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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft genetische Polymorphismen, die bei
der Beurteilung des cardiovaskulären
Status im Menschen verwendet werden können.
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Hintergrund der Erfindung
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Das
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) spielt eine wichtige
Rolle in der cardivaskulären Physiologie
von Säugern.
Insbesondere reguliert das RAAS die Salz-Wasser-Homöostasie
und die Aufrechterhaltung des vaskulären Tonus. Das Stimulieren
oder Inhibieren dieses Systems erhöht bzw. senkt den Blutdruck,
und Störungen
in diesem System können
beispielsweise bei der Etiologie von Hypertonie, Schlaganfall und
Myocard-Infarkt
beteiligt sein. Das RAAS-System hat möglicherweise auch andere Funktionen,
wie beispielsweise die Kontrolle von Zellwachstum. Das Renin-Angiotensin-System
umfasst zumindest Renin, Angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE),
Angiotensinogen (AGT), Typ-1-Angiotensin-II-Rezeptor
(AT1) und Typ-2-Angiotensin-II-Rezeptor (AT2).
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AGT
ist das spezifische Substrat für
Renin, eine Aspartylprotease. Das menschliche AGT-Gen enthält fünf Exons
und vier Introns, die 13kb umspannen (Gaillard et al., DNA 8: 87-99,
1989; Fukamizu et al., J. Biol. Chem. 26: 7576-7582; 1990). Das
erste Exon (37 bp) kodiert die 5'-untranslatierte
mRNA-Region. Das zweite Exon kodiert das Signalpeptid und die ersten
252 Aminosäuren
des reifen Peptids. Die Exons 3 und 4 sind kürzer und kodieren 90 bzw. 48
Aminosäuren.
Exon 5 enthält
eine kurze kodierende Sequenz (62 Aminosäuren) und die 3'-untranslatierte
Region.
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Plasma-AGT
wird primär
in der Leber synthetisiert, und seine Expression wird positiv mittels Östrogenen,
Glucocorticoiden, Thyroidhormonen und Angiotensin-II (Ang II) reguliert
(Clauser et al., Am. J. Hypertension 2: 403-410, 1989). Die Abtrennung
des aminoterminalen Segments von AGT durch Renin setzt ein Decapeptid-Prohormon,
Angiotensin-I, frei, welches durch Dipeptidylcarboxypeptidase, sogenanntes
Angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE), weiter in das aktive Octapeptid
Angiotensin-II umgewandelt wird. Bei der Abspaltung des AGT durch
Renin handelt es sich um den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt
bei der Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems.
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Einige
epidemiologische Beobachtungen weisen auf eine mögliche Rolle von AGT bei der
Blutdruckregulierung hin. In epidemiologischen Studien wurde eine
höchst
signifikante Korrelation zwischen der Plasma-AGT-Konzentration und
dem Blutdruck beobachtet (Walker et al., J. Hypertension 1: 287-291,
1979). Interessanterweise wurde eine Reihe von Allel-Dimorphismen
im AGT-Gen identifiziert. Die Häufigkeit
von zumindest zweien von diesen (174M und 235T) sind teilweise charakterisiert
worden und haben sich in bestimmten Populationen als signifikant
erhöht
bei Personen mit Bluthochdruck gezeigt (Jeunemaitre et al., Cell
71: 169-180, 1992). Darüber
hinaus wird angenommen, dass ein spezifischer Polymorphismus, nämlich 235T,
direkt bei der Koronar-Atherosklerose beteiligt ist (Ishigami et al.,
Circulation 91: 9514, 1995). Weiterhin wurde die Anwesenheit von
A oder G in Position 1218 der AGT-Regulierungsregion mit Unterschieden
in der in vitro-Transkriptionsfähigkeit
für dieses
Gen in Verbindung gebracht (Inuoe et al., J. Clin. Invest. 99: 1786,
1997). Weiterhin beschreibt WO 94/08048 die Assoziation von molekularen
Varianten des AGT-Gens und Hypertonie.
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Das
menschliche ACE-Gen ist ebenfalls ein Kandidat für einen Marker für Hypertonie
und Myokardinfarkt. ACE-Inihibitoren stellen einen wichtigen und
effektiven therapeutischen Ansatz bei der Kontrolle menschlicher
Hypertonie dar (Sassaho et al., Am. J. Med. 83: 227-235, 1987). Im Plasma
und auf der Oberfläche
endothelialer Zellen wandelt ACE das inaktive Angiotensin-I-Molekül (Ang I)
in aktives Angiotensin-II (Ang II) um (Bottari et al., Front. Neuroendocrinology
14: 123-171, 1993). Bradykinin, ein wirksamer Vasodilator und Inhibitor
von Weichmuskel-Zellproliferation, ist ein weiteres ACE-Substrat,
welches durch ACE inaktiviert wird (Ehlers et al., Biochemistry
28: 531-5318, 1989; Erdos, E. G., Hypertension 16: 363-370, 1990;
Johnston, C. I., Drugs (Ergänzungsband.
1) 39: 21-31, 1990).
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Die
ACE-Spiegel sind in einem Individuum sehr stabil, unterscheiden
sich aber stark von Individuum zu Individuum. Es wird angenommen,
dass die Plasma-ACE-Spiegel als Konsequenz von diallelen Polymorphismen,
die sich innerhalb des oder nahe beim ACE-Gen befinden, genetisch
bedingt sind. Vor der vorliegenden Erfindung konnte keine definitive
Verbindung zwischen Polymorphismen und Hypertonie oder Blutdruck gezeigt
werden. Es wurde jedoch ein erhöhtes
Risiko für
Myokardinfarkt bei einer Gruppe von Personen identifiziert, die
einen sogenannten ACE-DD ACE-Polymorphismus aufweisen (Cambien et
al., Nature 359: 641-644, 1992), und ein 12-fach höheres Risiko
für Myokardinfarkt
wurde bei einer Patientenuntergruppe festgestellt, die eine Kombination
des ACE-Polymorphismus ACE-DD und einen der oben beschriebenen AGT-Polymorphismen
(235T) aufweist (Kamitani et al., Hypertension 24: 381, 1994). Kürzlich wurden
sechs ACE-Polymorphismen identifiziert und charakterisiert (Villard
et al., Am. J. Human Genet. 58: 1268-1278, 1996). Die WO 93/00360
offenbart ein Verfahren zur Detektion von Polymorphismen im ACE-Gen
mittels eines Ketten-Amplifizierungsverfahrens.
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Die
vasokonstriktiven, zellwachstumsfördernden und Salz-bewahrenden
Wirkungsweisen des Ang II erfolgen mittels Bindung an und Aktivierung
von Angiotensionrezeptoren, von denen mindestens zwei Typen geklont
wurden (AT1 und AT2). Der Typ-1-Ang-II-Rezeptor (ATi), ein G-Protein-gekoppeltes
sieben Transmembrandomänen
umfassendes Protein, ist im Körper
weit verbreitet und vermittelt fast alle bekannten Ang II-Wirkungen
(Fyhrquist et al., J. Hum. Hypertension 5: 519-524, 1995).
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Im
ATi-Rezeptorgen sind einige Polymorphismen identifiziert worden.
Anfängliche
Studien gehen davon aus, dass wenigstens einer von diesen (AT1166C)
gehäuft
bei hypertonischen Personen auftritt (Bonnardeaux et al., Hypertension
24: 63-69, 1994). Es wurde gezeigt, dass dieser Polymorphismus in
Kombination mit dem ACE-DD-Polymorphismus sehr stark mit dem Myokardinfarkt-Risiko
korreliert (Tiret et al., Lancet 344: 910-913, 1994). Die WO 96/05324
offenbart ein Verfahren und ein Kit zur Detektion der Prädisposition
für Myokardinfarkt
durch die Detektion einer Insertion/Deletion im ACE-Gen und eines
Polymorphismus in der Position 1166 des AT1-Gens.
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Die
hohe Erkrankungs- und Sterblichkeitsrate, die mit cardiovaskulären Erkrankungen
in Verbindung gebracht wird, zeigt die Notwendigkeit gemäß Stand
der Technik für
Verfahren und Zusammensetzungen auf, die die Bestimmung und/oder
Vorhersage des therapeutischen Vorgehens ermöglichen, welche in den positivsten
Behandlungsergebnissen bei einem Patienten resultieren, der unter
einer cardiovaskulären
Erkrankung leidet. Dies beinhaltet die Identifizierung von Individuen,
die mehr oder weniger für
bestimmte therapeutische Vorgehen, einschließlich beispielsweise bestimmter üblicherweise
bei der Behandlung cardiovaskulärer
Erkrankungen verwendeter Medikamente, empfänglich sind. Im Stand der Technik
besteht ebenfalls ein Bedarf an Verfahren und Zusammensetzungen,
welche die Identifizierung von Individuen ermöglichen, die eine Prädisposition
für cardiovaskuläre Erkrankungen,
wie z. B. Myocardinfarkt, Hypertonie, Atherosklerose und Schlaganfall
aufweisen, um eine frühe
Intervention und Erkrankungsprävention
zu erleichtern.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beurteilung des cardiovaskulären Status
bei Menschen, wie in den Ansprüchen
definiert. Der cardiovaskuläre
Status ist der physiologische Status des cardiovaskulären Systems,
der über
einen oder mehrere Statusmarker veranschaulicht wird. Ohne darauf
beschränkt
zu sein, umfassen Statusmarker klinische Parameter, wie z. B. Blutdruck
oder elektrokardiographische Profile sowie von Fachärzten vorgenommene
Diagnosen des cardiovaskulären
Status, wie z. B. akuter Myokardinfarkt, versteckter Myokardinfarkt,
Schlaganfall und Atherosklerose. Bei der Bewertung des cardiovaskulären Status
sind ebenfalls Änderungen
der Statusmarker im Laufe der Zeit umfasst. Die erfindungsgemäßen Verfahren
werden durch folgende Schritte ausgeführt:
- (i)
Bestimmung der Sequenz einer oder mehrerer polymorpher Positionen
in einem oder mehreren derjenigen Gen, die Angiotensin-konvertierendes
Enzym (ACE), Angiotensinogen (AGT) und Typ-1-Angiotensin-II-Rezeptor
(AT1) im Individuum kodieren, um ein polymorphes Muster für das Individuum
zu etablieren; und
- (ii) Vergleichen der polymorphen Muster aus (i) mit den polymorphen
Mustern von Individuen, die vorbestimmte Marker des cardiovaskulären Status
zeigen. Das polymorphe Muster des Individuums ist bevorzugt sehr ähnlich und
am meisten bevorzugt identisch mit dem polymorphen Muster von Individuen,
die bestimmte Statusmarker, cardiovaskuläre Syndrome und/oder bestimmte
Reaktionsmuster auf therapeutische Interventionen zeigen.
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Beispielsweise
kann ein Vergleich des polymorphen Musters eines Individuums mit
den polymorphen Mustern von Individuen, die unterschiedliche Reaktionen
auf eine be stimmte therapeutische Intervention zeigen, verwendet
werden, um den Grad der Reaktion des Individuums auf eine solche
Intervention vorherzusagen. In vergleichbarer Weise können die
erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, um die Prädisposition
für verschiedene
cardiovaskuläre
Syndrome vorherzusagen.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls isolierte Nukleinsäuren, die ACE, AGT und AT1
im Individuum kodieren, wobei jede einzelne wenigstens eine wie
in den Ansprüchen
definierte polymorphe Position umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen
ermöglicht
die polymorphe Position, entweder alleine oder in Kombination mit
anderen polymorphen Positionen in der Sequenz von menschlichem ACE,
AGT oder AT1 oder in einem oder mehreren menschlichen Genen, die
Vorhersage eines bestimmten Grades der Reaktion auf eine bestimmte Behandlung
und/oder indiziert eine Prädisposition
für eine
oder mehrere klinische Syndrome, die mit cardiovaskulären Erkrankungen
in Verbindung gebracht werden.
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Bei
den erfindungsgemäßen isolierten
Nukleinsäuren
(die unter Verwendung der Nummerierung in Tabelle 1, unten, beschrieben
sind) handelt es sich um:
- (i) ACE kodierende
Nukleinsäuren,
die eine oder mehrere polymorphe Positionen in der mit Nummer 5106 versehenen
Position der regulatorischen Region, den Positionen in der kodierenden
Region mit den Nummern 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 2287, 3503
und 3906; und Position 1451, wie in der Gebankzugangsnummer X62855
nummeriert, aufweisen und wobei die Sequenzen in den polymorphen
Positionen in der regulatorischen ACE-Region ausgewählt sind
aus einer oder mehreren von 5106T; und/oder die Sequenzen in den
polymorphen Positionen in der kodierenden Region ausgewählt sind
aus einer oder mehreren von 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T,
3387C, 3503G und 3906A. Die Erfindung umfasst ebenfalls eine Nukleinsäure, die
eine Deletion der Nukleotide 1451-1783, wie in Genbankzugangsnummer X62855
nummeriert, kodiert.
- (ii) AGT kodierende Nukleinsäuren
mit einer oder mehreren polymorphen Positionen in den mit 395, 412, 432,
449, 692, 839, 1007, 1072 und 1204 nummerierten Positionen in der
regulatorischen Region; in den mit 273, 912, 997, 1116 und 1174
nummerierten Position in der kodierenden Region; und Position 49,
wie in Genbankzugangsnummer M24688 nummeriert, wobei die Sequenzen
in den polymorphen Positionen in der regulatorischen AGT-Region
ausgewählt
sind aus einer oder mehreren von 412T und 1072A; die Sequenzen in
den polymorphen Positionen in der kodierenden Region ausgewählt sind
aus einer oder mehreren von 273T und 997C und die Sequenz in Position
49 in Genbankzugangsnummer M24688 entweder A oder G ist.
- (iii) AT1 kodierende Nukleinsäuren mit einer oder mehreren
polymorphen Positionen in den mit 1427, 1756, 1583, 2046, 2354,
2355 und 2415 nummerierten Positionen in der regulatorischen Region;
und in der mit 449 nummerierten Position in der kodierenden Region,
wobei die Sequenzen in den polymorphen Positionen in der regulatorischen
AT1-Region ausgewählt sind
aus einer oder mehreren von 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C
und 2415G und/oder die Sequenzen in den polymorphen Positionen in
der kodierenden Region 449C ist.
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Die
Erfindung umfasst ebenfalls Bibliotheken isolierter Nukleinsäuren, wie
in den Ansprüchen
definiert, wobei jede Sequenz in der Bibliothek eine oder mehrere
polymorphe Positionen in den für
menschliches ACE, AGT oder AT1 kodierenden Genen beinhaltet. Weiterhin
werden Nukleinsäure-Sonden,
wie in den Ansprüchen definiert,
bereitgestellt, die spezifisch mit den identifizierten polymorphen
Positionen hybridisieren; Peptide und Polypeptide, die polymorphe
Positionen umfassen; und Polymorphismus-spezifische Antikörper, d.
h. Sequenz-spezifische Antikörper,
die differenziert an polymorphe Varianten der ACE-, AGT- oder AT1-Polypeptide binden,
wie in den Ansprüchen
definiert, und die bevorzugt verwendet werden können, um bestimmte polymorphe
Varianten zu identifizieren.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Kits, wie in den Ansprüchen definiert,
zur Bestimmung der polymorphen Muster in den ACE-, AGT- und/oder
AT1-Genen eines Individuums. Die Kits umfassen Mittel zur Detektion
polymorpher Sequenzen, einschließlich, und ohne darauf beschränkt zu sein,
Oligonukleotid-Sonden, die an oder neben polymorphen Positionen
und Polymorphismus-spezifischen Antikörpern hybridisieren.
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Die
Erfindung betrifft gemäß einem
weiteren Aspekt Nukleinsäuren
und Polypeptid-Ziele,
wie in den Ansprüchen
definiert, zur Verwendung bei Screeningverfahren zur Identifizierung
geeigneter cardiovaskulärer Medikamente.
Die Nukleinsäure-Targets
können
beispielsweise DNA oder RNA sein und sind wenigstens 10 und am meisten
bevorzugt wenigstens 15 Reste lang und umfassen eine oder mehrere
polymorphe Positionen. Peptid-Targets sind wenigstens 5 Aminosäuren lang
und können
genauso groß wie
oder größer als
vollständige
ACE-, AGT- oder AT1-Polypeptide sein.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Definitionen
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- 1. Ein "Polymorphismus", wie hierin verwendet,
beschreibt eine Variation eines Gens in einem Individuum. Eine "polymorphe Position" ist eine vorbestimmte
Nukleotidposition innerhalb einer Gensequenz oder eine vorbestimmte
Aminosäureposition
in einer Polypeptidsequenz, in der sich der Polymorphismus befindet. Ein
individueller "Homozygot" für einen
bestimmten Polymorphismus liegt vor, wenn beide Kopien des Gens die
gleiche Sequenz in der polymorphen Position enthalten. Ein individueller "Heteroozygot" für einen
bestimmten Polymorphismus liegt vor, wenn die zwei Kopien des Gens
unterschiedliche Sequenzen in der polymorphen Position enthalten.
- 2. Ein "Polymorphismusmuster", wie hierin verwendet,
beschreibt einen oder mehrere Sets von Polymorphismen, die in der
Sequenz eines einzelnen Gens oder einer Mehrzahl von Genen enthalten
sein können. Ein
Polymorphismusmuster kann Nukleotid- oder Aminosäure-Polymorphismen enthalten.
- 3. "Nukleinsäure" oder "Polynukleotid", wie hierin verwendet,
bezeichnen Purin- oder Pyrimidin-enthaltende Polymere jeglicher
Länge,
entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleotide oder gemischte
Polyribo-Polydesoxyribonukleotide. Nukleinsäuren umfassen, ohne darauf
beschränkt
zu sein Einzelstrang oder Doppelstrang-Moleküle, d. h. DNA-DNA-, DNA-RNA-
und RNA-RNA-Hybride sowie "Proteinnukleinsäure" (PNA), welche durch
Konjugation von Basen an ein Aminosäure-Skelett gebildet wird.
Dies beinhaltet auch modifizierte Basen enthaltende Nukleinsäuren.
- 4. Eine "isolierte" Nukleinsäure oder
ein "isoliertes" Polypeptid, wie
hierin verwendet, bezeichnet eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, welches)
aus der ursprünglichen
Umgebung entfernt wird (z. B. aus der natürlichen Umgebung, sofern sie
natürlich
vorkommen). Eine) isoliertes) Nukleinsäure oder Polypeptid beinhaltet
weniger als 50 %, bevorzugt weniger als 75 % und am meisten bevorzugt
weniger als 90 % der zellulären
Komponenten, mit denen es ursprünglich
assoziiert war.
- 5. Eine Nukleinsäure-
oder Polypeptidsequenz, die von einer bestimmten Sequenz "abgeleitet" ist, bezeichnet
eine Sequenz, die einer Region der bestimmten Sequenz entspricht.
Im Falle von Nukleinsäuresequenzen
umfasst dies Sequenzen, die homolog oder komplementär zu der
Sequenz sind.
- 6. Eine "Sonde" bezeichnet eine
Nukleinsäure
oder ein Oligonukleotid, welches) aufgrund der Komplementarität wenigstens
einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in der Ziel-Nukleinsäure Hybridstrukturen mit
einer Sequenz in einer Ziel-Nukleinsäure bildet.
- 7. Nukleinsäuren
sind zueinander "hybridisierbar", wenn sich wenigstens
ein Strang der Nukleinsäure
unter definierten stringenten Bedingungen an einen anderen Nukleinsäurestrang
anlagert. Die Stringenz der Hybridisierung wird beispielsweise bestimmt
durch a) die Temperatur, bei der die Hybridisierung und/oder das Waschen
durchgeführt
wird und b) die Ionenstärke
und Polarität
(z. B. Formamid) der Hybridisierungs- und Waschlösungen, sowie durch andere
Parameter. Für
die Hybridisierung ist es notwendig, dass die beiden Nukleinsäuren im
Wesentlichen komplementäre
Sequenzen beinhalten; je nach Stringenz der Hybridisierung können jedoch
Ungleichheiten toleriert werden. Die angemessene Stringenz für die Hybridisierung
von Nukleinsäuren
ist abhängig
von der Länge
der Nukleinsäuren
und vom Grad der Komplementarität,
von Variablen, die dem Fachmann geläufig sind. Beispielsweise steht "hohe Stringenz", wie hierin verwendet,
für eine
Hybridisierung bei 68 °C
in 0,2XSSC, bei 42 °C
in 50 % Formamide, 4XSSC oder unter Bedingungen, die einen Hybridisierungsgrad
bewirken, der dem unter einem dieser beiden Bedingungen beobachteten entspricht.
- 8. Ein "Gen" für ein bestimmtes
Protein, wie hierin verwendet, bezeichnet eine zusammenhängende Nukleinsäuresequenz,
die einer in einem Genom vorliegenden Sequenz entspricht, welche
(i) eine "kodierende Region", umfassend Exons
(d. h. Sequenzen, die eine Polypeptidsequenz kodieren oder "Protein-kodierende
Sequenzen"), Introns
und Se quenzen an den Verknüpfungspunkten
zwischen Exons und Introns; und (ii) regulatorische Sequenzen, die
die kodierende Region sowohl am 5'- als auch am 3'-Terminus flankieren, umfasst. Beispielsweise
umfasst das "ACE-Gen", wie hierin verwendet,
die regulatorischen und kodierenden Regionen des menschlichen Gens,
das für
Angiotensin-konvertierendes Enzym kodiert. In ähnlicher Weise umfasst das "AGT-Gen" die regulatorischen
und kodierenden Regionen des menschlichen Gens, das für Angiotensinogen
kodiert, und das "AT1-Gen" umfasst die regulatorischen
und kodierenden Regionen des menschlichen Gens, das für Typ-I-Angiotensin-II-Rezeptor
kodiert. Typischerweise befinden sich die erfindungsgemäßen regulatorischen
Sequenzen in der 5'-Position
(d. h. aufwärts)
des Segments der kodierenden Region. Die aus der Genbank bezogenen
Referenz-Sequenzen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
verwendet wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Die
Erfinder haben überraschend
und unerwartet die Existenz genetischer Polymorphismen innerhalb der
menschlichen Gene gefunden, die ACE, AGT und AT1 kodieren, die einzeln
oder in Kombination zur Bewertung des cardiovaskulären Status
verwendet werden können.
Erfindungsgemäß können die
polymorphen Muster der ACE-, AGT- und/oder AT1-Sequenzen in einem
Individuum für
die Vorhersage der Ansprechbarkeit des Individuums auf bestimmte
therapeutische Interventionen verwendet werden und dienen als Indikator
von Prädispositionen
für unterschiedliche
Formen cardiovaskulärer
Erkrankungen. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bewertung des
cardiovaskulären
Status durch die Detektion polymorpher Muster im Individuum. Die
vorliegende Erfindung betrifft auch aus ACE-, AGT- und AT1-Genen
abgeleitete isolierte Nukleinsäuren,
die diese Polymorphismen umfassen, einschließlich den Sonden, die spezifisch
mit polymorphen Positionen hybridisieren; isolierte Polypeptide
und Peptide, die polymorphe Reste umfassen; und Antikörper, die
spezifisch die ACE-, AGT- oder AT1-Polypeptide erkennen, die eine
oder mehrere polymorphe Aminosäuren
beinhalten.
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Verfahren zur Beurteilung
des cardiovaskulären
Status
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Die
vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Verfahren zur Bewertung
des cardiovaskulären
Status eines menschlichen Individuums. Wie hierin verwendet, bezieht
sich der cardiovaskuläre
Status auf den physiologischen Status des cardiovaskulären Systems
eines Individuums, wie er durch einen oder mehrere Marker oder Indikatoren
wiedergegeben wird. Statusmarker umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein,
klinische Messgrößen, wie
z. B. Blutdruck, Elektrokardiogrammprofil und differenzierte Blutflussanalyse.
Die erfindungsgemäßen Statusmarker
umfassen die Diagnose eines oder mehrerer cardiovaskulärer Syndrome,
wie z. B. Hypertonie, akuten Myokardinfarkt, versteckten Myokardinfarkt,
Schlaganfall und Atherosklerose. Dass die Diagnose eines cardiovaskulären Syndroms
durch einen Arzt sowohl klinische Messgrößen als auch medizinische Beurteilung
einschließt,
versteht sich von selbst. Die erfindungsgemäßen Statusmarker werden unter
Verwendung von herkömmlichen,
dem Fachmann bekannten Verfahren bewertet. Die Bewertung des cardiovaskulären Status
beinhaltet auch im Lauf der Zeit auftretende quantitative oder qualitative
Veränderungen
in den Statusmarkern, wie sie auch beispielsweise bei der Bestimmung
der Reaktion eines Individuums auf ein bestimmtes therapeutisches
Vorgehen verwendet würden.
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Die
Verfahren werden in folgenden Schritten ausgeführt:
- (i)
Bestimmung der Sequenz einer oder mehrerer polymorpher Positionen
in einem oder mehreren Genen die Angiotensin-konvertierendes Enzym
(ACE), Angiotensinogen (AGT) oder Typ-1-Angiotensin-II-Rezeptor
(AT1) im Individuum kodieren, um ein polymorphes Muster für das Individuum
zu etablieren; und
- (ii) Vergleichen des nach (i) etablierten polymorphen Musters
mit den polymorphen Mustern von Menschen, die unterschiedliche Marker
des cardiovaskulären
Status zeigen. Das polymorphe Muster des Individuums wird bevorzugt
sehr ähnlich
und am meisten bevorzugt identisch mit dem polymorphen Muster von
Individuen sein, die bestimmte Statusmarker, cardiovaskuläre Syndrome
und/oder bestimmte Reaktionsmuster auf therapeutische Interventionen
zeigen. Polymorphe Muster können
auch polymorphe Positionen in anderen Genen umfassen, die in Kombination
mit einer oder mehreren polymorphen Positionen im ACE, AGT oder
AT1 mit der Gegenwart bestimmter Statusmarker korrelieren.
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Gemäß einer
Ausführungsform
umfasst das Verfahren den Vergleich des polymorphen Musters eines Individuums
mit den polymorphen Mustern von Individuen, die auf ein bestimmtes
therapeutisches Vorgehen positiv oder negativ reagiert haben. Die
therapeutische Vorgehensweise, wie hierin angewendet, bezieht sich auf
Behandlungen, die auf die Eliminierung oder Abschwächung von
Symptomen und Ereignissen zielen, die mit cardiovaskulären Erkrankungen
in Verbindung stehen. Derartige Behandlungen umfassen, ohne darauf
beschränkt
zu sein, eine oder mehrere, ausgewählt unter Veränderung
der Ernährung,
des Lebensstils und der körperlichen
Betätigung;
invasive und nichtinvasive operative Verfahren, wie Atherectomie,
Angioplastie und koronare Bypassoperation; und pharmazeutische Interventionen,
wie die Verabreichung von ACE-Inhibitoren, Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten, Diuretica,
Alpha-Adrenorezeptor-Antagonisten, Cardialglycosiden, Phospho-diesterase-Inhibitoren,
Beta-Adrenorezeptor-Antagonisten, Calcium-Channelblockern, HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren,
Imidazolinrezeptor-Blockern, Endothelinrezeptor-Blockern und organischen
Nitriten. Interventionen mit pharmazeutischen Agenzien, von denen
noch nicht bekannt ist, welche Aktivität mit bestimmten polymorphen
Mustern korreliert, die mit cardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht
werden, sind ebenfalls umfasst. Die Erfinder haben gefunden, dass
bestimmte polymorphe Muster mit der Reaktionsfähigkeit eines Individuums auf
ACE-Inhibitoren korrelieren (s. beispielsweise Beispiel 3, unten).
Es wird zum Beispiel angenommen, dass Patienten, die Kandidaten
für ein
bestimmtes therapeutisches Vorgehen sind, auf polymorphe Muster
gescreent werden, die mit der Reaktionsfähigkeit auf dieses bestimmte Vorgehen
korrelieren.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird das Vorliegen oder Fehlen eines polymorphen Musters, welches
ACE 2193 AIG, AGR 1072 G/G und AT1 1167 A/A (siehe unten) umfasst,
in einem Individuum bestimmt, um die Reaktionsfähigkeit des Individuums auf
ACE-Inhibitoren zu identifizieren.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
beinhaltet das Verfahren den Vergleich des polymorphen Musters eines
Individuums mit den polymorphen Mustern von Individuen, die einen
oder mehrere Marker cardiovaskulärer
Erkrankungen, wie z. B. hohen Blutdruck, ein abnormes Elektrokardiogrammprofil,
Myokardinfarkt, Schlaganfall oder Atherosklerose (siehe z. B. Beispiel
2, unten), zeigen oder gezeigt haben.
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Beim
Anwenden der erfindungsgemäßen Verfahren
kann das polymorphe Muster eines Individuums bestimmt werden, indem
man vom Individuum DNA erhält
und die Sequenz an den vorbestimmten polymorphen Positionen in ACE,
AGT und AT1, wie oben beschrieben, bestimmt.
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Die
DNA kann aus jeder zellulären
Quelle erhalten werden. Beispiele von zellulären Quellen, die in der klinischen
Praxis verfügbar
sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Blutzellen, Buccalzellen,
Cervicovaginalzellen, Epithelzellen aus Urin, fötale Zellen oder jegliche Zellen,
die in Gewebe enthalten sind, die durch Biopsie erhalten werden.
Zellen können
auch aus Körperflüssigkeiten
erhalten werden, einschließlich und
ohne darauf beschränkt
zu sein aus Blut, Speichel, Schweiß, Urin, Knochenmarksflüssigkeit,
Fäzes und Gewebeausflüssen aus
Infektions- oder Entzündungsstellen.
Die DNA wird aus der zellulären
Quelle oder der Körperflüssigkeit
unter Verwendung einer der zahlreichen Verfahren extrahiert, die
für das
Fachgebiet Standard sind. Dass ein bestimmtes Verfahren zur DNA-Extraktion von der
Natur der Quelle abhängt,
versteht sich von selbst.
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Die
Bestimmung der Sequenz der extrahierten DNA an den polymorphen Positionen
in den ACE-, AGT- und/oder AT1-Genen wird mittels üblicher
Verfahren vorgenommen, einschließlich und ohne darauf beschränkt zu sein
mittels Direktsequenzierung, Hybridisierung mit Allel-spezifischen
Oligonukleotiden, Allel-spezifischer PCR, Ligase-PCR, HOT-Saltung,
denaturierender Gradientengelelektrophorese (DDGE) und Einzelstrang-Konformationspolymorphismus
(SSCP). Direktsequenzierung kann mit einem Verfahren erreicht werden,
das ausgewählt
ist unter chemischer Sequenzierung unter Verwendung des Maxam-Gilbert-Verfahrens, enzymatischer
Sequenzierung unter Verwendung des Sanger-Verfahrens, massenspektrometrische
Sequenzierung, und Sequenzierung unter Verwendung einer Chip-basierten Technologie,
ohne darauf beschränkt
zu sein (siehe z. B. Little et al., Genet. Anal. 6: 151, 1996).
Bevorzugt wird die DNA eines Individuums zunächst einer Amplifizierung mittels
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines spezifischen Amplifizierungs-Primers
unterzogen.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
wird Biopsiegewebe eines Individuums erhalten. Anschließend gibt
man Antikörper,
die in der Lage sind zwischen den unterschiedlichen polymorphen
Formen von ACE, AGT und/oder AT1 zu unterscheiden, zu den Gewebeproben
um die Gegenwart oder Abwesenheit einer polymorphen Form, die durch
den Antikörper
spezifiziert wird, zu bestimmen. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal
und bevorzugt monoklonal sein. Das Messen der spezifischen Antikörper-Bindungsfähigkeit an
die Zellen kann mittels bekannter Verfahren, wie z. B. mit quantitativer
Flusscytometrie oder mit Enzym-verknüpftem oder mit Fluoreszenz-verknüpftem Immunoassay
erreicht werden. Die Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten
Polymorphismus oder polymorphen Musters und seine Allel-Verteilung
(d. h. Homozygozität vs.
Heterozygozität)
wird durch den Vergleich der Werte, die von einem Patienten erhalten
werden, mit den festgestellten Normen von Patientenpopulationen
mit bekannten polymorphen Mustern bestimmt.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
wird RNA mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Standardverfahren,
wie Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, aus Biopsiegewebe
isoliert (Chomocyznski et al., 1987, Anal. Biochem., 162: 156).
Die RNA wird danach gekoppelter reverser Transkription und Amplifizierung
durch Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung eines spezifischen
Oligonukleotidprimers unterzogen. Die Bedingungen für das Primer-Annealing
werden so gewählt,
dass die spezifische reverse Transkription und die Amplifizierung
sichergestellt sind; somit dient das Auftreten eines Amplifizierungsprodukts
der Diagnose für
die Gegenwart bestimmter Allele. Gemäß einer weiteren Ausführungsform
wird RNA revers transkribiert und amplifiziert, wonach die amplifizierten
Sequenzen beispielsweise durch direktes Sequenzieren identifiziert
werden.
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Bei
der Ausübung
der vorliegenden Erfindung wird die Verteilung polymorpher Muster
in einer großen Anzahl
von Individuen, die bestimmte Marker des cardiovaskulären Status
zeigen, mittels irgend eines der oben beschriebenen Verfahren bestimmt
und mit der Distribution der polymorphen Muster von Patienten verglichen,
die nach Alter, ethnischer Herkunft und/oder irgendwelchen anderen
statistisch oder medizinisch relevanten Parametern zugeordnet wurden
und die quantitativ oder qualitativ unterschiedliche Statusmarker
zeigen. Die Korrelationen werden mit bekannten Verfahren des Standes
der Technik erreicht, einschließlich
Nominal-logistische Regression oder Standard-Least-Squares-Regressionsanalyse.
Auf diese Weise ist es möglich,
statistisch signifikante Korrelationen zwischen bestimmten polymorphen
Mustern und bestimmtem cardiovaskulären Status zu etablieren. Es
ist weiterhin möglich,
statistisch signifikante Korrelationen zwischen bestimmten polymorphen
Mustern und Veränderungen
im cardiovaskulären
Status, die beispielsweise aus bestimmten Behandlungsverfahren resultieren,
zu etablieren. Auf diese Weise ist es möglich, polymorphe Muster mit
der Reaktionsfähigkeit
auf bestimmte Behandlungsformen zu korrelieren.
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Polymorphe Positionen
in Genen, die ACE, AGT und AT1 kodieren
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Polymorphe
Positionen in den Genen, die ACE, AGT und AT1 kodieren und die von
der Erfindung umfasst sind, werden durch Bestimmung der DNA-Sequenz
der vollständigen
ACE-, AGT- und/oder AT1-Gene oder eines Teils davon in einer Vielzahl
von Individuen aus einer Population identifiziert. Die DNA-Sequenzbestimmung
kann mit herkömmlichen
Verfahren erreicht werden, einschließlich z. B. chemisches oder
enzymatisches Sequenzieren.
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Die
erfindungsgemäßen polymorphen
Positionen umfassen die unten aufgeführten, deren Nummerierung den
Genbank-Sequenzen aus Tabelle 1 entspricht, ohne jedoch auf diese
beschränkt
zu sein.
- (i) ACE: Positionen in der regulatorischen
Region (bezeichnet als ACR) mit den Nummern 5105, 5349 und 5496;
Positionen in der kodierenden Region (bezeichnet als ACE) mit den
Nummern 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387,
3503 und 3906; und Position 1451 wie in Genbankzugangsnummer X62855
nummeriert.
- (ii) AGT: Positionen in der regulatorischen Region (bezeichnet
als AGR) mit den Nummern 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072,
1204 und 1218; Positionen in der kodierenden Region (bezeichnet
als AGT) mit den Nummern 273, 620, 803, 912, 997, 1116 und 1174;
und Position 49 wie in Genbankzugangsnummer M24688 nummeriert.
- (iii) AT1: Positionen in der regulatorischen Region (bezeichnet
als ATR mit den Nummern 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 und 2415;
und Positionen in der kodierenden Region (bezeichnet als AT1) mit
den Nummern 449, 678, 1167 und 1271.
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Gemäß bevorzugten
Ausführungsformen
ist die Sequenz an jeder der oben genannten polymorphen Positionen
ausgewählt
aus:
- (i) ACE-regulatorische Region: 5106C,
5106T, 5349A, 5349T, 5496T und 5496C;
- (ii) ACE-kodierende Region: 375A, 375C, 582C, 582T, 731A, 731G,
1060G, 1060A, 1215C, 1215T, 2193G, 2193A, 2328A, 2328G, 2741G, 2741T,
3132C, 3132T, 3387T, 3387C, 3503G, 3503C, 3906G und 3906A; und eine
Deletion der Nukleotide 1451-1783
wie in Genbankzugangsnummer X62855 nummeriert;
- (iii) AGT-regulatorische Region: 395T, 395A, 412C, 412T, 432G,
432A, 449T, 449C, 692C, 692T, 839G, 839A, 1007G, 1007A, 1072G, 1072A,
1204C, 1204A, 1218A, 1218G;
- (iv) AGT-kodierende Region: 273C, 273T, 620C, 620T, 803T, 803C,
912C, 912T, 997G, 997C, 1116G, 1116A, 1174C und 1174A; und A und
G in Position 49 in Genbankzugangsnummer M24688;
- (v) AT1-regulatorische Region: 1427A, 1427T, 1756T, 1756A, 1853T,
1853G, 2046T, 2046C, 2354A, 2354C, 2355G, 2355C, 2415A und 2415G;
und
- (vi) AT1-kodierende Region: 449G, 449C, 678T, 678C, 1167A, 1167G,
1271A und 1271 C.
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Ein
Individuum kann homozygot oder heterozygot für eine bestimmte polymorphe
Position sein (siehe beispielsweise Tabelle 6, unten).
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Nichtbeschränkende Beispiele
polymorpher Muster umfassen einen oder mehrere Polymorphismen in erfindungsgemäßen ACE-,
AGT und/oder AT1-Genen einschließlich der folgenden, die mit
vermehrtem Vorkommen klinischer Anzeichen von cardiovaskulären Erkrankungen
korreliert wurden:
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Isolierte polymorphe Nukleinsäuren, Sonden
und Vektoren
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren, welche die polymorphen
Positionen, die oben für
die humanen ACE-, AGT- und AT1-Gene beschrieben worden sind, Vektoren,
umfassend die Nukleinsäuren,
und transformierte Wirtszellen, umfassend diese Vektoren, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem
Sonden bereit, welche für
die Detektion dieser Polymorphismen brauchbar sind.
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Für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung werden zahlreiche herkömmliche Techniken der Molekularbiologie,
Mikrobiologie und rekombinanten DNA-Technologie verwendet. Derartige
Techniken sind allgemein bekannt und beispielsweise vollständig beschrieben
in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York, DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II, 1985 (D.N.Glover,
Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait, Hrsg.); Nucleic
Acid Hybridization, 1985 (Hames and Higgins); Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 1997, (John Wiley and Sons); und
Methods in Ezymology, Bd .154 und Bd. 155 (Wu und Grossman bzw.
Wu, Hrsg.).
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Die
Insertion von Nukleinsäuren
(typischerweise DNAs), umfassend die erfindungsgemäßen Sequenzen,
in einen Vektor, wird in einfacher Weise dadurch erreicht, dass
die Termini der DNAs und des Vektors kompatible Restriktionsschnittstellen
umfassen. Wenn dies nicht erreicht werden kann, kann es erforderlich
sein, die Enden der DNAs und/oder des Vektors durch Verdauen einzelsträngiger DNA-Überhänge, die
durch Restriktions-Endonukleaseschnitte erzeugt wurden, zu modifizieren,
um gerade Enden herzustellen, oder in dem man das gleiche Ergebnis
durch Auffüllen
der einzelsträngigen
Enden mit einer geeigneten DNA-Polymerase erreicht.
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Alternativ
kann jede gewünschte
Stelle beispielsweise durch Ligation von Nukleotidsequenzen (Linkern)
mit den Enden produziert werden. Derartige Linker können spezifische
Oligonukleotidsequenzen umfassen, welche die gewünschte Restriktionsschnittstelle
definieren. Die Restriktionsschnittstellen können auch durch die Verwendung
der Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt werden (siehe z. B. Saiki
et al., 1988, Science 239: 48). Der geschnittene Vektor und die
DNA-Fragmente können
auch erforderlichenfalls durch Homopolymer-Tailing modifiziert werden.
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Die
Nukleinsäuren
können
mit Hilfe bekannter Methoden direkt aus Zellen isoliert oder chemisch
synthetisiert werden. Alternativ kann die Polymerasekettenreaktion
(PCR) dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu
produzieren, entweder indem man chemisch synthetisierte Stränge oder
genomisches Material als Vorlagen verwendet. Die für die PCR
verwendeten Primer können
unter Verwendung der Sequenzinformation synthetisiert werden, welche
erfindungsgemäß bereitgestellt
wird und können
außerdem
so gestaltet werden, dass sie geeignete neue Restriktionsschnittstellen
einführen,
um gewünschtenfalls die
Inkorporation in einen gegebenen Vektor für die rekombinante Expression
zu erleichtern.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch
native ACE-, ATG- oder AT1-Gensequenzen flankiert
werden oder können
mit heterologen Sequenzen assoziiert sein, wie einschließlich Promotoren,
Enhancern, Response-Elementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen,
Introns, 5'- und
3'-nichtkodierende
Bereiche, und dergleichen. Die Nukleinsäuren können außerdem mit Hilfe vieler bekannter
Methoden modifiziert werden. Nicht limitierende Beispiele solcher
Modifikationen umfassen Methylierung, „Caps", Substitution einer oder mehrerer der
natürlichen
Nukleotide durch ein Analogon, Internukleotidmodifikationen, wie z.
B. mit ungeladenen Verknüpfungen
(wie z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate,
Carbamate und dergleichen) und mit geladenen Verknüpfungen
(z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate und dergleichen). Die
Nukleinsäuren
können
eine oder mehrere zusätzliche
kovalent verknüpfte
Gruppen enthalten, wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen, Toxine,
Antikörper,
Signalpeptide, Poly-L-Lysin und dergleichen), Intercalatoren (z.
B. Acridin, Psoralen und dergleichen), Chelatbildner (wie z. B.
Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidierende Metalle und dergleichen)
und Alkylatoren. PNAs sind ebenfalls mit umfasst. Die Nukleinsäure kann
durch Bildung einer Methyl- oder Ethylphosphotriester- oder einer Alkylphosphoramidat-Verknüpfung derivatisiert
werden. Darüber
hinaus können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
auch mit einer Markierung modifiziert werden, welche zur Bereitstellung
eines direkt oder indirekt detektierbaren Signals befähigt ist.
Beispiele für
Markierungen sind Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin
und derglei chen.
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Die
Erfindung stellt außerdem
Nukleinsäurevektoren
bereit, welche die offenbarten, von ACE, AGT und AT1 abgeleiteten
Gensequenzen oder Derivate oder Fragmente davon umfassen. Eine große Anzahl
von Vektoren, einschließlich
Plasmid und Pilz-Vektoren, wurde für die Replikation und/oder
Expression in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokariotischen
Wirten beschrieben und kann für
die Gentherapie ebenso wie für
einfache Klonierung und Proteinexpression verwendet werden. Nicht
limitierende Beispiele von geeigneten Vektoren umfassen, ohne darauf
beschränkt
zu sein, pUC-Plasmide, pET-Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI)
oder pRSET oder pREP (Invitrogen, San Diego, CA) und viele geeignete
Wirtszellen, unter Verwendung von Methoden, welche darin beschrieben
oder zitiert sind oder in sonstiger Weise dem relevanten Fachmann bekannt
sind. Die jeweilige Auswahl von Vektor/Wirt ist für die Durchführung der
Erfindung nicht kritisch.
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Geeignete
Wirtszellen können
transfomiert/transfiziert/infiziert werden, wobei man geeignete
Methoden, wie Elektroporation, CaCl2-vermittelte
DNA-Aufnahme, virale oder Pilzinfektion, Mikroinjektion, Verwendung
von Mikroprojektilen oder andere etablierte Methoden. anwendet.
Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Archaebakterien, Pilze,
insbesondere Hefe, Pflanzen- und Tierzellen, vor allem Säugerzellen.
Eine große
Anzahl regulatorischer Transkriptionsstart- und -stop-Regionen wurden
isoliert und deren Wirksamkeit bei der Transkription und Translation
von heterologen Proteinen in verschiedenen Wirtszellen wurde gezeigt.
Beispiele für
diese Regionen, Verfahren zur Isolation und Manipulation und dergleichen
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen
können
Wirtszellen als Quelle für
die rekombinante Produktion von Peptiden und Polypeptiden verwendet
werden, welche von ACE, AGT oder AT1 abgeleitet sind.
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Nukleinsäuren, welche
für ACE-,
AGT- oder AT1-abgeleitete Gensequenzen kodieren, können auch
in Zellen durch Rekombinationsereignisse eingeführt werden. Beispielsweise
können
solche Sequenzen in eine Zelle eingeführt werden, um dadurch homologe
Rekombination an einer Stelle eines endogenen Gens oder einer Sequenz
mit substanzieller Identität
zu dem Gen zu bewirken. Andere Rekombinations-basierte Methoden,
wie nicht-homologe
Rekombinationen oder Deletion von endogenen Genen durch homologe
Rekombination, können
ebenfalls verwendet werden.
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Die
Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung finden Anwendung als Sonden für die Detektion
von genetischen Polymorphismen und als Vorlagen für die rekombinante
Produktion von normalen ACE, AGT oder AT1 abgeleiteten Peptiden
oder Polypeptiden oder Varianten davon.
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Erfindungsgemäße Sonden
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, isolierte Nukleinsäuren
mit einer Länge
von etwa 10 bis 100 bp, vorzugsweise 15 bis 75 bp und insbesondere
17 bis 25 bp, welche bei hoher Stringenz mit einer oder mehreren
der von dem ACE-, AGT- oder AT1-Gen abgeleiteten polymorphen Sequenzen,
die hierin offenbart sind oder mit einer Sequenz, die zu einer polymorphen
Position unmittelbar benachbart ist, hybridisieren. Darüber hinaus
kann in einzelnen Ausführungsformen
eine Voll-Längen-Gensequenz als Sonde
verwendet werden. In einer Serie von Ausführungsformen erstrecken sich
die Sonden über
die polymorphen Positionen in den oben offenbarten ACE-, AGT- oder AT1-Gene. In
einer weiteren Serie von Ausführungsformen
entsprechen die Sonden den unmittelbar benachbarten Sequenzen der
polymorphen Positionen.
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Polymorphe ACE-, AGT-
oder AT1-Polpeptide und Polymorahismus-spezifische Antikörper
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Die
vorliegende Erfindung umfasst isolierte Peptide und Polypeptide,
welche für
ACE, AGT oder AT1 kodieren, welche polymorphe Positionen gemäß obiger
Offenbarung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Peptide und
Polypeptide nützliche
Screening-Targets, um cardiovaskuläre Wirkstoffe zu identifizieren.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen
sind die Peptide und Polypeptide geeignet, um Antikörper in
einem geeigneten Wirt zu generieren, welche spezifisch mit einem
Polypeptid reagieren, welches die polymorphe Position umfasst und
dieses von anderen Polypeptiden unterscheidet, die eine andere Sequenz an
dieser Position aufweisen.
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Erfindungsgemäße Polypeptide
haben vorzugsweise eine Länge
von wenigstens fünf
oder mehr Resten, vorzugsweise eine Länge von wenigstens fünfzehn Resten.
Verfahren zur Bereitstellung dieser Polypeptide werden im Folgenden
beschrieben. Viele konventionelle Techniken der Proteinbiochemie
und Immunologie finden Verwendung. Derartige Techniken sind allgemein
bekannt und werden in Immunochemical Methods in Cell and Molecular
Biology, 1987 (Mayer and Waler, Hrsg; Academic Press, London); Scopes,
1987, Protein Purification: Principles and Practice, 2. Aufl. (Springer-Verlag,
N. Y.) und Handbook of Experimental Immunology, 1986, Bde. I-IV
(Weir and Blackwell, Hrsg.) beschrieben.
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Nukleinsäuren, umfassend
Protein-kodierende Sequenzen, können
für die
rekombinante Expression von ACE-, AGT- oder AT1-abgeleiteten Polypeptiden
in intakten Zellen oder in zellfreien Translationssystemen verwendet
werden. Der bekannte genetische Code der gewünschtenfalls für eine effizientere
Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus aufbereitet wird,
kann zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden, welche
für die
gewünschten
Aminosäuresequenzen
kodieren. Die Polypeptide können
auch aus menschlichen Zellen oder aus heterologen Organismen oder
Zellen (einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Bakterien, Pilzen, Insekten, Pflanzen und Säugerzellen)
isoliert werden, in welche eine geeignete Protein-kodierende Sequenz
eingeführt
und exprimiert wurde. Darüber
hinaus können
die Polypeptide Teil rekombinanter Fusionsproteine sein.
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Peptide
und Polypeptide können
auch chemisch synthetisiert werden unter Verwendung automatisierter,
käuflich
erhältlicher
Verfahren, wie beispielsweise, ohne darauf be schränkt zu sein,
vollständige
Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden, Fragmentkondensation
oder klassische Lösungssynthesen.
Die Polypeptide werden vorzugsweise durch Festphasenpeptidsynthese,
wie beschrieben in Merrifield, 1963, J. Am Chem. Soc. 85: 2149,
hergestellt.
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Verfahren
für die
Polypeptidreinigung sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, präparative
Disk-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, HPLC, Reversed-Phase-HPLC,
Gelfiltration, Ionenaustausch- und Verteilungs-Chromatographie und
Gegenstromverteilung. Für
einzelne Zwecke ist es bevorzugt, die Polypeptide in einem rekombinanten
System zu produzieren, in welchem das Protein ein zusätzliches
Sequenz-Tag enthält,
welches dessen Reinigung erleichtert, wie beispielsweise, ohne darauf
beschränkt
zu sein, eine Polyhistidin-Sequenz. Das Polypeptid kann dann aus
dem Rohlysat der Wirtselle durch Chromatographie über eine
geeignete Festphasenmatrix gereinigt werden. Darüber hinaus können als
Reinigungsreagenzien Antikörper
verwendet werden, welche gegen ACE, AGT oder AT1 oder gegen davon
abgeleitete Peptide gerichtet sind. Andere Reinigungsmethoden sind
ebenfalls möglich.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst außerdem Derivate und Analoga
der Polypeptide. Für
einzelne Zwecke können
die Nukleinsäuresequenzen,
welche für
die Peptide kodieren, durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen
verändert
werden, welche funktional äquivalente
Moleküle,
d.h. Funktions-konservative Varianten, bereitstellen. Beispielsweise
können
ein oder mehrere Aminosäurereste
innerhalb der Sequenz durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften substituiert
werden, wie z. B. positiv geladene Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin);
negativ geladene Aminosäuren
(Aspartat und Glutamat), polare neutrale Aminosäuren; und nicht-polare Aminosäuren.
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Die
isolierten Polypeptide können
beispielsweise durch Phosphorylierung, Sulfatierung, Acylierung oder
andere Proteinmodifikationen modifiziert werden. Sie können auch
mit einer Markierung modifiziert werden, welche ein direkt oder
indirekt detektierbares Signal bereitstellt, wie beispielsweise,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Radioisotope oder fluoreszierende Verbindungen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper, welche spezifisch die
polymorphen Positionen gemäß vorliegender
Erfindung erkennen und ein Peptid oder Polypeptid, das einen speziellen
Polymorphismus aufweist, von einem solchen unterscheiden, das eine
andere Sequenz an dieser Position aufweist. Derartige Polymorphismusposition-spezifische
Antikörper
gemäß vorliegender
Erfindung umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper. Die
Antikörper
können
in einem Wirtstier durch Immunisierung mit ACE-, AGT- oder AT1-abgeleiteten
immunogenen Komponenten erzeugt werden oder können durch in vitro-Immunisierung von Immunzellen
generiert werden. Die immunogenen Komponenten, welche zur Erzeugung
von Antikörpern
verwendet werden, können
aus menschlichen Zellen isoliert oder in rekombinanten Systemen
produziert werden. Die Antikörper
können
auch in rekombinanten Systemen produziert werden, die mit geeigneter
Antikörper-kodierender
DNA programmiert sind. Alternativ dazu können Antikörper durch biochemische Rekonstitution
von gereinigten schweren und leichten Ketten konstruiert werden.
Die Antikörper
umfassen Hybridantikörper
(d.h. enthaltend zwei Sätze
von Kombinationen aus schwerer Kette und leichter Kette, wobei jede
davon ein anderes Antigen erkennt), chimäre Antikörper (d.h. worin entweder die
schweren Ketten, die leichten Ketten oder beide Fusionsproteine
darstellen) und univalente Antikörper
(d.h. solche, die einen Komplex aus schwerer Kette und leichter
Kette umfassen, gebunden an die konstante Region einer zweien schweren
Kette). Außerdem sind
Fab-Fragmente umfasst, einschließlich Fab'- und F(ab)2-Fragmente
von Antikörpern.
Verfahren zur Produktion all dieser oben beschriebenen Typen von
Antikörpern
und Derivaten sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden
im Folgenden genauer diskutiert. Beispielsweise sind Techniken zur
Produktion und Prozessierung polyklonaler Antiseren beschrieben
in Mayer und Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular
Biology (Academic Press, London). Die allgemeine Methodologie zur
Herstellung monoklonaler Antikörper
durch Hybridome ist allgemein bekannt. Immortalisierte Antikörperproduzierende
Zelllinien können durch
Zellfusion und außerdem
durch andere Techniken, wie der direkten Transformation von B-Lymphozyten mit
onkogener DNA oder durch Transfektion mit Epstein-Barr-Virus erzeugt
werden; siehe z. B. Schreier et al., 1980, Hybridoma Techniques;
U.S. Patente Nr. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783, 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500;
4,491,632 und 4,493,890. Sätze
von monoklonalen Antikörpern,
welche gegen ACE-, AGT- oder AT1-abgeleitete Epitope gerichtet sind,
können
hinsichtlich verschiedener Eigenschaften, wie z. B. in Bezug auf
Isotyp- oder Epitop-Affinität
und dergleichen, gescreent werden.
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Die
erfindungsgemäßen Antikörper können mit
Hilfe standardisierter Verfahren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
der präparativen
Disk-Gelelektrophorese, isoelektrischen Fokussierung, HPLC, Reversed-Phase-HPLC,
Gelfiltration, Ionenaustausch- und Verteilungschromatographie und
Gegenstrom-Verteilung, gereinigt werden. Reinigungsmethoden für Antikörper sind
beispielsweise beschrieben in The Arf of Antibody Purification,
1989, Amicon Division, W. R. Grace & Co. Allgemeine Protein-Reinigungsmethoden
sind beschrieben in Protein Purification: Principles and Practice,
R.K. Scopes (Hrsg.), 1987, Springer-Verlag, New York, NY.
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Verfahren
zur Bestimmung der immunogenen Kapazität der offenbarten Sequenzen
und der Eigenschaften der resultierenden Sequenz-spezifischen Antikörper und
Immunzellen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise
können
Antikörper,
welche als Antwort auf ein Peptid erzeugt wurden, das eine spezielle
polymorphe Sequenz umfasst, auf ihre Fähigkeit getestet werden, in
spezifischer Weise diese polymorphe Sequenz zu erken nen, d.h. differenziell
an ein Polypeptid oder Peptid zu binden, das die polymorphe Sequenz
umfasst, um es auf diese Weise von einem ähnlichen Peptid oder Polypeptid
zu unterscheiden, welches eine andere Sequenz an der gleichen Position
aufweist.
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Diagnostische Methoden
und Kits
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Die
vorliegende Erfindung stellt Kits zur Bestimmung der Sequenz an
polymorphen Positionen innerhalb der ACE-, AGT- und AT1-Gene in
einem Individuum bereit. Die Kits umfassen Mittel zur Bestimmung
der Sequenz an einer oder mehreren polymorphen Positionen und können gegebenenfalls
Daten zur Analyse der polymorphen Muster umfassen. Die Mittel zur
Sequenzbestimmung können
geeignete Nukleinsäure-basierte und
immunologische Reagenzien (siehe unten) umfassen. Vorzugsweise umfassen
die Kits außerdem
geeignete Puffer, falls erforderlich, Kontrollreagenzien sowie Angaben
zur Bestimmung der Sequenz an einer polymorphen Position. Die Kits
können
außerdem
Daten zur Korrelierung eines speziellen polymorphen Musters mit
geeigneten Behandlungsschemata oder anderen Indikatoren umfassen.
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Nukleinsäure-basierte
diagnostische Methoden und Kits:
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Die
Erfindung stellt Nukleinsäure-basierte
Methoden zur Detektion polymorpher Muster in einer biologischen
Probe bereit. Die Sequenz an speziellen polymorphen Positionen in
den für
ACE, AGT und/oder AT1 kodierenden Genen wird unter Verwendung geeigneter
Mittel des Standes der Technik bestimmt, einschließlich, ohne
darauf beschränkt
zu sein, der Hybridisierung mit Polymorphismus-spezifischen Sonden
und direkter Sequenzierung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
Kits bereit, welche für
Nukleinsäure-basierte diagnostische Applikationen
geeignet sind. In einer Ausführungsform
umfassen diagnostische Kits die folgenden Komponenten:
- (i) DNA-Sonde: Die Sonden-DNA kann vormarkiert sein; alternativ
dazu kann die Sonden-DNA unmarkiert sein und die Bestandteile für die Markierung
können
in den Kit in separaten Behältern
enthalten sein; und
- (ii) Hybridisierungsreagenzien: Der Kit kann außerdem andere
geeignete verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, welche
für das
jeweilige Hybridisierungsprotokoll erforderlich sind, einschließlich Festphasen-Matrices,
falls erforderlich, und Standards.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
umfassen die diagnostischen Kits:
- (i) Sequenzbestimmungsprimer:
Sequenzierungsprimer können
vormarkiert sein oder können
eine Affinitätsreinigungs-
oder Anlagerungs-Einheit enthalten; und
- (ii) Sequenzbestimmungsreagenzien: Der Kit kann auch in geeigneter
Weise verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, welche für das jeweilige
Sequenzierungsprotokoll erforderlich sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Kit einen Satz von Sequenzierungsprimern, deren Sequenzen
Sequenzen entsprechen, welche zu folgenden polymorphen Positionen
benachbart sind: ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, AT1 1167 A/A; sowie
Mittel zur Detektion der Präsenz
von jeder polymorphen Sequenz.
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Antikörper-basierte diagnostische
Methoden und Kits:
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Die
Erfindung stellt Antikörper-basierte
Methoden zur Detektion von polymorphen Mustern in einer biologischen
Probe bereit. Die Methoden umfassen die folgenden Schritte:
- (i) das Inkontaktbringen der Probe mit einer
oder mehreren Antikörperpräparationen,
wobei jede der Antikörperpräparationen
für eine
spezielle polymorphe Form von ACE, ATG oder AT1 spezifisch ist,
unter Bedingungen, bei denen ein stabiler Antigen-Antikörperkomplex
zwischen dem Antikörper
und den Antigenkomponenten in der Probe gebildet werden kann; und
- (ii) Detektion jedes Antigen-Antikörperkomplexes, der in Schritt
(i) gebildet wird, unter Anwendung geeigneter Verfahren aus dem
Stand der Technik, wobei die Detektion eines Komplexes darauf hinweist,
dass eine spezielle polymorphe Form in der Probe vorliegt.
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Typischerweise
werden in Immunoassays entweder markierte Antikörper oder markierte Antigenkomponenten
(wie z. B. solche, die mit dem Antigen in der Probe um die Bindung
an den Antikörper
kompetitieren) verwendet. Geeignete Markierungen umfassen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, enzymbasierte, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz-, radioaktive
oder Farbstoff-Moleküle.
Tests zur Amplifizierung der Signale der Probe sind als solche außerdem bekannt
und umfassen beispielsweise solche, die Biotin und Avitin verwenden sowie
enzymmarkierte Immunoassays, wie ELISA-Assays.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
Kits bereit, welche für
Antikörper-basierte
diagnostische Applikationen geeignet sind. Diagnostische Kits enthalten
typischerweise eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
- (i) Polymorphismus-spezifische Antikörper: Die
Antikörper
können
vormarkiert sein; alternativ dazu können die Antikörper unmarkiert
sein und die Bestandteile für
eine Markierung können
in dem Kit in separaten Behältern
enthalten sein; oder ein sekundärer,
markierter Antikörper
wird bereitgestellt; und
- (ii) Reaktionskomponenten: Der Kit kann außerdem andere in geeigneter
Weise verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, welche für das jeweilige
Immunoassay-Protokoll
erforderlich sind, einschließlich Festphasenmatrices,
falls erforderlich, und Standards.
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Die
oben beschriebenen Kits können
außerdem
Anweisungen zur Durchführung
des Tests enthalten. Darüber
hinaus können
in bevorzugten Ausführungsformen
die diagnostischen Kits für
Hochdurchsatz- und/oder automatisierte Operationen anpassbar sein.
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Wirkstofftargets und Screening-Verfahren
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen Nukleotidsequenzen, abgeleitet von den für ACE, AGT und
AT1 kodierenden Genen, und Peptidsequenzen, abgeleitet von ACE-,
AGT- und AT1-Polypeptiden, insbesondere solche, die eine oder mehrere
polymorphe Sequenzen enthalten, nützliche Targets zur Identifizierung cardiovaskulärer Wirkstoffe,
d.h. Verbindungen, welche bei der Behandlung von einem oder mehreren
klinischen Symptomen cardiovaskulärer Erkrankungen wirksam sind.
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Ohne
darauf beschränkt
zu sein, umfassen Wirkstofftargets (i) isolierte Nukleinsäuren, abgeleitet
von den für
ACE, AGT und AT1 kodierenden Genen und (ii) isolierte Peptide und
Polypeptide, abgeleitet von ACE-, AGT- und AT1-Polypeptiden, wobei
jedes davon eine oder mehrere polymorphe Positionen umfasst.
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In vitro-Screening-Verfahren:
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Gemäß einer
Reihe von weiteren Ausführungsformen
wird eine isolierte Nukleinsäure,
umfassend eine oder mehrere polymorphe Positionen, in vitro auf
deren Fähigkeit
getestet, Testverbindungen in sequenzspezifische Weise zu binden.
Diese Methoden umfassen:
- (i) die Bereitstellung
einer ersten Nukleinsäure,
enthaltend eine spezielle Sequenz an einer polymorphen Position
und eine zweite Nukleinsäure,
deren Sequenz mit derjenigen der ersten Nukleinsäure identisch ist, mit Ausnahme
einer an der gleichen polymorphen Position verschiedenen Sequenz;
- (ii) das Inkontaktbringen der Nukleinsäuren mit einer Vielzahl von
Testverbindungen unter Bedingungen, die für eine Bindung geeignet sind;
und
- (iii) die Identifizierung solcher Verbindungen, welche selektiv
an die erste oder zweite Nukleinsäuresequenz binden.
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Unter
einer selektiven Bindung versteht man hierin jeden messbaren Unterschied
in irgendeinem Bindungsparameter, wie z.B. Bindungsaffinität, Bindungskapazität und dergleichen.
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In
einer Reihe weiterer Ausführungsformen
wird ein isoliertes Peptid oder Polypeptid, umfassend eine oder
mehrere polymorphe Positionen, in vitro auf seine Befähigung getestet,
Testverbindungen in sequenzspezifischer Weise zu binden. Die Screening-Verfahren
umfassen:
- (i) die Bereitstellung eines ersten
Peptids oder Polypeptids, enthaltend eine spezielle Sequenz an einer
polymorphen Position und eines zweiten Peptids oder Polypeptids,
dessen Sequenz mit derjenigen des ersten Peptids oder Polypeptids übereinstimmt,
mit Ausnahme von einer anderen Sequenz an der gleichen polymorphen
Position,
- (ii) das Inkontaktbringen der Polypeptide mit einer Vielzahl
von Testverbindungen unter Bedingungen, die für eine Bindung geeignet sind;
und
- (iii) die Identifizierung solcher Verbindungen, welche selektiv
an eine der Sequenzen bindet.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
werden Hochdurchsatz-Screeningprotokolle verwendet, um eine große Anzahl
von Testverbindungen auf ihre Befähigung zur sequenzspezifischen
Bindung an Gene oder Polypeptide, die oben beschrieben sind, zu überprüfen.
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Testverbindungen
aus großen
Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen werden
gescreent. Zahlreiche Maßnahmen
zur zufälligen
und gesteuerten Synthese von Saccharid-, Peptid- und Nukleinsäure-Verbindungen
stehen derzeit zur Verfügung.
Bibliotheken synthetischer Verbindungen sind kommerziell erhältlich von
Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton,
NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford,
CT). Eine Bibliothek seltener chemischer Verbindungen ist von Aldrich
(Milwaukee, WI) erhältlich.
Andererseits sind Bibliotheken natürliche Verbindungen in Form
von bakteriellen, pilzlichen-, pflanzlichen und tierischen Extrakten,
beispielsweise von Pan Laboratories (Bothell, WA) oder MycoSearch
(NC) erhältlich
oder in einfacher Weise herstellbar. Zusätzlich können natürlich und synthetisch hergestellte
Bibliotheken und Verbindungen mit Hilfe konventioneller chemischer,
physikalischer und biochemischer Methoden in einfacher Weise modifiziert
werden.
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In vivo-Screening-Verfahren:
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Intakte
Zellen ganzer Tiere, welche polymorphe Varianten von Genen, kodierend
für ACE,
AGT und/oder AT1 exprimieren, können
in Screening-Verfahren zur Identifizierung von Kandidaten für cardiovaskuläre Wirkstoffe
verwendet werden.
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In
einer Serie von Ausführungsformen
wird eine permanente Zelllinie von einem Individuum etabliert, das
ein spezielles polymorphes Muster aufweist. Alternativ dazu werden
Zellen (ohne darauf beschränkt
zu sein, Säuger-,
Insekten-, Hefe- oder Bakterienzellen) so programmiert, dass sie
ein Gen exprimieren, das eine oder mehrere polymorphe Sequenzen
umfasst, indem man eine geeignete DNA einführt. Die Identifizierung von
Verbindungskandidaten kann mit Hilfe beliebiger geeigneter Assays
erreicht werden, welche, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen:
- (i) Tests, welche die selektive Bindung der
Testverbindungen an spezielle polymorphe Varianten von ACE, AGT
oder AT1 messen;
- (ii) Test, welche die Befähigung
einer Testverbindung messen, eine messbare Aktivität oder Funktion
von ACE, AGT oder AT1 zu modifizieren (d.h. zu inhibieren oder zu
verstärken);
und
- (iii) Tests, welche die Fähigkeit
einer Verbindung messen, die Transkriptionsaktivität von Sequenzen
zu modifizieren (d.h. zu inhibieren oder zu verstärken), welche
von den Promotor- (d.h. regulatorischen) Regionen des ACE-, AGT-
oder AT1-Gens abgeleitet sind.
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In
einer anderen Serie von Ausführungsformen
werden transgene Tiere erzeugt, in denen (i) eines oder mehrere
der humanen ACE-, AGT- und AT1-Gene, die verschiedene Sequenzen
an speziellen polymorphen Positionen aufweisen, in das Genom des
transgenen Tiers stabil integriert werden; und/oder (ii) in denen die
endogenen ACE-, AGT- und/oder AT1-Gene inaktiviert sind und ersetzt
werden durch humane ACE-, AGT- und/oder AT1-Gene, welche verschiedene Sequenzen
an speziellen polymorphen Positionen aufweisen, siehe z. B. Coffman,
Semin. Nephrol. 17: 404, 1997; Esther et al., Lab. Invest. 74: 953,
1996; Murakami et al., Blood Press. Suppl. 2: 36, 1996. Derartige
Tiere können
mit Verbindungskandidaten behandelt werden und hinsichtlich eines
oder mehrerer klinischer Marker für den cardiovaskulären Status überwacht
werden.
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Es
folgen nicht limitierende Beispiele der Erfindung.
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BEISPIEL 1: Verfahren
zur Identifizierung polymorpher Positionen in menschlichen Genen
die ACE, AGT und AT1 kodieren
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Die
folgenden Untersuchungen wurden zur Identifizierung polymorpher
Reste innerhalb von Genen, die menschliches ACE, AGT und AT1 kodieren,
durchgeführt.
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Es
wurden DNA-Proben von 277 Individuen erhalten. Die Individuen waren
zwischen 1920 und 1924 in Uppsala, Schweden, geborene kaukasische
Männer.
Basierend auf ihrer Anamnese wurden die Individuen für die Testpopulation
ausgewählt,
d.h., sie waren entweder (i) gesund, ohne Anzeichen einer cardiovaskulären Erkrankung
(100); oder (ii) hatten einen akuten Herzinfarkt (68), einen stummen
Herzinfarkt (34), Schlaganfall (18), Schlaganfall und akuten Herzinfarkt
(19) oder Bluthochdruck im Alter von 50 (39) erlitten. Von jedem
Individuum wurden DNA-Proben erhalten.
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Die
DNA-Sequenzanalyse erfolgte durch: (i) Amplifizieren kurzer Fragmente
von jedem der ACE-, AGT- und AT1-Gene mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) und (ii) Sequenzierung der amplifizierten Fragmente. Die von
jedem Individuum erhaltenen Sequenzen wurden danach mit bekannten
genomischen Sequenzen für
ACE, AGT und AT1 verglichen (siehe Tabelle 1).
- (i)
Amplifizierung: PCR-Reaktionen verwendeten die in der nachfolgenden
Tabelle 2 dargestellten Primer.
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Wo
angegeben, wurden die Primer nach einem der folgenden Verfahren
modifiziert: (i) ein Biotin-Molekül wurde an den 5'-Terminus der angegebenen
Sequenz (B) konjugiert; (ii) eine Sequenz von Nukleotiden, abgeleitet
von M13, 5' -CAGGAAACAGCTATGACT-3', wurde an den 5'-Terminus der angegebenen
Sequenz (MT) angeheftet; oder (iii) die Sequenz 5'-AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' wurde an den 5'-Terminus der angegebenen
Sequenz (T = Schwanz) angeheftet. Wo angegeben, wurden die Nukleotide
gemäß den in
Tabelle 1 angegebenen SEQ ID Nos. nummeriert. Wenn die involvierten
Sequenzen nicht der Öffentlichkeit
zugänglich
waren, erfolgte die Nummerierung wie in den folgenden Beispielen:
Die Bezeichnung "i-4:
1-200" gibt an,
dass die Primersequenz innerhalb der Sequenz angeordnet ist, die
sich 200 bp stromaufwärts
von und einschließlich
des Nukleotids erstreckt, das sich stromaufwärts unmittelbar an das erste
kodierende Nukleotid für
Exon 4 anschließt.
Dementsprechend gibt die Bezeichnung "i + 4: 1-200" an, dass die Primersequenz innerhalb
der Sequenz lokalisiert ist, die sich von dem Nukleotid, das sich
stromabwärts
unmittelbar an das letzte kodierende Nukleotid für Exon 4 anschließt, 200
bp stromabwärts
erstreckt. In Tabelle 2 in der mit "Nucleotide" gekennzeichneten Spalte ist jeweils
der spezifische Ort der Primersequenz angegeben. Die für die PCR
verwendeten Reaktionskomponenten sind in der nachfolgenden Tabelle
3 beschrieben.
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Die
bei der PCR verwendeten Reaktionsbedingungen sind in der nachfolgenden
Tabelle 4 beschrieben.
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Alle
PCR-Produkte (bis auf die Fragmente ACEDI, AT1-spec. 1 und AT1-spec.
2) wurden einer Festphasensequenzierung gemäß dem kommerziell von Pharmacia
Biotech erhältlichen
Protokoll unterzogen. Die Sequenzierungsreaktionen werden mit einem
Sequenzierungsprimer, der eine zu der zuvor in Tabelle 2 beschriebenen "Schwanz"-Sequenz komplementäre Sequenz
aufweist, durchgeführt.
Die Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers war 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' und der Primer war
mit einem Cy-S-Molekül
an dem 5'-Nukleotid
fluoreszenzmarkiert. Die eine genetische Variation tragenden Positionen wurden
durch Ermittlung der Nukleotidsequenz unter Verwendung des kommerziell
von Pharmacia Biotech erhältlichen
ALFexpressTM-Systems bestimmt.
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Für die Detektion
des Fragments ACEDI analysierte man die Größen der amplifizierten Fragmente
mittels Gelelektrophorese, wobei die Anwesenheit eines kürzeren PCR-Produktes
(192 Basenpaare) auf das D-Allel und eines längeren PCR-Produkts (497 Basenpaare)
auf das I-Allel hindeutete. Die Anwesenheit beider Banden weist
auf ein Heterozygot für
die zwei Allele hin. Die Detektion der allelspezifischen Reaktion
von Position AT1-1271 erfolgte, indem man getrennt zwei parallele
PCR-Reaktionen an derselben Probe durchführte und die Größen der
amplifizierten Fragmente verglich. Ein PCR-Produkt mit 501 Basenpaaren
sollte in beiden parallelen Reihen als Kontrolle immer vorhanden
sein, wobei die Anwesenheit eines PCR-Produktes mit 378-Basenpaaren
in der als AT1-spec.1 bezeichneten Reaktion auf die Anwesenheit
eines A in dieser Position hindeutete. Die Anwesenheit eines PCR-Produktes
mit 378-Basenpaaren in der als AT1-spec. 2 bezeichneten Reaktion
bedeutete ein C in dieser Position. Wenn das kürzere PCR-Produkt in beiden
Reaktionen vorhanden war, so war das Individuum ein Heterozygot
für A und
C.
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Ergebnisse:
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Die
zuvor beschriebene Untersuchung führt zur Identifizierung polymorpher
Positionen innerhalb der regulatorischen und kodierenden/Intron-Segmente
von menschlichen Genen, die ACE, AGT und AT1 kodieren. Die polymorphen
Positionen, d.h. die an jeder der Positionen gefundenen Nukleotidvarianten,
und die PCR-Fragmente, in denen der Polymorphismus nachgewiesen
wurde, sind in der nachfolgenden Tabelle 6 dargestellt. Ebenfalls
dargestellt sind die Häufigkeiten
jedes Genotyps in einer Population von 90 Individuen, angegeben
in Prozent der untersuchten Population mit diesem Genotyp. Polymorphismen,
die zu alternierenden Aminosäuren
in ACE, AGT und AT1 führten,
sind ebenfalls angegeben. Wie nachfolgend verwendet beziehen sich
die Bezeichnungen "AGR", "ACR" und "ATR" auf die regulatorischen
Regionen der menschlichen AGT-, ACE- beziehungsweise AT1-Gene; und
die Bezeichnungen "AGT", "ACE" und "AT1" auf die kodierenden
Regionen der AGT-, ACE- beziehungsweise AT1-Gene.
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Eine
Untergruppe dieser polymorphen Positionen wurde darüber hinaus
bei weiteren 187 Individuen untersucht. Tabelle 7 gibt die polymorphen
Positionen, die Sequenz an diesen Positionen und die Genotyp-Häufigkeiten
für jede
Position in einer Population von 277, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben,
an.
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BEISPIEL 2: Korrelation
von polymorphen Mustern mit cardiovaskulärer Erkrankung
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Die
wie in Beispiel 1 bestimmten polymorphen Positionen wurden mit den
folgenden Markern eines cardiovaskulären Status, der in der Population
vorliegt, korreliert: Herzinfarkt (MI); Schlaganfall; und Bluthochdruck.
Polymorphe Muster, d.h., Kombinationen von Sequenzen an besonderen
polymorphen Positionen, die eine statistisch signifikante Korrelation
mit einem oder mehreren dieser Kennzeichen zeigen, sind nachfolgend dargestellt.
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BEISPIEL 3: Korrelation
zwischen einem spezifischen polymorphem Muster mit dem Ansprechen
auf die Behandlung
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Die
folgende Untersuchung wurde zur Bestimmung polymorpher Muster in
den menschlichen ACE-, AGT- und/oder AT1-Genen, die die Wirksamkeit
von Behandlungen bei einer cardiovaskulären Erkrankung voraussagen,
durchgeführt.
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Es
wurden zwei Patientengruppen mit Bluthochdruck untersucht, 41 Patienten
in der ersten Gruppe und 20 in der zweiten Gruppe. Die Gruppen wurden
unabhängig
voneinander und zusammen untersucht.
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Die
Patienten in dieser Population wurden jeweils mit einem der folgenden
fünf ACE-Inhibitoren behandelt:
Captopril, Trandolapril, Lisinopril, Fosinopril oder Enalapril.
Die Wirkung der Wirkstoffe auf den mittleren arteriellen Blutdruck
wurde quantifiziert. Der mittlere arterielle Blutdruck ist definitionsgemäß 2/3 des
diastolischen Blutdrucks + 1/3 des systolischen Blutdrucks. Die
Individuen wurden eingestuft als "stark ansprechend", d.h. solche, die eine Abnahme von
mehr als 16 mm Hg während
der Behandlung mit einem ACE-Inhibitonnrirkstoff aufwei sen, und
als "schwach ansprechend", d.h., solche, die
keine Abnahme von mehr als 16 mm Hg aufweisen.
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Ein
bestimmtes polymorphes Muster, ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, AT1 1167
A/A, das in 51 % der ersten Beobachtungspopulation vorhanden war,
unterschied zwischen stark ansprechend und schwach ansprechend.
In der zweiten Gruppe von 20 Patienten war das Muster weniger vorherrschend
(25 %), die Korrelation mit niedrigerem Blutdruck war jedoch offensichtlich.
Individuen mit diesem polymorphem Muster (nachfolgend mit "1" bezeichnet) zeigten eine stärkere Abnahme
des Blutdrucks als die, die dieses polymorphe Muster (nachfolgend
mit "0" bezeichnet) nicht
aufwiesen.
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Außerdem war
die Verteilung von „stark
ansprechend" und „schwach
ansprechend" (wie
zuvor definiert) wie folgt:
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Zusammenfassend
zeigen die Ergebnisse aus den zwei Gruppen, dass das Vorliegen dieses
polymorphen Musters mit einer inkrementellen Abnahme von 6,4-7,3
mm Hg, bezogen auf Individuen, die dieses polymorphe Muster nicht
aufweisen, korreliert.
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Die
Verbreitung dieses polymorphen Musters betrug 41 % in dieser Population
mit Bluthochdruck. Dies deutet darauf hin, dass bei Bluthochdruckpatienten
das Testen auf dieses polymorphe Muster und das anschließende Verschreiben
von ACE-Inhibitoren nur an solche Patienten mit diesem polymorphen
Muster die Ansprechrate von 43 % (bei einer Population mit Bluthochdruck
im Allgemeinen) auf 76 % bei einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
ausgewählten
Population mit Bluthochdruck erhöhen
könnte.
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