewandt. Die Ergebnisse werden mit einem 95-%-Konfidenzintervall ausgewiesen. Um das Verhältnis von Fällen mit myokardialem Infarkt, welcher dem t-PA-Gen-Polymorphismus (der Population zuschreibbares Risiko) zugeschrieben werden kann, wendeten wir das Verfahren wie von Miettinen¹⁹ beschrieben an.
Die Amplifikation der 967/655 pb-Fragmente des t-PA-Gens erfolgte im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Verwendung als 5'-Primer 5'-TCCGTAACAGGACAGCTCA-3' (Sequenz-Id. Nr. 1 = nt 25.216–25.234) (von Isogen) und als 3'-Primer 5' ACCGTGGCTTCAGTCATGGA-3' (Sequenz-Id. Nr. 2 = nt 26.181–26.162) (von Isogen). Die Amplifikation umfasst das Unterwerfen von 50 Mikrolitern einer Mischung, enthaltend 20 mM TRIS-HCl (von Gibco BRL), pH-Wert 8,4, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂ (von Gibco BRL), 0,05% (v/v) Detergenz (Polyoxyethylenether) (min. 99,5%) (von Gibco BRL), 0,05% DMSO (von Merck), 0,2 mM jedes Nukleosidtriphosphats (von Pharmacia), 100 ng jedes Primers, 100 ng DNA und und 1 U Taq-Polymerase (Gibco BRL) einer Denaturierung während 4 min bei 94°C, gefolgt von 32 Zyklen von 94°C (1 min), 58°C (1,5 min), 72°C (2 min), gefolgt am Ende von 4 min bei 72°C. Die verwendete PCR-Vorrichtung war ein HYBRID Omnigene von Biozym. 20 Mikroliter der PCR-Produkte mit 2 Mikroliter SLM-Beladungsmischung wurden auf einem 2% Agarosegel (Pronarosegel) bei 100 V/500 mA separiert. Die Identifikation von Fragmenten kann mit einem Marker mit 100 bp-Leiter durchgeführt werden.
Ergebnisse
Die kompletten Daten waren für 162 Fall- und 258 Kontrollpersonen verfügbar. Die gewählten Basislinien-Charakteristika der Studienpopulation sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den kardiovaskulären Risikofaktoren zwischen den nach verschiedenen Genotypen klassifizierten Gruppen gefunden. Unter den Kontrollpersonen waren die Allel-Häufigkeiten 0,46 für das Allel mit der Deletion und 0,54 für die Allele mit der Insertion und befanden sich im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht. Die Roh- und angepassten relativen Risiken von nicht tödlichem myokardialen Infarkt sind in Tabelle 2 angegeben. Das relative Risiko von myokardialem Infarkt für Personen, die für die Insertion homozygot sind, gegenüber denjenigen, die für die Deletion homozygot sind, war 2.04 (1.03–4,03), angepasst auf Alter, Geschlecht, Rauchen, Body-Mass-Index, systolischer und diastolischer Blutdruck, Gesamt- und HDL-Cholesterol. Das angepasste relative Risiko für heterozygote Personen war 1,42 (95% CI 0,74–2,73). Von allen Fällen mit myokardialem Infarkt wurde bei 33% geschätzt, dass dieser entweder einer Homo- oder Heterozygosität für die Insertion zuzuschreiben war.
Die 1 zeigt die Identifikation von TPA Alu-Wiederholungs-Insertions-/Deletions-Polymorphismus. m, Marker-Bahnen mit 100 bp-Leiter. 1, negative PCR-Kontrolle. 2, Einzelperson homozygot für das Insertions-Allel, das ein 967 bp-PCR-Fragment zeigt. 3, Einzelperson heterozygot für die Insertions- und Deletions-Allele. 4, Einzelperson homozygot für das Deletions-Allel, das ein 655 bp-PCR-Fragment zeigt.
Diskussion
Wir liefern den Nachweis dafür, dass die polymorphe Variation des t-PA-Gens stark mit dem Risiko eines nicht zum Tode führenden myokardialen Infarkts assoziiert ist, und zwar unabhän gig von anderen Risikofaktoren. Da t-PA eine wesentliche Rolle beim Abbau von intraarteriellen Fibrin-Gerinnsel spielt, spricht diese Assoziation am wahrscheinlichsten für eine genetisch festgelegte beeinträchtigte Fähigkeit des fibrinolytischen Systems, adäquat auf Koronarthrombose bei myokardialem Infarkt zu reagieren. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie, die einen Zusammenhang zwischen dem t-PA-Gen und myokardialem Infarkt untersucht. Es ist unwahrscheinlich, dass die Heterogenität der Population unsere Ergebnisse erklären könnte. Fall- und Kontrollpersonen wurden aus einer Single-centre-Populations-basierten Studie unter 7983 Personen genommen. Alle Personen, die an unserer Studie teilnahmen, waren Kaukasier und die Allel-Häufigkeiten unterschieden sich nicht von den von anderen²⁰ beobachteten.
Eine Einschränkung unserer Studie ist deren Beschränkung auf nicht tödliche myokardiale Infarkte aufgrund von deren Querschnitts-Design. Jedoch nimmt man an, dass das t-PA-Gen nicht die Tödlichkeit eines myokardialen Infarkts beeinflusst. T-PA soll über den Weg einer beeinträchtigten koronaren Gerinnsel-Lysis wirken, und eine Wirkung einer beeinträchtigten t-PA-Aktivität würde das Risiko eines tödlichen myokardialen Infarkts erhöhen, und nicht verringern, und somit kann der beobachtete Zusammenhang für eine Unterschätzung des tatsächlichen Zusanunenhangs sprechen. Obwohl wird den Zusammenhang zwischen dem t-PA-Gen und nicht-tödlichem myokardialem Infarkt nachwiesen, bleibt der hinter dem erhöhten Risiko stehende Mechanismus unbekannt. Abgesehen von dessen großer Bedeutung bei der Fibrin-Gerinnselauflösung spielt t-PA auch eine Rolle in verschiedenen anderen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellmigration^21,22. In mehreren Studien waren ein erhöhtes t-PA-Antigen und eine verringerte t-PA-Aktivität im Plasma mit einem erhöhten Risiko von myokardialem Infarkt^4,6,7,2 assoziiert. Die Natur des Polymorphismus, die Insertion oder Deletion einer Alu-Wiederholung im Intron h, macht eine direkte funktionelle Auswirkung des Polymorphismus auf das fibrinolytische Gleichgewicht unwahrscheinlich. Vielmehr kann die Alu-Wiederholungs-Insertion physisch eng mit einer Mutation verknüpft sein, die eine unbekannte funktionelle Wirkung entweder in dem oder nahe dem t-PA-Gen besitzt und dadurch das Risiko eines myokardialen Infarkts erhöht. In dem oder nahe dem t-PA-Gen bedeutet innerhalb 1000 kb des t-PA-Gens. Diese funktionelle Wirkung kann lokal oder systemisch erfolgen.
Unsere Erkenntnisse können von großer öffentlicher Bedeutung für die Gesundheit sein. Da die Prävalenz des t-PA I-Allels hoch ist, kann diese Variante des t-PA-Gens eine Rolle bei einen hohen Prozentsatz von myokardialen Infarkten in der Population spielen. Es wird geschätzt, dass in 33% der Fälle myokardialer Infarkt dem Tragen des t-PA I-Allels zugeschrieben werden kann.
Somit erhöht das Vorhandensein des t-PA-I-Allels das Risiko eines myokardialen Infarkts um 42% für Heterozygoten und mit mehr als einem Faktor 2 für Homozygoten. Etwa 33% aller (nicht tödlichen) Fälle von myokardialem Infarkt können zumindest teilweise dem t-PA I-Allel zugeschrieben werden.
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Tabelle 1. Basislinien-Charakteristika der Studienpopulation. D/D = Homozygote für die Deletion; I/D = Heterrozygote für die Insertion/Deletion; I/I = Homozygote für den Insertionspolymorphismus.
Tabelle 2. Relatives Risiko von myokardialem Infarkt durch Anwesenheit der Insertion

* Referenzrisiko (1)
+ Risikofaktoren schließen Rauchen (ja/nein), Gesamtcholesterol (mMol/l), HDL-Cholesterol (mMol/l), systolischen Blutdruck (mm Hg), diastolischen Blutdruck (mm Hg) und Body-Mass-Index ein.

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein in vitro Verfahren zur Diagnose eines erhöhten Risikos einer Thrombus assoziierten Krankheit in einem Individuum umfassend das Analysieren von Nukleinsäure, die von besagtem Individuum isoliert wurde, auf das Vorliegen eines t-PA (Gewebsplasminogenaktivator) Alu-h I Allels, worin der Nachweis des besagten t-PA Alu-h I Allels für ein solch erhöhtes Risiko indikativ ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin vor dem Analysieren der Nukleinsäure die Nukleinsäure amplifiziert wird.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin die Nukleinsäure DNS ist.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin die Nukleinsäure RNS ist.
Diagnosekit zur Bestimmung eines erhöhten Risikos einer Thrombus assoziierten Krankheit umfassend Oligonukleotid-Primer, die die das t-PA Alu-h I Allel umfassende Region amplifizieren, falls das besagte Allel vorhanden ist.
Diagnosekit gemäss Anspruch 5 ferner umfassend einen nachweisbaren Marker für das Amplifikationsprodukt.
Diagnosekit gemäss Anspruch 6, worin der nachweisbare Marken eine mit einer Markierung versehene Oligionukleotidsonde ist.