ES2270510T3 - Metodos para evaluar el estado cardiovascular y composiciones para su uso. - Google Patents
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Abstract
La invención suministra procedimientos para evaluar el estado cardiovascular en un individuo, los procedimientos comprenden la determinación de la secuencia en una o más posiciones polimórficas dentro de los genes humanos que codifican la enzima de conversión de la angiotensina (ACE), el angiotensinógeno (AGT) y/o el receptor de la angiotensina II de tipo 1 (AT1). La invención también suministra ácidos nucleicos aislados que codifican polimorfismos de ACE, AGT y AT1, sondas de ácido nucleico que se hibridizan en posiciones polimórficas, equipos para la predicción del estado cardiovascular y dianas de ácido nucleico y peptídicas para su utilización en la identificación de medicamentos cardiovasculares candidatos.
Description
Métodos para evaluar el estado cardiovascular y
composiciones para su uso.
El presente invento se refiere a polimorfismos
genéticos útiles para evaluar el estado cardiovascular en
humanos.
El sistema renina angiotensina aldosterona
(RAAS, del inglés
renin-angiotensin-aldosterone
system) juega un papel importante en la fisiología
cardiovascular de los mamíferos. Específicamente, RAAS regula la
homeostasis sal-agua y el mantenimiento del tono
vascular. La estimulación o inhibición de este sistema sube o baja
la presión sanguínea, respectivamente, y las alteraciones en este
sistema pueden estar implicadas en la etiología de, por ejemplo, la
hipertensión, el derrame cerebral y el infarto de miocardio. El
sistema RAAS también puede tener otras funciones tales como, p.
ej., el control del crecimiento celular. El sistema renina
angiotensina incluye al menos renina, enzima convertidora de
angiotensina (ACE, del inglés angiotensin converting enzyme),
angiotensinógeno (AGT), receptor tipo 1 de angiotensina II (AT1) y
receptor tipo 2 de angiotensina II (AT2).
AGT es el sustrato específico de la renina, una
aspartil proteasa. El gen AGT humano contiene cinco exones y cuatro
intrones que se extiende sobre 13 kb (Gaillard et al., DNA
8:87-99, 1989; Fukamizu et al., J Biol Chem
265:7576-7582, 1990). El primer exón (37 pb)
codifica para la región 5' no traducida del ARNm. El segundo exón
codifica para el péptido señal y los primeros 252 aminoácidos de la
proteína madura. Los exones 3 y 4 son más cortos y codifican para
90 y 48 aminoácidos, respectivamente. El exón 5 contiene una
secuencia codificante corta (62 aminoácidos) y la región 3' no
traducida.
El AGT de plasma se sintetiza primariamente en
el hígado y su expresión está regulada positivamente por estrógenos,
glucocorticoides, hormonas tiroideas y angiotensina II (Ang II)
(Clauser et al., Am J Hypertension 2:403-410,
1989). La escisión del segmento aminoterminal de AGT por la renina
desprende una prohormona decapéptido, angiotensina I, que se
procesa adicionalmente al octapéptido angiotensina II activo
mediante la dipeptidil carboxipeptidasa, designada enzima
convertidora de angiotensina (ACE). La escisión de AGT por renina es
la etapa limitante de la velocidad en la activación del sistema
renina-angiotensina.
Varias observaciones epidemiológicas indican un
posible papel de AGT en la regulación de la presión sanguínea. Se
ha observado una correlación altamente significativa entre la
concentración de AGT del plasma y la presión sanguínea en estudios
epidemiológicos (Walker et al., J Hypertension
1:287-291, 1979). De forma interesante, se han
identificado muchos dimorfismos alélicos del gen AGT. La frecuencia
de al menos dos de ellos (174M y 235T) se ha caracterizado
parcialmente y en ciertas poblaciones se muestran significativamente
elevados en sujetos hipertensos (Jeunemaitre et al., Cell
71:169-180, 1992). Además, se ha sugerido que un
polimorfismo específico, 235T, está directamente implicado en la
arterosclerosis coronaria (Ishigami et al., Circulation
91:9514, 1995). Además, la presencia de A o G en la posición 1218 de
la región reguladora de AGT se ha correlacionado con diferencias en
la capacidad transcripcional in vitro para este gen (Inoue
et al., J Clin Invest 99:1786, 1997). Adicionalmente, el
documento WO 94/08048 discute la asociación de variantes moleculares
del gen AGT con la hipertensión.
El gen ACE humano también es un candidato como
marcador de la hipertensión y del infarto de miocardio. Los
inhibidores de ACE constituyen una aproximación terapéutica
importante y eficaz en el control de la hipertensión humana
(Sassaho et al., Am J Med 83:227-235, 1987).
En el plasma y sobre la superficie de las células endoteliales, ACE
convierte la molécula inactiva de angiotensina I (Ang I) en
angiotensina II (Ang II) activa (Bottari et al., Front
Neuroendocrinology 14:123-171, 1993). Otro
sustrato de ACE es bradiquinina, un potente vasodilatador e
inhibidor de la proliferación de las células del músculo liso, el
cual es inactivado por ACE (Ehlers et al., Biochemistry
28:5311-5318, 1989; Erdos EG, Hypertension
16:363-370, 1990; Johnston CI, Drugs (supl.
1) 39:21-31, 1990).
Los niveles de ACE son muy estables dentro del
individuo, pero difieren considerablemente entre individuos. Se ha
sugerido que los niveles de ACE plasmático están determinados
genéticamente como consecuencia de polimorfismos dialélicos
situados dentro o cercanos al gen ACE. Previo al presente invento,
no estaba demostrada una asociación definitiva entre los
polimorfismos y la hipertensión o presión sanguínea. Sin embargo, se
ha identificado un mayor riesgo de infarto de miocardio en un grupo
de sujetos con un polimorfismo de ACE designado
ACE-DD (Cambien et al., Nature
359:641-644, 1992), y se ha identificado un riesgo
12 veces mayor de infarto de miocardio en un subgrupo de pacientes
que tienen una combinación del polimorfismo ACE-DD
de ACE y de uno de los polimorfismos de AGT (235T) descritos
anteriormente (Kamitani et al., Hypertension 24:381, 1994).
Recientemente, se identificaron y caracterizaron seis polimorfismos
de ACE (Villard et al., Am J Human Genet
58:1268-1278, 1996). El documento WO
93/00360
describe un método para detectar polimorfismo en el gen ACE por medio de una técnica de amplificación de la cadena.
describe un método para detectar polimorfismo en el gen ACE por medio de una técnica de amplificación de la cadena.
Las acciones vasoconstrictiva, promotora del
crecimiento celular y conservadora de la sal de Ang II están
mediadas a través de la unión y activación de los receptores de
angiotensina, de los cuales al menos se han clonado dos tipos (AT1
y AT2). El receptor tipo I de Ang II (ATi), una proteína acoplada a
proteína G con siete dominios transmembrana, está ampliamente
distribuido en el cuerpo y media casi todos los efectos conocidos
de Ang II (Fyhrquist et al., J Hum Hypertension
5:519-524, 1995).
Se han identificado varios polimorfismos del gen
del receptor ATi. Los estudios iniciales sugieren que al menos uno
de ellos es más frecuente en sujetos hipertensos (AT1166C)
(Bonnardeaux et al., Hypertension 24:63-69,
1994). Se ha mostrado que este polimorfismo, combinado con el
polimorfismo ACE-DD, se correlaciona fuertemente
con el riesgo de infarto de miocardio (Tiret et al., Lancet
344:910-913, 1994). El documento WO 96/05324 publica
un método y un kit para la detección de la predisposición al
infarto de miocardio mediante la detección de una
inserción/deleción en el gen ACE y un polimorfismo en la posición
1166 del gen AT1.
La elevada morbilidad y mortalidad asociadas con
la enfermedad cardiovascular demuestra una necesidad en la técnica
de métodos y composiciones que permitan determinar y/o predecir el
régimen terapéutico que dará como resultado el efecto más positivo
del tratamiento en un paciente que sufre de enfermedad
cardiovascular. Esto incluye la identificación de individuos que
son más o menos susceptibles a regímenes terapéuticos particulares,
incluidos, p. ej., fármacos particulares que se emplean
convencionalmente para tratar la enfermedad cardiovascular. También
hay una necesidad en la técnica de métodos y composiciones que
permitan identificar individuos que tienen una predisposición a la
enfermedad cardiovascular tal como, p. ej., infarto de miocardio,
hipertensión, aterosclerosis y derrame cerebral, para facilitar la
intervención precoz y la prevención de la enfermedad.
El presente invento proporciona métodos para
evaluar el estado cardiovascular de un individuo humano, según se
define en las reivindicaciones. El estado cardiovascular es el
estado fisiológico del sistema cardiovascular según se refleja en
uno o más marcadores del estado. Los marcadores del estado incluyen,
sin limitación, parámetros clínicos tales como, p. ej., presión
sanguínea o perfil electrocardiográfico, así como diagnósticos de
estado cardiovascular realizados por profesionales médicos expertos
tales como, p. ej., infarto agudo de miocardio, infarto de
miocardio silente, derrame cerebral y aterosclerosis. También están
incluidos en la evaluación del estado cardiovascular los cambios en
los marcadores del estado con el tiempo. Los métodos del invento se
llevan a cabo mediante las etapas de:
(i) determinar la secuencia de una o más
posiciones polimórficas dentro de uno o más de los genes que
codifican la enzima convertidora de angiotensina (ACE), el
angiotensinógeno (AGT) y el receptor de tipo 1 de angiotensina II
(AT1) del individuo para establecer un patrón polimórfico para el
individuo; y
(ii) comparar el patrón polimórfico establecido
en (i) con los patrones polimórficos de individuos que exhiben
marcadores predeterminados del estado cardiovascular. El patrón
polimórfico del individuo es, preferiblemente, altamente similar y,
más preferiblemente, idéntico al patrón polimórfico de individuos
que exhiben marcadores particulares del estado, síndromes
cardiovasculares y/o patrones particulares de respuesta a las
intervenciones terapéuticas.
Por ejemplo, una comparación del patrón
polimórfico de un individuo con los patrones polimórficos de
individuos que exhiben respuestas diferentes frente a una
intervención terapéutica particular puede emplearse para predecir
el grado de respuesta del individuo ante tal intervención. De manera
similar, los métodos del invento pueden emplearse para predecir la
predisposición a diferentes síndromes cardiovasculares.
El invento también proporciona ácidos nucleicos
aislados que codifican ACE, AGT y AT1 en un individuo, cada uno de
los cuales comprende al menos una posición polimórfica, según se
define en las reivindicaciones. En realizaciones preferidas, la
posición polimórfica, bien sola o en combinación con otras
posiciones polimórficas de la secuencia ACE, AGT o AT1 humana, o en
uno o más de otros genes humanos, es predictiva de un nivel
particular de respuesta a un tratamiento dado y/o indica una
predisposición a uno o más síndromes clínicos asociados con la
enfermedad cardiovascular.
Los ácidos nucleicos aislados de acuerdo con el
invento (que se describen empleando la numeración indicada en la
Tabla 1 abajo) son:
(i) Ácidos nucleicos que codifican ACE que
tienen una o más posiciones polimórficas en la posición de la región
reguladora numerada 5106; posiciones en la región codificante
numeradas 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 y 3906; y la
posición 1451 según se numera en el registro X62855 del Genbank, en
los que las secuencias de las posiciones polimórficas en la región
reguladora de ACE son una o más de 5106T; y/o las secuencias de las
posiciones polimórficas en la región codificante son una o más de
375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G y 3906A. El
invento también abarca un ácido nucleico que codifica una deleción
de los nucleótidos 1451-1783, según se numera en el
registro X62855 del Genbank.
(ii) Ácidos nucleicos que codifican AGT que
tienen una o más posiciones polimórficas en las posiciones de la
región reguladora numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072
y 1204; posiciones en la región codificante numeradas 273, 912,
997, 1116 y 1174; y la posición 49, según se numera el registro
M24688 del Genbank, en los que las secuencias en las posiciones
polimórficas de la región reguladora de AGT son una o más de 412T y
1072A; las secuencias en la posición polimórfica de la región
codificante son una o más de 273T y 997C; y la secuencia en la
posición 49 del registro M24688 del Genbank es bien A o G.
(iii) Ácidos nucleicos que codifican AT1 que
tienen una o más posiciones polimórficas en las posiciones de la
región reguladora numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 y
2415; y la posición de la región codificante numerada 449, en los
que las secuencias en las posiciones polimórficas de la región
reguladora AT1 son una o más de 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C,
2355C y 2415G; y/o la secuencia en las posiciones polimórficas de
la región codificante es 449C.
El invento también abarca librerías de
secuencias de ácidos nucleicos aislados, según se define en las
reivindicaciones, en las que cada secuencia de la librería
comprende una o más posiciones polimórficas en los genes que
codifican ACE, AGT o AT1 humanos. También se proporcionan sondas de
ácido nucleico, según se define en las reivindicaciones, que
hibridan específicamente en las posiciones polimórficas
identificadas; péptidos y polipéptidos que comprenden posiciones
polimórficas; y anticuerpos específicos de polimorfismo, es decir,
anticuerpos específicos de secuencia que se unen diferencialmente a
variantes polimórficas de los polipéptidos de ACE, AGT o AT1, según
se de-
fine en las reivindicaciones, y, preferiblemente, pueden emplearse para identificar variantes polimórficas particulares.
fine en las reivindicaciones, y, preferiblemente, pueden emplearse para identificar variantes polimórficas particulares.
En aún otro aspecto, el invento proporciona
kits, según se define en las reivindicaciones, para determinar
patrones polimórficos en los genes ACE, AGT y/o AT1 de un individuo.
Los kits comprenden un medio para detectar secuencias polimórficas,
incluidas, sin limitación, sondas oligonucleótidas que hibridan en,
o adyacentes a, las posiciones polimórficas y anticuerpos
específicos de polimorfismo.
En aún otro aspecto, el invento proporciona
dianas de ácidos nucleicos y polipéptidos, según se define en las
reivindicaciones, para uso en métodos de escrutinio para identificar
candidatos de fármacos cardiovasculares. Las dianas de ácidos
nucleicos pueden ser, p. ej., ADN o ARN y son, preferiblemente, al
menos de alrededor de 10, y más preferiblemente al menos
aproximadamente de 15 residuos en longitud, y comprenden una o más
posiciones polimórficas. Las dianas de péptidos son al menos de
aproximadamente 5 aminoácidos en longitud y pueden ser tan grandes,
o más grandes, que los polipéptidos de cadena completa de ACE, AGT o
AT1.
1. Un "polimorfismo", según se usa en la
presente memoria, denota una variación en la secuencia de un gen de
un individuo. Una "posición polimórfica" es una posición
predeterminada de un nucleótido dentro de la secuencia de un gen o
una posición predeterminada de un aminoácido en la secuencia de un
polipéptido en la que se localiza un polimorfismo. Un individuo
"homocigoto" para un polimorfismo particular es uno en el que
ambas copias del gen contienen la misma secuencia en la posición
polimórfica. Un individuo "heterocigoto" para un polimorfismo
particular es uno en el que las dos copias del gen contienen
secuencias diferentes en la posición polimórfica.
2. Un "patrón de polimorfismo", según se
usa en la presente memoria, denota un grupo de uno o más
polimorfismos, el cual puede estar contenido en la secuencia de un
único gen o de una pluralidad de genes. Un patrón de polimorfismo
puede comprender polimorfismos de nucleótidos o de aminoácidos.
3. "Ácido nucleico" o
"polinucleótido", según se usa en la presente memoria, se
refiere a polímeros de cualquier longitud que contienen purina y
pirimidina, bien polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos o
polirribo-polidesoxirribonucleótidos mezclados.
Los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, moléculas de cadena
única y doble, es decir, híbridos ADN-ADN,
ADN-ARN y ARN-ARN, así como
"ácidos nucleicos peptídicos" (PNA, del inglés protein
nucleic acids) formados por conjugación de bases a una cadena
principal de aminoácidos. Esto también incluye ácidos nucleicos que
contienen bases modificadas.
4. Un ácido nucleico o polipéptido
"aislado", según se emplea en la presente memoria, se refiere a
un ácido nucleico o polipéptido que se elimina de su medioambiente
original (por ejemplo, su medioambiente natural si ocurre de forma
natural). Un ácido nucleico o polipéptido aislado contiene menos de
aproximadamente 50%, preferiblemente menos de aproximadamente 75%,
y más preferiblemente menos de aproximadamente 90% de los
componentes celulares con los que estaba asociado
originalmente.
5. Una secuencia de ácido nucleico o polipéptido
que "deriva de" una secuencia designada se refiere a una
secuencia que corresponde a una región de la secuencia designada.
Para las secuencias de ácido nucleico, esto abarca secuencias que
son homólogas o complementarias a la secuencia.
6. Una "sonda" se refiere a un ácido
nucleico u oligonucleótido que forma una estructura híbrida con una
secuencia de un ácido nucleico diana debido a complementariedad de
al menos una secuencia de la sonda con una secuencia del ácido
nucleico diana.
7. Los ácidos nucleicos son "hibridables"
entre sí cuando al menos una cadena del ácido nucleico puede
aparearse con otra cadena de ácido nucleico bajo condiciones de
estringencia definidas. La estringencia de hibridación se
determina, p. ej., por a) la temperatura a la que se lleva a cabo la
hibridación y/o lavado y b) la fuerza iónica y polaridad (p. ej.,
formamida) de las soluciones de hibridación y lavado, así como por
otros parámetros. La hibridación requiere que los dos ácidos
nucleicos contengan secuencias substancialmente complementarias;
dependiendo de la estringencia de la hibridación, sin embargo,
pueden tolerarse errores de apareamiento. La estringencia apropiada
para la hibridación de los ácidos nucleicos depende de la longitud
de los ácidos nucleicos y del grado de complementariedad, variables
bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, "alta estringencia",
según se usa en la presente memoria, se refiere a hibridación y/o
lavado a 68ºC en 0,2 x SSC, a 42ºC en 50% de formamida, 4 x SSC, o
bajo condiciones que pueden proporcionar niveles de hibridación
equivalentes a las observadas bajo cualquiera de estas dos
condiciones.
8. Un "gen" para una proteína particular,
según se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de
ácido nucleico contiguo correspondiente a una secuencia presente en
un genoma que comprende (i) una "región codificante", la cual
comprende exones (es decir, secuencias que codifican una secuencia
polipeptídica o "secuencias codificantes de proteína"),
intrones y secuencias en la unión entre exones e intrones; y (ii)
secuencias reguladoras, las cuales flanquean la región codificante
en ambos extremos 5' y 3'. Por ejemplo, el "gen ACE", según se
usa en la presente memoria, abarca las regiones reguladora y
codificante del gen humano que codifica la enzima convertidora de
angiotensina. De forma similar, el "gen AGT" abarca regiones
reguladoras y codificantes del gen humano que codifica
angiotensinógeno y el "gen AT1" abarca regiones reguladoras y
codificantes del gen humano que codifica el receptor de tipo I de
la angiotensina II. Típicamente, las secuencias reguladoras, de
acuerdo con el invento, están localizadas 5' (es decir,
upstream) del segmento de región codificante. Las secuencias
referencia, obtenidas del Genbank, que se usaron en la práctica del
presente invento se muestran en la Tabla 1.
\newpage
Los inventores presentes han descubierto de
forma sorprendente e inesperada la existencia de polimorfismos
genéticos dentro de los genes humanos que codifican ACE, AGT y AT1,
los cuales, solos o en combinación, pueden emplearse para evaluar
el estado cardiovascular. De acuerdo con el invento, el patrón
polimórfico de las secuencias ACE, AGT y/o AT1 de un individuo
puede predecir la respuesta del individuo a intervenciones
terapéuticas particulares y servir como un indicador de la
predisposición a varias formas de la enfermedad cardiovascular. El
invento proporciona métodos para evaluar el estado cardiovascular
por detección de patrones polimórficos en un individuo. El presente
invento también proporciona los ácidos nucleicos aislados derivados
de los genes ACE, AGT y AT1, los cuales comprenden estos
polimorfismos, incluyendo las sondas que hibridan de forma
específica a las posiciones polimórficas; los polipéptidos y
péptidos aislados que comprenden residuos polimórficos; y los
anticuerpos que reconocen específicamente los polipéptidos ACE, AGT
o AT1 que contienen uno o más aminoácidos polimórficos.
El presente invento proporciona métodos
diagnósticos para evaluar el estado cardiovascular de un individuo
humano. El estado cardiovascular, según se emplea en la presente
memoria, se refiere al estado fisiológico del sistema
cardiovascular de un individuo como se refleja en uno o más
marcadores o indicadores. Los marcadores del estado incluyen, sin
limitación, medidas clínicas tales como, p. ej., presión sanguínea,
perfil electrocardiográfico y análisis diferenciado del flujo
sanguíneo. Los marcadores del estado, de acuerdo con el invento,
incluyen diagnósticos de uno o más síndromes cardiovasculares tales
como, p. ej., hipertensión, infarto agudo de miocardio, infarto de
miocardio silente, derrame cerebral y aterosclerosis. Se entenderá
que un diagnóstico de un síndrome cardiovascular hecho por un
profesional médico abarca medidas clínicas y juicio médico. Los
marcadores del estado, de acuerdo con el invento, se evalúan
empleando métodos convencionales bien conocidos en la técnica.
También incluidos en la evaluación del estado cardiovascular están
los cambios cuantitativos o cualitativos de los marcadores del
estado con el tiempo, tales como se usarían, p. ej., en la
determinación de la respuesta de un individuo a un régimen
terapéutico particular.
Los métodos se llevan a cabo mediante las etapas
de:
(i) determinar la secuencia de una o más
posiciones polimórficas dentro de uno o más de los genes que
codifican la enzima convertidora de angiotensina (ACE),
angiotensinógeno (AGT) o receptor tipo I de angiotensina II (AT1)
en el individuo para establecer un patrón polimórfico para el
individuo; y
(ii) comparar el patrón polimórfico establecido
en (i) con los patrones polimórficos de humanos que exhiben
diferentes marcadores del estado cardiovascular. El patrón
polimórfico del individuo es, preferiblemente, altamente similar y,
más preferiblemente, idéntico al patrón polimórfico de individuos
que exhiben marcadores particulares del estado, síndromes
cardiovasculares y/o patrones particulares de respuesta a
intervenciones terapéuticas. Los patrones polimórficos pueden
incluir también posiciones polimórficas en otros genes que
muestran, en combinación con una o más posiciones polimórficas de
ACE, AGT o AT1, correlación con la presencia de marcadores del
estado particulares.
En una realización, el método comprende comparar
el patrón polimórfico de un individuo con los patrones polimórficos
de individuos que han mostrado responder positiva o negativamente a
un régimen terapéutico particular. El régimen terapéutico, según se
emplea en la presente memoria, se refiere a tratamientos dirigidos a
eliminar o mejorar los síntomas y eventos asociados a la enfermedad
cardiovascular. Tales tratamientos incluyen, sin limitación, uno o
más de alteraciones en la dieta, estilo de vida y régimen de
ejercicio; técnicas quirúrgicas invasivas y no invasivas tales como
aterectomía, angioplastia y cirugía de bypass coronario; e
intervenciones farmacéuticas tales como administración de
inhibidores de ACE, antagonistas del receptor de angiotensina II,
diuréticos, antagonistas del adrenorreceptor alfa, glucósidos
cardiacos, inhibidores de fosfodiesterasa, antagonistas del
adrenorreceptor beta, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores
de HMG-CoA reductasa, agonistas del receptor de
imidazolina, agonistas del receptor de endotelina y nitritos
orgánicos. Las intervenciones con agentes farmacéuticos aún
desconocidos cuya actividad se correlaciona con patrones
polimórficos particulares asociados con la enfermedad
cardiovascular también se abarcan. Los inventores presentes han
descubierto que patrones polimórficos particulares se correlacionan
con la respuesta de un individuo a los inhibidores de ACE
(véase, p. ej., el Ejemplo 3 a continuación). Se contempla,
por ejemplo, que los pacientes que son candidatos para un régimen
terapéutico particular se escrutarán para patrones polimórficos que
correlacionan con respuesta a ese régimen particular.
En una realización preferida, la presencia o
ausencia en un individuo de un patrón polimórfico que comprende ACE
2193 A/G, AGR 1072 G/G y AT1 1167 A/A (véase abajo) se
determina para identificar la respuesta de un individuo a los
inhibidores de ACE.
En otra realización, el método incluye comparar
el patrón polimórfico de un individuo con los patrones polimórficos
de individuos que exhiben o han exhibido uno o más marcadores de
enfermedad cardiovascular tales como, p. ej., presión sanguínea
elevada, perfil electrocardiográfico anormal, infarto de miocardio,
derrame cerebral o aterosclerosis (véase, p. ej., el Ejemplo
2 a continuación).
En la práctica de los métodos del invento, el
patrón polimórfico de un individuo puede establecerse obteniendo
ADN del individuo y determinando la secuencia en posiciones
polimórficas predeterminadas de ACE, AGT y AT1 tal como se describe
anteriormente.
\newpage
El ADN puede obtenerse a partir de cualquier
fuente de células. Ejemplos no limitantes de fuentes de células
disponibles en la práctica clínica incluyen células sanguíneas,
células bucales, células cervicovaginales, células epiteliales de
orina, células fetales o cualquier célula presente en tejidos
obtenidos por biopsia. Las células también pueden obtenerse a
partir de fluidos corporales, incluidos sin limitación, sangre,
saliva, sudor, orina, líquido cerebroespinal, heces y tejidos
exudados en el lugar de la infección o inflamación. El ADN se
extrae a partir de la fuente de células o del fluido corporal
empleando cualquiera de los numerosos métodos que son estándar en
la técnica. Se entenderá que el método particular empleado para
extraer ADN dependerá de la naturaleza de la fuente.
La determinación de la secuencia del ADN
extraido en las posiciones polimórficas de los genes ACE, AGT y/o
AT1 se logra por medios conocidos en la técnica, incluidos pero no
limitados a la secuenciación directa, hibridación con
oligonucleótidos específicos de alelo, PCR específica de alelo, PCR
ligasa, escisión HOT, electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante (DDGE) y polimorfismo conformacional de cadena
sencilla (SSCP). La secuenciación directa puede realizarse por
cualquier método, incluidos, sin limitación, secuenciación química,
empleando el método de Maxam-Gilbert; mediante
secuenciación enzimática, empleando el método de Sanger;
secuenciación por espectrometría de masas; y secuenciación
empleando una tecnología basada en chips. Véase, p. ej.,
Little et al., Genet Anal 6:151, 1996. Preferiblemente, el
ADN de un sujeto se somete primero a amplificación por la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) empleando cebadores de
amplificación específicos.
En una realización alternativa, se obtiene
biopsia de tejido a partir de un sujeto. Entonces se aplican
anticuerpos que son capaces de distinguir entre las diferentes
formas polimórficas de ACE, AGT y/o AT1 a las muestras del tejido
para determinar la presencia o ausencia de una forma polimórfica
especificada por el anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser
policlonales o monoclonales, preferiblemente monoclonales. La medida
de la unión específica de los anticuerpos a las células puede
realizarse mediante cualquier método conocido, p. ej., citometría
de flujo cuantitativa o inmunoensayo ligado a enzima o ligado a
fluorescencia. La presencia o ausencia de un polimorfismo o patrón
polimórfico particular, y su distribución alélica (es decir,
homocigosidad versus heterocigosidad) se determina comparando los
valores obtenidos a partir de un paciente con promedios establecidos
a partir de poblaciones de pacientes que tienen patrones
polimórficos conocidos.
En una realización alternativa, el ARN se aísla
a partir de biopsia de tejido empleando métodos estándar bien
conocidos para aquellos especialistas en la técnica tales como
extracción con tiocianato de guanidinio
fenol-cloroformo (Chomocyznski et al., Anal
Biochem 162:156, 1987). El ARN aislado se somete entonces a
transcripción reversa acoplada y amplificación mediante reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR), empleando
cebadores oligonucleótidos específicos. Las condiciones para el
apareamiento de los cebadores se escogen para asegurar la
transcripción reversa y amplificación específicas; de este modo, la
aparición de un producto de amplificación es diagnóstico de la
presencia de alelos particulares. En otra realización, el ARN se
transcribe en reversa y amplifica, después de lo cual las
secuencias amplificadas se identifican mediante, p. ej.,
secuenciación directa.
En la práctica del presente invento, la
distribución de los patrones polimórficos en un gran número de
individuos que exhiben marcadores particulares del estado
cardiovascular se determina por cualesquiera de los métodos
descritos anteriormente, y se compara con la distribución de los
patrones polimórficos en pacientes que se han emparejado por edad,
origen étnico y/o cualquier otro parámetro relevante estadística o
médicamente, que exhiben marcadores del estado diferentes
cuantitativa o cualitativamente. Las correlaciones se realizan
empleando cualquier método conocido en la técnica, incluida la
regresión logística nominal o el análisis estándar de regresión de
mínimos cuadrados. De esta manera, es posible establecer
correlaciones estadísticamente significativas entre patrones
polimórficos particulares y estados cardiovasculares particulares.
Además, es posible establecer correlaciones estadísticamente
significativas entre patrones polimórficos particulares y cambios en
el estado cardiovascular tal como resultaría, p. ej., de regímenes
de tratamiento particulares. De esta manera, es posible
correlacionar patrones polimórficos con respuesta a tratamientos
particulares.
Las posiciones polimórficas en los genes que
codifican ACE, AGT y AT1, que se abarcan en el presente invento, se
identifican determinando la secuencia de ADN de todos, o parte, de
los genes ACE, AGT y/o AT1 en multitud de individuos de una
población. La determinación de la secuencia de ADN puede realizarse
empleando cualquier método convencional, incluyendo, p. ej.,
secuenciación química o enzimática.
Las posiciones polimórficas del invento
incluyen, sin limitación, aquellas relacionadas a continuación, cuya
numeración corresponde a las secuencias del Genbank relacionadas en
la Tabla 1.
(i) ACE: posiciones en la región reguladora
(designada ACR) numeradas 5106, 5349 y 5496; posiciones en la
región codificante (designada ACE) numeradas 375, 582, 731, 1060,
1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 y 3906; y la posición
1451, según se numera en el registro X62855 del Genbank.
(ii) AGT: posiciones en la región reguladora
(designada AGR) numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072,
1204 y 1218; posiciones en la región codificante (designada AGT)
numeradas 273, 620, 803, 912, 997, 1116 y 1174; y la posición 49,
según se numera en el registro M24688 del Genbank.
\newpage
(iii) AT1: posiciones en la región reguladora
(designada ATR) numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 y
2415; y posiciones en la región codificante (designada AT1)
numeradas 449, 678, 1167 y 1271.
En realizaciones preferidas, la secuencia en
cada una de las posiciones polimórficas anteriores es una de:
(i) Región reguladora de ACE: 5106C, 5106T,
5349A, 5349T, 5496T y 5496C;
(ii) Región codificante de ACE: 375A, 375C,
582C, 582T, 731A, 731G, 1060G, 1060A, 1215C, 1215T, 2193G, 2193A,
2328A, 2328G, 2741G, 2741T, 3132C, 3132T, 3387T, 3387C, 3503G,
3503C, 3906G y 3906A; y una deleción de los nucleótidos
1451-1783, según se numera en el registro X62855 del
Genbank;
(iii) Región reguladora de AGT: 395T, 395A,
412C, 412T, 432G, 432A, 449T, 449C, 692C, 692T, 839G, 839A, 1007G,
1007A, 1072G, 1072A, 1204C, 1204A, 1218A, 1218G;
(iv) Región codificante de AGT: 273C, 273T,
620C, 620T, 803T, 803C, 912C, 912T, 997G, 997C, 1116G, 1116A, 1174C
y 1174A; y A o G en la posición 49 del registro M24688 del
Genbank;
(v) Región reguladora de AT1: 1427A, 1427T,
1756T, 1756A, 1853T, 1853G, 2046T, 2046C, 2354A, 2354C, 2355G,
2355C, 2415A y 2415G; y
(vi) Región codificante de AT1: 449G, 449C.
678T, 678C, 1167A, 1167G, 1271A y 1271C.
Un individuo puede ser homocigoto o heterocigoto
para una posición polimórfica particular (véase, p. ej., la
Tabla 6 abajo).
Ejemplos no limitantes de patrones polimórficos
que comprenden uno o más polimorfismos en los genes ACE, AGT y/o
AT1, de acuerdo con el invento, incluyen los siguientes, los cuales
se correlacionaron con una incidencia aumentada de síntomas
clínicos de enfermedad cardiovascular:
ACR 5349 A/T, AGR 1218 A; ACR 5496 C, AGR 1204
A/C; ACR 5496 C/T, AGR 1218 A, AGT 620 C/T; ACE 2193 A, AGR 1204 C,
ACE 2328 G; ACE 2193 A, AGR 1204 A/C; ACE 3387 T, AGR 1218 A; ACE
3387 T, AGT 620 C/T; AGR 1204 A/C, AT1 678 C/T; AGR 1204 A/C, AT1
1271 A/C; ACE 1215 C, AGR 1204 A/C; AGR 1204 A/C, AT1 1167 A, ACE
3906 A/G; AGR 1204 A, AGT 620 C, AT1 1271 A, AT1 1167 A, AGR 395
A/T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1 1167 A, AGR 395
T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1 1167 A/G, AGR 395 T;
AGR 1204 A, AT1 678 C, AT1 1167 A, AGR 395 A/T; AGR 1204 A/C, AT1
678 C/T, AT1 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1 1167
A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1 1167 A/G, AGR 395 T;
AGT 620 C, AT1 1271 A, AT1 1167 A, AGR 395 A/T; AGT 620 C, AT1 678
A, AT1 1167 A, AGR 395 A/T; AGT 620 C/T, AT1 678 C/T; AT1 1167 A,
AGR 395 T; ACE 2193 A, AGR 1218 A, AGT 803 A; ACE 2193 A, AGT 620
C/T; ACE 2328 G, AGT 620 C/T; ACE 3387 T, AGR 1204 A/C; ACE 2193 A,
ACE 2328 G, AGR 1204 C; y ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, AT1
1167 A/A.
El presente invento proporciona ácidos nucleicos
aislados que comprenden las posiciones polimórficas descritas
anteriormente para los genes ACE, AGT y AT1 humanos; vectores que
comprenden los ácidos nucleicos; y células hospedantes
transformadas que comprenden los vectores. El invento también
proporciona sondas, las cuales son útiles para detectar estos
polimorfismos.
En la práctica del presente invento, se emplean
muchas técnicas convencionales de biología molecular, microbiología
y ADN recombinante. Tales técnicas son bien conocidas y están
completamente explicadas en, por ejemplo, Sambrook et al.,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y
II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984
(M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames y
Higgins); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, 1997, (John Wiley e hijos); y Methods in
Enzymology, vol. 154 y vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds.,
respectivamente).
La inserción de ácidos nucleicos (típicamente
ADN) que comprenden las secuencias del presente invento dentro de
un vector se realiza fácilmente cuando los extremos de ambos ADN y
el vector comprenden sitios de restricción compatibles. Si esto no
puede hacerse, puede ser necesario modificar los extremos de los ADN
y/o vector digiriendo la parte de ADN de cadena sencilla que cuelga
mediante escisión por endonucleasas de restricción para producir
extremos romos o conseguir el mismo resultado rellenando los
extremos de cadena única con una polimerasa de ADN apropiada.
Alternativamente, puede producirse cualquier
sitio deseado, p. ej., por ligación de secuencias nucleotídicas
(enlazadores) sobre los extremos. Tales enlazadores pueden
comprender secuencias de oligonucleótidos específicas que definen
sitios de restricción deseados. Los sitios de restricción también
pueden generarse mediante el empleo de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Véase, p. ej., 1988, Science 239:48.
El vector escindido y los fragmentos de ADN pueden modificarse
también si se requiere, mediante prolongación homopolímera.
Los ácidos nucleicos pueden aislarse
directamente de las células o pueden sintetizarse químicamente
empleando métodos conocidos. Alternativamente, el método de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede usarse para
producir los ácidos nucleicos del invento, empleando como moldes
bien cadenas sintetizadas químicamente o material genómico. Los
cebadores usados para PCR pueden sintetizarse empleando la
información de la secuencia proporcionada en esta memoria y pueden,
además, diseñarse para introducir nuevos sitios de restricción
apropiados, si se desea para facilitar la incorporación dentro de
un vector dado para expresión recombinante.
Los ácidos nucleicos del presente invento pueden
flanquearse por secuencias génicas nativas de ACE, AGT o AT1, o
pueden asociarse con secuencias heterólogas, incluidas promotores,
intensificadores, elementos de respuesta, secuencias señal,
secuencias de poliadenilación, intrones, regiones 5' y 3' no
codificantes y similares. Los ácidos nucleicos pueden modificarse
también de muchas maneras conocidas en la técnica. Ejemplos no
limitantes de tales modificaciones incluyen metilación,
"capuchas", sustitución por un análogo de uno o más nucleótidos
que ocurren de forma natural, modificaciones internucleótidas tales
como, por ejemplo, aquéllas con enlazadores no cargados (p. ej.,
metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos,
etc.) y con enlazadores cargados (p. ej., fosforotioatos,
fosforoditioatos, etc.). Los ácidos nucleicos pueden contener uno o
más restos adicionales enlazados covalentemente tales como, por
ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos,
péptidos señal, poli-L-lisina,
etc.), intercaladores (p. ej., acridina, psoralen, etc.), quelantes
(p. ej., metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidativos,
etc.) y alquiladores. Los PNA también están incluidos. Los ácidos
nucleicos pueden derivatizarse por formación de un enlace metil o
etil fosfotriéster o un alquilfosforamidato. Además, las secuencias
de ácido nucleico del presente invento pueden modificarse también
con un marcaje capaz de proporcionar una señal detectable, bien
directa o indirectamente. Marcajes ilustrativos incluyen
radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.
El invento también proporciona vectores de
ácidos nucleicos que comprenden las secuencias génicas descritas
derivadas de ACE, AGT y AT1, sus derivados o sus fragmentos. Un gran
número de vectores, incluidos plásmidos y vectores fúngicos, se han
descrito para la replicación y/o expresión en una variedad de
hospedantes eucariotas y procariotas, y pueden emplearse para
terapia génica, así como para simple clonaje o expresión proteica.
Ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen, sin
limitación, los plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc.,
Madison, WI) o pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA), y muchas
células hospedantes apropiadas, empleando métodos descritos o
citados en esta memoria o de otra manera conocidos para los expertos
en la técnica relevante. La elección particular de
vector/hospedante no es crítica para la práctica del invento.
Las células hospedantes adecuadas pueden
transformarse/transfectarse/infectarse según sea apropiado mediante
cualquier método adecuado, incluida electroporación, incorporación
de ADN mediada por CaCl_{2}, infección fúngica o vírica,
microinyección, micropoyectil u otros métodos establecidos. Células
hospedantes apropiadas incluyen bacterias, arquebacterias, hongos,
especialmente levaduras y células de plantas y animales,
especialmente células de mamíferos. Se han aislado un gran número
de regiones reguladoras del inicio y final de la transcripción, que
se han mostrado eficaces en la transcripción y traducción de
proteínas heterólogas en los diversos hospedantes. Ejemplos de
estas regiones, métodos de aislamiento, modos de manipulación, etc.
son conocidos en la técnica. Bajo condiciones de expresión
adecuadas, las células hospedantes pueden emplearse como una fuente
de péptidos y polipéptidos derivados de ACE, AGT o AT1 producidos
de forma recombinante.
Los ácidos nucleicos que codifican las
secuencias génicas derivadas de ACE, AGT o AT1 también pueden
introducirse dentro de las células mediante eventos de
recombinación. Por ejemplo, tal secuencia puede introducirse en una
célula y, de ese modo, efectuar recombinación homóloga en el lugar
de un gen endógena o de una secuencia con identidad substancial al
gen. Otros métodos basados en la recombinación tales como
recombinaciones no homólogas o deleción de genes endógenos mediante
recombinación homóloga también pueden emplearse.
Los ácidos nucleicos del presente invento
encuentran uso como sondas para la detección de polimorfismos
genéticos y como moldes para la producción recombinante de péptidos
y polipéptidos normales o variantes derivados de ACE, AGT o
AT1.
Las sondas, de acuerdo con el presente invento,
comprenden, sin limitaciones, ácidos nucleicos aislados de
aproximadamente 10-100 pb, preferiblemente
15-75 pb y más preferiblemente 17-25
pb en longitud, las cuales hibridan a estringencia elevada con una
o más de las secuencias polimórficas derivadas del gen ACE, AGT o
AT1 descritas en esta memoria o con una secuencia inmediatamente
adyacente a una posición polimórfica. Además, en algunas
realizaciones puede emplearse como sonda una secuencia de un gen
completo. En una serie de realizaciones, las sondas se extienden
sobre las posiciones polimórficas de los genes ACE, AGT o AT1
descritos anteriormente. En otra serie de realizaciones, las sondas
se corresponden a secuencias inmediatamente adyacentes a las
posiciones polimórficas.
El presente invento abarca péptidos y
polipéptidos aislados que codifican ACE, AGT y AT1 que comprenden
posiciones polimórficas descritas anteriormente. En una realización
preferida, los péptidos y polipétidos son dianas de escrutinio
útiles para identificar fármacos cardiovasculares. En otras
realizaciones preferidas, los péptidos y polipéptidos son capaces
de producir anticuerpos en un animal hospedante adecuado que
reaccionan específicamente con un polipéptido que comprende la
posición polimórfica y distinguirlo de otros polipéptidos que tienen
una secuencia diferente en esa posición.
Los polipéptidos, de acuerdo con el invento,
tienen preferiblemente al menos cinco o más residuos de longitud,
preferiblemente al menos quince residuos. Los métodos para obtener
estos polipéptidos se describen a continuación. Se emplean muchas
técnicas convencionales en bioquímica de proteínas e inmunología.
Tales técnicas son bien conocidas y se explican en
Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987
(Mayer y Waler, eds; Academic Press, Londres); Scopes, 1987,
Protein Purification: Principles and Practice, segunda
edición (Springer-Verlag, N. Y.) y Handbook of
Experimental Immunology, 1986, volúmenes I-IV
(Weir y Blackwell eds.).
Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias
codificantes de proteínas pueden emplearse para dirigir la
expresión recombinante de polipéptidos derivados de ACE, AGT o AT1
en células intactas o en sistemas de traducción libres de células.
El código genético conocido, ajustado si se desea para una expresión
más eficaz en un organismo hospedante dado, puede emplearse para
sintetizar oligonucleótidos que codifican las secuencias de
aminoácidos deseados. Los polipéptidos pueden aislarse a partir de
células humanas o a partir de organismos o células heterólogas
(incluidas, pero no limitadas a, células bacterianas, hongos, de
insectos, de plantas y de mamíferos) en los que se ha introducido y
expresado una secuencia codificante de proteína apropiada. Además,
los polipéptidos pueden formar parte de proteínas recombinantes de
fusión.
Los péptidos y polipéptidos pueden sintetizarse
químicamente por procedimientos automáticos disponibles
comercialmente, incluidos, sin limitación, síntesis en fase sólida
exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensación de
fragmentos o síntesis clásica en solución. Los polipéptidos se
preparan preferiblemente mediante síntesis de péptidos en fase
sólida, como se describe por Merrifield, 1963, J Am Chem Soc
85:2149.
Los métodos para la purificación polipeptídica
se conocen bien en la técnica, incluidos, sin limitación,
electroforesis preparativas de disco en gel, isoelectroenfoque,
HPLC, HPLC en fase reversa, filtración en gel, cromatografía de
intercambio iónico y partición y distribución en contracorriente.
Para algunos propósitos, es preferible producir el polipéptido en
un sistema recombinante en el que la proteína contiene una secuencia
etiqueta adicional que facilite la purificación tal como, pero no
limitada a, una secuencia de polihistidinas. Entonces el polipéptido
puede purificarse a partir de un lisado crudo de células
hospedantes mediante cromatografía en una matriz de fase sólida
apropiada. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos
producidos contra ACE, AGT o AT1 o contra péptidos derivados de
aquellos como reactivos de purificación. Otros métodos de
purificación son posibles.
El presente invento también abarca derivados y
homólogos de los polipéptidos. Para algunos propósitos, las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos pueden
alterarse mediante sustituciones, adiciones o deleciones que
proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes, es decir,
variantes conservadoras de la función. Por ejemplo, uno o más
aminoácidos de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido
de propiedades similares tales como, por ejemplo, aminoácidos
cargados positivamente (arginina, lisina e histidina); aminoácidos
cargados negativamente (aspartato y glutamato); aminoácidos neutros
polares; y aminoácidos no polares.
Los polipéptidos aislados pueden modificarse
mediante, por ejemplo, fosforilación, sulfatación, acilación u
otras modificaciones proteicas. Éstos también pueden modificarse con
un marcaje capaz de proporcionar una señal detectable, bien directa
o indirectamente, que incluye, pero no está limitado a,
radioisótopos y compuestos fluorescentes.
El presente invento también abarca anticuerpos
que reconocen específicamente las posiciones polimórficas del
invento y distinguen un péptido o polipéptido que contiene un
polimorfismo particular de otro que contiene una secuencia
diferente en esa posición. Tales anticuerpos específicos de posición
polimórfica, de acuerdo con el presente invento, incluyen
anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos pueden
producirse en un animal hospedante por inmunización con componentes
inmunógenos derivados de ACE, AGT o AT1 o pueden formarse mediante
inmunización in vitro de células inmunes. Los componentes
inmunógenos empleados para producir los anticuerpos pueden aislarse
a partir de células humanas o producirse en sistemas recombinantes.
Los anticuerpos también pueden producirse en sistemas recombinantes
programados con ADN que codifica el anticuerpo apropiado.
Alternativamente, los anticuerpos pueden construirse mediante
reconstitución bioquímica de cadenas pesadas y ligeras purificadas.
Los anticuerpos incluyen anticuerpos híbridos (es decir, que
contienen dos grupos de combinaciones de cadenas pesadas/cadenas
ligeras, cada uno de las cuales reconoce un antígeno diferente),
anticuerpos quimeras (es decir, en los que bien las cadenas pesadas,
las cadenas ligeras o ambas son proteínas de fusión) y anticuerpos
univalentes (es decir, que comprenden un complejo de cadena
pesada/cadena ligera unido a una región constante de una segunda
cadena pesada). También incluidos están los fragmentos Fab, que
incluyen los fragmentos Fab' y F(ab)_{2} de los
anticuerpos. Los métodos para producir todos los tipos de
anticuerpos y derivados anteriores son bien conocidos en la técnica
y se discuten en más detalle a continuación. Por ejemplo, las
técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se
describen en Mayer y Walter, 1987, Immunochemical Methods in
Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres). La
metodología general para fabricar anticuerpos monoclonales mediante
hibridomas se conoce bien. Pueden crearse líneas celulares
inmortales productoras de anticuerpos por fusión celular, y también
por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos
B con ADN oncogénico, o por transfección con virus
Epstein-Barr. Véase, p. ej., Schrerier et
al., 1980, Hybridoma Techniques; patentes de EE.UU. nº
4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.466.917; 4.472.500;
4.491.632; y 4.493.890. Los paneles de anticuerpos monoclonales
producidos contra epítopos derivados
de ACE, AGT o AT1 pueden escrutarse para varias propiedades; es decir, para isotipo, afinidad de epítopo, etc.
de ACE, AGT o AT1 pueden escrutarse para varias propiedades; es decir, para isotipo, afinidad de epítopo, etc.
Los anticuerpos de este invento pueden
purificarse por métodos estándar, incluidos, pero no limitados a,
electroforesis preparativa de disco en gel, isoelectroenfoque,
HPLC, HPLC en fase reversa, filtración en gel, cromatografía de
intercambio iónico y partición y distribución en contracorriente.
Los métodos de purificación para anticuerpos se describen, p. ej.,
en The Art of Antibody Purification, 1989, Amicon Division,
W.R. Grace & Co. Métodos generales de purificación de proteínas
se describen en Protein Purification: Principles and
Practice, R.K. Scopes, Ed., 1987,
Springer-Verlag, Nueva York, NY.
Los métodos para determinar la capacidad
inmunógena de las secuencias descritas y las características de los
anticuerpos y células inmunes resultantes específicos de secuencia
son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos
producidos en respuesta a un péptido que comprende una secuencia
polimórfica particular pueden someterse a ensayo para determinar su
capacidad para reconocer específicamente esa secuencia polimórfica,
es decir, para unirse de forma diferencial a un péptido o
polipéptido que comprende la secuencia polimórfica y, de este modo,
distinguirlo de un péptido o polipéptido similar que contiene una
secuencia diferente en la misma posición.
El presente invento proporciona kits para
determinar la secuencia en posiciones polimórficas dentro de los
genes ACE, AGT y AT1 de un individuo. Los kits comprenden un medio
para determinar la secuencia en una o más posiciones polimórficas y
pueden, opcionalmente, incluir datos para el análisis de patrones
polimórficos. Los medios para determinar la secuencia pueden
comprender reactivos adecuados basados en ácidos nucleicos e
inmunológicos (véase abajo). Preferiblemente, los kits
también comprenden tampones adecuados, reactivos control donde
apropiado e instrucciones para determinar la secuencia en una
posición polimórfica. Los kits también pueden comprender datos para
correlacionar patrones polimórficos particulares con regímenes de
tratamiento u otros indicadores deseables.
El invento proporciona métodos basados en ácidos
nucleicos para detectar patrones polimórficos en una muestra
biológica. La secuencia en posiciones polimórficas particulares de
los genes que codifican ACE, AGT y/o AT1 se determina empleando
cualquier medio adecuado conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, hibridación con sondas específicas de polimorfismo y
secuenciación directa.
El presente invento también proporciona kits
adecuados para aplicaciones diagnósticas basadas en ácidos
nucleicos. En una realización, los kits diagnósticos incluyen los
siguientes componentes:
(i) Sonda de ADN: la sonda de ADN puede
marcarse previamente; alternativamente, la sonda de ADN puede estar
sin marcar y los ingredientes para el marcaje pueden estar incluidos
en el kit en envases separados; y
(ii) Reactivos de hibridación: el kit
puede contener también otros reactivos y materiales adecuadamente
empaquetados necesarios para el protocolo particular de
hibridación, incluyendo matrices de fase sólida, si aplicable, y
estándares.
En otra realización, los kits diagnósticos
incluyen:
(i) Cebadores para determinar la
secuencia: los cebadores de secuenciación pueden estar marcados
previamente o pueden contener un residuo para purificación por
afinidad o de unión; y
(ii) Reactivos para determinar la
secuencia: el kit puede contener también otros reactivos y
materiales empaquetados adecuadamente necesarios para el protocolo
particular de secuenciación. En una realización preferida, el kit
comprende un panel de cebadores de secuenciación, cuyas secuencias
corresponden a secuencias adyacentes a las siguientes posiciones
polimórficas: ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, AT1 1167 A/A; así como un
medio para detectar la presencia de cada secuencia polimórfica.
El invento también proporciona métodos basados
en anticuerpos para la detección de patrones polimórficos en una
muestra biológica. Los métodos comprenden las etapas de: (i) poner
en contacto una muestra con una o más preparaciones de anticuerpos,
en las que cada una de las preparaciones de anticuerpos es
específica para una forma polimórfica particular bien de ACE, AGT o
AT1, bajo condiciones en las que puede formarse un complejo estable
antígeno-anticuerpo entre el anticuerpo y los
componentes antigénicos de la muestra; y (ii) emplear cualquier
medio adecuado conocido en la técnica en el que la detección de un
complejo indica la presencia de la forma polimórfica particular en
la muestra.
Típicamente, los inmunoensayos emplean bien un
anticuerpo marcado o un componente antigénico marcado (p. ej., que
compite con el antígeno de la muesta para unirse al anticuerpo).
Marcajes adecuados incluyen, sin limitación, moléculas basadas en
enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o
colorantes. Los ensayos que amplifican las señales a partir de la
sonda también son conocidos, tales como, por ejemplo, los que
utilizan biotina y avidina y los inmunoensayos marcados con
enzimas, tales como los ensayos de ELISA.
El presente invento también proporciona kits
adecuados para aplicaciones diagnósticas basadas en anticuerpos.
Los kits diagnósticos típicamente incluyen uno o más de los
componentes siguientes:
(i) Anticuerpos específicos de
polimorfismo: los anticuerpos pueden estar marcados previamente;
alternativamente, el anticuerpo puede estar sin marcar y los
ingredientes para el marcaje pueden estar incluidos en el kit en
envases separados, o se proporciona un anticuerpo secundario
marcado; y
(ii) Componentes de la reacción: el kit
puede contener también otros reactivos y materiales empaquetados
adecuadamente necesarios para el protocolo particular del
inmunoensayo, incluidos matrices de fase sólida, si aplicable, y
estándares.
Los kits referidos anteriormente pueden incluir
instrucciones para llevar a cabo el ensayo. Además, en realizaciones
preferidas, los kits de diagnóstico se adaptan a operaciones de
alto rendimiento y/o automáticas.
De acuerdo con el presente invento, las
secuencias de nucleótidos derivadas de los genes que codifican ACE,
AGT y AT1 y las secuencias peptídicas derivadas de los polipéptidos
ACE, AGT y AT1, particularmente aquéllas que contienen una o más
secuencias polimórficas, comprenden dianas útiles para identificar
fármacos cardiovasculares, es decir, compuestos que son eficaces
para tratar uno o más síntomas clínicos de la enfermedad
cardiovascular.
Las dianas de los fármacos incluyen, sin
limitación, (i) ácidos nucleicos aislados derivados de los genes
que codifican ACE, AGT y AT1 y (ii) péptidos y polipéptidos aislados
derivados de polipéptidos ACE, AGT y AT1, cada una de los cuales
comprende una o más posiciones polimórficas.
En una serie de realizaciones, un ácido nucleico
aislado que comprende una o más posiciones polimórficas se somete a
ensayo in vitro para su capacidad para unir compuestos de
ensayo de una manera específica de secuencia. Los métodos
comprenden:
(i) proporcionar un primer ácido nucleico que
contiene una secuencia particular en una posición polimórfica y un
segundo ácido nucleico cuya secuencia es idéntica a la del primer
ácido nucleico salvo por una secuencia diferente en la misma
posición polimórfica;
(ii) poner en contacto los ácidos nucleicos con
una multitud de compuestos de ensayo bajo condiciones apropiadas
para la unión; e
(iii) identificar aquellos compuestos que se
unen selectivamente bien a la primera o a la segunda secuencia de
ácido nucleico.
La unión selectiva, como se emplea en esta
memoria, se refiere a cualquier diferencia medible en cualquier
parámetro de unión tal como, p. ej., afinidad de unión, capacidad de
unión, etc.
En otra serie de realizaciones, un péptido o
polipéptido aislado que comprende una o más posiciones polimórficas
se somete a ensayo in vitro para su capacidad para unir
compuestos de ensayo de una manera específica de secuencia. Los
métodos de escrutinio incluyen:
(i) proporcionar un primer péptido o polipéptido
que contiene una secuencia particular en una posición polimórfica y
un segundo péptido o polipéptido cuya secuencia es idéntica a la del
primer péptido o polipéptido salvo por una secuencia diferente en
la misma posición polimórfica;
(ii) poner en contacto los polipéptidos con una
multitud de compuestos de ensayo bajo condiciones de unión
apropiadas; e
(iii) identificar aquellos compuestos que se
unen selectivamente a una de las secuencias de ácidos nucleicos.
En realizaciones preferidas, los protocolos de
escrutinio de alto rendimiento se emplean para examinar un gran
número de compuestos de ensayo para su capacidad de unir los genes o
péptidos descritos anteriormente de una manera específica de
secuencia.
Los compuestos de ensayo se escrutan a partir de
grandes librerías de compuestos sintéticos o naturales. En la
actualidad se emplean numerosos medios para la síntesis al azar y
directa de compuestos basados en sacáridos, péptidos y ácidos
nucleicos. Las librerías de compuestos sintéticos están disponibles
comercialmente de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU),
Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) y
Microsource (New Milford, CT). Una librería química rara está
disponible de Aldrich (Milwaukee, WI). Alternativamente, librerías
de compuestos naturales en la forma de extractos de bacterias,
hongos, plantas y animales están disponibles de, p. ej., Pan
Laboratories (Bothell, WA) o MycoSearch (NC) o son producibles
fácilmente. Adicionalmente, las librerías y compuestos producidos
de forma natural y sintética son fácilmente modificados a través de
medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
Células intactas o animales completos que
expresan variantes polimórficas de genes que codifican ACE, AGT y/o
AT1 pueden emplearse en los métodos de escrutinio para identificar
candidatos de fármacos cardiovasculares.
En una serie de realizaciones, se establece una
línea celular permanente a partir de un individuo que exhibe un
patrón polimórfico particular. Alternativamente, las células
(incluidas, sin limitación, células de mamífero, de insecto, de
levadura o de bacteria) se programan para expresar un gen que
comprende una o más secuencias polimórficas por introducción del
ADN apropiado. La identificación de compuestos candidatos puede
realizarse empleando cualquier ensayo adecuado, incluidos, sin
limitación, (i) ensayos que miden la unión selectiva de los
compuestos de ensayo a variantes polimórficas particulares de ACE,
AGT o AT1; (ii) ensayos que miden la capacidad de un compuesto a
ensayo para modificar (es decir, inhibir o intensificar) una
actividad o función medible de ACE, AGT o AT1; y (iii) ensayos que
miden la capacidad de un compuesto para modificar (es decir,
inhibir o intensificar) la actividad transcripcional de secuencias
derivadas de las regiones del promotor (es decir, reguladoras) de
los genes ACE, AGT o AT1.
En otra serie de realizaciones, se crean
animales transgénicos en los que (i) uno o más genes ACE, AGT o AT1
humanos que tienen secuencias diferentes en posiciones polimórficas
particulares se insertan de forma estable en el genoma del animal
transgénico; y/o (ii) los genes ACE, AGT y/o AT1 endógenos se
inactivan y se reemplazan con genes ACE, AGT y/o AT1 humanos que
tienen secuencias diferentes en posiciones polimórficas
particulares. Véase, p. ej., Coffman, Semin. Nephrol.
17:404, 1997; Esther et al., Lab. Invest.
74:953, 1996; Murakami et al., Blood Press. Supl.
2:36, 1996. Tales animales pueden tratarse con compuestos candidatos
y monitorizarse para uno o más marcadores clínicos del estado
cardiovascular.
Los siguientes se proponen como ejemplos no
limitantes del invento.
Los estudios siguientes se llevaron a cabo para
identificar residuos polimórficos dentro de los genes que codifican
ACE, AGT y AT1 humanos.
Las muestras de ADN se obtuvieron de 277
individuos. Los individuos fueron varones caucásicos nacidos en
Uppsala, Suecia, entre 1920 y 1924. Los individuos se seleccionaron
para la población de ensayo de acuerdo con su historia médica, es
decir, bien eran (i) sanos, sin síntomas de enfermedad
cardiovascular (100); o (ii) habían sufrido uno de infarto agudo de
miocardio (68), infarto de miocardio silente (34), derrame cerebral
(18), derrame cerebral e infarto agudo de miocardio (19) o presión
sanguínea elevada a la edad de 50 (39). Se obtuvieron muestras de
ADN de cada individuo.
El análisis de la secuencia del ADN se llevó a
cabo mediante: (i) amplificación de fragmentos cortos de cada uno
de los genes ACE, AGT y AT1, empleando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y (ii) secuenciación de los fragmentos
amplificados. Las secuencias obtenidas a partir de cada individuo se
compararon entonces con secuencias genómicas conocidas de ACE, AGT
y AT1 (véase la Tabla 1).
(i) Amplificación: las reacciones de PCR
emplearon los cebadores mostrados en la Tabla 2 abajo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Donde se indique, los cebadores se modificaron
de una de las formas siguientes: (i) una molécula de biotina se
conjugó con el extremo 5' de la secuencia indicada (B); (ii) una
secuencia de nucleótidos derivados de M13,
5'-CAGGAAACAGCTATGACT-3', se añadió
al extremo 5' de la secuencia indicada (MT); o (iii) la secuencia
5'- AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' se añadió al
extremo 5' de la secuencia indicada (T = cola, del inglés
tail). Los nucleótidos se numeraron de acuerdo con los nº de
SEQ ID relacionados en la Tabla 1, donde se indique. Cuando las
secuencias implicadas no estuvieron disponibles públicamente, la
numeración fue como en los ejemplos siguientes: la designación
"i-4: 1-200" indica que la
secuencia del cebador se localiza dentro de la secuencia que se
extiende 200 pb en 5' respecto de, e incluido, el nucleótido
inmediatamente en 5' respecto del primer nucleótido codificante del
exón 4. Similarmente, la designación "i+4:
1-200" indica que la secuencia del cebador se
localiza dentro de la secuencia que se extiende a partir del
nucleótido que está localizado inmediatamente en 3' respecto del
último nucleótido codificante del exón 4 en 3' para 200 pb. En cada
caso, la localización específica de la secuencia del cebador se
indica en la Tabla 2 en la columna señalada "Nucleótidos". Los
componentes de la reacción empleados para PCR se describen en la
Tabla 3 a continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Todos los productos de PCR (salvo los fragmentos
ACEDI, AT1-espec. 1 y AT1-espec. 2)
se sometieron a secuenciación en fase sólida de acuerdo con el
protocolo comercialmente disponible de Pharmacia Biotech. Las
reacciones de secuenciación se realizan con un cebador de
secuenciación que tiene una secuencia complementaria a la secuencia
"Cola" previamente descrita en la Tabla 2. La secuencia de
nucleótidos del cebador de secuenciación fue
5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' y el
cebador fue marcado fluorescentemente en el nucleótido 5' con una
molécula Cy-5. Las posiciones portadoras de una
variación genética se identificaron determinando la secuencia de
nucleótidos mediante el uso del sistema ALFexpress™ disponible
comercialmente de Pharmacia Biotech.
La detección del fragmento ACEDI se llevó a cabo
analizando los tamaños de los fragmentos amplificados mediante
electroforesis en gel, donde la presencia de un producto de PCR más
pequeño (192 pares de bases) indicó el alelo D y un producto de PCR
más largo (479 pares de bases) indicó el alelo I. La presencia de
ambas bandas indicó un heterocigoto para los dos alelos. La
detección de la reacción específica de alelo de la posición
AT1-1271 se llevó a cabo corriendo de forma separada
dos reacciones de PCR sobre la misma muestra y comparando los
tamaños de los fragmentos amplificados. Un producto de PCR de 501
pares de bases debería estar siempre presente como control en ambas
carreras paralelas, mientras que la presencia de un producto de PCR
de 378 pares de bases en la reacción designada
AT1-espec. 1 indicó la presencia de una A en esta
posición. La presencia de un producto de PCR de 378 pares de bases
en la reacción designada AT1-espec. 2 indicó una C
en esta posición. Si el producto de PCR más corto estaba presente
en ambas reacciones, el individuo es un heterocigoto para A y
C.
El análisis descrito anteriormente dio como
resultado la identificación de posiciones polimórficas dentro de
los segmentos reguladores y codificantes/intrones de los genes
humanos que codifican ACE, AGT y AT1. Las posiciones polimórficas,
las variantes de nucleótidos encontradas en cada una de las
posiciones y el fragmento de PCR en las que se identificó el
polimorfismo se muestran en la Tabla 6 abajo. También se muestran
las frecuencias de cada genotipo en una población de 90 individuos,
expresadas como el porcentaje de la población a estudio que tiene
ese genotipo. Los polimorfismos que dieron como resultado
aminoácidos alternativos en ACE, AGT o AT1 también se indican.
Según se emplean en la presente memoria a continuación, las
designaciones "AGR", "ACR" y "ATR" se refieren a las
regiones reguladoras de los genes AGT, ACE y AT1 humanos,
respectivamente; y las designaciones "AGT", "ACE" y
"AT1" se refieren a las regiones codificantes de los genes AGT,
ACE y AT1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Un subgrupo de estas posiciones polimórficas se
analizaron más ampliamente en 187 individuos adicionales. La Tabla
7 muestra las posiciones polimórficas, la secuencia de estas
posiciones y las frecuencias genotípicas para cada posición en una
población de 277, según se describe en el Ejemplo 1 anterior.
Las posiciones polimórficas identificadas como
en el Ejemplo 1 se correlacionaron con los siguientes marcadores
del estado cardiovascular presentes en la población a estudio:
infarto de miocardio (MI, del inglés myocardial infarction);
derrame cerebral; y presión sanguínea elevada. Los patrones
polimórficos, es decir, las combinaciones de secuencias en
posiciones polimórficas particulares que muestran una correlación
estadísticamente significativa con uno o más de estos marcadores se
muestran a continuación.
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Compendio de los tres patrones polimórficos
previos (que implican las mismas posiciones polimórficas):
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Compendio de los dos patrones polimórficos
previos:
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Compendio de los tres patrones polimórficos
previos:
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Compendio de los dos patrones polimórficos
previos:
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El estudio siguiente se emprendió para definir
patrones polimórficos en los genes ACE, AGT y/o AT1 humanos que
predicen la eficacia de los tratamientos para la enfermedad
cardiovascular.
Se estudiaron dos grupos de pacientes
hipertensos, 41 en el primer grupo y 20 en el segundo grupo. Los
grupos se analizaron independientemente y en combinación.
Los pacientes en esta población se trataron cada
uno de ellos con uno de los cinco inhibidores de ACE siguientes:
captopril, trandolapril, lisinopril, fosinopril o enalapril. El
efecto de los fármacos en la presión sanguínea arterial media se
cuantificó. La presión sanguínea arterial media se definió como 2/3
de la presión sanguínea diastólica + 1/3 de la presión sanguínea
sistólica. Los individuos se agruparon también en categorias como
"buenos respondedores", es decir, aquéllos que exhiben una
disminución de más de 16 mmHg durante el tratamiento con un fármaco
inhibidor de ACE y "malos respondedores", es decir, aquéllos
que no exhiben una disminución de más de 16 mmHg.
Un patrón polimórfico particular, ACE 2193 A/G,
AGR 1072 G/G, AT1 1167 A/A, que estaba presente en un 51% de la
primera población a estudio, discriminó entre buenos respondedores y
malos respondedores. En el segundo grupo de 20 pacientes, el patrón
fue menos prevalente (25%), pero la correlación con una presión
sanguínea disminuida fue evidente. Los individuos que tenían este
patrón polimórfico (designado "1" abajo) experimentaron una
mayor disminución en la presión sanguínea que aquéllos que carecían
de este patrón polimórfico (designado "0" abajo).
| Patrón polimórfico | Observaciones | Media (mmHg) del cambio en PS | D.E. |
| 0 | 36 | -11,4 | 8,6 |
| 1 | 25 | -18,1 | 9,7 |
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Además, la distribución de buenos respondedores
y malos respondedores (según se definió anteriormente) fue como
sigue:
| Patrón polimórfico | Mal respondedor (%) | Buen respondedor (%) |
| 0 | 80,1 | 19,4 |
| 1 | 24,0 | 76,0 |
Tomados juntos, los resultados de los dos grupos
indican que la presencia de este patrón polimórfico se correlaciona
con una disminución incrementada de 6,4-7,3 mmHg
relativo a individuos que no tienen este patrón polimórfico.
La prevalencia de este patrón polimórfico fue
del 41% en esta población hipertensa. Esto sugiere que someter a
ensayo para este patrón polimórfico a pacientes hipertensos, seguido
por prescribir inhibidores de ACE sólo a aquellos pacientes que
tienen este patrón polimórfico, podría incrementar la tasa de
respuesta desde 43% (en una población hipertensa en general) hasta
76% en una población hipertensa seleccionada de acuerdo con los
métodos del invento.
<110> Meadowland Business Partners
AB
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<120> Métodos para evaluar el estado
cardiovascular y composiciones para su uso
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<130> 72254/09
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 98908252.4
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<141>
1998-04-01
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
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<170> PatentIn, versión 3.0
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<210> 1
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<211> 1.278
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1.347
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 377
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 273
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 945
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 5.590
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 4.020
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 1.856
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 2.720
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 480
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 2.268
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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Claims (25)
1. Un método para evaluar la respuesta a un
régimen de tratamiento cardiovascular en un individuo humano; tal
método comprende comparar un patrón polimórfico establecido en una o
más posiciones polimórficas dentro de uno o más genes ACE, AGT o
AT1 de dicho individuo con un patrón polimórfico de las mismas
posiciones polimórficas de humanos que tienen una respuesta
conocida al régimen de tratamiento cardiovascular, en el que la
identidad o similaridad de los patrones polimórficos respectivos se
comparan para determinar si dicho individuo exhibe o no un patrón
polimórfico correlacionado con la respuesta a dicho régimen de
tratamiento.
2. Un método, según se define en la
reivindicación 1, en el que dicho régimen de tratamiento es una
alteración en la dieta, estilo de vida y/o ejercicio; una técnica
quirúrgica invasiva o no invasiva; o una intervención
farmacéutica.
3. Un método, según se define en la
reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que dicho régimen
de tratamiento es respecto a infarto de miocardio, hipertensión,
aterosclerosis o derrame cerebral.
4. Un método, según se define en la
reivindicación 1, en el que dicho régimen de tratamiento es una
intervención farmacéutica.
5. Un método, según se define en la
reivindicación 4, en el que dicho régimen de tratamiento comprende
administrar un fármaco cardiovascular seleccionado del grupo que
consiste en inhibidores de ACE, antagonistas del receptor de
angiotensina II, diuréticos, antagonistas del adrenorreceptor alfa,
glucósidos cardiacos, inhibidores de fosfodiesterasa, antagonistas
de beta-adrenorreceptores, bloqueantes del canal de
calcio, inhibidores de HMG-CoA reductasa, agonistas
del receptor de imidazolina, agonistas del receptor de endotelina y
nitritos orgánicos.
6. Un método, según se define en la
reivindicación 5, en el que dichas posiciones polimórficas
comprenden ACE 2193, según se numera en el nº de acceso J04144 del
GenBank; AGT 1072, según se numera en el nº de acceso X15323 del
GenBank; y ATI 1167, según se numera cuando la secuencia codificante
de proteína de nº de acceso S80239 del GenBank se empalmó en la
posición 288 del nº de acceso S77410 del GenBank.
7. Un método, según se define en la
reivindicación 6, en el que dicho patrón polimórfico comprende ACE
2193 A/G, AGT 1072 G/A y AT1 1167 A/G.
8. Un método, según se define en la
reivindicación 1, en el que dicho régimen de tratamiento es la
administración de un inhibidor de ACE; tal método comprende comparar
el patrón polimórfico establecido determinando la secuencia de (a)
el gen ACE en la posición 2193 de la región codificante, según se
numera en el nº de acceso J04144 del GenBank; (b) el gen AGT en la
posición 1072 de la región reguladora, según se numera en el nº de
acceso X15323 del GenBank; y (c) el gen AT1 en la posición 1167 de
la región codificante, según se numera cuando la secuencia
codificante de proteína del nº de acceso S80239 del GenBank se
empalmó en la posición 288 del nº de acceso S77410 del GenBank, con
los mismos patrones polimórficos de humanos que exhiben diferentes
respuestas a dicho inhibidor de ACE.
9. Un método, según se define en la
reivindicación 8, en el que dicho patrón polimórfico comprende ACE
2193 A/G, AGT 1072 G/A, AT1 1167 A/G.
10. Un método, según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha posición polimórfica se selecciona
del grupo que consiste en las posiciones de la región reguladora de
ACE numeradas 5106, 5349 y 5496, según se numeran en el nº de
acceso X94359 del GenBank; las posiciones de la región codificante
de ACE numeradas 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132,
3387, 3503 y 3906, según se numeran en el nº de acceso J04144 del
GenBank; la posición 1451 del gen ACE, según se numera en el nº de
acceso X62855 del GenBank; las posiciones de la región reguladora
de AGT numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 y
1218, según se numeran en el nº de acceso X15323 del GenBank; las
posiciones de la región codificante de AGT numeradas 273, 620, 912,
997, 1116 y 1174, según se numeran cuando las secuencias
codificantes de proteína a partir de los nº de acceso M24686,
M24687, M24688, M24689 se empalman juntas; la posición 49 del gen
AGT, según se numera en el nº de acceso M24688 del GenBank; las
posiciones de la región reguladora de AT1 numeradas 1427, 1756,
1853, 2046, 2354, 2355 y 2415, según se numeran en el nº de acceso
U07144 del GenBank; las posiciones en la región codificante de AT1
numeradas 449, 678, 1167 y 1271, según se numeran cuando la
secuencia codificante de proteína del nº de acceso S80239 del
GeBank se empalmó en la posición 288 del nº de acceso S77410 del
GenBank; y en combinaciones de cualesquiera de las antedichas.
11. Un método, según se define en la
reivindicación 10, en el que dichos patrones polimórficos se
seleccionan del grupo que consiste en: ACE 5349 A/T, AGT 1218 A;
ACE 5496 C, AGT 1204 A/C; ACE 5496 C/T, AGT 1218 A, AGT 620 C/T;
ACE 2193 A, AGT 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, AGT 1204 A/C; ACE
3387 T, AGT 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C/T; AGT 1204 A/C, AT1 678
C/T; AGT 1204 A/C, AT1 1271 A/C; ACE 1215 C, AGT 1204 A/C; AGT 1204
A/C, AT1 1167 A, ACE 3906 A/G; AGT 1204 A, AGT 620 C, AT1 1271 A,
AT1 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C,
AT1 1167 A, AGT 395 T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1
1167 A/G, AGT 395 T; AGT 1204 A, AT1 678 C, AT1 1167 A, AGT 395
A/T; AGT 1204 A/C, AT1 678 C/T, AT1 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T,
AT1 1271 A/C, AT1 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T, AT1 1271 A/C, AT1
1167 A/G, AGT 395 T; AGT 620 C, AT1 1271 A, AT1 1167 A; AGT 395
A/T; AGT 620 C, AT1 678 A, AT1 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 620 C/T, AT1
678 C/T; AT1 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGT 1218 A, ACE 2193 A,
AGT 620 C/T; ACE 2328 G, AGT 620 C/T; ACE 3387 T, AGT 1204 A/C; ACE
2193 A, ACE 2328 G, AGT 1204 C; y ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A, AT1
1167 A/G.
12. Un ácido nucleico aislado que
corresponde, homólogo o complementario, al gen humano que codifica
la enzima convertidora de angiotensina (ACE), en el que dicho ácido
nucleico comprende una posición polimórfica y en el que la
secuencia en dicha posición polimórfica está en la región reguladora
y es 5106T, según se numera en el nº de acceso X94359 del GenBank;
y/o la secuencia en dicha posición polimórfica está en la región
codificante y se selecciona del grupo que consiste en 375C, 582T,
731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G y 3906A, según se numeran
en el nº de acceso J04144 del GenBank; y combinaciones de
cualesquiera de las antedichas.
13. Una sonda de 10 a 100 pares de bases
de longitud que hibrida a estringencia elevada con una posición
polimórfica o con una secuencia inmediatamente adyacente a una
posición polimórfica, según se define en la reivindicación 12.
14. Un ácido nucleico aislado que
corresponde, homólogo o complementario, al gen humano que codifica
angiotensinógeno (AGT), en el que dicho ácido nucleico comprende una
posición polimórfica y en el que la secuencia de dicha posición
polimórfica está en la región reguladora y se selecciona del grupo
que consiste en 412T y 1072A, según se numeran en el nº de acceso
X15323 del GenBank; y/o la secuencia en dicha posición polimórfica
está en la región codificante y se selecciona del grupo que consiste
en 273T y 997C, según se numeran cuando las secuencias codificantes
de proteína de los nº de acceso M24686, M24687, M24688, M24689 del
GenBank se empalman juntas, y G en la posición 49 en el nº de
acceso M24688 del GenBank; y combinaciones de cualesquiera de las
antedichas.
15. Una sonda de 10 a 100 pares de bases
de longitud que hibrida a estringencia elevada con una posición
polimórfica o con una secuencia inmediatamente adyacente a una
posición polimórfica, según se define en la reivindicación 14.
16. Un ácido nucleico aislado que
corresponde, homólogo o complementario, al gen humano que codifica
el receptor tipo I de angiotensina II (AT1), en el que dicho ácido
nucleico comprende una posición polimórfica y en el que la
secuencia en dicha posición polimórfica está en la región reguladora
y se selecciona del grupo que consiste en 1427T, 1756A, 1853G,
2046C, 2354C, 2355C y 2415G, según se numeran en el nº de acceso
U07144 del GenBank; y/o la secuencia de dicha posición polimórfica
está en la región codificante/intrón y es 449C, según se numera
cuando la secuencia codificante de proteína del nº de acceso S80239
se empalmó en la posición 288 del nº de acceso S77410 del
GenBank.
17. Una sonda de 10 a 100 pares de bases
de longitud que hibrida a estringencia elevada con una posición
polimórfica o con una secuencia inmediatamente adyacente a una
posición polimórfica, según se define en la reivindicación 16.
18. Una librería de ácidos nucleicos,
cada uno de los cuales comprende una o más posiciones polimórficas
dentro del gen ACE humano, en el que la secuencia en dicha posición
polimórfica está en la región reguladora y se selecciona del grupo
que consiste en 5106T, 5349T y 5496C, según se numeran en el nº de
acceso X94359 del GenBank; y/o la secuencia de dicha posición
polimórfica está en la región codificante y se selecciona del grupo
que consiste en 375C, 582T, 731G, 1060A, 1215T, 2193A, 2328G, 2741T,
3132T, 3387C, 3503G y 3906A, según se numeran en el nº de acceso
J04144 del GenBank, y una deleción de los nucleótidos
1451-1783, según se numera en el nº de acceso
X62855 del GenBank.
19. Una librería de ácidos nucleicos,
cada uno de los cuales comprende una o más posiciones polimórficas
dentro del gen AGT humano, en el que la secuencia en dicha posición
polimórfica está en la región reguladora y se selecciona del grupo
que consiste en 395A, 412T, 432A, 449T, 692T, 839A, 1007A, 1072A,
1204A, 1218G, según se numeran en el nº de acceso X15323 del
GenBank; y/o la secuencia en dicha posición polimórfica está en la
región codificante y se selecciona del grupo que consiste en 273T,
620T, 912T, 997C, 1116A, 1174A, según se numeran cuando las
secuencias codificantes de proteína de los nº de acceso M24686,
M24687, M24688, M24689 del GenBank se empalman juntas y G en la
posición 49 en el nº de acceso M24688 del GenBank.
20. Una librería de ácidos nucleicos,
cada uno de los cuales comprende una o más posiciones polimórficas
dentro del gen AT1 humano, en el que la secuencia en dicha posición
polimórfica está en la región reguladora y se selecciona del grupo
que consiste en 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C y 2415G,
según se numeran en el nº de acceso U07144 del GenBank; y/o la
secuencia en dicha posición polimórfica está en la región
codificante y se selecciona del grupo que consiste en 449C, 678C,
1167G y 1271C, según se numeran cuando la secuencia codificante de
proteína de nº de acceso S80239 del GenBank se empalmó en la
posición 288 del nº de acceso S77410 del GenBank.
21. Una librería de dianas de fármacos
cardiovasculares, cada una de dichas dianas comprende un péptido
aislado derivado del polipéptido ACE que comprende una o más
posiciones polimórficas en la secuencia polipeptídica de ACE, en la
que dichas posiciones polimórficas se codifican por nucleótidos
seleccionados del grupo que consiste en las posiciones
nucleotídicas de la región codificante de ACE que tienen la
secuencia 731G, 1060A, 2741T y 3503G, según se numeran en el nº de
acceso J04144 del GenBank.
22. Una librería de dianas de fármacos
cardiovasculares, cada una de dichas dianas comprende un péptido
aislado derivado del polipéptido AGT que comprende una o más
posiciones polimórficas en el polipéptido AGT, en el que dichas
posiciones polimórficas se codifican por nucleótidos seleccionados
del grupo que consiste en posiciones nucleotídicas que tienen la
secuencia 620T, 997T y 1174A, según se numeran cuando las secuencias
codificantes de proteína de los nº M24686, M24687, M24688, M24689
del GenBank se empalman juntas.
23. Una diana de fármacos
cardiovasculares, dicha diana comprende un péptido aislado derivado
del polipéptido AT1 que comprende una o más posiciones polimórficas
del polipéptido AT1, en el que dicha posición polimórfica se
codifica por un nucleótido que tiene la secuencia 449C, según se
numera cuando la secuencia codificante de proteína de nº de acceso
S80239 del GenBank se empalmó en la posición 288 del nº de acceso
S77410 del GenBank.
24. Un kit para evaluar la respuesta de un
individuo a un régimen de tratamiento de un síndrome cardiovascular;
dicho kit comprende:
- (i)
- cebadores para determinar la secuencia; y
- (ii)
- reactivos para determinar la secuencia, en los que dichos cebadores se seleccionan del grupo que consiste en cebadores que hibridan en las posiciones polimórficas de los genes humanos ACE, AGT o AT1; y los cebadores que hibridan inmediatamente adyacentes a posiciones polimórficas, en los que las posiciones polimórficas son predictivas de las respuestas de un individuo a un régimen de tratamiento cardiovascular de un síndrome cardiovascular, en el que dichas posiciones polimórficas se seleccionan del grupo que consiste en posiciones de la región reguladora de ACE numerada 5106, según se numera en el nº de acceso X94359 del GenBank; posiciones de la región codificante de ACE numeradas 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 y 3906, según se numeran en el nº de acceso J04144 del GenBank; posición 1451 del gen ACE, según se numera en el nº de acceso X62855 del GenBank; posiciones de la región reguladora de AGT numeradas 412 y 1072, según se numeran en el nº de acceso X15323 del GenBank; posiciones de la región codificante de AGT numeradas 273 y 912, según se numeran cuando la secuencia codificante de proteína del nº de acceso S80239 del GenBank se empalmó en la posición 288 del nº de acceso S77410; posición 49 del gen AGT, según se numera en el nº de acceso M24688 del GenBank; posiciones de la región reguladora de AT1 numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 y 2415, según se numeran en el nº de acceso U07144 del GenBank; posiciones de la región codificante AT1 numeradas 449, según se numera cuando la secuencia codificante de proteína del nº de acceso S80239 se empalmó en la posición 288 del nº de acceso S77410 del GenBank; y combinaciones de cualesquiera de las antedichas.
25. Un kit para evaluar el estado
cardiovascular; dicho kit comprende uno o más anticuerpos
específicos para una posición polimórfica dentro de los
polipéptidos ACE, AGT o AT1 humanos, en los que dichas posiciones
polimórfica se codifican por un nucleótido seleccionado del grupo
que consiste en posiciones nucleotídicas de la región codificante
de ACE que tienen la secuencia 731G, 1060A, 2741T y 3503G, según se
numeran en el nº de acceso J04144 del GenBank; posiciones
nucleotídicas de la región codificante AGT que tienen la secuencia
620T, 997C y 1174A, según se numeran cuando las secuencias
codificantes de proteína de los nº de acceso M24686, M24687,
M24688, M24689 del GenBank se empalman juntas; posiciones de la
región codificante AT1 que tienen la secuencia 449C, según se
numera cuando la secuencia codificante de proteína del nº de acceso
S80239 del GenBank se empalmó en la posición 288 del nº de acceso
S77410 del GenBank; y combinaciones de cualesquiera de las
antedichas.
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