JP2001078773A

JP2001078773A - 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法

Info

Publication number: JP2001078773A
Application number: JP25509299A
Authority: JP
Inventors: Masataka Shiraki; 正孝白木; Yasuyoshi Ouchi; 尉義大内; Takayuki Hosoi; 孝之細井
Original assignee: Nissho Corp
Current assignee: Nissho Corp
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2001-03-27
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: JP4048555B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ヒト由来試料に含まれるゲノムＤＮＡか
ら、ビタミンＤ受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝
子のそれぞれの多型を分析し、該遺伝子多型の組み合わ
せに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆症治療薬に対する
感受性において特定の優先性を示すヒト由来のものであ
ると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測
方法。【効果】本発明の方法によれば、投薬前にどの骨粗鬆症
治療薬が対象患者に対して最も治療効果が高いかを予測
することができるので、適切な薬剤の選択が可能とな
り、患者のＱＯＬを向上させるのに極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、骨粗鬆症の治療に
おいて有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分
析方法に関し、さらに詳細には、ヒト由来試料中に存在
するゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み合わせから、該試
料が骨粗鬆症治療薬剤に対する感受性において、特定の
優先性を示すヒト由来のものであると予測する方法に関
する。また、本発明は上記の方法において使用し得る遺
伝子多型分析用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウ
ムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ骨組織の
微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやす
くなった病態である。閉経後の女性や高齢の男性に多
く、我が国の患者数は推定１，０００万人いわれてい
る。人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増
加するものと予測される。

【０００３】現在、骨粗鬆症の治療薬として、カルシウ
ム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の
骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々
の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によっ
てまちまちであり、それらをどのように使い分けるかに
ついての検討はほとんどなわれていない。これらの治療
薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最
も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数
年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかない
のが現状であり、極めて非効率的である。

【０００４】一方、近年の遺伝子研究から、いくつかの
遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性と
の関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体
（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エ
クソンの間のイントロン領域内でApa Iにより切断され
ない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝
子型ａに比べてビタミンＤに対して高感受性であるとの
報告がある（例えば、特開平8-126497号公報および特開
平8-126500号公報参照）。

【０００５】また、白木ら〔１９９７年骨代謝学会要旨
集５２頁〕には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感受
性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子の
多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以
下、ＡｐｏＥ）遺伝子の多型とビタミンＫ2感受性につ
いて調べた結果、ＶＤＲ遺伝子型ＡＡＢＢまたはＡＡＢ
ｂ（ＡおよびＢはそれぞれ第８エクソンと第９エクソン
の間のイントロン領域内で、ApaIおよびBsm Iにより切
断されない遺伝子型）はａａｂｂに比べて、ビタミンＤ
3に対する感受性が有意に低く、また、ＥＲ遺伝子型Ｐ
ｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu IIおよびXba Iで切
断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群に比べてエスト
ロゲンに対する感受性が有意に高く、さらに、ＡｐｏＥ
4(+)群はＡｐｏＥ4(-)群に比べて、ビタミンＫ2に対す
る感受性が有意に低かったと記載されている。

【０００６】さらに、ビタミンＤ結合蛋白（ＤＢＰ）遺
伝子をHae IIIおよびStyIで切断して得られるＲＦＬＰ
パターンが、ＧＣ２−２型のものは、他の群に比べてビ
タミンＤ類に対する感受性が高いと記載されている（特
開平8-201373号公報）。

【０００７】しかしながら、これらはいずれも１遺伝子
の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するもので
あり、１つの薬剤について、他の遺伝子型よりも感受性
が高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、Ｖ
ＤＲ遺伝子型がａａｂｂでかつＡｐｏＥ遺伝子型がＡｐ
ｏＥ4(-)である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およびＡｐｏ
Ｅ遺伝子型を有する人に比べて、ビタミンＤおよびビタ
ミンＫ２に対する感受性が高いと予測されるが、それで
は、このような遺伝子型を有する患者に対してビタミン
Ｄを投与するのとビタミンＫ２を投与するのとでは、ど
ちらがより高い治療効果が得られるかについては、依然
として予測することができない。従って、結局のとこ
ろ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより感受性が高
いかを知るには、上述のように、実際に各薬剤を、１つ
の薬剤について数年間のスパンで順次患者に投与して結
果を見るしかなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症す
る可能性のある人が、複数の骨粗鬆症薬のいずれに対し
てより高い感受性を有するかを予測する手段を提供する
ことであり、それによって治療効果の低い薬剤の長期投
与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬ（Quality
of life）を向上することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡを
含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子およびＡｐｏＥ
遺伝子の多型について分析することにより、得られる多
型の組み合わせに基づいて、ビタミンＤおよびビタミン
Ｋ2のうちのいずれかの薬剤に対する感受性が、他方の
薬剤に対する感受性に比べて高いかを予測することが可
能であることを見出した。すなわち、他の遺伝子型に比
べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の
遺伝子型に比べてビタミンＫ2に高感受性のＡｐｏＥ遺
伝子型を有する場合、ビタミンＤよりもビタミンＫ2に
対してより感受性が高い傾向を見出し、本発明に到達し
た。

【００１０】すなわち、本発明はヒトから採取した試料
中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝
子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子のそれぞれの遺伝子型を
分析し、これらの遺伝子型の組み合わせに基づいて、該
試料が複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特
定の優先性を示すヒト由来のものであることを予測する
ことを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法である。

【００１１】また、本発明はビタミンＤ受容体遺伝子を
特異的に増幅し得るプライマー対およびアポリポ蛋白Ｅ
遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／ま
たはビタミンＤ受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズ
し得る核酸プローブおよびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子と特異
的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含むことを特
徴とするヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用
キットである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の分析方法に供され得るヒ
ト由来試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれ
ば特に限定されない。たとえば、ヒト各種細胞、組織な
どから単離されたゲノムＤＮＡが含まれる。好ましく
は、全血、分画された血球細胞、擦過診材料として使用
される表皮細胞や粘膜細胞、あるいは毛髪など、入手が
容易で且つＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡ使用として、従来から
使用されている細胞、組織などが例示される。この場
合、例えば細胞、組織などを水中で煮沸したり、あるい
はアルカリ溶液中で加熱することにより、細胞を破砕し
てゲノムＤＮＡ試料とする。ゲノムＤＮＡの抽出は、Ｓ
ＤＳ／フェノール法、グアニジンチオシアネート法、Ｃ
ＴＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。

【００１３】本発明の分析方法は、ＶＤＲ遺伝子および
ＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子多型を分析することを
特徴とする。ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）とは、ビタミ
ンＤの効果発現系において大きな役割を果たす４２７個
のアミノ酸配列を有する蛋白質である。ビタミンＤが骨
およびカルシウム代謝の有力な制御因子であることか
ら、ＶＤＲも骨量などに大きく関っている。ＶＤＲ遺伝
子とは第１２番染色体上に存在する上記ＶＤＲをコード
する遺伝子である。ＶＤＲ遺伝子の多型の１つは、第８
エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内での制
限酵素Bsm Iによる切断の可否によって検出される。Bsm
Iで切断されない対立遺伝子をＢ、同酵素によって切断
される対立遺伝子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂ
の３つの遺伝子型をとり得る。しかし、本発明において
は、ＶＤＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子
型B(+)（すなわち、ＢＢおよびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを
有しない遺伝子型B(-)（すなわち、ｂｂ）とに類別され
る。なお、ＶＤＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｂ
の第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内
のBsm I制限部位（ＧＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂ
のそれに対応する部位（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとす
る。

【００１４】ＡｐｏＥ蛋白とは、リポ蛋白によるトリグ
リセリドやコレステロールの輸送に関与する蛋白であ
り、さらにリポ蛋白を介したビタミンＫ２の転送に関与
する蛋白でもあり、２９９個のアミノ酸配列を有する。
ＡｐｏＥ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３お
よびＥ４）が知られており、このうち、Ｅ３が野性型で
あると考えられている。Ｅ4は第１１２番目のシステイ
ン（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）
に置換されたものである。また、Ｅ２は第１５８番目の
アルギニンがシステインに置換されたものである。Ａｐ
ｏＥ遺伝子とは第１９番染色体上に存在し、上記Ａｐｏ
Ｅをコードする遺伝子であり、４つのエクソンと３つの
イントロンからなる。上記３つのアイソフォームが存在
することから、ＡｐｏＥ4対立遺伝子は変異部位におい
て、制限酵素Hha Iにより切断されるが、ＡｐｏＥ2およ
びＡｐｏＥ3対立遺伝子は同部位において同酵素により
切断されない。また、ＡｐｏＥ2、ＡｐｏＥ3およびＡｐ
ｏＥ4対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2
/2、2/3、2/4、3/3、3/4および4/4の遺伝子型をとり得
る。しかし、本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型は
対立遺伝子４を有する遺伝子型4(+)（すなわち、2/4、3
/4および4/4）と、対立遺伝子４を有しない遺伝子型4
(-)（すなわち、2/2、2/3および3/3）とに分類する。な
お、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子４の第
１１２コドンにおけるHhaI制限部位（ＧＣＧＣ）および
対立遺伝子２および３のそれに対応する部位（ＧＴＧ
Ｃ）をいうものとする。

【００１５】本発明において、ビタミンＤ受容体遺伝子
およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせ
は、[B(-)4(-)], [B(-)4(+)], [B(+)4(-)]および[B(+)4
(+)]からなる群より選択されるいずれかである（ここ
で、Bは第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン
領域内でBsm Iにより切断されないビタミンＤ受容体対
立遺伝子を、4はＡｐｏＥ4型アポリポ蛋白Ｅ対立遺伝子
をそれぞれ表し、(+)または(-)はその対立遺伝子を有す
る、または有しないことをそれぞれ表している）。

【００１６】本発明の遺伝子多型の測定法は、ＶＤＲ遺
伝子の多型B(+)とB(-)およびＡｐｏＥ遺伝子の多型4(+)
と4(-)をそれぞれ区別し得る方法であれば、特に制限さ
れず、サザンハイブリダイゼーション法、シーケンス
法、ＰＣＲ法等の通常ゲノムＤＮＡの検出・分析法を適
宜組み合わせた種々の方法が利用できる。

【００１７】これら遺伝子多型の測定法法は、その原理
に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型部
位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を決
定するか、あるいは特異的なプローブまたはプライマー
を用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部位
を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳動
により多型を判別する方法、および（３）多型部位での
制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動により
多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法とし
ては、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプロー
ブ（sequence-specific oligonucleotide probe;ＳＳＯ
Ｐ）法、アレル特異的増幅（mutant allelespecific am
plification;ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。

【００１８】シーケンス法では、まず、ＶＤＲ遺伝子お
よびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む
適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プ
ライマー対を合成する。該プライマー対は約１５〜４０
塩基であり、通常のＰＣＲプライマーに要求される好適
な条件を満たすものであれば特に制限されない。次い
で、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型として
ＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させる。ＰＣ
Ｒの反応条件は通常使用される範囲で適宜選択すること
ができる。各遺伝子断片の増幅は別個に行っても同時に
行ってもよい。得られた増幅断片を適当なベクターにそ
れぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバート法や
ジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより、各多型
部位の塩基配列を決定することができる。また、サブク
ローニングすることなく、直接サイクルシーケンス法に
より配列決定することもできる。

【００１９】ＳＳＯＰ法は、多型部位を含む約１５〜１
００塩基の一方の対立遺伝子配列に完全に相補的なプロ
ーブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密に制
御しながら、ヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡと
サザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形
成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハイ
ブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行っても
同時に行ってもよい。但し、本発明において測定される
３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換であるので、
ミスマッチを含むプローブとの交叉反応を防ぐためには
ハイブリダイゼーション条件を高度に制御する必要があ
る。また、ミスマッチによる不安定化効果を最大限にす
るために、プローブの中央付近に多型部位が存在するよ
うにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法
として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を
含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が
挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２
つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共
存化にハイブリダイゼーションを行う競合的ハイブリダ
イゼーション法は、ハイブリダイゼーション条件を厳密
に制御することなく１塩基置換を判別することができ
る。

【００２０】ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜４
０塩基の一方の対立遺伝子配列に完全相同的（または完
全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとして合
成し、アニーリング温度を厳密に制御しながら、ヒト由
来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在の有
無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法も上
記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高度に
制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中で反
応を行えば、比較的容易に正確な判断が可能である。

【００２１】上記（２）の方法としては、以下のＰＣＲ
−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphis
m）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denatureing gradient gel
electrophoresis）法、ＯＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fr
agment length polymorphism）法等が挙げられる。これ
らの方法は、いずれも（１）のシーケンス法と同様にし
て、多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を
増幅することを第一の工程として含む。

【００２２】ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、増幅産物を加熱
またはアルカリ処理等により一本鎖に変成する。一本鎖
に解離したＤＮＡ断片はその配列に依存した独自の高次
構造を形成するので、これをポリアクリルアミドゲル等
の非変成ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換
の多型を移動度の差として検出することができる。

【００２３】ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法では、増幅産物を変
成、再合成させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムア
ミドなど）の濃度勾配をつけた変成ゲル上で電気泳動す
る。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温
度（Ｔｍ）を変化させるので異なる変性剤濃度の位置で
部分解離し、その結果、異なる移動度を示す。特に、ヘ
テロ接合体のＤＮＡの場合、変成・再会合により、野性
型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを
有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるの
で、４本のバンドが検出される。但し、最もＴｍの高い
ドメイン中に変異を有する場合は移動度に差を生じな
い。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５
０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その
部分が最もＴｍの高いドメインになるので、多型を移動
度の差として検出することができる。

【００２４】ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法は、増幅産物を加熱ま
たはアルカリ処理等により一本鎖に変成し、さらにクレ
バーゼ（cleavase）と呼ばれるヘアピン構造を認識して
切断する酵素で処理した後、ゲル電気泳動を行う方法で
あり、多型によるヘアピン構造の有無またはヘアピン形
成部位の相違をバンドの数および／または移動度の差と
して検出することができる。

【００２５】上記（３）の方法も、迅速且つ簡便に遺伝
し多型を測定できるので好ましい。このような方法とし
ては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられ
る。

【００２６】ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離した
ゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し
得る制限酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流
および下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他
の制限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全
配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを
行い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する
方法である。本発明においてはＶＤＲ遺伝子の分析には
Bsm Iが、ＡｐｏＥ遺伝子の分析にHha Iがそれぞれ使用
される。

【００２７】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＶＤＲおよびＡｐ
ｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長
さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー
対を合成し、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳
型としてＰＣＲを行い、目的の遺伝子断片を増幅させた
後、増幅産物について上記のＲＦＬＰ法と同様の制限酵
素処理を行い、ゲル電気泳動してバンドの長さおよび数
から判別する方法である。また、ＰＣＲに先立って制限
酵素処理を行えば制限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子
増幅されないので、バンドの有無により多型を判別する
ことができる。

【００２８】上記のような本発明の多型分析により、ヒ
ト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺
伝子多型の組み合わせに基づいて、[B(-)4(-)], [B(-)4
(+)], [B(+)4(-)]および[B(+)4(+)]に類別される。

【００２９】本発明は、上記の遺伝子多型の組み合わせ
に基づいて、該ヒト由来試料が複数の骨粗鬆症治療薬に
対する感受性において特定の優先性を示すヒト由来のも
のであると予測することを特徴とする。本発明におい
て、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミンＤ
およびビタミンＫ２である。また、ここで骨粗鬆症治療
薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗鬆症治療効果の度
合いの大きさを意味する。すなわち、ある患者において
薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場合には、「その
患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに対する感受性に
比べて高い」。本発明においては、薬剤投与前後での骨
塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨塩量変化率］−
［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、その薬剤に対す
る感受性が高いと定義する。

【００３０】本発明の分析方法では、ＶＤＲ遺伝子およ
びＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)4
(-)]および[B(+)4(-)]の場合、ビタミンＫ2に対する感
受性が、ビタミンＤに対する感受性に比べて高いヒト由
来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが[B
(-)4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミ
ンＫ2に対する感受性に比べて高いヒト由来の試料であ
ると予測することを特徴とする。

【００３１】本発明はまた、上記の分析方法を実施する
のに有用なゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キ
ットを提供する。本発明のキットは、ＶＤＲ遺伝子を特
異的に増幅し得るプライマー対およびＡｐｏＥ遺伝子を
特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはＶＤ
Ｒ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ
およびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る
核酸プローブを含む。

【００３２】多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯ
Ｐ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣ
Ｒ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多
型部位を内部に含む各遺伝子断片を増幅し得るように、
各遺伝子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位より
も下流の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドが使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、
一方のプライマーは、遺伝子の多型部位を含む領域に完
全相同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセン
ス）な塩基配列を有するものである。

【００３３】また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場
合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部を含むも
のであれば特に制限されず、多型部位の配列を必ずしも
含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法またはＰ
ＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブは、各遺
伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的な塩基配
列を有するものである。

【００３４】本発明のキットは、本発明の分析方法を実
施するのに好適な各種試薬および／または器具等をさら
に含んでいてもよい。

【００３５】

【実施例】以下、参考例および実施例を用いて、本発明
を詳細に説明する。

【００３６】参考例１無作為に選んだ閉経後の１５１人の日本人女性から血液
を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮ
Ａを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型として、下記
のプライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片およびＡｐｏ
Ｅ遺伝子断片をそれぞれ個別に増幅した。ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー：センス： 5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-
3'（配列番号１）アンチセンス： 5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3'（配
列番号２）ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマーセンス： 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'
（配列番号３）アンチセンス： 5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'
（配列番号４）

【００３７】ＰＣＲ条件は、ＶＤＲ遺伝子については、
変成９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０秒；
伸長：７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＡｐｏＥ遺伝
子については、変成：９４℃、３０秒；アニーリング：
６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３０サイク
ル）であった。このＰＣＲ増幅により、多型部位を含む
７．２ｋｂｐのＶＤＲ遺伝子段の案および２４４ｂｐの
ＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得られた。

【００３８】ＶＤＲ遺伝子増幅反応液をBsm Iで、Ａｐ
ｏＥ遺伝子増幅反応液をHha Iでそれぞれ処理した後、
アガロースゲル電気泳動にかけた。各増幅産物が多型部
位において制限酵素で切断され場合、ＶＤＲ増幅産物で
は４．６ｋｂｐと２．６ｋｂｐ、ＡｐｏＥ増幅産物では
７２、４８、３８、３５、１９、１７および１５ｂｐの
バンドが検出された。４型を持たない（すなわち、4
(-)）場合は認められない７２ｂｐのバンドが検出され
た。泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色
し、バンドパターンからＶＤＲおよびＡｐｏＥの遺伝子
型を判別し、４つの多型群に類別した（表２）。

【００３９】上記のように多型分析を行った日本人女性
１５１人の骨塩量をそれぞれ測定した。次いで、これら
の患者にビタミンＤ３またはビタミンＫ２のいずれかを
６ヶ月間投与した。投与量はビタミンＤ３が１μｇ／日
およびビタミンＫ２が４５ｍｇ／日であった。６ヶ月後
に再度骨塩量を測定し、薬剤投与前の骨塩量に対する変
化率を求めた。各遺伝子型別の平均骨塩量変化率から各
薬剤の治療効果期待値（無作為に抽出した患者に対する
全平均治療効果；表１）を差し引いた値を各遺伝子型に
おける薬剤感受性とした。その結果を表２に示す。

【００４０】

【表１】６ヶ月薬剤投与後の期待治療効果（骨塩量変化
率）値（単位：％）

【００４１】

【表２】遺伝子型別平均治療効果（％）−期待治療効果
（％）

【００４２】表２から明らかなように、遺伝子型が[B
(-)4(-)]および[B(+)4(-)]の場合、ビタミンＫ2に対す
る感受性が、ビタミンＤに対する感受性に比べて高く、
遺伝子型が[B(-)4(+)]の場合ビタミンＤに対する感受性
が、ビタミンＫ2に対する感受性に比べ高かった。

【００４３】実施例１ある日本人の骨粗鬆症患者から血液を採取し、血球細胞
を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。
該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例１と同様の方法でＶ
ＤＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得
られた遺伝子型が[B(-)4(-)]および[B(+)4(-)]の場合、
該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ２に対する感受性が、ビ
タミンＤに対する感受性に比べ高いヒト由来のものであ
ると判定し、遺伝子型が[B(-)4(+)]の場合、該ゲノムＤ
ＮＡは、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2に
対する感受性比べて高いヒト由来主のであると判定す
る。

【００４４】

【発明の効果】本発明の分析方法によれば、投薬前に対
象となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性
が高いかを高い確率で予測することができるので、適切
な薬剤選択が可能となる。したがって、治療効果の乏し
い薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避す
ることができ、患者のＱＯＬを向上することができる点
で有用である。

【００４５】

【配列表】 <110> NISSHO CORPORATION <120> Method for Expecting Sensitivity to Pharmaceutical Agent for Oste oporosis <130> <160> 4 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed to act as promer for amplifying VDR gene fragment containing polymorphic site. <400> 1 caaccaagac tacaagtacc gcgtcagtga 30

【００４６】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed to act as promer for amplifying VDR gene fragment containing polymorphic site. <400> 2 aaccagcggg aagaggtcaa ggg 23

【００４７】 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed to act as promer for amplifying ApoE gen e fragment containing polymorphic site. <400> 3 taagcttggc acggctgtcc aagga 25

【００４８】 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed to act as promer for amplifying ApoE gen e fragment containing polymorphic site. <400> 4 acagaattcg ccccggcctg gtacac 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 BA63 BA65 CA03 DA03 EA04 GA11 HA14 4B063 QA19 QQ03 QQ43 QR32 QR55 QS25 QS34 4C086 AA01 AA02 DA14 MA01 MA05 NA14 ZA97 ZC78 4C206 AA01 AA02 CB28 MA01 MA05 NA14 ZA97 ZC78

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトから採取した試料中に含まれるゲノ
ムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子およびアポリポ
蛋白Ｅ遺伝子のそれぞれの遺伝子型を分析し、これらの
遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨
粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示
すヒト由来のものであると予測することを特徴とする骨
粗鬆症薬剤感受性予測方法。
【請求項２】ビタミンＤ受容体遺伝子およびアポリポ
蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)4
(-)], [B(-)4(+)], [B(+)4(-)]および[B(+)4(+)]からな
る群より選択されるいずれかである請求項１記載の方法
（ここで、Ｂは第８エクソンと第９エクソンの間のイン
トロン領域内でBsm Iにより切断されないビタミンＤ受
容体対立遺伝子を、４はＡｐｏＥ4型アポリポ蛋白Ｅ対
立遺伝子をそれぞれ表し、(+)または(-)はその対立遺伝
子を有する、または有しないことをそれぞれ表してい
る）。
【請求項３】複数の骨粗鬆症治療薬がビタミンＤおよ
びビタミンＫ2である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】ビタミンＤ受容体遺伝子およびアポリポ
蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子型の組み合わせが、[B(-)4(-)]お
よび[B(+)4(-)]の場合、ビタミンＫ2に対する感受性が
ビタミンＤに対する感受性に比べて高いヒト由来の試料
であると予測することを特徴とする請求項３記載の方
法。
【請求項５】ビタミンＤ受容体遺伝子およびアポリポ
蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子型の組み合わせが、[B(-)4(+)]の
場合、ビタミンＤに対する感受性がビタミンＫ2に対す
る感受性に比べて高いヒト由来の試料であると予測する
ことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】ビタミンＤ受容体遺伝子を特異的に増幅
し得るプライマー対およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を特異
的に増幅し得るプライマー対、および／またはビタミン
Ｄ受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プ
ローブおよびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子と特異的にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを含むことを特徴とするヒト
ゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キット。