一种子痫前期的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种在子痫前期的生物标志物及其应用,具体的涉及在显著上调的ARHGAP27在子痫前期中的应用。
背景技术
子痫前期是妊娠期特发的以母体高血压和蛋白尿为特征的多系统综合征,可引起全身多器官功能损害以及功能的衰竭,是导致孕产妇以及围产儿死亡的主要原因,其临床表现的复杂性和各靶器官受累的不一致性,提示其发生可能与多种因素有关。经过多年广泛的研究,炎症免疫过度激活、子宫螺旋小动脉重铸不足、血管内皮细胞受损、遗传因素、营养缺乏等引起内皮功能障碍成为目前的研究热点。目前比较公认的学说是缺陷胎盘或胎盘浅表着床机制。
滋养细胞向子宫的增殖、迁移和侵袭是人类胚胎植入和胎盘形成的重要环节。滋养细胞侵袭与肿瘤的侵袭有许多相似之处,但在许多内分泌及旁分泌因子的调控下,滋养细胞侵袭呈现严格的时空限制,位于母胎界面的许多因素调控着这个过程,它们有些是促进滋养细胞侵袭的,有些则起着抑制作用。它们之间的平衡保证了早孕期滋养细胞的正常侵袭和胚胎的正常发育。因此任何一个因素的明显失调都可能引起滋养细胞的侵袭异常而导致妊娠相关性疾病。早孕期滋养细胞的侵袭不足是与包括子痫前期和胎儿生长受限在内的妊娠病理相关,而其过度侵袭则与葡萄胎及绒癌相关。近年来有关妊娠早期滋养细胞侵袭行为调控的研究层出不穷,许多研究均发现滋养细胞侵袭行为的异常与一些基因的异常表达有关。
生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题,理解人类基因组中不同基因的功能,监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达十分重要。对差异表达的研究,可以推断基因与基因的相互关系,揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。研究与子痫前期相关的基因,对于该疾病的理论研究和临床诊治都具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种子痫前期的生物标志物,灵敏和特异性的实现子痫前期的诊断和治疗。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测ARHGAP27水平的试剂在制备诊断子痫前期的产品中的应用。
进一步,所述产品包括通过芯片、印迹法、RT-PCR、实时定量PCR、FISH法、CGH法或阵列CGH法、检测ARHGAP27水平变化以诊断子痫前期的产品。
其中,印迹法包括Northern、Southern、Western印迹法。Southern印迹法是将从样本得到的基因组DNA分离并固定,通过检测DNA与ARHGAP27基因的杂交来测定样本中的ARHGAP27基因;Northern印迹法是一种将由样本中获得的mRNA分离、固定,通过检测mRNA与ARHGAP27基因的杂交来检测该基因的mRNA;Western印迹法是一种将样本中的蛋白分离、固定,通过检测抗体与ARHGAP27蛋白的免疫反应来分析基因的表达程度。
其中,所述用RT-PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增ARHGAP27基因的引物;所述用实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增ARHGAP27基因的引物。
进一步,所述用实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括的一对特异扩增ARHGAP27基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种诊断子痫前期的产品,所述产品包括检测ARHGAP27水平的试剂,其中所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条或制剂。
进一步,所述试剂包括:
特异性识别ARHGAP27基因的探针;或
特异性扩增ARHGAP27基因的引物;或
特异性结合ARHGAP27蛋白的抗体或配体。
本发明所述的产品可用于检测包括ARHGAP27基因在内的多个基因及所编码的蛋白(例如,与子痫前期相关的多个基因及所编码的蛋白)的表达水平。
本发明提供了ARHGAP27基因在制备治疗子痫前期的药物组合物中的应用。
进一步,所述药物组合物包括ARHGAP27功能性表达的抑制剂,其中,所述抑制剂包括抑制ARHGAP27基因表达的物质、抑制ARHGAP27基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制ARHGAP27基因表达产物活性的物质。
进一步,所述抑制剂是针对ARHGAP27基因的siRNA、针对ARHGAP27蛋白的抗体;优选的,所述抑制剂为siRNA。
在本发明的具体实施方式中,所述针对ARHGAP27基因的siRNA的序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种治疗子痫前期的药物组合物,所述药物包含ARHGAP27功能性表达的抑制剂,和药学上可接受的载体。
其中,所述抑制剂包括抑制ARHGAP27基因表达的物质、抑制ARHGAP27基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制ARHGAP27基因表达产物活性的物质。
进一步,所述抑制剂为siRNA,优选的,siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10。
本发明提供了ARHGAP27在筛选治疗子痫前期的药物中的应用。
进一步,筛选治疗子痫前期的药物的步骤包括:
用待筛选物质处理表达或含有ARHGAP27基因或其编码的蛋白的体系;和
检测所述体系中ARHGAP27基因或其编码的蛋白的表达或活性。
其中,若待筛选物质可降低ARHGAP27的表达或活性,则表明该待筛选的物质是治疗子痫前期的药物。
在本发明中,所述体系包括(但不限于):细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在本发明中,所述的步骤还包括:对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了与子痫前期发生发展相关的生物标志物—ARHGAP27,通过检测受试者ARHGAP27的变化,来实现子痫前期的早期诊断。
本发明提供了治疗子痫前期的分子靶标,通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。
本发明对子痫前期的机制研究提供了一定的理论基础。
附图说明
图1是利用QPCR检测ARHGAP27基因在子痫前期患者中的表达情况;其中,A是胚胎组织中的表达水平,图B是血液中的表达水平;
图2是利用QPCR检测siRNA对ARHGAP27基因表达的影响图;
图3是利用QPCR检测siRNA对ARHGAP27蛋白表达的影响图;
图4显示MTT法检测ARHGAP27对细胞增殖活性的影响图;
图5显示利用Transwell小室检测ARHGAP27基因对细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量测序技术,通过检测子痫前期患者和正常孕妇血液中的基因表达水平,发现其中具有明显差异的基因,探讨其与子痫前期的发生之间的关系,从而为子痫前期的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了ARHGAP27与子痫前期的发生发展相关,并验证了ARHGAP27在子痫前期中高表达。ARHGAP27可作为子痫前期的独立预测因子,也可以和其他的基因标志物联合应用。
本发明中术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。
ARHGAP27基因位于17号染色体长臂2区1带上,本发明中的ARHGAP27包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中,ARHGAP27具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中ARHGAP27基因(NM_001282290.1)所示的序列。
本文所述的生物标志物包括基因和蛋白。此类生物标志物包括含有编码生物标志物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。生物标志物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标志物蛋白是由本发明的DNA生物标志物编码的或对应于本发明的DNA生物标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。
所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白的一部分。为生物标志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续的核苷酸,或最多存在于本文所公开的全长生物标志物多核苷酸中的核苷酸个数。生物标志物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续氨基酸,或存在于本发明的全长生物标志物蛋白中的氨基酸的总数。“变体”旨在表示基本上相似的序列。一般来讲,本发明的特定生物标志物的变体将具有通过序列比对程序测定的与所述生物标志物至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。
作为可选择的实施方式,可在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如,用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹),但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如,通过斑点印迹)。基因组DNA(例如,来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)。可以检测所有形式的RNA,包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。
作为一种可选择的实施方式,可在翻译水平上检测生物标志物的表达水平。利用蛋白免疫技术检测进行具体蛋白或者多肽的测量的多种方法是本领域技术人员已知的。蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定,例如夹心ELISA,其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
抑制剂和药物组合物
本发明的药物组合物包括ARHGAP27功能性表达的抑制剂,和药学上可接受的载体。
在本发明中,关于ARHGAP27的“功能性表达”,意指功能性基因产物的转录和/或翻译。“功能性表达”可以在至少三个水平上失调。第一,在DNA水平上,例如通过基因的缺失或破坏,或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是,相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言,阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起,包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括ARHGAP27基因的启动子或调控区域的突变,如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50%但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是,功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调:通过赋予蛋白质新的活性,蛋白质的正常功能失调,表达的功能活性蛋白减少。反之亦然,功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调:通过赋予蛋白质新的活性,蛋白质的正常功能失调,表达的功能活性蛋白减少。反之亦然,功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。
第二,在RNA水平上,例如通过缺乏有效的翻译,例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体),可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录,例如因为突变诱导了新的剪接变体。
作为本发明的可选择的实施方式,ARHGAP27功能性表达的抑制剂包括抑制ARHGAP27基因表达的物质、影响ARHGAP27基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制ARHGAP27基因表达产物活性的物质。
作为可选择的一种优选的实施方式,所述抑制剂包括:通过干扰RNA抑制ARHGAP27基因表达的双链核糖核酸,或基于ARHGAP27抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制ARHGAP27蛋白活性的蛋白质。
作为本发明的一种优选方式,所述ARHGAP27的抑制剂是一种ARHGAP27特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染人早孕绒毛滋养细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,进一步地在细胞水平实验,结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中ARHGAP27基因的表达水平,以促进妊娠滋养细胞的增殖。
在本发明中,药学上可接受的载体,这类载体包括(但并不限于):稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油;崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等;表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等;致湿剂如甘油、淀粉等;吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备,例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐,例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1%w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖,例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等;糖醇,例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等;二糖,例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等;多聚糖,例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂,例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于),快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY;肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素;增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下,药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织,本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。
本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药,包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂,常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药,适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时,可将活性组分悬浮或溶解在油相中,并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话,可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时,可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如,通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋,也可制备所述制剂已延长或维持释放。
本发明的药物还可与其他治疗子痫前期的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药,而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中,可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答,调整本发明药物组合物的剂量。
本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药,如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成,如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。
本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物,可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体,如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
本发明中术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法,即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗,并且还包括病因治疗,即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外,该术语还包括姑息治疗,即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗;预防性治疗,即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗;以及支持性治疗,即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物
1、样品收集
1)血清标本的收集
各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液,EDTA抗凝管静置10min,离心分离血清,-20℃保存备用。
2)胎盘标本的收集
各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织,生理盐水漂洗2次,去除水分后分装于冻存管内,-80℃保存备用。
两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症,所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析,进行差异表达基因的筛选,并在各组全部45例标本中进行验证实验。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA,具体步骤参考说明书。
3、RNA样品的质量分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析,利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位,通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度,利用cuffdiff检测差异表达,当p值<0.05时,认为基因显著差异表达。
8、结果
RNA-seq结果显示,与正常孕妇的胚胎组织相比,ARHGAP27基因在子痫前期组织中的表达量显著上调。
实施例2 QPCR测序验证ARHGAP27基因的差异表达
1、对ARHGAP27基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA,血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA,具体步骤参考说明书。
3、逆转录:
1)加入dNTP mixture1μl,Oligo dT primer 1μl,总RNA 2μg,加Rnase FreeddH2O使总体积至10μl,在PCR仪上进行变性、退火反应,65℃,5min,反应完成后置于4℃。
2)构建20μl反应体系,继续加入5×Primer Script Buffer 4μl,RNaseInhibitor0.5μl,Prime Script RTase 0.5μl,RNase Free ddH2O 5.0μl,在PCR仪上按下列条件进行反转录反应:42℃15~30min,95℃5min,反应完成之后,置于冰上。
3)水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min,-20℃储存备用。
4、QPCR检测ARHGAP27的表达水平
1)引物设计
根据Genebank中ARHGAP27基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下:
管家基因GAPDH的引物序列为:
正向引物:5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.1)
反向引物:5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.2)
ARHGAP27基因:
正向引物为5’-TACACCAACCACTTCACT-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GGAGTCCTCTGGATTGTA-3’(SEQ ID NO.4)。
2)PCR反应体系:正向引物和反向引物各1μl,SYBR Green PCR master mix10μl,cDNA 1μl,ddH2O 7μl。
3)PCR反应条件:95℃10min,(95℃10s,60℃30s,72℃15s)×40个循环,65℃~95℃,温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
以GAPDH为内参,计算子痫前期组织与正常胎盘组织,子痫前期患者血液与正常孕妇血液中ARHGAP27荧光定量RT-PCR的实验结果,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析,两者之间的差异采用t检验,以P<0.05具有统计学差异。
6、结果
结果如图1所示,与正常孕妇相比,子痫前期孕妇中ARHGAP27基因表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),胚胎组织中的阳性检出率=上调表达例数/总检测例数×100%=42/45×100%=93.3%,血液中的阳性检出率为40/45×100%=89%,提示检测血液或胚胎组织中ARHGAP27的表达水平可以用于子痫前期的辅助诊断。
实施例3 ARHGAP27基因的沉默
1、细胞培养
人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10%胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养。2-3天换液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对ARHGAP27基因的siRNA序列:
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC):
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5),
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6);
siRNA1:
正义链为5’-AUCACAUUUUGCAAACUGCCC-3’(SEQ ID NO.7),
反义链为5’-GCAGUUUGCAAAAUGUGAUUC-3’(SEQ ID NO.8);
siRNA2:
正义链为5’-ACAAAUGGGAUAAUCCAAGCC-3’(SEQ ID NO.9),
反义链为5’-CUUGGAUUAUCCCAUUUGUUU-3’(SEQ ID NO.10);
siRNA3:
正义链为5’-UUAGACAUAUGGUAUGAGGCC-3’(SEQ ID NO.11),
反义链为5’-CCUCAUACCAUAUGUCUAAAU-3’(SEQ ID NO.12);
将细胞按1×105/孔接种到六孔细胞培养板中,在37℃、5%CO2培养箱中细胞培养24h,在无双抗、含10%FBS的RPIM-1640培养基中,转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
将实验分为三组:对照组(HTR-8/SVneo)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3),其中阴性对照组siRNA与ARHGAP27基因的序列无同源性,浓度为20nM/孔,同时分别进行转染。
3、QPCR检测ARHGAP27基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取,具体步骤详见试剂盒说明书
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,干扰ARHGAP27基因表达组与对照组之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示,相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载siRNA-NC,实验组能够显著降低ARHGAP27基因的表达水平,而,其中siRNA2的效果最为显著,因此选择siRNA2进行后续的实验。
实施例4 ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中ARHGAP27的蛋白表达
应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中ARHGAP27蛋白水平。RNA干扰后第六天,分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液,按照ELISA试剂盒操作流程定量检测肿瘤细胞上清液中ARHGAP27的浓度。
1、配置浓度为70000pg/ml的标准品,10倍稀释后,再进行2倍倍比稀释,共有7个稀释度。
2、加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl,余孔分别加不同浓度梯度的标准品和待测样品各50μl。轻轻晃动混匀,酶标板加上盖,37℃反应2h。
3、弃去液体,晾干。每孔加200μl VEGF-C结合物。37℃,120min后,弃去孔内液体,晾干,PBS洗板3次。
4、依序每孔加底物溶液200μl,37℃避光显色30min。
5、依序每孔加终止溶液50μl,终止反应。
6、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值。
7、计算样品的实际浓度。
8、结果如下图3所示,siRNA沉默HTR-8/SVneo细胞的ARHGAP27基因,ARHGAP27的蛋白含量也相应降低,说明沉默ARHGAP27基因可以抑制ARHGAP27蛋白的水平。
实施例5 MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性
1、细胞转染后24h,,0.25%胰蛋白酶消化,培养基重悬后计数,稀释细胞悬液,按每孔调整浓度控制在104/ml;
2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板,复设5个平行孔;
3、分别于转染1~6天时,弃掉各孔培养基,加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液,每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒,摇床上震荡10min,使结晶物充分溶解,酶联免疫仪检测490nm处吸光度值;
4、统计每天的细胞吸光度值,得到的数值用曲线图表示。
5、结果
结果如图4所示,与对照相比,转染siRNA2组的细胞增殖显著增加。
实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验
RNA干扰后第六天收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞,重悬于培养液中,使细胞终浓度为106/ml,吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察ARHGAP27基因沉默对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。
1、将Matrigel放入4℃融化,准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用,终浓度为1mg/ml。
2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中,向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1,37℃,细胞培养箱放置3~4h使胶凝聚。
3、收集对数生长期的细胞,重悬于培养液中,终浓度为106/ml,轻轻加100μ1细胞悬液入小室。
4、24孔板中加入600μ1含20%血清的培养基,37℃、5%CO2孵箱内孵育36h。
5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞,用甲醛固定小室底端的细胞,室温放置25min,取出小室后晾干。
6、.4%结晶紫染色10min,生理盐水快速洗涤三次,甩干后显微镜下观察,随机选择八个不同的视野照相并计数,统计结果并分析。
7、数据处理
用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
8结果
结果如图5所示,HTR-8/SVneo、siRNA2、siRNA-NC在transwell小室中培养后,siRNA2组细胞膜下室面的细胞数增加,提示改变ARHGAP27基因的表达水平可以用于子痫前期患者的治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
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