JP3159708B2 - アンジオテンシノーゲン遺伝子変異体および高血圧素質 - Google Patents
アンジオテンシノーゲン遺伝子変異体および高血圧素質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、メリーランド州ベセスダのナショナル・イ
ンスティチューツ・オブ・ヘルス（National Institute
s of Health）によりにより与えられた認可番号HL24855
およびHL45325の下の政府の援助で行われた。
ンスティチューツ・オブ・ヘルス（National Institute
s of Health）によりにより与えられた認可番号HL24855
およびHL45325の下の政府の援助で行われた。
発明の背景 本発明は、アンジオテンシノーゲン遺伝子の分子変異
体に関する。本発明は、さらに、高血圧素質の決定に関
するこれらの変異体の診断および高血圧の管理、特に、
本態性高血圧ならびに妊娠高血圧（子かん前症）の管理
に関する。
体に関する。本発明は、さらに、高血圧素質の決定に関
するこれらの変異体の診断および高血圧の管理、特に、
本態性高血圧ならびに妊娠高血圧（子かん前症）の管理
に関する。
本発明の背景を明らかにし、またはその実施に関す
る、さらなる詳細を提供するための本明細書に用いる刊
行物および他の材料を、参照により本明細書に取り込
み、便利のため、付記した文献のリストにそれぞれグル
ープ分けする。
る、さらなる詳細を提供するための本明細書に用いる刊
行物および他の材料を、参照により本明細書に取り込
み、便利のため、付記した文献のリストにそれぞれグル
ープ分けする。
高血圧は、ヒトの循環系疾病率および死亡率の主要な
原因であり、米国の成人白人人口の20〜30％が罹患して
いる（JNCリポート,1985年）。高血圧の人の95％が示す
本態性高血圧の主たる決定要因は、血圧の調節における
種々の機構を明らかにするために多くの研究が着手され
ているにもかかわらず、十分に調べられていない。多く
の人（双生児および養子関係の同胞）についての、血圧
の調節における強い遺伝的要素と和合する証拠を提供す
る研究（ウォード（Ward）,1990年）は、分子決定要因
が高血圧の病因となっていることを示唆している。しか
しながら、実際にに関与する遺伝子、血圧に対するそれ
らの個々の影響、あるいはそれらの相互作用および環境
との相互作用についての情報は含まれていない。血圧を
調節する多くの因子の中で、レニン−アンジオテンシン
系は、塩−水の恒常性および血管系の常態の維持におい
て重要な役割を果たしている。この系の刺激または阻害
は、それぞれ、血圧を上昇または低下させ（ホール（Ha
ll）およびガイトン（Guyton）,1990年）、高血圧の病
因に関係している。レニン−アンジオテンシン系は、酵
素レニンおよびアンジオテンシン変換酵素ならびに蛋白
アンジオテンシノーゲン（ATG）を包含している。アン
ジオテンシノーゲンは、アスパルチルプロテアーゼであ
るレニンの特異的基質である。AGT遺伝子の構造は特徴
づけられている（ジラード（Guillard）ら,1989年；フ
カミズ（Fukamizu）ら,1990年）。
原因であり、米国の成人白人人口の20〜30％が罹患して
いる（JNCリポート,1985年）。高血圧の人の95％が示す
本態性高血圧の主たる決定要因は、血圧の調節における
種々の機構を明らかにするために多くの研究が着手され
ているにもかかわらず、十分に調べられていない。多く
の人（双生児および養子関係の同胞）についての、血圧
の調節における強い遺伝的要素と和合する証拠を提供す
る研究（ウォード（Ward）,1990年）は、分子決定要因
が高血圧の病因となっていることを示唆している。しか
しながら、実際にに関与する遺伝子、血圧に対するそれ
らの個々の影響、あるいはそれらの相互作用および環境
との相互作用についての情報は含まれていない。血圧を
調節する多くの因子の中で、レニン−アンジオテンシン
系は、塩−水の恒常性および血管系の常態の維持におい
て重要な役割を果たしている。この系の刺激または阻害
は、それぞれ、血圧を上昇または低下させ（ホール（Ha
ll）およびガイトン（Guyton）,1990年）、高血圧の病
因に関係している。レニン−アンジオテンシン系は、酵
素レニンおよびアンジオテンシン変換酵素ならびに蛋白
アンジオテンシノーゲン（ATG）を包含している。アン
ジオテンシノーゲンは、アスパルチルプロテアーゼであ
るレニンの特異的基質である。AGT遺伝子の構造は特徴
づけられている（ジラード（Guillard）ら,1989年；フ
カミズ（Fukamizu）ら,1990年）。
ヒト・AGT遺伝子は、13Kbの間隔をおいた５個のエキ
ソンおよび４個のイントロンを有する。１番目のエキソ
ン（37bp）は、mRNAの５′非翻訳領域をコードしてい
る。２番目のエキソンは、シグナルペプチドおよび成熟
蛋白の最初の252個のアミノ酸をコードしている。エキ
ソン３および４は短く、それぞれ、90個および48個のア
ミノ酸をコードしている。エキソン５は、短い暗号配列
（62個のアミノ酸）および３′−非翻訳領域をコードし
ている。
ソンおよび４個のイントロンを有する。１番目のエキソ
ン（37bp）は、mRNAの５′非翻訳領域をコードしてい
る。２番目のエキソンは、シグナルペプチドおよび成熟
蛋白の最初の252個のアミノ酸をコードしている。エキ
ソン３および４は短く、それぞれ、90個および48個のア
ミノ酸をコードしている。エキソン５は、短い暗号配列
（62個のアミノ酸）および３′−非翻訳領域をコードし
ている。
血漿アンジオテンシノーゲンは、エストロゲン、グル
ココルチコイド、甲状腺ホルモン、およびアンジオテン
シンIIの正のコントロールの下、まず、肝臓で合成さ
れ、構成的経路を経て分泌される。レニンによるアンジ
オテンシノーゲンのアミノ末端セグメントの開裂によ
り、デカペプチドプロホルマンであるアンジオテンシン
Ｉが放出され、これは、ジペプチジルカルボキシペプチ
ダーゼであるアンジオテンシン変換酵素（ACE）により
さらにプロセッシングされて活性なオクタペプチドであ
るアンジオテンシンIIとなる。レニンによるアンジオテ
ンシノーゲンの開裂は、レニン−アンジオテンシン系の
律速段階である（シーリー（Sealey）およびララグ（La
ragh）,1990年）。いくつかの観察は、血漿アンジオテ
ンシノーゲン濃度と血圧との直接的関係を指摘してい
る； （１）直接的な正の関係（ウォーカーら,1979年）；
（２）正常血圧者と比較した場合の高血圧の対象および
高血圧の両親の子孫における高濃度血漿アンジオテンシ
ノーゲン（ファソラ（Fasola）ら,1968年）；（３）上
昇した血漿アンジオテンシノーゲンと、対比される親の
高血圧素質を伴った子孫における高血圧との関連；
（４）アンジオテンシノーゲン抗体の投与（ガルデス
（Gardes）ら,1982年）またはアンジオテンシノーゲン
の注射（メナード（Menard）ら,1991年）による血圧の
下降または上昇；（５）血圧調節に直接関連する組織に
おけるアンジオテンシノーゲン遺伝子の発現（キャンプ
ベル（Campbell）およびハベナー（Habener）,1986
年）；および（６）アンジオテンシノーゲンを過剰発現
するトランスジェニック動物における血圧の上昇（オー
クボ（Ohkubo）ら,1990年；キムラ（Kimura）ら,1992
年）。
ココルチコイド、甲状腺ホルモン、およびアンジオテン
シンIIの正のコントロールの下、まず、肝臓で合成さ
れ、構成的経路を経て分泌される。レニンによるアンジ
オテンシノーゲンのアミノ末端セグメントの開裂によ
り、デカペプチドプロホルマンであるアンジオテンシン
Ｉが放出され、これは、ジペプチジルカルボキシペプチ
ダーゼであるアンジオテンシン変換酵素（ACE）により
さらにプロセッシングされて活性なオクタペプチドであ
るアンジオテンシンIIとなる。レニンによるアンジオテ
ンシノーゲンの開裂は、レニン−アンジオテンシン系の
律速段階である（シーリー（Sealey）およびララグ（La
ragh）,1990年）。いくつかの観察は、血漿アンジオテ
ンシノーゲン濃度と血圧との直接的関係を指摘してい
る； （１）直接的な正の関係（ウォーカーら,1979年）；
（２）正常血圧者と比較した場合の高血圧の対象および
高血圧の両親の子孫における高濃度血漿アンジオテンシ
ノーゲン（ファソラ（Fasola）ら,1968年）；（３）上
昇した血漿アンジオテンシノーゲンと、対比される親の
高血圧素質を伴った子孫における高血圧との関連；
（４）アンジオテンシノーゲン抗体の投与（ガルデス
（Gardes）ら,1982年）またはアンジオテンシノーゲン
の注射（メナード（Menard）ら,1991年）による血圧の
下降または上昇；（５）血圧調節に直接関連する組織に
おけるアンジオテンシノーゲン遺伝子の発現（キャンプ
ベル（Campbell）およびハベナー（Habener）,1986
年）；および（６）アンジオテンシノーゲンを過剰発現
するトランスジェニック動物における血圧の上昇（オー
クボ（Ohkubo）ら,1990年；キムラ（Kimura）ら,1992
年）。
最近の研究により、レニンおよびACEは、高血圧に関
連した優れた候補であることが示された。ヒト・レニン
遺伝子は、本態性高血圧の病因論における魅力的な候補
である：（１）レニンは、有効なバソアクティブホルモ
ン（vasoactivehormone）であるアンジオテンシンIIに
先行する生合成カスケードにおける制限的酵素である；
（２）レニン分泌性腫瘍および腎動脈狭窄症により示さ
れるようなレニン産生の増加により、血圧が大きく上昇
しうる；（３）レニン−アンジオテンシン系のブロック
は、アンジオテンシンII−変換酵素阻害剤により示され
るような本態性高血圧の治療において非常に有効であ
る；（４）遺伝学的研究により、いくつかのラット株に
おいて、レニンが、高血圧の発生に関連していることが
示されている（ラップ（Rapp）ら,1989年；クルツ（Kur
tz）ら,1990年）；（５）外来遺伝子のみ（ムリンズ（M
ullins）ら,1990年）、あるいはアンジオテンシン遺伝
子と一緒に外来遺伝子を有する（オークボら,1990年）
トランスジェニック動物は、若年性および重篤な高血圧
を発生させる。
連した優れた候補であることが示された。ヒト・レニン
遺伝子は、本態性高血圧の病因論における魅力的な候補
である：（１）レニンは、有効なバソアクティブホルモ
ン（vasoactivehormone）であるアンジオテンシンIIに
先行する生合成カスケードにおける制限的酵素である；
（２）レニン分泌性腫瘍および腎動脈狭窄症により示さ
れるようなレニン産生の増加により、血圧が大きく上昇
しうる；（３）レニン−アンジオテンシン系のブロック
は、アンジオテンシンII−変換酵素阻害剤により示され
るような本態性高血圧の治療において非常に有効であ
る；（４）遺伝学的研究により、いくつかのラット株に
おいて、レニンが、高血圧の発生に関連していることが
示されている（ラップ（Rapp）ら,1989年；クルツ（Kur
tz）ら,1990年）；（５）外来遺伝子のみ（ムリンズ（M
ullins）ら,1990年）、あるいはアンジオテンシン遺伝
子と一緒に外来遺伝子を有する（オークボら,1990年）
トランスジェニック動物は、若年性および重篤な高血圧
を発生させる。
ヒト・ACE遺伝子も、本態性高血圧の病因論における
魅力的な候補である。ACE阻害剤は、ヒトの高血圧の調
節における重要かつ有効な治療のアプローチを構成し、
自発的高血圧ラット（spontaneously hypertensive ra
t）（SHR）における高血圧の発生を防止しうる（ハラプ
（Harrap）ら,1990年）。最近、卒中傾向のあるSHRにお
いて、高血圧とACE遺伝子座を含む染色体領域との連鎖
が示されたことにより（ヒルバート（Hilbert）ら,1991
年；ジャコブ（Jacob）ら,1991年）、ACEに対する興味
が脚光を浴びるようになった。高血圧と同じくらい一般
的な疾病を特徴付ける病因論的異質性および多因子決定
は、古典的な遺伝学的方法の限界を示すものである。表
現型の決定、遺伝様式、最適な家族構成、および一般的
な連鎖に対するアプローチに対する候補となる遺伝子
は、重大な戦略の選択をさせるものである（ランダー
（Lander）およびボトステイン（Botstein）,1986年；
ホワイト（White）およびラロウエル（Lalouel）,1987
年；ランダーおよびボトステイン,1989年；ラロウエル,
1990年；ラソープ（Lathorp）およびラロウエル,1991
年）。古典的な尤度比法（likelihood ratio methods）
による家系の分析は、異質性および未知の高血圧の遺伝
様式により問題がある。かかるアプローチは、連鎖の検
出にいくらかの力を発揮するが、関連を排除するための
その力は限られているようである。別法として、罹患し
ている同胞の対における連鎖を分析することは、異質性
および不完全な浸透度には便利であり得、形質の遺伝様
式の演繹的な明確化を必要とせず、しかも、単一の遺伝
子座における遺伝による形質に及ぼす効果の潜在的な大
きさに上限を置く有力な方法である（ブラックウェルダ
ー（Blackwelder）およびエルストン（Elston）,1985
年；スアレス（Suarez）およびバン・エールデヴェグ
（Van Eerdewegh）,1984年）。
魅力的な候補である。ACE阻害剤は、ヒトの高血圧の調
節における重要かつ有効な治療のアプローチを構成し、
自発的高血圧ラット（spontaneously hypertensive ra
t）（SHR）における高血圧の発生を防止しうる（ハラプ
（Harrap）ら,1990年）。最近、卒中傾向のあるSHRにお
いて、高血圧とACE遺伝子座を含む染色体領域との連鎖
が示されたことにより（ヒルバート（Hilbert）ら,1991
年；ジャコブ（Jacob）ら,1991年）、ACEに対する興味
が脚光を浴びるようになった。高血圧と同じくらい一般
的な疾病を特徴付ける病因論的異質性および多因子決定
は、古典的な遺伝学的方法の限界を示すものである。表
現型の決定、遺伝様式、最適な家族構成、および一般的
な連鎖に対するアプローチに対する候補となる遺伝子
は、重大な戦略の選択をさせるものである（ランダー
（Lander）およびボトステイン（Botstein）,1986年；
ホワイト（White）およびラロウエル（Lalouel）,1987
年；ランダーおよびボトステイン,1989年；ラロウエル,
1990年；ラソープ（Lathorp）およびラロウエル,1991
年）。古典的な尤度比法（likelihood ratio methods）
による家系の分析は、異質性および未知の高血圧の遺伝
様式により問題がある。かかるアプローチは、連鎖の検
出にいくらかの力を発揮するが、関連を排除するための
その力は限られているようである。別法として、罹患し
ている同胞の対における連鎖を分析することは、異質性
および不完全な浸透度には便利であり得、形質の遺伝様
式の演繹的な明確化を必要とせず、しかも、単一の遺伝
子座における遺伝による形質に及ぼす効果の潜在的な大
きさに上限を置く有力な方法である（ブラックウェルダ
ー（Blackwelder）およびエルストン（Elston）,1985
年；スアレス（Suarez）およびバン・エールデヴェグ
（Van Eerdewegh）,1984年）。
高血圧、特に、本態性高血圧および妊娠高血圧（子か
ん前症）に関連する遺伝的関連を調べることが本発明の
１の目的であった。かかる関連性を用いて高血圧素質で
ある可能性のある人を同定し、より良い疾病の管理を行
ううことが本発明のさらなる目的であった。
ん前症）に関連する遺伝的関連を調べることが本発明の
１の目的であった。かかる関連性を用いて高血圧素質で
ある可能性のある人を同定し、より良い疾病の管理を行
ううことが本発明のさらなる目的であった。
発明の概要 本発明は、ヒトの高血圧の分子的な原因を同定するこ
とに関する。より詳細には、本発明は、アンジオテンシ
ノーゲン（AGT）が高血圧の病因に関連していることを
示すものでる。AGT遺伝子の分子変異体は、高血圧発生
に対する個体の感受性に関連している。AGT遺伝子の分
析により、本態性高血圧または妊娠高血圧を発生させる
遺伝的素質のある対象が同定されよう。それゆえ、例え
ば、食事のナトリウム制限により、注意深く血圧をモニ
ターし慣用的な薬剤で治療することにより、レニン阻害
剤を投与することにより、あるいはAGT合成を阻害する
薬剤を投与することにより、これらの対象における高血
圧の管理がより個別的に行われうる。AGT遺伝子の分析
を、個体のAGT遺伝子のDNA配列とネイティブかつ変異体
でないAGT遺伝子、すなわち、天然の、または野生型のA
GT遺伝子の遺伝子配列とを比較することにより行う。
とに関する。より詳細には、本発明は、アンジオテンシ
ノーゲン（AGT）が高血圧の病因に関連していることを
示すものでる。AGT遺伝子の分子変異体は、高血圧発生
に対する個体の感受性に関連している。AGT遺伝子の分
析により、本態性高血圧または妊娠高血圧を発生させる
遺伝的素質のある対象が同定されよう。それゆえ、例え
ば、食事のナトリウム制限により、注意深く血圧をモニ
ターし慣用的な薬剤で治療することにより、レニン阻害
剤を投与することにより、あるいはAGT合成を阻害する
薬剤を投与することにより、これらの対象における高血
圧の管理がより個別的に行われうる。AGT遺伝子の分析
を、個体のAGT遺伝子のDNA配列とネイティブかつ変異体
でないAGT遺伝子、すなわち、天然の、または野生型のA
GT遺伝子の遺伝子配列とを比較することにより行う。
図面の簡単な説明 図1.高血圧同胞群におけるアンジオテンシノーゲン遺伝
子座におけるジヌクレオチド繰り返しで遺伝子型を表し
た図 AGTのGT繰り返しに関する代表的な遺伝子型を
示す。６個の高血圧同胞群における家族的関連を図の最
上部に示す。個体のゲノムDNAをAGT遺伝子座におけるGT
繰り返しに関するプライマーで増幅し、電気泳動により
分画し、実施例記載のごとくオートラジオフラフィーに
供した。それぞれの個体についての結果を、図の最下部
に示した個体の遺伝子型とともに下に示す。それぞれの
対立遺伝子は、特徴的に、単一の濃いバンドおよび２塩
基対短い薄いバンドを示す。濃いほうのバンドにより対
立遺伝子を評価した。
子座におけるジヌクレオチド繰り返しで遺伝子型を表し
た図 AGTのGT繰り返しに関する代表的な遺伝子型を
示す。６個の高血圧同胞群における家族的関連を図の最
上部に示す。個体のゲノムDNAをAGT遺伝子座におけるGT
繰り返しに関するプライマーで増幅し、電気泳動により
分画し、実施例記載のごとくオートラジオフラフィーに
供した。それぞれの個体についての結果を、図の最下部
に示した個体の遺伝子型とともに下に示す。それぞれの
対立遺伝子は、特徴的に、単一の濃いバンドおよび２塩
基対短い薄いバンドを示す。濃いほうのバンドにより対
立遺伝子を評価した。
図2.アンジオテンシノーゲン遺伝子における変異体の同
定およびDNA配列分析 アンジオテンシノーゲン遺伝
子のセグメントを増幅し、実施例記載のごとく非変性ゲ
ル上の電気泳動により分画した。異なる高血圧対象の増
幅産物を示すオートラジオグラムを示す。左に、T174M
変異体に対してホモ接合である個体の生成物（矢印）お
よびT174に対するホモ接合である２人の対象のものを示
す。これらの異なる生成物の配列を、実施例記載のよう
に決定し、T174M配列に対応する上のT174配列とともに
図の下方に示す（配列は、左から右へ５′から３′方向
のアンチセンス鎖である）。変異体を特徴づけているヌ
クレオチド置換を＊により示す。右に、M235Tに対して
ホモ接合である２人の個体の生成物（矢印）およびM235
に対してホモ接合である３人の対象のものを示す。さら
に、対応配列の図の下方に示す。
定およびDNA配列分析 アンジオテンシノーゲン遺伝
子のセグメントを増幅し、実施例記載のごとく非変性ゲ
ル上の電気泳動により分画した。異なる高血圧対象の増
幅産物を示すオートラジオグラムを示す。左に、T174M
変異体に対してホモ接合である個体の生成物（矢印）お
よびT174に対するホモ接合である２人の対象のものを示
す。これらの異なる生成物の配列を、実施例記載のよう
に決定し、T174M配列に対応する上のT174配列とともに
図の下方に示す（配列は、左から右へ５′から３′方向
のアンチセンス鎖である）。変異体を特徴づけているヌ
クレオチド置換を＊により示す。右に、M235Tに対して
ホモ接合である２人の個体の生成物（矢印）およびM235
に対してホモ接合である３人の対象のものを示す。さら
に、対応配列の図の下方に示す。
図3.ヒト・ゲノムのアンジオテンシノーゲン遺伝子地図
および同定された変異体の位置 アンジオテンシノー
ゲン遺伝子のエキソンを、図の上部にオープンボックス
で示す。該遺伝子の５′フランキング領域の拡大図を、
黒く塗った転写調節配列の位置とともに下に示す:CAT、
TATAおよびRNAポリメラーゼIII（RPP）プロモーターエ
レメント；グルココルチコイド（GRE、P.GRE:推定上のG
RE）、エストロゲン（ERE）または甲状腺ホルモン（TR
E）に対するホルモン応答エレメント；肝臓特異的エレ
メント（HSE）；急性相応答エレメント（APRE）；推定
上のエンハンサーエレメント（ENH）。高血圧対象にお
いて同定された変異体の配列の位置を、番号を付した矢
印により示す。個々の変異体の正確な位置および性質を
下表２に示す。
および同定された変異体の位置 アンジオテンシノー
ゲン遺伝子のエキソンを、図の上部にオープンボックス
で示す。該遺伝子の５′フランキング領域の拡大図を、
黒く塗った転写調節配列の位置とともに下に示す:CAT、
TATAおよびRNAポリメラーゼIII（RPP）プロモーターエ
レメント；グルココルチコイド（GRE、P.GRE:推定上のG
RE）、エストロゲン（ERE）または甲状腺ホルモン（TR
E）に対するホルモン応答エレメント；肝臓特異的エレ
メント（HSE）；急性相応答エレメント（APRE）；推定
上のエンハンサーエレメント（ENH）。高血圧対象にお
いて同定された変異体の配列の位置を、番号を付した矢
印により示す。個々の変異体の正確な位置および性質を
下表２に示す。
発明の詳細な説明 本発明は、アンジオテンシノーゲン（AGT）分子変異
体が本態性高血圧の病因に関連していることを決定する
ことに指向される。驚くべきことに、本発明により、AG
T遺伝子の分子変異体が、ヒトの高血圧の発生に関与し
ていることが見いだされた。本発明は、さらに、本態性
高血圧または妊娠高血圧を発生させるヒトの素質に関連
したAGT遺伝子変異体の存在について、ヒトをスクリー
ニングする方法に指向される。AGT遺伝子の分子変異体
をスクリーニングすることにより、高血圧の素質が判別
できるので、危険性のある個体を、より綿密にモニター
し、疾病が重篤になる前に治療することができる。
体が本態性高血圧の病因に関連していることを決定する
ことに指向される。驚くべきことに、本発明により、AG
T遺伝子の分子変異体が、ヒトの高血圧の発生に関与し
ていることが見いだされた。本発明は、さらに、本態性
高血圧または妊娠高血圧を発生させるヒトの素質に関連
したAGT遺伝子変異体の存在について、ヒトをスクリー
ニングする方法に指向される。AGT遺伝子の分子変異体
をスクリーニングすることにより、高血圧の素質が判別
できるので、危険性のある個体を、より綿密にモニター
し、疾病が重篤になる前に治療することができる。
本態性高血圧は、ヒトの循環系疾患率および死亡率の
主たる原因の１つである。結縁関係のある人々における
血圧についての疫学的研究は、約30％の遺伝的伝承を示
唆している（ウォード,1990年）。高血圧の両親の子孫
のみならず普通の人々における血圧の連続的で単一形態
の分散（ハミルトン（Hamilton）ら,1954年）は、いく
つかの遺伝子がこの遺伝的素質に関連しているというこ
とを支持するものである。しかしながら、実際に関連し
ている遺伝子、血圧に対するそれら個々の影響、あるい
はそれらの相互作用および環境とそれらの相互作用につ
いては情報がない。
主たる原因の１つである。結縁関係のある人々における
血圧についての疫学的研究は、約30％の遺伝的伝承を示
唆している（ウォード,1990年）。高血圧の両親の子孫
のみならず普通の人々における血圧の連続的で単一形態
の分散（ハミルトン（Hamilton）ら,1954年）は、いく
つかの遺伝子がこの遺伝的素質に関連しているというこ
とを支持するものである。しかしながら、実際に関連し
ている遺伝子、血圧に対するそれら個々の影響、あるい
はそれらの相互作用および環境とそれらの相互作用につ
いては情報がない。
高血圧動物モデルにおける遺伝学的研究により、高血
圧の発生におけるこの系の２つの鍵酵素、すなわち、近
くのマーカーへの結合を介したレニン（ラップら,1989
年；ムリンズら,1990年；クルツら,1990年）およびアン
ジオテンシン変換酵素（ヒルバートら,1991年；ジャコ
ブら,1991年；デング（Deng）およびラップ,1992年）の
意味が示唆されている。本発明の目的は、高血圧との関
連を同定することであった。意外にも、レニンもアンジ
オテンシン変換酵素も、ヒトの高血圧には関連していな
いことが見いだされた。そのかわりに、アンジオテンシ
ノーゲン遺伝子が本態性高血圧の病因に関連しているこ
とが見いだされた。以下のことが分かった：（１）本態
性高血圧と罹患した同胞のAGTとの遺伝的連鎖；（２）
症例と対照の間の比較により明らかになる高血圧とある
種のAGT分子変異体との関連；（３）高血圧に強く関連
した共通したAGT変異体を有する高血圧の対象における
血漿アンジオテンシノーゲン濃度の上昇；（４）最もあ
りふれたAGT遺伝子変異体を有する人は、高レベルの血
漿アンジオテンシノーゲンのみならず高血圧を示したこ
と；そして（５）最もありふれたAGT遺伝子変異体は、
統計学的に、妊娠中の子かん前症（すべての妊婦の５〜
10％に起こる）を示す女性において上昇していた。
圧の発生におけるこの系の２つの鍵酵素、すなわち、近
くのマーカーへの結合を介したレニン（ラップら,1989
年；ムリンズら,1990年；クルツら,1990年）およびアン
ジオテンシン変換酵素（ヒルバートら,1991年；ジャコ
ブら,1991年；デング（Deng）およびラップ,1992年）の
意味が示唆されている。本発明の目的は、高血圧との関
連を同定することであった。意外にも、レニンもアンジ
オテンシン変換酵素も、ヒトの高血圧には関連していな
いことが見いだされた。そのかわりに、アンジオテンシ
ノーゲン遺伝子が本態性高血圧の病因に関連しているこ
とが見いだされた。以下のことが分かった：（１）本態
性高血圧と罹患した同胞のAGTとの遺伝的連鎖；（２）
症例と対照の間の比較により明らかになる高血圧とある
種のAGT分子変異体との関連；（３）高血圧に強く関連
した共通したAGT変異体を有する高血圧の対象における
血漿アンジオテンシノーゲン濃度の上昇；（４）最もあ
りふれたAGT遺伝子変異体を有する人は、高レベルの血
漿アンジオテンシノーゲンのみならず高血圧を示したこ
と；そして（５）最もありふれたAGT遺伝子変異体は、
統計学的に、妊娠中の子かん前症（すべての妊婦の５〜
10％に起こる）を示す女性において上昇していた。
レニン、ACEまたはAGTと本態性高血圧との間の関連
を、実施例に詳細に説明するように、ユタ州のソルトレ
イクシティー（Salt Lake City）およびフランスのパリ
（Paris）の人々について、罹患した同胞対法（affecte
d sib pair method）（ビショップ（Bishop）およびウ
ィリアムソン（Williamson）,1990年）を用いて研究し
た。AGT遺伝子と高血圧との関連のみが見いだされた。A
GT遺伝子を、高血圧の人において調べ、少なくとも15変
異体を同定した。これらの変異体は、レニンまたはACE
いずれかにより開裂されるAGT蛋白の領域にはない。AGT
遺伝子が本態性高血圧に関連しているという同定結果
を、健康な人々および妊娠中の子かん前症を示す女性に
おいて確認した。
を、実施例に詳細に説明するように、ユタ州のソルトレ
イクシティー（Salt Lake City）およびフランスのパリ
（Paris）の人々について、罹患した同胞対法（affecte
d sib pair method）（ビショップ（Bishop）およびウ
ィリアムソン（Williamson）,1990年）を用いて研究し
た。AGT遺伝子と高血圧との関連のみが見いだされた。A
GT遺伝子を、高血圧の人において調べ、少なくとも15変
異体を同定した。これらの変異体は、レニンまたはACE
いずれかにより開裂されるAGT蛋白の領域にはない。AGT
遺伝子が本態性高血圧に関連しているという同定結果
を、健康な人々および妊娠中の子かん前症を示す女性に
おいて確認した。
AGT遺伝子の分子変異体は、高血圧に対するヒトの素
質を判別するもであるが、この時点では、観察されたAG
T分子変異体が直接的に機能するかどうか、あるいはそ
れらが、使用する分子スクリーニング法により同定から
逃れた機能的変異体に関するマーカーとして役立つかど
うかを決定するすることは可能ではない。ヒト・アンジ
オテンシノーゲン配列をラット・アンジオテンシノーゲ
ン配列およびアンチスロンビンIIIならびにアルファ−
１−アンチ−トリプシンのごとき他のセリンプロテアー
ゼ阻害剤（セルピン類）と比較した場合、AGT遺伝子変
異体M235TおよびT174Mは、殆ど保存性のない領域にある
ように思われる（カレル（Carrell）およびボスウェル
（Boswell）,1986年）。対照的に、高血圧同胞の１つの
対のみにおけるヘテロ接合状態において観察された変異
体Y248Cは、セルピン類ではよく保存されている領域に
おいて非保存的置換を構成する。普通の変異体によりコ
ードされるこの素質のほかに、Y248CおよびV388Mのごと
き希な変異体は、独特の臨床的経過および重篤性を素質
に付与する能力を有している。
質を判別するもであるが、この時点では、観察されたAG
T分子変異体が直接的に機能するかどうか、あるいはそ
れらが、使用する分子スクリーニング法により同定から
逃れた機能的変異体に関するマーカーとして役立つかど
うかを決定するすることは可能ではない。ヒト・アンジ
オテンシノーゲン配列をラット・アンジオテンシノーゲ
ン配列およびアンチスロンビンIIIならびにアルファ−
１−アンチ−トリプシンのごとき他のセリンプロテアー
ゼ阻害剤（セルピン類）と比較した場合、AGT遺伝子変
異体M235TおよびT174Mは、殆ど保存性のない領域にある
ように思われる（カレル（Carrell）およびボスウェル
（Boswell）,1986年）。対照的に、高血圧同胞の１つの
対のみにおけるヘテロ接合状態において観察された変異
体Y248Cは、セルピン類ではよく保存されている領域に
おいて非保存的置換を構成する。普通の変異体によりコ
ードされるこの素質のほかに、Y248CおよびV388Mのごと
き希な変異体は、独特の臨床的経過および重篤性を素質
に付与する能力を有している。
本明細書に記載する、AGT遺伝子変異体とは、例え
ば、変異体蛋白が、アミノ酸235の位置においてメチオ
ニンのかわりにスレオニンを有するM235Tのようなアミ
ノ酸レベル、あるいは例えば、変異体遺伝子が５′配列
のヌクレオチド−532の位置においてシトシンのかわり
にチミジンを有するＣ−532Tのようなヌクレオチドレベ
ルのいずれをも表す。いくつかの変異体を表２に掲載す
る。
ば、変異体蛋白が、アミノ酸235の位置においてメチオ
ニンのかわりにスレオニンを有するM235Tのようなアミ
ノ酸レベル、あるいは例えば、変異体遺伝子が５′配列
のヌクレオチド−532の位置においてシトシンのかわり
にチミジンを有するＣ−532Tのようなヌクレオチドレベ
ルのいずれをも表す。いくつかの変異体を表２に掲載す
る。
残基235における遺伝子型により高血圧の同胞群を階
層化し、アンジオテンシノーゲンの高い血漿濃度がM235
Tを有する者において観察された（Ｆ2.313＝14.9,p＜0.
0001）。さらに、それぞれのサンプルにおいてこの結果
が独立して観察された。血漿アンジオテンシノーゲン濃
度と血圧との相関関係はすでに観察されている（ウォー
カー（Walker）ら,1979年）。まとめると、これらの観
察結果は、血漿アンジオテンシノーゲンの本態性高血圧
への直接的関連を示唆するものである。M235T変異体
は、上昇した血漿アンジオテンシノーゲン濃度のみなら
ず上昇した血圧にも有意に関連していたことを見いだす
ことにより、この結論がさらに強固になる。下記実施例
８参照。本発明は、さらなる２つの知見により確証され
る：（１）血漿アンジオテンシノーゲンは、正常血圧者
においてよりも高血圧の対象および高血圧の両親の子孫
において高かった；そして（２）フォー−コーナース・
スタディー（Four−Corners study）において、アンジ
オテンシノーゲン濃度は、遺伝的素質を伝える可能性が
最も高いサブセット、すなわち、高血圧の両親の高血圧
の子孫における高血圧に有意に関連していた（ワット
（Watt）ら,1992年）。アンジオテンシノーゲンの血漿
濃度は、レニンとアンジオテンシノーゲンとの間の酵素
反応のKm値に近い（グールド（Gould）およびグリーン
（Green）,1971年）ので、レニン基質の増加または減少
は、アンジオテンシンII形成における随伴的変化を引き
起こしうる（ケイン（Cain）ら,1971年；メナード（Men
ard）およびカット（Catt）,1973年；アーナル（Arna
l）ら,1991年）それゆえ、上昇したベースラインレベル
は、レニン−アンジオテンシン系のおだやかな過剰活性
を引き起こしうるし、実質のある人々における恒常性の
セットポイントの変更を示す可能性がある。実際、昇圧
作用を示すよりも少ない用量でのアンジオテンシンIIの
長期投与は血圧を上昇させることが示されている（ブラ
ウン（Brown）ら,1981年）。
層化し、アンジオテンシノーゲンの高い血漿濃度がM235
Tを有する者において観察された（Ｆ2.313＝14.9,p＜0.
0001）。さらに、それぞれのサンプルにおいてこの結果
が独立して観察された。血漿アンジオテンシノーゲン濃
度と血圧との相関関係はすでに観察されている（ウォー
カー（Walker）ら,1979年）。まとめると、これらの観
察結果は、血漿アンジオテンシノーゲンの本態性高血圧
への直接的関連を示唆するものである。M235T変異体
は、上昇した血漿アンジオテンシノーゲン濃度のみなら
ず上昇した血圧にも有意に関連していたことを見いだす
ことにより、この結論がさらに強固になる。下記実施例
８参照。本発明は、さらなる２つの知見により確証され
る：（１）血漿アンジオテンシノーゲンは、正常血圧者
においてよりも高血圧の対象および高血圧の両親の子孫
において高かった；そして（２）フォー−コーナース・
スタディー（Four−Corners study）において、アンジ
オテンシノーゲン濃度は、遺伝的素質を伝える可能性が
最も高いサブセット、すなわち、高血圧の両親の高血圧
の子孫における高血圧に有意に関連していた（ワット
（Watt）ら,1992年）。アンジオテンシノーゲンの血漿
濃度は、レニンとアンジオテンシノーゲンとの間の酵素
反応のKm値に近い（グールド（Gould）およびグリーン
（Green）,1971年）ので、レニン基質の増加または減少
は、アンジオテンシンII形成における随伴的変化を引き
起こしうる（ケイン（Cain）ら,1971年；メナード（Men
ard）およびカット（Catt）,1973年；アーナル（Arna
l）ら,1991年）それゆえ、上昇したベースラインレベル
は、レニン−アンジオテンシン系のおだやかな過剰活性
を引き起こしうるし、実質のある人々における恒常性の
セットポイントの変更を示す可能性がある。実際、昇圧
作用を示すよりも少ない用量でのアンジオテンシンIIの
長期投与は血圧を上昇させることが示されている（ブラ
ウン（Brown）ら,1981年）。
最近の研究により、血漿アンジオテンシノーゲンのみ
ならず、特異的組織における局部的発現が、血圧調節に
関与していることが示唆されている。ヨング（Yongue）
ら，（1991年）は、正常血圧の対照WKYラットと比較し
て、SHRラットの前腹方の視床下部および脳の接触部位
におけるアンジオテンシノーゲンの発現増加を観察し
た。中枢神経系におけるアンジオテンシノーゲンの可能
な役割は、トランスジェニックラットにおけるAGT遺伝
子の実験的な過剰発現により、さらに支持される：血漿
濃度は上昇したが、脳における移入遺伝子の正常な組織
特異的発現を示すトランスジェニック系においてのみ、
高血圧が観察された（キムラ（Kimura）ら,1992年）。
さらにそのうえ、腎臓におけるレニン−アンジオテンシ
ン系の異なる成分の局部的な合成に関する証拠が集めら
れ、ナトリウムによるアンジオテンシノーゲン発現の調
節の変化がSHRラットにおいて観察された（プラット（P
ratt）ら,1989年）。
ならず、特異的組織における局部的発現が、血圧調節に
関与していることが示唆されている。ヨング（Yongue）
ら，（1991年）は、正常血圧の対照WKYラットと比較し
て、SHRラットの前腹方の視床下部および脳の接触部位
におけるアンジオテンシノーゲンの発現増加を観察し
た。中枢神経系におけるアンジオテンシノーゲンの可能
な役割は、トランスジェニックラットにおけるAGT遺伝
子の実験的な過剰発現により、さらに支持される：血漿
濃度は上昇したが、脳における移入遺伝子の正常な組織
特異的発現を示すトランスジェニック系においてのみ、
高血圧が観察された（キムラ（Kimura）ら,1992年）。
さらにそのうえ、腎臓におけるレニン−アンジオテンシ
ン系の異なる成分の局部的な合成に関する証拠が集めら
れ、ナトリウムによるアンジオテンシノーゲン発現の調
節の変化がSHRラットにおいて観察された（プラット（P
ratt）ら,1989年）。
いかなる作用に関する理論にも拘束されずに、残基23
5における変異体であると同定または評価されたような
いくつかのアンジオテンシノーゲン分子変異体が、合成
速度の増大、すなわちレニンとの反応定数の変化、ある
いはそれ自身または他の細胞外蛋白との複合体形成をし
ている間の滞留時間の延長のいずれかの結果としての血
漿もしくは組織のアンジオテンシノーゲンの増加を引き
起こすことがありうる。このことにより、ベースライン
またはアンジオテンシンIIの反応的生成のわずかな上昇
を引き起こす可能性があり、ナトリウムおよび環境的ス
トレスに応答したレニン−アンジオテンシン系のわずか
な過剰反応性を説明することとなる。数10年間にわた
り、このことは、順に、アルドステロン分泌の慢性的な
刺激の結果としてのナトリウム保持、血管肥大およびア
ンジオテンシンII生成の慢性的な増加の結果としての末
梢血管の抵抗性の上昇、または脳の関連部位におけるア
ンジオテンシンIIの生産増加により媒介される交感神経
系の異常な刺激を促進し得たのである。
5における変異体であると同定または評価されたような
いくつかのアンジオテンシノーゲン分子変異体が、合成
速度の増大、すなわちレニンとの反応定数の変化、ある
いはそれ自身または他の細胞外蛋白との複合体形成をし
ている間の滞留時間の延長のいずれかの結果としての血
漿もしくは組織のアンジオテンシノーゲンの増加を引き
起こすことがありうる。このことにより、ベースライン
またはアンジオテンシンIIの反応的生成のわずかな上昇
を引き起こす可能性があり、ナトリウムおよび環境的ス
トレスに応答したレニン−アンジオテンシン系のわずか
な過剰反応性を説明することとなる。数10年間にわた
り、このことは、順に、アルドステロン分泌の慢性的な
刺激の結果としてのナトリウム保持、血管肥大およびア
ンジオテンシンII生成の慢性的な増加の結果としての末
梢血管の抵抗性の上昇、または脳の関連部位におけるア
ンジオテンシンIIの生産増加により媒介される交感神経
系の異常な刺激を促進し得たのである。
AGT遺伝子と高血圧との関連を同定することにより、
高血圧素質を調べるためにの個体のスクリーニングが可
能となる。疾病の発生の危険があると同定された個体に
は、食事のナトリウム制限が有益でありうるし、その血
圧をより綿密にモニターし、疾病経過の早い時期に治療
することが可能である。かかる血圧モニタリングおよび
治療を、当該分野で知られた慣用的方法を用いて行うこ
とができる。高血圧素質を有する人を同定するために、
変異についてAGT対立遺伝子をスクリーニングする。つ
いで、AGT遺伝子変異体を有する人の血漿アンジオテン
シノーゲンレベルを調べて危険性のある人を同定する。
直接または対立遺伝子のクローニング後において、変異
についてAGT対立遺伝子をスクリーニングする。以下の
方法の１つにより、正常な対立遺伝子（天然のもの、変
異体でないものまたは野生型のもの）と異なるヌクレオ
チド配列の存在について対立遺伝子を試験する：（１）
クローン化された対立遺伝子および正常なAGT遺伝子ま
たは適当なフラグメントの両方のヌクレオチド配列（暗
号配列またはゲノム配列）を決定し、ついで、比較す
る、あるいは（２）AGT遺伝子または遺伝子フラグメン
トのRNA転写物を、試験すべき個体由来の１本鎖の全ゲ
ノムDNAにハイブリダイズさせ、得られたヘテロ２本鎖
をリボヌクレアーゼＡ（RNaseA）で処理し、ついで、変
性ゲルに流してすべてのミスマッチの位置を検出する。
さらに詳細には、これらの方法を、以下の方法に従って
実行する。
高血圧素質を調べるためにの個体のスクリーニングが可
能となる。疾病の発生の危険があると同定された個体に
は、食事のナトリウム制限が有益でありうるし、その血
圧をより綿密にモニターし、疾病経過の早い時期に治療
することが可能である。かかる血圧モニタリングおよび
治療を、当該分野で知られた慣用的方法を用いて行うこ
とができる。高血圧素質を有する人を同定するために、
変異についてAGT対立遺伝子をスクリーニングする。つ
いで、AGT遺伝子変異体を有する人の血漿アンジオテン
シノーゲンレベルを調べて危険性のある人を同定する。
直接または対立遺伝子のクローニング後において、変異
についてAGT対立遺伝子をスクリーニングする。以下の
方法の１つにより、正常な対立遺伝子（天然のもの、変
異体でないものまたは野生型のもの）と異なるヌクレオ
チド配列の存在について対立遺伝子を試験する：（１）
クローン化された対立遺伝子および正常なAGT遺伝子ま
たは適当なフラグメントの両方のヌクレオチド配列（暗
号配列またはゲノム配列）を決定し、ついで、比較す
る、あるいは（２）AGT遺伝子または遺伝子フラグメン
トのRNA転写物を、試験すべき個体由来の１本鎖の全ゲ
ノムDNAにハイブリダイズさせ、得られたヘテロ２本鎖
をリボヌクレアーゼＡ（RNaseA）で処理し、ついで、変
性ゲルに流してすべてのミスマッチの位置を検出する。
さらに詳細には、これらの方法を、以下の方法に従って
実行する。
試験すべき個体におけるAGT遺伝子の対立遺伝子を、
慣用的方法を用いてクローニングする。例えば、血液試
料を個体から得る。この試料中の細胞から単離されたゲ
ノムDNAを部分的に消化して約20kbの平均化されたサイ
ズにする。18〜21kbのフラグメントを単離する。得られ
たフラグメントを適当なベクター中にライゲーションす
る。ついで、該クローンの配列を決定し、正常な（野生
型）AGT遺伝子と比較する。
慣用的方法を用いてクローニングする。例えば、血液試
料を個体から得る。この試料中の細胞から単離されたゲ
ノムDNAを部分的に消化して約20kbの平均化されたサイ
ズにする。18〜21kbのフラグメントを単離する。得られ
たフラグメントを適当なベクター中にライゲーションす
る。ついで、該クローンの配列を決定し、正常な（野生
型）AGT遺伝子と比較する。
別法として、AGT遺伝子の５′領域またはエキソンに
対するプライマーの対を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（PCRs）を行う。かかるプライマー対の例を表１に掲載
する。正常AGT遺伝子の配列に基づくいかなるプライマ
ー対を用いてもPCRsを行うことができる。例えば、大き
なイントロンに対するプライマーの対を調製し使用する
ことができる。究極的には、PCRをmRNAについて行うこ
ともできる。ついで、慣用的方法を用いる１本鎖コンホ
ーメーション多形性（single stranded conformation p
olymorphisms）（SSCP）により増幅生成物を分析してす
べての相違を同定し、ついで、これらを配列決定し、正
常AGT遺伝子配列と比較する。
対するプライマーの対を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（PCRs）を行う。かかるプライマー対の例を表１に掲載
する。正常AGT遺伝子の配列に基づくいかなるプライマ
ー対を用いてもPCRsを行うことができる。例えば、大き
なイントロンに対するプライマーの対を調製し使用する
ことができる。究極的には、PCRをmRNAについて行うこ
ともできる。ついで、慣用的方法を用いる１本鎖コンホ
ーメーション多形性（single stranded conformation p
olymorphisms）（SSCP）により増幅生成物を分析してす
べての相違を同定し、ついで、これらを配列決定し、正
常AGT遺伝子配列と比較する。
表１に掲載したプライマーのセットまたは他の適当な
プライマーの対を用いて個体のDNAを増幅し、ついで、
例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ
を用いるドットハイブリダイゼーションにより増幅生成
物を分析することにより、表２に掲載したものを含む通
常のAGT遺伝子変異体について個体を素早くスクリーニ
ングすることができる。
プライマーの対を用いて個体のDNAを増幅し、ついで、
例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ
を用いるドットハイブリダイゼーションにより増幅生成
物を分析することにより、表２に掲載したものを含む通
常のAGT遺伝子変異体について個体を素早くスクリーニ
ングすることができる。
第２の方法は、RNaseを用いて正常AGT遺伝子と欠損遺
伝子との相違の検出を援助するものである。この比較
を、AGT遺伝子の小さな制限フラグメント（〜500bp）を
プローブとして行う。まず、AGT遺伝子配列を約500bpの
フラグメントに切断する制限酵素でAGT遺伝子を消化す
る。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離し、
ゲルから精製し、SP6ベクター（例えば、pSP64またはpS
P65）中に両向にそれぞれクローン化する。AGT遺伝子フ
ラグメントを含むSP6に基づくプラスミドを、［α−
32P］GTPの存在下、当該分野でよく知られたSP6転写系
を用いて、インビトロで転写し、AGT遺伝子の両鎖の放
射標識されたRNA転写物を得る。
伝子との相違の検出を援助するものである。この比較
を、AGT遺伝子の小さな制限フラグメント（〜500bp）を
プローブとして行う。まず、AGT遺伝子配列を約500bpの
フラグメントに切断する制限酵素でAGT遺伝子を消化す
る。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離し、
ゲルから精製し、SP6ベクター（例えば、pSP64またはpS
P65）中に両向にそれぞれクローン化する。AGT遺伝子フ
ラグメントを含むSP6に基づくプラスミドを、［α−
32P］GTPの存在下、当該分野でよく知られたSP6転写系
を用いて、インビトロで転写し、AGT遺伝子の両鎖の放
射標識されたRNA転写物を得る。
これらのRNAを別個に用い、慣用的方法を用いて、対
立的なDNAとのヘテロ二重鎖を形成する。AGTフラグメン
トと、個体から得られたAGT対立遺伝子サブクローンと
の配列の相違のために、RTA:DNAヘテロ二重鎖において
生じるミスマッチは、RAaseAで処理した場合、RNA鎖に
おける開裂を引き起こす。かかるミスマッチは、個体の
AGT対立遺伝子における点突然変異または小規模な欠失
の結果である。RNA鎖の開裂により、２個またはそれ以
上の小さいRNAフラグメントが得られ、それらは、変性
ゲル上でRNAプローブ自身よりも早く移動する。
立的なDNAとのヘテロ二重鎖を形成する。AGTフラグメン
トと、個体から得られたAGT対立遺伝子サブクローンと
の配列の相違のために、RTA:DNAヘテロ二重鎖において
生じるミスマッチは、RAaseAで処理した場合、RNA鎖に
おける開裂を引き起こす。かかるミスマッチは、個体の
AGT対立遺伝子における点突然変異または小規模な欠失
の結果である。RNA鎖の開裂により、２個またはそれ以
上の小さいRNAフラグメントが得られ、それらは、変性
ゲル上でRNAプローブ自身よりも早く移動する。
見い出されるいかなる相違も、個体がAGT遺伝子の分
子変異体および結果生じる高血圧素質を有することを同
定するものである。
子変異体および結果生じる高血圧素質を有することを同
定するものである。
適当なPCR法のさらなる詳細を実施例に示す。これら
の方法または当該分野で知られた方法を用いて、他の変
異体のみならずAGT対立遺伝子を、表２に示す変異体に
関してスクリーニングすることができる。
の方法または当該分野で知られた方法を用いて、他の変
異体のみならずAGT対立遺伝子を、表２に示す変異体に
関してスクリーニングすることができる。
本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明す
るが、本発明を何等限定するものではない。当該分野で
知られた標準的方法または特別に以下に記載した手法が
用いられる。
るが、本発明を何等限定するものではない。当該分野で
知られた標準的方法または特別に以下に記載した手法が
用いられる。
実施例１ 多数の高血圧対象を伴う同胞群の選択 A.ソルトレイクシティー ２人またはそれ以上の高血
圧同胞が存在する家族を特徴づけ、ユタ州の高等学校の
生徒40000人の親から集めた「健康家族系統］質問表か
ら試料化した。この集団に基礎を置く高血圧同胞群の選
択の特徴は、以前に記載されている（ウィリアムス（Wi
lliams）ら,1988年）。本研究の目的のために、病状
を、60才になる前に抗高血圧治療での治療を必要とする
高血圧と診断されるものであって、糖尿病あるいは腎不
全の見られないものと定義した。該研究は、309人の同
胞（女性165人、男性144人）からなる。３個の同胞対
は、白人（１個はアジア人、２個はヒスパニア人）であ
り、それらの重要な臨床的性質を表３に示す。132個の
罹患した高血圧同胞群は、２人のものが102個、３人の
ものが20個、４人のものが７個、５人のものが１個、６
人のものが２個からなる。
圧同胞が存在する家族を特徴づけ、ユタ州の高等学校の
生徒40000人の親から集めた「健康家族系統］質問表か
ら試料化した。この集団に基礎を置く高血圧同胞群の選
択の特徴は、以前に記載されている（ウィリアムス（Wi
lliams）ら,1988年）。本研究の目的のために、病状
を、60才になる前に抗高血圧治療での治療を必要とする
高血圧と診断されるものであって、糖尿病あるいは腎不
全の見られないものと定義した。該研究は、309人の同
胞（女性165人、男性144人）からなる。３個の同胞対
は、白人（１個はアジア人、２個はヒスパニア人）であ
り、それらの重要な臨床的性質を表３に示す。132個の
罹患した高血圧同胞群は、２人のものが102個、３人の
ものが20個、４人のものが７個、５人のものが１個、６
人のものが２個からなる。
B.パリ 本態性高血圧の者が非常に多い高血圧家族の
選択を、以前記載されたごとく（コーボル（Corvol）
ら,1989年）、パリのブルセ病院（Broussais Hospita
l）の高血圧クリニック（Hypertension Clinic）に委託
された高血圧プロバンズを確認することにより行った。
以下の判断基準を満たす指標患者をもとに、83個のフラ
ンス人の同胞群を集めた：（１）60才になるまでに高血
圧を発症；（２）長期にわたり治療されている高血圧
（ｎ＝156）により、または連続した２回の来院におい
て95mmHgより高い拡張期血圧であって抗高血圧治療され
ていないこと（ｎ＝34、平均拡張期血圧＝103.8±13.1m
mHg）により定義される確立された高血圧；（３）臨床
的に必要とされた場合、広範囲の入院患者の処置により
確立される２次的な高血圧が見られないこと、および
（４）少なくとも一方の親および１人の同胞において若
いときに（60才になる前に）高血圧を発症した家族歴あ
り。血圧に影響しうる外因性因子を有する患者を除外
し、特に、１日４回アルコールを飲む者あるいは経口避
妊薬を服用している女性を除外した。他の除外のための
判断基準は、30kg/m2より大きい体重指標（BMI＝体重／
身長２）、糖尿病の存在、または腎不全とした。試料全
体は、２人のものが62個、３人のものが19個、４人のも
のが１個、５人のものが１個の83個の高血圧同胞群より
なっていた。すべての対象は、白人であり、それらの重
要な臨床的特徴を下表３にまとめてある。
選択を、以前記載されたごとく（コーボル（Corvol）
ら,1989年）、パリのブルセ病院（Broussais Hospita
l）の高血圧クリニック（Hypertension Clinic）に委託
された高血圧プロバンズを確認することにより行った。
以下の判断基準を満たす指標患者をもとに、83個のフラ
ンス人の同胞群を集めた：（１）60才になるまでに高血
圧を発症；（２）長期にわたり治療されている高血圧
（ｎ＝156）により、または連続した２回の来院におい
て95mmHgより高い拡張期血圧であって抗高血圧治療され
ていないこと（ｎ＝34、平均拡張期血圧＝103.8±13.1m
mHg）により定義される確立された高血圧；（３）臨床
的に必要とされた場合、広範囲の入院患者の処置により
確立される２次的な高血圧が見られないこと、および
（４）少なくとも一方の親および１人の同胞において若
いときに（60才になる前に）高血圧を発症した家族歴あ
り。血圧に影響しうる外因性因子を有する患者を除外
し、特に、１日４回アルコールを飲む者あるいは経口避
妊薬を服用している女性を除外した。他の除外のための
判断基準は、30kg/m2より大きい体重指標（BMI＝体重／
身長２）、糖尿病の存在、または腎不全とした。試料全
体は、２人のものが62個、３人のものが19個、４人のも
のが１個、５人のものが１個の83個の高血圧同胞群より
なっていた。すべての対象は、白人であり、それらの重
要な臨床的特徴を下表３にまとめてある。
C.対照 ソルトレイクシティーにおいて、140人の対
照は、CEPH（Centre d′Etude du polymorphisme Humai
n）データベース、すなわち、連鎖の研究（ダウセット
（Dausset）ら,1990年）の参考として役立つ大きな同胞
群サイズを有する健康な家族のランダムな名簿に包含さ
れるユタ州の家族の祖父母であると定義された。フラン
スの対照は、以前の症例対照研究（スブリエ（Soubrie
r）ら,1990年）によって選択された98人の健康な正常血
圧対象であった。両試料とも白人のみを含んでいた。
照は、CEPH（Centre d′Etude du polymorphisme Humai
n）データベース、すなわち、連鎖の研究（ダウセット
（Dausset）ら,1990年）の参考として役立つ大きな同胞
群サイズを有する健康な家族のランダムな名簿に包含さ
れるユタ州の家族の祖父母であると定義された。フラン
スの対照は、以前の症例対照研究（スブリエ（Soubrie
r）ら,1990年）によって選択された98人の健康な正常血
圧対象であった。両試料とも白人のみを含んでいた。
dx年令：診断年令 SBP:およびDBP:収縮期および拡張期血圧 B.M.I.:体重指標 特に断らない限り、値は、平均値±標準偏差で表され
る。
る。
実施例２ レニンとの連鎖の分析の一般的方法 A.一般的プロトコル 既に記載されている（ソウブリアー（Soubrier）ら、
1990）とおりに、フランス人集団を用いて実験プロトコ
ルを行った。簡単に言えば、２個のプローブを用いて３
個の制限酵素の二対立遺伝子（ジアレリック（dialleli
c））RFLPを検出した。1.1kbのヒトレニンcDNA断片（ソ
ウブリアー（Soubrier）ら、1983）を用いてHind III多
型性を検出し、レニン遺伝子の５′領域に位置する307b
pのゲノムDNA断片（ソウブリアー（Soubrier）ら、198
6）を用いてTaq IおよびHinf I多型性を検出した。これ
らの２個のプローブをランダムプライマー標識法（ファ
インバーグ（Feinberg）およびフォゲルシュタイン（Vo
gelstein）、1983）により高特異的活性（４×109〜８
×109cpm/mg）にて標識した。
1990）とおりに、フランス人集団を用いて実験プロトコ
ルを行った。簡単に言えば、２個のプローブを用いて３
個の制限酵素の二対立遺伝子（ジアレリック（dialleli
c））RFLPを検出した。1.1kbのヒトレニンcDNA断片（ソ
ウブリアー（Soubrier）ら、1983）を用いてHind III多
型性を検出し、レニン遺伝子の５′領域に位置する307b
pのゲノムDNA断片（ソウブリアー（Soubrier）ら、198
6）を用いてTaq IおよびHinf I多型性を検出した。これ
らの２個のプローブをランダムプライマー標識法（ファ
インバーグ（Feinberg）およびフォゲルシュタイン（Vo
gelstein）、1983）により高特異的活性（４×109〜８
×109cpm/mg）にて標識した。
ヒトゲノムDNAをTag I、Hinf IまたはHind III（ニュ
ー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolab
s）、マサチュセッツ州ビバリー（Beverly））で消化
し、アガロースゲル（0.7％または1.2％）による電気泳
動に付した。ナイロン膜（ハイボンド（Hybond−N+）、
アマシャム（Amersham））へのアルカリ移動、対応する
プローブへのハイブリダイゼーション、高緊縮条件下で
の洗浄、およびオートラジオグラフィー後、各制限エン
ドヌクレアーゼが、以下の二対立遺伝子（バイアレリッ
ク（biallelic））RFLPを検出した:11kbおよび9.8kbの
対立遺伝子（Taq I）、1.4kbおよび1.3kbの対立遺伝子
（Hinf I）および9.0kbおよび6.2kbの対立遺伝子（Hind
III）。これらの多型性およびそれらの頻度は、既に記
載されているもの（フロサード（Frossard）ら、1986a,
b;マシャラニ（Masharani）、1989;ナフチラン（Naftil
an）ら、1989）と一致した。
ー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolab
s）、マサチュセッツ州ビバリー（Beverly））で消化
し、アガロースゲル（0.7％または1.2％）による電気泳
動に付した。ナイロン膜（ハイボンド（Hybond−N+）、
アマシャム（Amersham））へのアルカリ移動、対応する
プローブへのハイブリダイゼーション、高緊縮条件下で
の洗浄、およびオートラジオグラフィー後、各制限エン
ドヌクレアーゼが、以下の二対立遺伝子（バイアレリッ
ク（biallelic））RFLPを検出した:11kbおよび9.8kbの
対立遺伝子（Taq I）、1.4kbおよび1.3kbの対立遺伝子
（Hinf I）および9.0kbおよび6.2kbの対立遺伝子（Hind
III）。これらの多型性およびそれらの頻度は、既に記
載されているもの（フロサード（Frossard）ら、1986a,
b;マシャラニ（Masharani）、1989;ナフチラン（Naftil
an）ら、1989）と一致した。
B.RFLP頻度の分析 各RFLPについて、120人の正常血圧者および102人の高
血圧者で既に確立されている遺伝子型頻度（ソウブリア
ー（Soubrier）ら、199）から対立遺伝子頻度を決定し
た。これらの頻度は、ハーディー−ワインベルグ平衡を
満たした。多型性常法含量（polymorphism information
content（PIC））により推定される各二対立遺伝子RFL
Pの情報性は、それぞれ0.16（Taq I）、0.33（Hind II
I）および0.27（Hinf I）であった。Hinf I−Hind III
とHinf I−Taq I多型性との間の連鎖不平衡にもかかわ
らず、３個のRFLPの組み合わせはマーカーの情報性の著
しい改良につながった（PIC＝0.65）（ヘテロ接合性の7
0％に相当）。
血圧者で既に確立されている遺伝子型頻度（ソウブリア
ー（Soubrier）ら、199）から対立遺伝子頻度を決定し
た。これらの頻度は、ハーディー−ワインベルグ平衡を
満たした。多型性常法含量（polymorphism information
content（PIC））により推定される各二対立遺伝子RFL
Pの情報性は、それぞれ0.16（Taq I）、0.33（Hind II
I）および0.27（Hinf I）であった。Hinf I−Hind III
とHinf I−Taq I多型性との間の連鎖不平衡にもかかわ
らず、３個のRFLPの組み合わせはマーカーの情報性の著
しい改良につながった（PIC＝0.65）（ヘテロ接合性の7
0％に相当）。
C.ハプロタイプの構築 ３個の二対立遺伝子RFLPの組み合わせからハプロタイ
プを推定した。各制限酵素部位の存在または非存在によ
り、８（23）個の異なるハプロタイプおよび27（33）個
の遺伝子型を定義することが可能であった。ハプロタイ
プ頻度は、ヒルの方法（ヒル（Hill）、1975）に従う最
大尤度技術により高血圧者の集団で既に推定されている
（ソウブリアー（Soubrier）ら、1990）。これらのハプ
ロタイプは、そのオーダー頻度により計数される、各対
立遺伝子が１個のハプロタイプに対応する新しい複対立
遺伝子系として使用した。これらの頻度により、レニン
遺伝子マーカーと高血圧との独立分離の仮定のもと、同
胞群により共有される対立遺伝子の数の期待値を算出す
ることが可能となった。
プを推定した。各制限酵素部位の存在または非存在によ
り、８（23）個の異なるハプロタイプおよび27（33）個
の遺伝子型を定義することが可能であった。ハプロタイ
プ頻度は、ヒルの方法（ヒル（Hill）、1975）に従う最
大尤度技術により高血圧者の集団で既に推定されている
（ソウブリアー（Soubrier）ら、1990）。これらのハプ
ロタイプは、そのオーダー頻度により計数される、各対
立遺伝子が１個のハプロタイプに対応する新しい複対立
遺伝子系として使用した。これらの頻度により、レニン
遺伝子マーカーと高血圧との独立分離の仮定のもと、同
胞群により共有される対立遺伝子の数の期待値を算出す
ることが可能となった。
D.同胞遺伝子型の比較 12人の同胞型においては、同一の家族の他者の分析に
もかかわらず、各ハプロタイプ（制限酵素部位における
二重または三重のヘテロ接合性の存在）を確信をもって
決定することは可能ではなかった。これらの場合、ハロ
タイプ頻度により相対的異親交配型確率を計算した。つ
いで、各同胞対の遺伝子型の確率が各親交配型に条件的
であると推定した。各同胞群について、それらの相対確
率により、同胞間の一致をすべての可能な一致の平均と
して計算した。
もかかわらず、各ハプロタイプ（制限酵素部位における
二重または三重のヘテロ接合性の存在）を確信をもって
決定することは可能ではなかった。これらの場合、ハロ
タイプ頻度により相対的異親交配型確率を計算した。つ
いで、各同胞対の遺伝子型の確率が各親交配型に条件的
であると推定した。各同胞群について、それらの相対確
率により、同胞間の一致をすべての可能な一致の平均と
して計算した。
57個の同胞群のうちの40個で１個または２個の親遺伝
子型が存在しないため、また、レニンマーカーの完全な
ヘテロ接合性が存在しないため、１個の同胞対により共
有される対立遺伝子は、系統により同一であるというよ
りむしろ状態により同一であると想定された。同胞遺伝
子型間の一致は、全体的（ibs＝１）、部分的（ibs＝1/
2）または無し（ibs＝０）となり得る。無連鎖の帰無仮
説のもとでは、一組の同胞対により共有される同一のマ
ーケット対立遺伝子の平均数（およびその分散）は、同
胞対の幾つかが同じ同胞群に属するか否かに影響されな
い（スアレズ（Suarez）ら、1983、ブラックウェルダー
（Blackwelder）およびエルストン（Elston）1985）。
従って、各同胞対についてレニン遺伝子型を比較し、す
べての異なる同胞対間の一致を加えることにより、各同
胞群に含まれるすべての情報を考慮した。
子型が存在しないため、また、レニンマーカーの完全な
ヘテロ接合性が存在しないため、１個の同胞対により共
有される対立遺伝子は、系統により同一であるというよ
りむしろ状態により同一であると想定された。同胞遺伝
子型間の一致は、全体的（ibs＝１）、部分的（ibs＝1/
2）または無し（ibs＝０）となり得る。無連鎖の帰無仮
説のもとでは、一組の同胞対により共有される同一のマ
ーケット対立遺伝子の平均数（およびその分散）は、同
胞対の幾つかが同じ同胞群に属するか否かに影響されな
い（スアレズ（Suarez）ら、1983、ブラックウェルダー
（Blackwelder）およびエルストン（Elston）1985）。
従って、各同胞対についてレニン遺伝子型を比較し、す
べての異なる同胞対間の一致を加えることにより、各同
胞群に含まれるすべての情報を考慮した。
E.期待一致値の比較 両同胞により共有される対立遺伝子の予想される割合
をランジ（Lange）（1986）によりコンピューター計算
した。対立遺伝子頻度を考慮してこの統計学的方法によ
りまず異なる可能な親交配型の確率を、ついで同胞間の
全部、半分または無一致の期待確率を計算する。従っ
て、無連鎖の帰無仮説に基づき、異なる同胞の大きさに
ついて、期待一致の平均および分散を計算するのが可能
である。最終のｔ統計は、異なる同胞群の寄与を加える
一面的（one−sided）なスチューデントの検定である。
をランジ（Lange）（1986）によりコンピューター計算
した。対立遺伝子頻度を考慮してこの統計学的方法によ
りまず異なる可能な親交配型の確率を、ついで同胞間の
全部、半分または無一致の期待確率を計算する。従っ
て、無連鎖の帰無仮説に基づき、異なる同胞の大きさに
ついて、期待一致の平均および分散を計算するのが可能
である。最終のｔ統計は、異なる同胞群の寄与を加える
一面的（one−sided）なスチューデントの検定である。
同胞群の大きさの確認において考えられる偏りを考慮
し、この統計の能力を最大にする異なるウエート（ｗ）
を提案している著者もいる。W1＝１であることに加え、
W2＝1/Var（Zs）1/2（スアレックス（Suarex）ら、198
3;モツロ（Motro）およびトンプソン（Thompson）、198
5）およびW3＝（ｓ−１）1/2/Var（Zs）1/2（ホッジ（H
odge）、1984）を試験した（式中、ｓは影響された同胞
群の大きさおよびＺを示し、該統計は各同胞群の大きさ
についての対立遺伝子の一致を反映する）（ランジ（La
nge）1986）。
し、この統計の能力を最大にする異なるウエート（ｗ）
を提案している著者もいる。W1＝１であることに加え、
W2＝1/Var（Zs）1/2（スアレックス（Suarex）ら、198
3;モツロ（Motro）およびトンプソン（Thompson）、198
5）およびW3＝（ｓ−１）1/2/Var（Zs）1/2（ホッジ（H
odge）、1984）を試験した（式中、ｓは影響された同胞
群の大きさおよびＺを示し、該統計は各同胞群の大きさ
についての対立遺伝子の一致を反映する）（ランジ（La
nge）1986）。
実施例３ ACEとの連鎖の分析についての一般的方法 A.遺伝子型 （１）hGH遺伝子の18番目および19番目のAlu因子にフラ
ンキングする公開されている配列（チェン（Chen）ら、
1989）:5′−ACTGCACTCCAGCCTCGGAG−３′（配列番号1
9）、５′−ACAAAAGTCCTTTCTCCAGAGCA−３′（配列番号
20）からhGH−A1819プライマーを設計した。１×PCR緩
衝液（シータス（Cetus））、125mM dNTP、150pmolプラ
イマー、2mCia 32P−dCTPを含有する全量20ml中100ngの
ゲノムDNAを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行っ
た。初めの変性工程（94℃で４分）後は、30サイクルの
各々は94℃で１分、63℃で45秒および72℃で30秒からな
り、ついで最終の延長工程（72℃で７分）を行った。テ
クネ（Techne）２装置を用いて、96ウェルのマイクロタ
イタープレート中PCR反応を行った。完了後、20mlのホ
ルムアミドを10mM EDTAと共に各反応に加え、94℃で５
分間変性後、30％ホルムアミド、7M尿素、135mMトリスH
Cl、45mMホウ酸および2.5mM EDTAを含有する６％アクリ
ルアミドゲル上にこの混合物1mlを積層した。70Wで４時
間ゲルを走らせ、オートラジオグラフィーのために６〜
12時間露出した。（２）ACE二対立遺伝子多型性は、1.5
％アガロースゲルにより分離された190および490bp対立
遺伝子でイントロン16中のセグメントの酵素的増幅によ
り遺伝子型決定した（リガト（Rigat）ら、1992）。
ンキングする公開されている配列（チェン（Chen）ら、
1989）:5′−ACTGCACTCCAGCCTCGGAG−３′（配列番号1
9）、５′−ACAAAAGTCCTTTCTCCAGAGCA−３′（配列番号
20）からhGH−A1819プライマーを設計した。１×PCR緩
衝液（シータス（Cetus））、125mM dNTP、150pmolプラ
イマー、2mCia 32P−dCTPを含有する全量20ml中100ngの
ゲノムDNAを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行っ
た。初めの変性工程（94℃で４分）後は、30サイクルの
各々は94℃で１分、63℃で45秒および72℃で30秒からな
り、ついで最終の延長工程（72℃で７分）を行った。テ
クネ（Techne）２装置を用いて、96ウェルのマイクロタ
イタープレート中PCR反応を行った。完了後、20mlのホ
ルムアミドを10mM EDTAと共に各反応に加え、94℃で５
分間変性後、30％ホルムアミド、7M尿素、135mMトリスH
Cl、45mMホウ酸および2.5mM EDTAを含有する６％アクリ
ルアミドゲル上にこの混合物1mlを積層した。70Wで４時
間ゲルを走らせ、オートラジオグラフィーのために６〜
12時間露出した。（２）ACE二対立遺伝子多型性は、1.5
％アガロースゲルにより分離された190および490bp対立
遺伝子でイントロン16中のセグメントの酵素的増幅によ
り遺伝子型決定した（リガト（Rigat）ら、1992）。
B.遺伝地図作成 ザ・デパートメント・オブ・ヒューマン・ジェネティ
ックス・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ユタ（th
e Department of Human Genetics of the University o
f Utah）にて遺伝地図に使用した染色体17マーカーを現
像した（ナカムラ（Nakamura）ら、1988）。リンケイジ
（LINKAGE）を用い、それぞれACEおよびhGHマーカーに
ついて35および11のCEPH参照家族の分析から、対様のロ
ッド得点（lod score）および組換え概算（ｒ）を決定
した（ラスロップ（Lathrop）ら、1984）。この対様の
分析からACEとhGHとの間の組換えは全く検出されなかっ
た。ついで、シリンク（CILINK）サブルーティーを用い
て染色体17マーカーのマップオーダーおよび組換え推定
を決定した。hGHを包含するすべての他のマーカー間の
オーダーおよび組換え頻度がそれらの最大尤度値で固定
されているこの遺伝地図との関連によりACEの置換を決
定した。
ックス・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ユタ（th
e Department of Human Genetics of the University o
f Utah）にて遺伝地図に使用した染色体17マーカーを現
像した（ナカムラ（Nakamura）ら、1988）。リンケイジ
（LINKAGE）を用い、それぞれACEおよびhGHマーカーに
ついて35および11のCEPH参照家族の分析から、対様のロ
ッド得点（lod score）および組換え概算（ｒ）を決定
した（ラスロップ（Lathrop）ら、1984）。この対様の
分析からACEとhGHとの間の組換えは全く検出されなかっ
た。ついで、シリンク（CILINK）サブルーティーを用い
て染色体17マーカーのマップオーダーおよび組換え推定
を決定した。hGHを包含するすべての他のマーカー間の
オーダーおよび組換え頻度がそれらの最大尤度値で固定
されているこの遺伝地図との関連によりACEの置換を決
定した。
C.同胞対分析 多様な同胞からのすべての同胞対は独立していると考
えた。また、統計は共有対立遺伝子の平均数に基づくも
のであった（ブラックウェルダー（Blackwelder）およ
びエルストン（Elston）、1985）。親遺伝子型の非存在
下、対立遺伝子の共有をi.b.s.として評価した。それぞ
れの同胞群の大きさについて、i.b.s.で共有されている
対立遺伝子の平均数の期待値およびその分散を既に記載
されている（ランジ（Lange）、1986）とおりに算出し
た。結果は、共有されている対立遺伝子（95％信頼区画
±6.9％）の0.08％過剰を示す。等しいウエートを与え
られたすべての対について、一面的なｔ値は0.02（ｐ＝
0.45）である。ホッジ（Hodge）（ホッジ、1984）によ
り多様な同胞の寄与を加重することにより、最終的なｔ
値0.01（Ｐ＝0.49）が得られる。
えた。また、統計は共有対立遺伝子の平均数に基づくも
のであった（ブラックウェルダー（Blackwelder）およ
びエルストン（Elston）、1985）。親遺伝子型の非存在
下、対立遺伝子の共有をi.b.s.として評価した。それぞ
れの同胞群の大きさについて、i.b.s.で共有されている
対立遺伝子の平均数の期待値およびその分散を既に記載
されている（ランジ（Lange）、1986）とおりに算出し
た。結果は、共有されている対立遺伝子（95％信頼区画
±6.9％）の0.08％過剰を示す。等しいウエートを与え
られたすべての対について、一面的なｔ値は0.02（ｐ＝
0.45）である。ホッジ（Hodge）（ホッジ、1984）によ
り多様な同胞の寄与を加重することにより、最終的なｔ
値0.01（Ｐ＝0.49）が得られる。
実施例４ AGTとの連鎖の分析の一般的方法 A.AGT遺伝子座でのGT対立遺伝子の遺伝子型決定 AGT遺伝子型は、AGT遺伝子の３′フランキング領域に
おける高度に情報的なジアヌクレオチド反復により確立
されている（コテレブツェフ（Kotelevtsev）ら、199
1）。パリ標本に用いるプライマーは公開されていると
おりであり（Ｋプライマー）、ユタ州で特徴づけされて
いる遺伝子型について、（GT）反復により遠いプライマ
ーを設計した： （Ｕ−プライマー）（これらは167bp断片を増幅させ
る）。両実験室にて、50mM KCl、5mMトリス−HCl、0.01
％ゼラチン、1.5mmol MgCl2、125μM dNTP、20pmolの各
非標識プライマー、10pmolの１つの32P末端標識プライ
マーおよび0.5UのTagポリメラーゼ（パーキン−エルマ
ー・シータス・ノーウォーク（Perkin−Elmer Cetus No
rwalk）、コネチカット州）を含有する全量20μｌ中の8
0ngのゲノムDNAを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
を行った。初めの変性工程（94℃で４分）後、30サイク
ルの各々は94℃で１分、55℃で１分および72℃で１分
（Ｋ−プライマー）または94℃で45秒、62℃で45秒およ
び72℃で30秒（Ｕ−プライマー）よりなるものであっ
た。完了後、各反応に20μｌのホルムアミドを10mM EDT
Aと共に加え、94℃で５分間変性後、この混合物の１μ
ｌを、30％ホルムアミド、7M尿素、135mMトリスHCl、45
mMホウ酸および2.5mM EDTA（pH7.8）を含有する６％ア
クリルアミドゲル上に積層した。70Wで４時間ゲルを走
らせ、オートラジオグラフィーのために６〜12時間露出
させた。
おける高度に情報的なジアヌクレオチド反復により確立
されている（コテレブツェフ（Kotelevtsev）ら、199
1）。パリ標本に用いるプライマーは公開されていると
おりであり（Ｋプライマー）、ユタ州で特徴づけされて
いる遺伝子型について、（GT）反復により遠いプライマ
ーを設計した： （Ｕ−プライマー）（これらは167bp断片を増幅させ
る）。両実験室にて、50mM KCl、5mMトリス−HCl、0.01
％ゼラチン、1.5mmol MgCl2、125μM dNTP、20pmolの各
非標識プライマー、10pmolの１つの32P末端標識プライ
マーおよび0.5UのTagポリメラーゼ（パーキン−エルマ
ー・シータス・ノーウォーク（Perkin−Elmer Cetus No
rwalk）、コネチカット州）を含有する全量20μｌ中の8
0ngのゲノムDNAを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
を行った。初めの変性工程（94℃で４分）後、30サイク
ルの各々は94℃で１分、55℃で１分および72℃で１分
（Ｋ−プライマー）または94℃で45秒、62℃で45秒およ
び72℃で30秒（Ｕ−プライマー）よりなるものであっ
た。完了後、各反応に20μｌのホルムアミドを10mM EDT
Aと共に加え、94℃で５分間変性後、この混合物の１μ
ｌを、30％ホルムアミド、7M尿素、135mMトリスHCl、45
mMホウ酸および2.5mM EDTA（pH7.8）を含有する６％ア
クリルアミドゲル上に積層した。70Wで４時間ゲルを走
らせ、オートラジオグラフィーのために６〜12時間露出
させた。
各高血圧患者において及びそれらの一親等の親類117
人において遺伝子型を特徴づけした。パリからの正常血
圧対照コーカサス人98人、ソルトレークシティーからの
CEPH系統のコーカサス人祖父母140人および高血圧指標
例の両組において対立遺伝子頻度を評価した。該４群各
々において少なくとも10個の対立遺伝子が認められ、該
マーカーの高いヘテロ接合性（80％）が確認された。パ
リからの対照と高血圧者の間に対立遺伝子頻度における
有意差は全く認められず（χ2 6＝7.7、ｐ＝0.26）、こ
の標本における連鎖分析のための標準として対照におけ
る頻度を用いた。対照的に、ソルトレークシティーから
の対照および高血圧者は、対立遺伝子における有意差を
示したχ2 6＝17.1、ｐ＜0.01）。これは主として、最も
一般的な対立遺伝子の頻度が高血圧者（0.36）において
は対照（0.40）におけるより低いからである。連鎖試験
での偽偏倚を避けるために、高血圧者指標例において評
価された頻度をソルトレークシティー標本の分析に用い
た。
人において遺伝子型を特徴づけした。パリからの正常血
圧対照コーカサス人98人、ソルトレークシティーからの
CEPH系統のコーカサス人祖父母140人および高血圧指標
例の両組において対立遺伝子頻度を評価した。該４群各
々において少なくとも10個の対立遺伝子が認められ、該
マーカーの高いヘテロ接合性（80％）が確認された。パ
リからの対照と高血圧者の間に対立遺伝子頻度における
有意差は全く認められず（χ2 6＝7.7、ｐ＝0.26）、こ
の標本における連鎖分析のための標準として対照におけ
る頻度を用いた。対照的に、ソルトレークシティーから
の対照および高血圧者は、対立遺伝子における有意差を
示したχ2 6＝17.1、ｐ＜0.01）。これは主として、最も
一般的な対立遺伝子の頻度が高血圧者（0.36）において
は対照（0.40）におけるより低いからである。連鎖試験
での偽偏倚を避けるために、高血圧者指標例において評
価された頻度をソルトレークシティー標本の分析に用い
た。
B.高血圧同胞のパリにおける連鎖の分析 同胞内の分離事象の条件独立（スアレズ（Suarez）お
よびファン・エーデヴェフ（Van Eerdewegh）、1984）
は、合計379対の高血圧同胞の生成につながった。親表
現型を直接的に決定、またはフランス人同胞群10人のう
ちの非高血圧同胞の遺伝子型から推量した。これらの同
胞群においては、同胞が共有している対立遺伝子は、家
系により同一である（j.b.d.）とみなし、適切な統計学
的比較を行った（独立下、対当たりに共有されている1.
0対立遺伝子の平均）。親遺伝子型の非存在下（すべて
のユタ同胞、73人のフランス同胞）、同胞が共有してい
る対立遺伝子を、状態により同一である（i.b.s.）と評
価した（スアレズ（Suarez）ら、1978;ブラックウェル
ダー（Blackwelder）およびエルストン（Elston）、198
5;ランジ（Lange）、1986）。各同胞群の大きさについ
て、i.b.s.で共有されている対立遺伝子の平均数の期待
値およびその分散をランジ（Lange）（1986）に従い算
出した。各同胞の同胞の対が共有する対立遺伝子の観察
された、また、期待された平均数の間の比較は、片側ス
チューデントｔ−検定を与えた。各大きさの同胞群の寄
与をホッジ（Hodge、1984）に従い操作した。複数の比
較に関連した自由度の節減管理を与えるよう、データの
前もって決められた分配を連続的に検査した。
よびファン・エーデヴェフ（Van Eerdewegh）、1984）
は、合計379対の高血圧同胞の生成につながった。親表
現型を直接的に決定、またはフランス人同胞群10人のう
ちの非高血圧同胞の遺伝子型から推量した。これらの同
胞群においては、同胞が共有している対立遺伝子は、家
系により同一である（j.b.d.）とみなし、適切な統計学
的比較を行った（独立下、対当たりに共有されている1.
0対立遺伝子の平均）。親遺伝子型の非存在下（すべて
のユタ同胞、73人のフランス同胞）、同胞が共有してい
る対立遺伝子を、状態により同一である（i.b.s.）と評
価した（スアレズ（Suarez）ら、1978;ブラックウェル
ダー（Blackwelder）およびエルストン（Elston）、198
5;ランジ（Lange）、1986）。各同胞群の大きさについ
て、i.b.s.で共有されている対立遺伝子の平均数の期待
値およびその分散をランジ（Lange）（1986）に従い算
出した。各同胞の同胞の対が共有する対立遺伝子の観察
された、また、期待された平均数の間の比較は、片側ス
チューデントｔ−検定を与えた。各大きさの同胞群の寄
与をホッジ（Hodge、1984）に従い操作した。複数の比
較に関連した自由度の節減管理を与えるよう、データの
前もって決められた分配を連続的に検査した。
C.分子変異体の探索 アンジオテンシン遺伝子のセグメントの酵素的増幅 ヒ
トアンジオテンシン遺伝子の公知のゲノム構造から（ガ
イラード（Gaillard）ら、1989）、主調節因子および該
遺伝子の５個のエキソンを含有する５′領域を覆うため
に10個の異なる組のオリゴヌクレオチド（表１）を設計
した。それらは、スプライス部位のいずれかの側の少な
くとも15bpのイントロン配列を含む200〜300bp長の生成
物を生成するように選択した。
トアンジオテンシン遺伝子の公知のゲノム構造から（ガ
イラード（Gaillard）ら、1989）、主調節因子および該
遺伝子の５個のエキソンを含有する５′領域を覆うため
に10個の異なる組のオリゴヌクレオチド（表１）を設計
した。それらは、スプライス部位のいずれかの側の少な
くとも15bpのイントロン配列を含む200〜300bp長の生成
物を生成するように選択した。
一本鎖DNAのコンフォメーション分析のため、50mM KC
l、5mMトリス−HCl（pH8.3）、0.01％ゼラチン、1.5mmo
l MgCl2、125μM dNTP、20pmolの各非標識プライマー、
0.5UのTagポリメラーゼおよび0.15μｌの［α−32P］dC
TP（3000Ci/ml）を含有する全量20μｌ中80ngのゲノムD
NAを用いて標本を酵素的に増幅した。
l、5mMトリス−HCl（pH8.3）、0.01％ゼラチン、1.5mmo
l MgCl2、125μM dNTP、20pmolの各非標識プライマー、
0.5UのTagポリメラーゼおよび0.15μｌの［α−32P］dC
TP（3000Ci/ml）を含有する全量20μｌ中80ngのゲノムD
NAを用いて標本を酵素的に増幅した。
非変性条件下でのDNA断片の電気泳動 95％ホルムアミ
ド、20mM EDTA、0.05％ブロモフェノール・ブルーおよ
び0.05％キシレンシアノールを含有する溶液中でPCR生
成物を５倍希釈した。90℃で４分間変性後、該標本を氷
上に載せ、0.5×TBE（１×TBE＝90Mmトリスボラート、p
H7.8、2mM EDTA）（オリタ（Orita）ら、1989）を含有
する1.5μｌのアリコートを５％非変性ポリアクリルア
ミドゲル（49:1ポリアクリルアミド：メチレン−ビスア
クリルアミド）上に積層した。少なくとも３個の条件下
（室温および４℃での10％グリセロールゲル、および４
℃でのグリセロールなしのゲル）で標本の各組を電気泳
動に付した。最初の２個の条件については、500ボル
ト、定常電圧で14〜20時間で電気泳動を行い、３個目の
ものについては、15W、定常電力で４〜５時間電気泳動
を行った。ゲルを乾燥し、強化スクリーンと共に６〜12
時間オートラジオグラフィーに付した。
ド、20mM EDTA、0.05％ブロモフェノール・ブルーおよ
び0.05％キシレンシアノールを含有する溶液中でPCR生
成物を５倍希釈した。90℃で４分間変性後、該標本を氷
上に載せ、0.5×TBE（１×TBE＝90Mmトリスボラート、p
H7.8、2mM EDTA）（オリタ（Orita）ら、1989）を含有
する1.5μｌのアリコートを５％非変性ポリアクリルア
ミドゲル（49:1ポリアクリルアミド：メチレン−ビスア
クリルアミド）上に積層した。少なくとも３個の条件下
（室温および４℃での10％グリセロールゲル、および４
℃でのグリセロールなしのゲル）で標本の各組を電気泳
動に付した。最初の２個の条件については、500ボル
ト、定常電圧で14〜20時間で電気泳動を行い、３個目の
ものについては、15W、定常電力で４〜５時間電気泳動
を行った。ゲルを乾燥し、強化スクリーンと共に６〜12
時間オートラジオグラフィーに付した。
電気泳動変異体の直接配列決定 野生型に関して移動度
変異を表す個々の帯を、ハタ（Hata）ら（1990）の記載
をいくつか修飾して配列決定した。乾燥ゲルから各帯を
切り取り、100μl H2Oに懸濁し、37℃で１時間インキュ
ベートした。普遍的および逆M13配列決定プライマーに
相当するモチーフを有する５′末端で特異的プライマー
を増大させ、２μｌのアリコートを100μｌの反応容量
中で酵素的増幅に付した。この増幅から生じた二本鎖生
成物を低融点アガロースゲル上電気泳動により単離し、
ジーンクリーン（GeneClean）（バイオ（Bio）101、ラ
・ジョラ（La Jolla）、カリフォルニア州）を用いて精
製した。第２ラウンドの酵素増幅を、減少させた量のプ
ライマー（５ピコモル）およびdNTP（50μＭ）を用いて
同様の条件下通常に行い、増幅された生成物をセントリ
コン（Centricon）100カラム（アミコン（Amicon）、マ
サチューセッツ州ビバリー（Beverly））でスピン透析
した。蛍光M13プライマー、Taqポリメラーゼおよび製造
者（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）、カリフォルニア州フォスター・シティー（Foster
City））により供給された熱回転プロトコルを用い
て、ABI373A DNAシークエンサー上、二本鎖DNAの直接配
列決定を行った。
変異を表す個々の帯を、ハタ（Hata）ら（1990）の記載
をいくつか修飾して配列決定した。乾燥ゲルから各帯を
切り取り、100μl H2Oに懸濁し、37℃で１時間インキュ
ベートした。普遍的および逆M13配列決定プライマーに
相当するモチーフを有する５′末端で特異的プライマー
を増大させ、２μｌのアリコートを100μｌの反応容量
中で酵素的増幅に付した。この増幅から生じた二本鎖生
成物を低融点アガロースゲル上電気泳動により単離し、
ジーンクリーン（GeneClean）（バイオ（Bio）101、ラ
・ジョラ（La Jolla）、カリフォルニア州）を用いて精
製した。第２ラウンドの酵素増幅を、減少させた量のプ
ライマー（５ピコモル）およびdNTP（50μＭ）を用いて
同様の条件下通常に行い、増幅された生成物をセントリ
コン（Centricon）100カラム（アミコン（Amicon）、マ
サチューセッツ州ビバリー（Beverly））でスピン透析
した。蛍光M13プライマー、Taqポリメラーゼおよび製造
者（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）、カリフォルニア州フォスター・シティー（Foster
City））により供給された熱回転プロトコルを用い
て、ABI373A DNAシークエンサー上、二本鎖DNAの直接配
列決定を行った。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ション 直接配列決定により同定される分子変異体の存
在を確認するため、および遺伝子型を決定するために、
オリゴヌクレオチド特異的ハイブリダイゼーションを行
った。ゲノムDNAの酵素的増幅後、0.4N NaOHで５分間各
生成物を変性させ、ついでナイロン膜（Hybond+,Amersh
am,Arlington Heights,I11）上で２系統同様にスポット
し、3M酢酸ナトリウムで中和し、UV光で架橋させた。つ
いで、各膜を、野生型および変異配列に相当する32P末
端標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさ
せた。７％ポリエチレングリコール、10％SDS、50mMリ
ン酸ナトリウム、pH7.0中で６時間ハイブリダイゼーシ
ョン後、該膜を、該プローブの算出された融点に相当す
る緊縮で６×SSC、0.1％SDS中洗浄した。６個の分子変
異体をかかる手法に付した（表２の変異体３、５、７、
９、10、15）。140のユタ対照において、およびユタか
らの36のより重症の高血圧指標例において、Pst I部位
（クナプリ（Kunapuli）およびクマー（Kumar）、198
6）の存在または非存在により変異体14（L359M）を分析
した。
ション 直接配列決定により同定される分子変異体の存
在を確認するため、および遺伝子型を決定するために、
オリゴヌクレオチド特異的ハイブリダイゼーションを行
った。ゲノムDNAの酵素的増幅後、0.4N NaOHで５分間各
生成物を変性させ、ついでナイロン膜（Hybond+,Amersh
am,Arlington Heights,I11）上で２系統同様にスポット
し、3M酢酸ナトリウムで中和し、UV光で架橋させた。つ
いで、各膜を、野生型および変異配列に相当する32P末
端標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさ
せた。７％ポリエチレングリコール、10％SDS、50mMリ
ン酸ナトリウム、pH7.0中で６時間ハイブリダイゼーシ
ョン後、該膜を、該プローブの算出された融点に相当す
る緊縮で６×SSC、0.1％SDS中洗浄した。６個の分子変
異体をかかる手法に付した（表２の変異体３、５、７、
９、10、15）。140のユタ対照において、およびユタか
らの36のより重症の高血圧指標例において、Pst I部位
（クナプリ（Kunapuli）およびクマー（Kumar）、198
6）の存在または非存在により変異体14（L359M）を分析
した。
D.GTマーカーとAGTの変異体との間の連鎖不平衡 GT対立遺伝子の、および残基174および235に認められ
る変異のハプロタイプ分布を最大尤度により評価した。
M235対立遺伝子は、もっとも一般的なGT対立遺伝子（16
反復;GT16）と強い連鎖不平衡にあり、M235T変異体は広
い範囲のGT対立遺伝子と組み合わされていることが判明
した。M235とGT16との間の関連は、より初期に注目され
ていた高血圧者より大きな、対照のGT16頻度と一致し
た。M235T変異体は種々のGT対立遺伝子と関連して生じ
ているため、M235Tのより大きな頻度しばしば、高血圧
とGTマーカーとの偽遺伝連鎖を誘導しない。
る変異のハプロタイプ分布を最大尤度により評価した。
M235対立遺伝子は、もっとも一般的なGT対立遺伝子（16
反復;GT16）と強い連鎖不平衡にあり、M235T変異体は広
い範囲のGT対立遺伝子と組み合わされていることが判明
した。M235とGT16との間の関連は、より初期に注目され
ていた高血圧者より大きな、対照のGT16頻度と一致し
た。M235T変異体は種々のGT対立遺伝子と関連して生じ
ているため、M235Tのより大きな頻度しばしば、高血圧
とGTマーカーとの偽遺伝連鎖を誘導しない。
E.アンジオテンシンの検定 半精製ヒトレニンを添加後、血漿アンジオテンシノー
ゲンをアンジオテンシンＩの生成として測定して、アン
ジオテンシンＩへの完全な切断を得た。遊離されたアン
ジオテンシンＩの量は、ラジオイムノアッセイにより測
定し、アンジオテンシンノーゲンをngA−I/mlで表した
（プロウイン（Plouin）ら、1989）。
ゲンをアンジオテンシンＩの生成として測定して、アン
ジオテンシンＩへの完全な切断を得た。遊離されたアン
ジオテンシンＩの量は、ラジオイムノアッセイにより測
定し、アンジオテンシンノーゲンをngA−I/mlで表した
（プロウイン（Plouin）ら、1989）。
実施例５ レニンおよび高血圧の間の連鎖分析 一次志願者のレニン、および高血圧の間の連鎖の分析
を実施例２に記載の方法を用いて行った。
を実施例２に記載の方法を用いて行った。
A.RFLP対立遺伝子およびハプロタイプ頻度 同様のRFLP頻度を57対の高血圧同胞発端者にて測定
し、高血圧性基準群を最初に確認した。すべてのRFLPは
ハーディ−ウェインバーグ平衡にあり、２つの群にて同
様の割合が見られた。かくして、同じハプロタイプ頻度
が、これら３つのRFLPから、８つの可能なハプロタイプ
と70％ヘテロ接合性で推論された。６種のより頻度の高
いハプロタイプが133人の高血圧性同胞にて測定され
た。
し、高血圧性基準群を最初に確認した。すべてのRFLPは
ハーディ−ウェインバーグ平衡にあり、２つの群にて同
様の割合が見られた。かくして、同じハプロタイプ頻度
が、これら３つのRFLPから、８つの可能なハプロタイプ
と70％ヘテロ接合性で推論された。６種のより頻度の高
いハプロタイプが133人の高血圧性同胞にて測定され
た。
B.各同胞群の大きさによる測定と期待されるコンコーダ
ンス 連鎖がないという仮説の下では、98対の高血圧同胞対
は、133.4（1.36±0.60）が期待されるが、−0.04〜＋
0.20の95％信頼区間で平均0.08過剰の対立遺伝子に対応
する、141ibs対立遺伝子（平均±１標準偏差＝1.44±0.
60）を共有した。
ンス 連鎖がないという仮説の下では、98対の高血圧同胞対
は、133.4（1.36±0.60）が期待されるが、−0.04〜＋
0.20の95％信頼区間で平均0.08過剰の対立遺伝子に対応
する、141ibs対立遺伝子（平均±１標準偏差＝1.44±0.
60）を共有した。
各同胞群の大きさにより、63、49および26の対立遺伝
子が、各々、41の対、13のトリオ（39対）および３のカ
ルテット（18対）により共有された。その対応する平均
の測定Ｚコンコーダンスは、0.77、1.89および4.33であ
った。片側ｔ統計にて計算した、測定および期待コンコ
ーダンスの比較は顕著ではなかった（ｔ＝0.51、Ｐ＝0.
30）。
子が、各々、41の対、13のトリオ（39対）および３のカ
ルテット（18対）により共有された。その対応する平均
の測定Ｚコンコーダンスは、0.77、1.89および4.33であ
った。片側ｔ統計にて計算した、測定および期待コンコ
ーダンスの比較は顕著ではなかった（ｔ＝0.51、Ｐ＝0.
30）。
C.同胞群の大きさによる重さ 単に41の同胞対を考えた場合、共有するibs対立遺伝
子の過剰（13％）が顕著であった（63の測定対立遺伝子
vs.55.8の期待対立遺伝子、ｔ＝1.93、ｐ＜0.03）。し
かし、これは期待されるよりも少ない４対立遺伝子を有
する13のトリオおよびわずか1.5だけ過剰の対立遺伝子
を有する３のカルテットを含めることにより否定され
る。
子の過剰（13％）が顕著であった（63の測定対立遺伝子
vs.55.8の期待対立遺伝子、ｔ＝1.93、ｐ＜0.03）。し
かし、これは期待されるよりも少ない４対立遺伝子を有
する13のトリオおよびわずか1.5だけ過剰の対立遺伝子
を有する３のカルテットを含めることにより否定され
る。
これら変化は、同胞群を考慮する種々の重さにしたが
って、種々のレベルのｔ値により表される。w1＝１でｔ
は0.52と計算されたが、大きな同胞群に適用される重さ
を減少させるw2およびw3を使用すると、有意性はないま
まであるが、ｔ統計値を増加させた:t2＝1.34、Ｐ＝0.0
9およびt3＝1.16、Ｐ＝0.12。
って、種々のレベルのｔ値により表される。w1＝１でｔ
は0.52と計算されたが、大きな同胞群に適用される重さ
を減少させるw2およびw3を使用すると、有意性はないま
まであるが、ｔ統計値を増加させた:t2＝1.34、Ｐ＝0.0
9およびt3＝1.16、Ｐ＝0.12。
D.検討 57の独立性同胞群からの98対の高血圧同胞対を分析し
た。家族性高血圧に対して高い素質（少なくとも一人の
親と一人の同胞）を有し、該疾患に初期（40.7±12歳）
に罹患し、確立された本態性高血圧であるならば、その
高血圧性同胞を選択した。レニン遺伝子全体に位置され
た３種の異なるRFLP（Tag I、Hind III、Hinf I）を遺
伝マーカーとして用いた。これら３種のRFLPを組み合わ
せて、８種のハプロタイプを定義し、そのうち６種を観
察した。対立遺伝子頻度は102人の高血圧対象を分析す
ることにより以前に決定されており（ソブリア（Soubri
er）ら、1990）、57人の高血圧同胞発端者にて確認され
た。このレニンマーカーの不完全ヘテロ接合性（70％）
および57人の同胞群のうち40人に両親の情報がないこと
を考慮した場合、罹患した同胞により共有されている対
立遺伝子は状態により同一であると考えられ、適当な統
計試験を用いた（ラング（Lange）1986）。全体、半分
または不存在の対立遺伝子コンコーダンスの測定頻度
と、レニン遺伝子と高血圧の間に連鎖がないという仮説
の下、期待される頻度との間には、統計的に有意な差異
は見られなかった。それらの対を独立して分析した場
合、これらの割合は、各々、カイ自乗（2df）＝1.21を
付与する、測定値vs.期待値について、0.50vs.0.45、0.
43vs.0.48および0.07vs.0.07であり、有意ではなかっ
た。同胞により共有されるマーカー対立遺伝子の平均数
を用い（ブラックウェルダーおよびエルストン（Blackw
elderおよびElston）,1985）、罹患した同胞群の大きさ
にしたがって各家族にて得られた情報を加える、最適な
統計操作は、98対の高血圧同胞により共有されるi.b.s.
レニン対立遺伝子が5.7％過剰であるだけで、有意性を
示さなかった（ｔ＝0.51、Ｐ＝0.30）。各同胞群の大き
さについて、コンコーダンス指数の変数の平方根の逆数
を用いて試験能を最大限とした場合（モターおよびトム
ソン（MotorおよびThomson）1985）、有意性はないまま
であるが（Ｐ＝0.09）、ｔ値を増加させた（ｔ＝1.3
1）。かくして、レニンと高血圧症の間に関連性は見い
だされなかった。
た。家族性高血圧に対して高い素質（少なくとも一人の
親と一人の同胞）を有し、該疾患に初期（40.7±12歳）
に罹患し、確立された本態性高血圧であるならば、その
高血圧性同胞を選択した。レニン遺伝子全体に位置され
た３種の異なるRFLP（Tag I、Hind III、Hinf I）を遺
伝マーカーとして用いた。これら３種のRFLPを組み合わ
せて、８種のハプロタイプを定義し、そのうち６種を観
察した。対立遺伝子頻度は102人の高血圧対象を分析す
ることにより以前に決定されており（ソブリア（Soubri
er）ら、1990）、57人の高血圧同胞発端者にて確認され
た。このレニンマーカーの不完全ヘテロ接合性（70％）
および57人の同胞群のうち40人に両親の情報がないこと
を考慮した場合、罹患した同胞により共有されている対
立遺伝子は状態により同一であると考えられ、適当な統
計試験を用いた（ラング（Lange）1986）。全体、半分
または不存在の対立遺伝子コンコーダンスの測定頻度
と、レニン遺伝子と高血圧の間に連鎖がないという仮説
の下、期待される頻度との間には、統計的に有意な差異
は見られなかった。それらの対を独立して分析した場
合、これらの割合は、各々、カイ自乗（2df）＝1.21を
付与する、測定値vs.期待値について、0.50vs.0.45、0.
43vs.0.48および0.07vs.0.07であり、有意ではなかっ
た。同胞により共有されるマーカー対立遺伝子の平均数
を用い（ブラックウェルダーおよびエルストン（Blackw
elderおよびElston）,1985）、罹患した同胞群の大きさ
にしたがって各家族にて得られた情報を加える、最適な
統計操作は、98対の高血圧同胞により共有されるi.b.s.
レニン対立遺伝子が5.7％過剰であるだけで、有意性を
示さなかった（ｔ＝0.51、Ｐ＝0.30）。各同胞群の大き
さについて、コンコーダンス指数の変数の平方根の逆数
を用いて試験能を最大限とした場合（モターおよびトム
ソン（MotorおよびThomson）1985）、有意性はないまま
であるが（Ｐ＝0.09）、ｔ値を増加させた（ｔ＝1.3
1）。かくして、レニンと高血圧症の間に関連性は見い
だされなかった。
実施例６ ACEと高血圧の間の連鎖分析 ACEと高血圧の間の連鎖分析を実施例３に記載の方法
を用いて行った。
を用いて行った。
A.ACE成長ホルモン連鎖 同胞対連鎖試験は、臨界的に、マーカー遺伝子座での
高ヘテロ接合性に依存するため（ビショップおよびウィ
ルアムソン（BishopおよびWilliamson）,1990）、ACE遺
伝子座をスパンするコスミドはクローンされるが、情報
性単純配列繰り返し単位を同定できなかった（データは
表示せず）。ACE遺伝子は、in situ雑種形成により遺伝
学的に十分に特徴化された染色体領域（ナカムラ（Naka
mura）ら、1988）の17q23（マテイ（Mattei）ら、198
9）に局在化されるため、ACE遺伝子座を、総当たり多形
性を用いる35のCEPH家系にて、連鎖分析により遺伝地図
上に配列した。（リガト（Rigat）ら,1990;リガトら,19
92）。分析はマーカーfLB17.14、pCMM86およびPM8に対
して強い連鎖を示した。多遺伝子座分析は、ACE遺伝子
座をpCMM86とPM8の間に局在化した（この区間における
局在化を助成するオッズ比は2000:1）。in situ雑種形
成により同一部位に局在化されたhGH遺伝子（ハーパー
（harper）ら,1982）もまた、これらのマーカーに対し
て強い連鎖を示した（プタセク（Ptacek）ら,1991）。
その配列（チェン（Chen）ら,1989）は、この遺伝子座
の18番目と19番目のAlu繰り返し配列の間に置かれてい
るAAAGとAG繰り返し単位に基づく高多形性マーカーの発
達を可能とした。hGH−A1819マーカーは、132人の関連
のない対象にて94.6％のヘテロ接合性および24の対立遺
伝子を示した。類似するhGHマーカーが、22人の関連し
ない対象にて82％のヘテロ接合性を示すと報告されてい
る（ポリメロポウラス（Polymeropoulos）ら,1991）。1
1のCEPH家系にてこのマーカーを用いるペアーワイズ（p
airwise）連鎖分析は、109の還元分裂にて、hGHとACE遺
伝子座が完全に連鎖していることを示した（ロッドの対
数（lod）値＝11.68）。多遺伝子座分析により、ACEとh
GHの遺伝子座の間の遺伝子組換えについて、95％の信頼
区間でこれら遺伝子座の間の完全な連鎖を確認した。こ
の緊密な連鎖により、ほとんどまたはまったく効力を喪
失することなく、連鎖分析におけるACE遺伝子座の代わ
りにhGHマーカーを使用することができる。
高ヘテロ接合性に依存するため（ビショップおよびウィ
ルアムソン（BishopおよびWilliamson）,1990）、ACE遺
伝子座をスパンするコスミドはクローンされるが、情報
性単純配列繰り返し単位を同定できなかった（データは
表示せず）。ACE遺伝子は、in situ雑種形成により遺伝
学的に十分に特徴化された染色体領域（ナカムラ（Naka
mura）ら、1988）の17q23（マテイ（Mattei）ら、198
9）に局在化されるため、ACE遺伝子座を、総当たり多形
性を用いる35のCEPH家系にて、連鎖分析により遺伝地図
上に配列した。（リガト（Rigat）ら,1990;リガトら,19
92）。分析はマーカーfLB17.14、pCMM86およびPM8に対
して強い連鎖を示した。多遺伝子座分析は、ACE遺伝子
座をpCMM86とPM8の間に局在化した（この区間における
局在化を助成するオッズ比は2000:1）。in situ雑種形
成により同一部位に局在化されたhGH遺伝子（ハーパー
（harper）ら,1982）もまた、これらのマーカーに対し
て強い連鎖を示した（プタセク（Ptacek）ら,1991）。
その配列（チェン（Chen）ら,1989）は、この遺伝子座
の18番目と19番目のAlu繰り返し配列の間に置かれてい
るAAAGとAG繰り返し単位に基づく高多形性マーカーの発
達を可能とした。hGH−A1819マーカーは、132人の関連
のない対象にて94.6％のヘテロ接合性および24の対立遺
伝子を示した。類似するhGHマーカーが、22人の関連し
ない対象にて82％のヘテロ接合性を示すと報告されてい
る（ポリメロポウラス（Polymeropoulos）ら,1991）。1
1のCEPH家系にてこのマーカーを用いるペアーワイズ（p
airwise）連鎖分析は、109の還元分裂にて、hGHとACE遺
伝子座が完全に連鎖していることを示した（ロッドの対
数（lod）値＝11.68）。多遺伝子座分析により、ACEとh
GHの遺伝子座の間の遺伝子組換えについて、95％の信頼
区間でこれら遺伝子座の間の完全な連鎖を確認した。こ
の緊密な連鎖により、ほとんどまたはまったく効力を喪
失することなく、連鎖分析におけるACE遺伝子座の代わ
りにhGHマーカーを使用することができる。
B.同胞対分析 ユタ州で確認された高血圧家系の特徴は、前記されて
いるとおりである（実施例１参照のこと）。分析された
同胞はすべて、60歳になる前（平均39.3±9.6歳）に高
血圧と診断され、抗高血圧の薬物治療中であった。ACE
およびhGH遺伝子座での対立遺伝子頻度を、132人の対照
（CEPH基準家族に属するユタ州の祖父母）と149人の高
血圧家系の間で比較した。２つのACE対立遺伝子の頻度
は２群で類似しており（大きい方の対立遺伝子の頻度
は、各々、0.455および0.448であった）、それに対して
hGH遺伝子座での24の対立遺伝子の頻度は、マーカー遺
伝子座と高血圧の間に連鎖不均衡がないことを示した。
149の高血圧同胞群から、hGHマーカーを有する237の同
胞対を遺伝子型に付した。両親の遺伝子型のない場合、
同胞の間で共有する対立遺伝子を「状態による同一性」
（i.b.s.）（ラング（lang）,1986）として表した。マ
ーカー遺伝子座と高血圧の素質に連鎖がないという帰無
仮説の下、全サンプルにて共有される対立遺伝子の期待
数は254.8（同胞対当たり1.075）であり；共有する対立
遺伝子の測定数、255はこの期待数と一致した（ｔ＝0.0
1、ns）。hGH毎回と多数の同胞対の高多形性の研究は、
この分析が80％の検出能を有し、劣性または優性実験
下、各々、「家系による同一性」（i.b.d.）での12.02
または13.06％過剰の対立遺伝子に対応する、10.36％過
剰のi.b.s.で共有される対立遺伝子の数を付与した。
いるとおりである（実施例１参照のこと）。分析された
同胞はすべて、60歳になる前（平均39.3±9.6歳）に高
血圧と診断され、抗高血圧の薬物治療中であった。ACE
およびhGH遺伝子座での対立遺伝子頻度を、132人の対照
（CEPH基準家族に属するユタ州の祖父母）と149人の高
血圧家系の間で比較した。２つのACE対立遺伝子の頻度
は２群で類似しており（大きい方の対立遺伝子の頻度
は、各々、0.455および0.448であった）、それに対して
hGH遺伝子座での24の対立遺伝子の頻度は、マーカー遺
伝子座と高血圧の間に連鎖不均衡がないことを示した。
149の高血圧同胞群から、hGHマーカーを有する237の同
胞対を遺伝子型に付した。両親の遺伝子型のない場合、
同胞の間で共有する対立遺伝子を「状態による同一性」
（i.b.s.）（ラング（lang）,1986）として表した。マ
ーカー遺伝子座と高血圧の素質に連鎖がないという帰無
仮説の下、全サンプルにて共有される対立遺伝子の期待
数は254.8（同胞対当たり1.075）であり；共有する対立
遺伝子の測定数、255はこの期待数と一致した（ｔ＝0.0
1、ns）。hGH毎回と多数の同胞対の高多形性の研究は、
この分析が80％の検出能を有し、劣性または優性実験
下、各々、「家系による同一性」（i.b.d.）での12.02
または13.06％過剰の対立遺伝子に対応する、10.36％過
剰のi.b.s.で共有される対立遺伝子の数を付与した。
C.高血圧下位群 かかる分析の能力は、原因論的に異種集団をさらに均
一の下位群に階層化することにより向上させることがで
きる。６種のサブセットの高血圧対を順次考慮した。高
血圧を決定する遺伝の可能な補足成分として、２つのサ
ブセット： （１）両方の同胞が初期に（40歳前に）高血圧に罹患し
た52対；（２）より重度の高血圧にある31同胞対を選択
し、かれらは血圧を調整するのに、２またはそれ以上の
薬物療法を必要とした。過剰な対立遺伝子の共有はいず
れの群においても観察されなかった。肥満病の影響の可
能性のある対照、有意な混乱因子として、両同胞が20kg
m-2より小さい体重指数（平均25.9±2.8kg m-2）を有
する71の脂肪の少ない高血圧対を別々に分析した。再
度、共有する対立遺伝子は、マーカーおよび高血圧の任
意のセグリゲーション下、期待されるものから逸脱する
ものではなかった。
一の下位群に階層化することにより向上させることがで
きる。６種のサブセットの高血圧対を順次考慮した。高
血圧を決定する遺伝の可能な補足成分として、２つのサ
ブセット： （１）両方の同胞が初期に（40歳前に）高血圧に罹患し
た52対；（２）より重度の高血圧にある31同胞対を選択
し、かれらは血圧を調整するのに、２またはそれ以上の
薬物療法を必要とした。過剰な対立遺伝子の共有はいず
れの群においても観察されなかった。肥満病の影響の可
能性のある対照、有意な混乱因子として、両同胞が20kg
m-2より小さい体重指数（平均25.9±2.8kg m-2）を有
する71の脂肪の少ない高血圧対を別々に分析した。再
度、共有する対立遺伝子は、マーカーおよび高血圧の任
意のセグリゲーション下、期待されるものから逸脱する
ものではなかった。
さらには、ACEまたはhGH遺伝子座のいずれかと関連さ
せることができる中間のフェノタイプを階層化すること
も興味がある。ACEの血漿中濃度は、健康な対象の血圧
に関連しないが、主たる遺伝子効果に関連するという証
拠がある（ライアット（Righat）ら,1990;アルヘンク−
ゲラス（Alhenc−Gelas）ら,1991）。hGHの慢性増加
は、脂肪なし体重および高血圧の上昇だけでなく、イン
スリン耐性（ブララッシュ−マルレイン）（Bratusch−
Marrain）ら,1982）、ヒト高血圧（フェランニニ（Ferr
annini）ら,1987;ポルラー（Pollare）ら,1990）および
SHR（リーベン（Reaven）ら,1991）の一般的特徴を誘発
する。体重がインスリン濃度と強い相関関係にあるため
（この研究において、ｒ＝0.40、ｐ＜0.001）、（ａ）
高脂肪なし体重、（ｂ）高絶食インスリン濃度および
（ｃ）体重を調整した後に高絶食インスリン濃度を有す
る同胞対を階層化した。再び、任意な期待数からの逸脱
はいずれの下位群においても観察されなかった。
せることができる中間のフェノタイプを階層化すること
も興味がある。ACEの血漿中濃度は、健康な対象の血圧
に関連しないが、主たる遺伝子効果に関連するという証
拠がある（ライアット（Righat）ら,1990;アルヘンク−
ゲラス（Alhenc−Gelas）ら,1991）。hGHの慢性増加
は、脂肪なし体重および高血圧の上昇だけでなく、イン
スリン耐性（ブララッシュ−マルレイン）（Bratusch−
Marrain）ら,1982）、ヒト高血圧（フェランニニ（Ferr
annini）ら,1987;ポルラー（Pollare）ら,1990）および
SHR（リーベン（Reaven）ら,1991）の一般的特徴を誘発
する。体重がインスリン濃度と強い相関関係にあるため
（この研究において、ｒ＝0.40、ｐ＜0.001）、（ａ）
高脂肪なし体重、（ｂ）高絶食インスリン濃度および
（ｃ）体重を調整した後に高絶食インスリン濃度を有す
る同胞対を階層化した。再び、任意な期待数からの逸脱
はいずれの下位群においても観察されなかった。
D.検討 これらの結果は、この集団にてACE/hGH遺伝子座と高
血圧の間に連鎖がないことを示す。この研究は連鎖の実
質的な探知能を有し、多数の高血圧同胞対を分析し、AC
Eとの組換えを示さない極端に多形性のマーカーを用い
た。ACEおよびhGHマーカーと高血圧の間に連鎖不均衡が
ないことと共に、マーカー遺伝子座と高血圧の任意のセ
グリゲーションから逸脱しないことは、この遺伝子座で
の共通の変異体が血圧に対して有意な効果を有し得ると
いう仮説を排除するものである。これら対象に対する95
％の信頼限界は大きなままであるが、潜在的に遺伝成分
に富むさらに同種のサブセットの高血圧対の分析は陰性
であった。これらの結果は、高コレステロール血症にお
けるLDL−レセプター変異（ゴールドスタインおよびブ
ラウン（GoldsteinおよびBrown）,1979）のような、ACE
遺伝子の稀な変異が、その集団におけるほんの少数の割
合の罹患者について説明できるだけであるが、その特徴
において優位な効果を有し得るという可能性を除外しな
かった。かくして、ACEと高血圧の間に関連は見られな
かった。
血圧の間に連鎖がないことを示す。この研究は連鎖の実
質的な探知能を有し、多数の高血圧同胞対を分析し、AC
Eとの組換えを示さない極端に多形性のマーカーを用い
た。ACEおよびhGHマーカーと高血圧の間に連鎖不均衡が
ないことと共に、マーカー遺伝子座と高血圧の任意のセ
グリゲーションから逸脱しないことは、この遺伝子座で
の共通の変異体が血圧に対して有意な効果を有し得ると
いう仮説を排除するものである。これら対象に対する95
％の信頼限界は大きなままであるが、潜在的に遺伝成分
に富むさらに同種のサブセットの高血圧対の分析は陰性
であった。これらの結果は、高コレステロール血症にお
けるLDL−レセプター変異（ゴールドスタインおよびブ
ラウン（GoldsteinおよびBrown）,1979）のような、ACE
遺伝子の稀な変異が、その集団におけるほんの少数の割
合の罹患者について説明できるだけであるが、その特徴
において優位な効果を有し得るという可能性を除外しな
かった。かくして、ACEと高血圧の間に関連は見られな
かった。
実施例７ AGTと高血圧の間の連鎖分析 AGTと高血圧の間の連鎖分析を実施例４に記載の方法
を用いて行った。３つの別個の工程を、AGT遺伝子と高
血圧の間の連鎖を同定し、確認する分析手段にて利用し
た：（１）遺伝連鎖試験；（２）AGTの分子変異体の同
定、つづいて高血圧患者と対照におけるその頻度の比
較；（３）AGT遺伝子型の作用としての、高血圧対照に
おける血漿中アンジオテンシノゲン濃度の変化の分析。
を用いて行った。３つの別個の工程を、AGT遺伝子と高
血圧の間の連鎖を同定し、確認する分析手段にて利用し
た：（１）遺伝連鎖試験；（２）AGTの分子変異体の同
定、つづいて高血圧患者と対照におけるその頻度の比
較；（３）AGT遺伝子型の作用としての、高血圧対照に
おける血漿中アンジオテンシノゲン濃度の変化の分析。
マーカー遺伝子座での両親性対立遺伝子をその子孫に
て明瞭に同定できる場合、家系による同一性（i.b.d.）
の０、１または２の対立遺伝子を共有する同胞対の測定
割合は、遺伝連鎖がないとする仮説の下、1/4、1/2およ
び1/4の期待割合と直接対照することができる。しか
し、遅く罹患する場合、サンプリングするのに、通常、
両親を利用できない。さらには、多数の対立遺伝子およ
び高ヘテロ接合性を有するマーカーでさえ、一対の同胞
群の２つの対立遺伝子の状態による同一性（i.b.s.）
は、かれらが家系により同一性を有すること、すなわ
ち、同じ両親の遺伝子を受け継いでいることを意味する
ものではなく：この対立遺伝子は４人のうち１人以上の
両親の遺伝子中にあるかもしれない。そのような場合、
子孫にある２つの対立遺伝子が、メンデルの遺伝法則お
よび基準集団における対立遺伝子頻度の関数として、状
態による同一性を有する可能性を示すにちがいない。そ
の場合、同胞群により共有される対立遺伝子の平均数
を、高血圧およびマーカーの独立性セグリゲーションの
仮説の下、片側スチューデントｔ−試験（ブラックウェ
ルダーおよびエルストン（BlackwelderおよびElston）,
1985;ラング（Lange）,1986）を介して期待値に対照さ
れる。
て明瞭に同定できる場合、家系による同一性（i.b.d.）
の０、１または２の対立遺伝子を共有する同胞対の測定
割合は、遺伝連鎖がないとする仮説の下、1/4、1/2およ
び1/4の期待割合と直接対照することができる。しか
し、遅く罹患する場合、サンプリングするのに、通常、
両親を利用できない。さらには、多数の対立遺伝子およ
び高ヘテロ接合性を有するマーカーでさえ、一対の同胞
群の２つの対立遺伝子の状態による同一性（i.b.s.）
は、かれらが家系により同一性を有すること、すなわ
ち、同じ両親の遺伝子を受け継いでいることを意味する
ものではなく：この対立遺伝子は４人のうち１人以上の
両親の遺伝子中にあるかもしれない。そのような場合、
子孫にある２つの対立遺伝子が、メンデルの遺伝法則お
よび基準集団における対立遺伝子頻度の関数として、状
態による同一性を有する可能性を示すにちがいない。そ
の場合、同胞群により共有される対立遺伝子の平均数
を、高血圧およびマーカーの独立性セグリゲーションの
仮説の下、片側スチューデントｔ−試験（ブラックウェ
ルダーおよびエルストン（BlackwelderおよびElston）,
1985;ラング（Lange）,1986）を介して期待値に対照さ
れる。
AGTの分子変異体を同定した後、それと対照のその頻
度を直接比較した。この目的では、高血圧同胞群の各々
において、同一数が最低の対象を指数対象として選択す
る；対照患者のパネラーは、同じ集団からの健康な、関
連のない患者からなる。
度を直接比較した。この目的では、高血圧同胞群の各々
において、同一数が最低の対象を指数対象として選択す
る；対照患者のパネラーは、同じ集団からの健康な、関
連のない患者からなる。
最後に、血漿アンジオテンシノゲンに対するAGT遺伝
子型の効果を、独立した固定効果として起源の性または
集団を考慮して、測定が利用できるすべての高血圧患者
の変化を分析することにより試験した。
子型の効果を、独立した固定効果として起源の性または
集団を考慮して、測定が利用できるすべての高血圧患者
の変化を分析することにより試験した。
A.AGTと本態性高血圧の間の遺伝連鎖 合計215の同胞群を別々のサンプリング操作にて２カ
所のセンターで集めた。ソルトレークシティーのサンプ
ルは132の同胞群からなり、各々は、抗高血圧薬物療法
中の少なくとも２人の高血圧同胞を有し、そのことを局
所集合より直接的にすでに確認した。パリにおいては、
83家族からの患者を、血圧および体重指数に関する厳格
な基準に基づいて、高血圧クリニックにて選択した。確
認プロトコルにおける差異の影響が、第３表に示される
要約した統計に反映されている。配列モチーフ「GT」
（コテレフステブ（Kotelevstev）ら,1991）の可変縦列
繰り返し単位に基づき、AGT遺伝子座での高度に情報的
な遺伝マーカーは、すべての研究対象にて特徴付けら
れ；基準頻度および遺伝子型（図１）を測定した。この
疾患の病因性不均質は予測されるため、全サンプルにつ
いて分析を行うだけでなく、より早く罹患するか、また
はより重度の高血圧を示す対象のような、より大きな遺
伝同種性を示す可能性のあるデータを有する前記のサブ
セットにおいても実施する（ジョイネマイトレ（Jeunem
aitre）ら、1992a）。
所のセンターで集めた。ソルトレークシティーのサンプ
ルは132の同胞群からなり、各々は、抗高血圧薬物療法
中の少なくとも２人の高血圧同胞を有し、そのことを局
所集合より直接的にすでに確認した。パリにおいては、
83家族からの患者を、血圧および体重指数に関する厳格
な基準に基づいて、高血圧クリニックにて選択した。確
認プロトコルにおける差異の影響が、第３表に示される
要約した統計に反映されている。配列モチーフ「GT」
（コテレフステブ（Kotelevstev）ら,1991）の可変縦列
繰り返し単位に基づき、AGT遺伝子座での高度に情報的
な遺伝マーカーは、すべての研究対象にて特徴付けら
れ；基準頻度および遺伝子型（図１）を測定した。この
疾患の病因性不均質は予測されるため、全サンプルにつ
いて分析を行うだけでなく、より早く罹患するか、また
はより重度の高血圧を示す対象のような、より大きな遺
伝同種性を示す可能性のあるデータを有する前記のサブ
セットにおいても実施する（ジョイネマイトレ（Jeunem
aitre）ら、1992a）。
ソルトレークシティーからの全サンプルにおいて、連
鎖は有意差があるまで達しなかった（ｔ＝1.22、ｐ＝0.
11）。しかし、高血圧同胞により共有される7.7％過剰
の対立遺伝子がパリ由来の全サンプルにて測定され（ｔ
＝1.71、ｐ＜0.05）、両サンプルを一緒に計算した場
合、有意差のレベルはわずかにおおきくなった（ｔ＝2.
02、ｐ＝0.02、第４表）。より早く罹患した高血圧対象
だけを考えた場合も、同様の結果が観察された（第５
表）。対照的に、分析を、血圧を調整するのに２種類の
薬物療法を必要とする対象として、または100mmHgに等
しいまたはより高い心臓拡張期の血圧を有する対象とし
て、両群にて前記した、「より重度の」高血圧の患者に
限定した場合、同胞対によって共有されるより顕著な15
％ないし18％過剰の対立遺伝子が観察された（第５
表）。両方の実験からの「より重度の」高血圧の対を一
緒に計算することにより得られる有意差の増加に加えて
（ｔ＝3.40、ｐ＜0.001）、２つの異なる高血圧集合に
おけるこの知見の応答は、この統計学的形跡を評価する
のに関連がある。
鎖は有意差があるまで達しなかった（ｔ＝1.22、ｐ＝0.
11）。しかし、高血圧同胞により共有される7.7％過剰
の対立遺伝子がパリ由来の全サンプルにて測定され（ｔ
＝1.71、ｐ＜0.05）、両サンプルを一緒に計算した場
合、有意差のレベルはわずかにおおきくなった（ｔ＝2.
02、ｐ＝0.02、第４表）。より早く罹患した高血圧対象
だけを考えた場合も、同様の結果が観察された（第５
表）。対照的に、分析を、血圧を調整するのに２種類の
薬物療法を必要とする対象として、または100mmHgに等
しいまたはより高い心臓拡張期の血圧を有する対象とし
て、両群にて前記した、「より重度の」高血圧の患者に
限定した場合、同胞対によって共有されるより顕著な15
％ないし18％過剰の対立遺伝子が観察された（第５
表）。両方の実験からの「より重度の」高血圧の対を一
緒に計算することにより得られる有意差の増加に加えて
（ｔ＝3.40、ｐ＜0.001）、２つの異なる高血圧集合に
おけるこの知見の応答は、この統計学的形跡を評価する
のに関連がある。
エストロゲンはアンジオテンシノゲン産生を刺激する
ため（カイン（Cain）ら、1971;メナードおよびカット
（MenardおよびCatt）,1973）、データを性別により分
類した（第６表）。ソルトレークシティーならびにパリ
のサンプルにおいて、連鎖は男性−男性の対の間でのみ
有意性を保持した（ｔ＝2.42、ｐ＜0.01、合計したサン
プル）。さらには、「より重度の」高血圧についての基
準にも合致する両サンプルからの37対の男性−男性対
は、33％過剰の共有対立遺伝子を示した（ｔ＝3.60、ｐ
＜0.001）。ソルトレークシティーのサンプル中の48人
の女性に、合成エストロゲンまたは天然エストロゲン配
合の経口用調製物を投与し、それに対してパリのサンプ
ルの女性にはそのような操作を行わなかった；なお、外
因性エストロゲンの服用しなかった35人のユタ州の女性
対の間には過剰な共有対立遺伝子はなかった。
ため（カイン（Cain）ら、1971;メナードおよびカット
（MenardおよびCatt）,1973）、データを性別により分
類した（第６表）。ソルトレークシティーならびにパリ
のサンプルにおいて、連鎖は男性−男性の対の間でのみ
有意性を保持した（ｔ＝2.42、ｐ＜0.01、合計したサン
プル）。さらには、「より重度の」高血圧についての基
準にも合致する両サンプルからの37対の男性−男性対
は、33％過剰の共有対立遺伝子を示した（ｔ＝3.60、ｐ
＜0.001）。ソルトレークシティーのサンプル中の48人
の女性に、合成エストロゲンまたは天然エストロゲン配
合の経口用調製物を投与し、それに対してパリのサンプ
ルの女性にはそのような操作を行わなかった；なお、外
因性エストロゲンの服用しなかった35人のユタ州の女性
対の間には過剰な共有対立遺伝子はなかった。
B.高血圧とATGの分子変異体の間の関連性 本態性高血圧とATG遺伝子座でのマーカーの間で有意
な遺伝連鎖を観察し、この遺伝子における分子変異体が
本態性高血圧の発生病理において原因として関連してい
ることがわかった。すべてのエキソンとATGの５′非コ
ード領域の682−bpセグメントにおけるこのような変異
体についての直接的な研究を、両方の集合からのより重
度の高血圧対のインデックス・ケースからなるサンプル
にて実施した。非変性条件下、酵素的に亢進されたDNA
セグメントを電気泳動に付すことにより検出された変異
体（オリタ（Orita）、1989）を直接DNA配列決定に付し
た（ハタ（Hata）ら、1990）（図２）。遺伝子の５′領
域にて５つのヌクレオチド置換、および10の沈黙および
ミスセンス変異体を含む、少なくとも15種の独特な分子
変異体を同定した（図３、第２表）。いずれの変異体
も、レニンにより切断される部位をコードするエキソン
２のＮ−末端部で検出されなかった。
な遺伝連鎖を観察し、この遺伝子における分子変異体が
本態性高血圧の発生病理において原因として関連してい
ることがわかった。すべてのエキソンとATGの５′非コ
ード領域の682−bpセグメントにおけるこのような変異
体についての直接的な研究を、両方の集合からのより重
度の高血圧対のインデックス・ケースからなるサンプル
にて実施した。非変性条件下、酵素的に亢進されたDNA
セグメントを電気泳動に付すことにより検出された変異
体（オリタ（Orita）、1989）を直接DNA配列決定に付し
た（ハタ（Hata）ら、1990）（図２）。遺伝子の５′領
域にて５つのヌクレオチド置換、および10の沈黙および
ミスセンス変異体を含む、少なくとも15種の独特な分子
変異体を同定した（図３、第２表）。いずれの変異体
も、レニンにより切断される部位をコードするエキソン
２のＮ−末端部で検出されなかった。
同定変異体の各々の有病率を高血圧性インデックス・
ケースと対照患者の間で比較した。ソルトレークシティ
ーのサンプルの場合、検出された第１の変異体、M235T
（AGTのアミノ酸235にあるメチオニンをトレオニンに変
更）は、対照よりもすべての高血圧性インデックス・ケ
ースにおいて有意により頻繁に見られ、そのうちより重
度に罹患したインデックス・ケースでは、頻度がさらに
増加した（第７表）。これらの結果は、パリのサンプル
においても同様である。関連性はいずれの性別において
も顕著であった。特に、M235Tは、対照（0.37）（χ2 1
＝16.9、ｐ＜0.001）にあるよりも、女性高血圧患者
（0.51）にて顕著である。
ケースと対照患者の間で比較した。ソルトレークシティ
ーのサンプルの場合、検出された第１の変異体、M235T
（AGTのアミノ酸235にあるメチオニンをトレオニンに変
更）は、対照よりもすべての高血圧性インデックス・ケ
ースにおいて有意により頻繁に見られ、そのうちより重
度に罹患したインデックス・ケースでは、頻度がさらに
増加した（第７表）。これらの結果は、パリのサンプル
においても同様である。関連性はいずれの性別において
も顕著であった。特に、M235Tは、対照（0.37）（χ2 1
＝16.9、ｐ＜0.001）にあるよりも、女性高血圧患者
（0.51）にて顕著である。
他の試験した変異体で、T174Mだけがまた両方のサン
プルにおいて有意な関連性を示した（第７表）。M235T
およびT174M遺伝子型の分布分析は、これら２つの変異
体が完全な連鎖不均衡にあることを示す（χ2 4＝36.4、
ｐ＜0.0001）:T174MはM235T対立遺伝子を有する染色体
のサブセット中にある。高血圧症患者および対照患者の
間で、これらハプロタイプの頻度を対比した場合、T174
Mと共にまたはなしでM235Tを有するハプロタイプが、対
照（0.09および0.28、ｎ＝232）におけるよりもすべて
の高血圧インデックス・ケース（0.14および0.33、ｎ＝
215）の間でより頻繁に観察され、両方の差異は顕著で
あった（χ2 1＝5.6、ｐ＜0.02およびχ2 1＝13.5、ｐ＜
0.01）。
プルにおいて有意な関連性を示した（第７表）。M235T
およびT174M遺伝子型の分布分析は、これら２つの変異
体が完全な連鎖不均衡にあることを示す（χ2 4＝36.4、
ｐ＜0.0001）:T174MはM235T対立遺伝子を有する染色体
のサブセット中にある。高血圧症患者および対照患者の
間で、これらハプロタイプの頻度を対比した場合、T174
Mと共にまたはなしでM235Tを有するハプロタイプが、対
照（0.09および0.28、ｎ＝232）におけるよりもすべて
の高血圧インデックス・ケース（0.14および0.33、ｎ＝
215）の間でより頻繁に観察され、両方の差異は顕著で
あった（χ2 1＝5.6、ｐ＜0.02およびχ2 1＝13.5、ｐ＜
0.01）。
C.アンジオテンシノゲンの血漿濃度との関連性 アンジオテンシノゲンの血漿中濃度とこの蛋白の２つ
の分子変異体（M235TおよびT174M）の間の関係を、各サ
ンプルの高血圧対象における、遺伝子型および性別の関
数として、変異を分析することにより試験した。エスト
ロゲンの経口用調製物を服用した女性はこの分析から排
除した。対象を残基174での遺伝子型にしたがって分類
した場合、有意差は観察されなかった。対照的に、アン
ジオテンシノゲンの血漿中濃度は、各集合サンプル中、
M235T変異体を有する女性にて顕著に高かった；両方の
サンプルを、固定効果として性別および集合を考慮する
変数分析において一緒にして考えた場合、遺伝子型の差
異は非常に顕著であった（Ｆ2.313＝14.9、ｐ＜0.000
1）（第８表）。
の分子変異体（M235TおよびT174M）の間の関係を、各サ
ンプルの高血圧対象における、遺伝子型および性別の関
数として、変異を分析することにより試験した。エスト
ロゲンの経口用調製物を服用した女性はこの分析から排
除した。対象を残基174での遺伝子型にしたがって分類
した場合、有意差は観察されなかった。対照的に、アン
ジオテンシノゲンの血漿中濃度は、各集合サンプル中、
M235T変異体を有する女性にて顕著に高かった；両方の
サンプルを、固定効果として性別および集合を考慮する
変数分析において一緒にして考えた場合、遺伝子型の差
異は非常に顕著であった（Ｆ2.313＝14.9、ｐ＜0.000
1）（第８表）。
M235Tに伴う効果は女性にて共優性であることは明ら
かである。ソルトレークシティーにて、より高い濃度が
男性よりも女性にて見られた（ｔ＝4.3、ｐ＜0.001）
が、パリでは見られなかった（ｔ＝1.41、ｐ＜0.16）。
アンジオテンシノゲン産生に対するエストロゲンの効果
はソルトレークシティーにて見られた性の差異を説明す
るが、２つのサンプルの間の平均値の差異は生理学的に
有意差があるとは考えられず；所定の集団サンプルに属
するすべての対象を同時に検定し、同一標準体に照合し
たが、ソルトレークシティーおよびパリのサンプルにつ
いての測定を、レニンおよび異なる標準体の異なる調製
物を用い、別に６カ月行った。
かである。ソルトレークシティーにて、より高い濃度が
男性よりも女性にて見られた（ｔ＝4.3、ｐ＜0.001）
が、パリでは見られなかった（ｔ＝1.41、ｐ＜0.16）。
アンジオテンシノゲン産生に対するエストロゲンの効果
はソルトレークシティーにて見られた性の差異を説明す
るが、２つのサンプルの間の平均値の差異は生理学的に
有意差があるとは考えられず；所定の集団サンプルに属
するすべての対象を同時に検定し、同一標準体に照合し
たが、ソルトレークシティーおよびパリのサンプルにつ
いての測定を、レニンおよび異なる標準体の異なる調製
物を用い、別に６カ月行った。
D.検討 高血圧対象の独立した２つのサンプルにおける、３種
の観察−−遺伝連鎖、対立遺伝子関連、およびAGT遺伝
子型の間の血漿中アンジオテンシノゲン濃度の違い−−
によって、本態性高血圧症の病理発生におけるアンジオ
テンシノゲンの関連が確立される。
の観察−−遺伝連鎖、対立遺伝子関連、およびAGT遺伝
子型の間の血漿中アンジオテンシノゲン濃度の違い−−
によって、本態性高血圧症の病理発生におけるアンジオ
テンシノゲンの関連が確立される。
1.高血圧同胞における遺伝連鎖 メンデル遺伝学の第一法則を関連する個々の対（ブラ
ックウェルダーおよびエルストン（BlackwelderおよびE
lston）,1985）、多数の罹患した対および試験遺伝子座
での高多形性マーカーを要する解決手段（リシュ（Risc
h）,1990;ビショップおよびウィリアムソン（Bishopお
よびWilliamson）,1990）に適用して遺伝関連を推論し
た。この研究デザインはある障害、例えば原因となる因
子の予想される多様性および不均質により、一連の遺伝
質を明白に系統的組織化することに依存する従来の解決
手段では解決できない障害に適している。
ックウェルダーおよびエルストン（BlackwelderおよびE
lston）,1985）、多数の罹患した対および試験遺伝子座
での高多形性マーカーを要する解決手段（リシュ（Risc
h）,1990;ビショップおよびウィリアムソン（Bishopお
よびWilliamson）,1990）に適用して遺伝関連を推論し
た。この研究デザインはある障害、例えば原因となる因
子の予想される多様性および不均質により、一連の遺伝
質を明白に系統的組織化することに依存する従来の解決
手段では解決できない障害に適している。
ユタのサンプルにおいて、有意な連鎖が、２種の抗高
血圧薬の使用により、または100mmHgに等しいもしくは
より高い拡張期血圧により定義されるような、より重度
の罹患した対象のサブセットについてのみ得られた；対
照的に、パリでは全サンプルにおいて、連鎖は有意にま
で達した。この観察は、各研究にて適用される種々の確
認スキームによる反映していると思われる。ソルトレー
クシティーの同胞群は高血圧対象を集団ベースでの収集
することに相当するのに対して、パリの対象は、高血圧
クリニックへの紹介を介し、厳格な排除基準を適用して
補充された（実施例１参照）。先のサンプルは、集団を
ベースとする長所を有するが；フランスのサンプルより
も低い治療血圧値によって反映されるように、あまり重
度でない罹患対象を含み、サンプル全体にてより大きな
病因性不均質が生じる。
血圧薬の使用により、または100mmHgに等しいもしくは
より高い拡張期血圧により定義されるような、より重度
の罹患した対象のサブセットについてのみ得られた；対
照的に、パリでは全サンプルにおいて、連鎖は有意にま
で達した。この観察は、各研究にて適用される種々の確
認スキームによる反映していると思われる。ソルトレー
クシティーの同胞群は高血圧対象を集団ベースでの収集
することに相当するのに対して、パリの対象は、高血圧
クリニックへの紹介を介し、厳格な排除基準を適用して
補充された（実施例１参照）。先のサンプルは、集団を
ベースとする長所を有するが；フランスのサンプルより
も低い治療血圧値によって反映されるように、あまり重
度でない罹患対象を含み、サンプル全体にてより大きな
病因性不均質が生じる。
2.高血圧とAGTの分子変異体の間の関連性 遺伝連鎖は、AGTの変異体が本態性高血圧の病理発生
に含まれることを示唆した。同定されたAGT遺伝子の15
の分子変異体にて、高血圧との有意な関連性が２種の別
個のアミノ酸置換、M235TおよびT174Mについて観察され
た。この関連性の有意性は、高血圧および対象患者にお
ける対立遺伝子頻度を対比することにより確立された。
このデザインは、未調整の階層化により偏見する傾向に
あるが、以下の考察は、観察された関連性が見せかけで
ないという解釈を支持する：（１）有意性は２つの異な
る集団からの独立したサンプルにて得られること；
（２）遺伝子頻度は、これら２種のサンプルにてかなり
類似しており、北および西ヨーロッパ系のカフカズ人の
間にてほとんど変化は予想されないこと；（３）これら
の高血圧および対照群のうち、対立遺伝子頻度における
差異が、レニン、アンジオテンシン変換酵素およびHLA
を含む他の遺伝子座で観察されなかったこと（実施例５
および６）。
に含まれることを示唆した。同定されたAGT遺伝子の15
の分子変異体にて、高血圧との有意な関連性が２種の別
個のアミノ酸置換、M235TおよびT174Mについて観察され
た。この関連性の有意性は、高血圧および対象患者にお
ける対立遺伝子頻度を対比することにより確立された。
このデザインは、未調整の階層化により偏見する傾向に
あるが、以下の考察は、観察された関連性が見せかけで
ないという解釈を支持する：（１）有意性は２つの異な
る集団からの独立したサンプルにて得られること；
（２）遺伝子頻度は、これら２種のサンプルにてかなり
類似しており、北および西ヨーロッパ系のカフカズ人の
間にてほとんど変化は予想されないこと；（３）これら
の高血圧および対照群のうち、対立遺伝子頻度における
差異が、レニン、アンジオテンシン変換酵素およびHLA
を含む他の遺伝子座で観察されなかったこと（実施例５
および６）。
変異体M235TおよびT174Mは、M235T変異体を有するハ
プロタイプのサブセット上に存在するT174Mとして、完
全な連鎖不均衡を示し、両方のハプロタイプは高血圧患
者の間でより高い頻度で観察された。この観察を考慮し
て、いくつかの解釈を提案できる：（１）M235Tは直接
的に高血圧に対する素質を介在する；（２）同定されて
いない危険因子は両方のハプロタイプに共通である；
（３）ハプロタイプは、各々、別個の危険因子を隠して
いる。
プロタイプのサブセット上に存在するT174Mとして、完
全な連鎖不均衡を示し、両方のハプロタイプは高血圧患
者の間でより高い頻度で観察された。この観察を考慮し
て、いくつかの解釈を提案できる：（１）M235Tは直接
的に高血圧に対する素質を介在する；（２）同定されて
いない危険因子は両方のハプロタイプに共通である；
（３）ハプロタイプは、各々、別個の危険因子を隠して
いる。
両方の変異体は対照患者におけるよりも女性高血圧患
者において有意により頻繁に見られるが、いずれのサン
プルの女性高血圧患者の対においても連鎖は明白でなか
った。これらの観察は、アンジオテンシノゲンが男性で
は直接的であるが、女性では間接的に高血圧となる危険
性に寄与すると仮定することにより理解できる。ここ
に、別のエストロゲシ調節因子がアンジオテンシノゲン
関連の素質の影響を介在してもよく；レニン−アンジオ
テンシン系の遺伝子の調節に対するテストステロンおよ
びエストロゲンの効果における文書で示された差異はこ
の仮説を支持する（バックマン（Bachmann）ら,199
1）。連鎖により、および関連性により同定される素質
は独立した変異体を示すと考えられるが、該データのサ
ブセットにおける関連性および連鎖が共に同傾向で増加
することはそれらが同一の遺伝決定因子の２つの発現で
あることを示唆する。
者において有意により頻繁に見られるが、いずれのサン
プルの女性高血圧患者の対においても連鎖は明白でなか
った。これらの観察は、アンジオテンシノゲンが男性で
は直接的であるが、女性では間接的に高血圧となる危険
性に寄与すると仮定することにより理解できる。ここ
に、別のエストロゲシ調節因子がアンジオテンシノゲン
関連の素質の影響を介在してもよく；レニン−アンジオ
テンシン系の遺伝子の調節に対するテストステロンおよ
びエストロゲンの効果における文書で示された差異はこ
の仮説を支持する（バックマン（Bachmann）ら,199
1）。連鎖により、および関連性により同定される素質
は独立した変異体を示すと考えられるが、該データのサ
ブセットにおける関連性および連鎖が共に同傾向で増加
することはそれらが同一の遺伝決定因子の２つの発現で
あることを示唆する。
これらの知見を考慮して、アンジオテンシノゲン遺伝
子の分子変異体はヒトにて本態性高血圧に対する素質の
受継ぎをなすものである。
子の分子変異体はヒトにて本態性高血圧に対する素質の
受継ぎをなすものである。
実施例８ AGT変異体についてのスクリーニング 健康な対象および妊娠女性を、実施例４に記載されて
いるように、PCR増幅および対立遺伝子−特異的オリゴ
ヌクレオチド交雑を用い、M235T変異体についてスクリ
ーンした。M235T変異体を有する健康な対象は、非キャ
リアーよりもより高いアンジオテンシノゲンの血漿中濃
度を有し、さらにより高い血圧を有することが判明し
た。これらの違いは、共に、統計学的に有意であること
が判明した。さらに、該変異体はカフカズ人に限定され
ないことも判明した。M235T変異体は、妊娠の間、子癇
前症を示す女性にて有意に増加していることが判明し
た。
いるように、PCR増幅および対立遺伝子−特異的オリゴ
ヌクレオチド交雑を用い、M235T変異体についてスクリ
ーンした。M235T変異体を有する健康な対象は、非キャ
リアーよりもより高いアンジオテンシノゲンの血漿中濃
度を有し、さらにより高い血圧を有することが判明し
た。これらの違いは、共に、統計学的に有意であること
が判明した。さらに、該変異体はカフカズ人に限定され
ないことも判明した。M235T変異体は、妊娠の間、子癇
前症を示す女性にて有意に増加していることが判明し
た。
本発明は、この特許出願中、好ましい具体例を参照し
て詳細に開示されているが、該開示は限定よりもむしろ
例示を意図としており、当業者であれば、本発明の創作
の範囲内で、添付した請求の範囲の範囲内で、修飾を容
易に行うであろう。
て詳細に開示されているが、該開示は限定よりもむしろ
例示を意図としており、当業者であれば、本発明の創作
の範囲内で、添付した請求の範囲の範囲内で、修飾を容
易に行うであろう。
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アソシエイション（J.Am.Med.Assn.）,259:3579−3586; ウィリアムズ，アール・アール（Williams,R.R.）（198
9）、ハイパーテンション（Hypertension）,14:610−61
3; ヤング，ビー・ジー（Yongue,B.G.）ら（1991）、ハイ
パーテンション（Hypertension）,17:485−491
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラローエル，ジーン−マーク アメリカ合衆国84103ユタ州、ソルト・ レイク・シティ、ノース・ヒルズ・ドラ イブ495番 (72)発明者 ジュヌメートル，グザビエ フランス75012パリ、リュ・ドゥ・ラ・ ヴォート 15番 (72)発明者 リフトン，リチャード・ピィ アメリカ合衆国84103ユタ州、ソルト・ レイク・シティ、テラス・ヒルズ・ドラ イブ794番 (72)発明者 スーブリエ，フロラン フランス75016パリ、スカール・アン リ・パト11番 (72)発明者 コテレブトセブ，ユーリ イギリス、エディンバラ・イーエイチ 16・５エックスジェイ、イースト・パー クサイド１／８番 (72)発明者 コルヴォル，ピエール フランス75007パリ、リュ・ドゥ・セー ブル88番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】ヒトから分離された試料中のアンジオテン
シノーゲン遺伝子の変異を検出する方法であって、該試
料のアンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列を、正常
アンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列と比較して、
アンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列中の変異に関
して分析することを含み、該変異がT174M、M235T、Ｇ−
6AおよびＡ−20Cからなる群より選択されるものであ
り、変異の存在が該ヒトの高血圧素質を表示するものと
なる方法。 - 【請求項２】該ヒトのアンジオテンシノーゲン遺伝子の
DNA配列が変異T174Mに関して分析される請求項１の方
法。 - 【請求項３】該ヒトのアンジオテンシノーゲン遺伝子の
DNA配列が変異M235Tに関して分析される請求項１の方
法。 - 【請求項４】該ヒトのアンジオテンシノーゲン遺伝子の
DNA配列が変異Ｇ−6Aに関して分析される請求項１の方
法。 - 【請求項５】該ヒトのアンジオテンシノーゲン遺伝子の
DNA配列が変異Ａ−20Cに関して分析される請求項１の方
法。 - 【請求項６】ヒトから分離された試料中のアンジオテン
シノーゲン遺伝子の変異を検出する方法であって、該試
料のアンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列を、正常
アンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列と比較して、
アンジオテンシノーゲン遺伝子のDNA配列中の変異M235T
に関して連鎖不平衡の状態にある変異に関して分析する
ことを含み、該変異の存在がヒトの高血圧素質を表示す
るものとなる方法。 - 【請求項７】該分析がハイブリダイゼーションにより行
われる請求項１ないし６のいずれか１項の方法。 - 【請求項８】該ハイブリダイゼーションが対立遺伝子特
異的プローブを用いるものである請求項７の方法。 - 【請求項９】該分析が配列の分析により行われる請求項
１ないし６のいずれか１項の方法。 - 【請求項１０】該分析が１本鎖コンホーメーション多型
性分析により行われる請求項１ないし６のいずれか１項
の方法。 - 【請求項１１】該試料のアンジオテンシノーゲン遺伝子
のゲノム配列の全部または一部が分析される請求項１な
いし10のいずれか１項の方法。 - 【請求項１２】該試料のアンジオテンシノーゲン遺伝子
のcDNA配列の全部または一部が分析される請求項１ない
し10のいずれか１項の方法。 - 【請求項１３】該素質が本態性高血圧の素質である請求
項１ないし12のいずれか１項の方法。 - 【請求項１４】該素質が妊娠高血圧の素質である請求項
１ないし12のいずれか１項の方法。
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