EP1044268A1 - Neue sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen rezeptorgens und ihre verwendung - Google Patents

Neue sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen rezeptorgens und ihre verwendung

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EP1044268A1
EP1044268A1 EP98966818A EP98966818A EP1044268A1 EP 1044268 A1 EP1044268 A1 EP 1044268A1 EP 98966818 A EP98966818 A EP 98966818A EP 98966818 A EP98966818 A EP 98966818A EP 1044268 A1 EP1044268 A1 EP 1044268A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
beta2
diseases
sequence
disposition
variants
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98966818A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Margret Hoehe
Bernd Timmermann
Karla KÖPKE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP1044268A1 publication Critical patent/EP1044268A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • the invention relates to new sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and their use for the diagnosis of a spectrum of diseases, in particular for the determination of hypertension dispositions and for the development of therapeutic agents on the basis of pharmacogenetic principles.
  • the human beta2-adrenergic receptor is an important component of the sympathetic nervous system and, as such, regulates a spectrum of central and peripheral functions, e.g. Cardiovascular functions, metabolic functions, central nervous functions and neurosecretion. It is the target of pharmaceuticals / therapeutic agents with a wide range of indications, which are among the most commonly prescribed drugs.
  • This receptor could play a role in the pathogenesis / pathophysiology of a number of common diseases, e.g. hypertension and other cardiovascular diseases, various neuropsychiatric diseases such as Depression, and metabolic diseases such as Obesity (Insel PA (Ed) (1987) Adrenergic receptors in man, Marcel Dekker, New York, Basel).
  • the aim of the invention is to determine variants, polymorphisms, mutations and resulting haplotypes in the DNA sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene and to determine their correlations with disease dispositions. Based on these correlations, a method for diagnosing these disease predispositions, for predicting severity, course and survival time, a system for predicting individual responsiveness to beta2 active therapeutic agents, for developing individually specific beta2 receptor agonists and antagonists, and a system for developing a new one Class of beta2 effective therapeutic agents, as well as the development of test systems for researching pathophysiological relationships and development of the above-mentioned therapeutic agents.
  • an individually optimal therapeutic agent can be predicted or developed for each beta2 genotype.
  • the object is achieved according to the claims, the subclaims are preferred variants. 2
  • the invention then relates to the sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene, which is at positions 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, and 2826 in whole or is partially mutated.
  • sequences are particularly important:
  • the invention furthermore relates to a method for determining disease dispositions, it being possible for all sequences and variants of the beta2-adrenergic receptor gene from the individual mutation to all possible combinations of all variants (including any absolute number of variants which can be included) to be genotyped and enable the corresponding statements about disease dispositions.
  • the method is characterized in that the DNA of a test subject is isolated and genotyped at least in one of the exchanged positions and subsequently compared with the reference DNA sequence.
  • Embodiments are preferred in which at least position 1633, at least the three positions 1541, 1633 and 1666 or the four last-mentioned positions (1541, 1568, 1633 and 1666) or at the seven positions 245, 565 934, 11541, 1568, 1633 and genotyped in 1666. 3
  • the method can also be varied by genotyping at least 3 of the 4 positions 1541, 1568, 1633 and 1666 and subsequently comparing them with the reference DNA sequence. Genotyping of positions 1541, 1633 and 1666 is preferred here.
  • Genotyping is performed by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of point mutations. This includes PCR-based genotyping methods such as B. allele-specific PCR, other genotyping methods using ohgonucleotides (examples would be 'dot blotting' or 'oligonucleotide ligation assays' (OLA)), methods using restriction enzymes, and' single nucleotide polymorphism '(SNP) analysis using' matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI), as well as in principle any future method for variant detection including chip technology in all its technological versions.
  • PCR-based genotyping methods such as B. allele-specific PCR, other genotyping methods using ohgonucleotides (examples would be 'dot blotting' or 'oligonucleotide ligation assays' (OLA)), methods using restriction enzymes, and' single nucleotide polymorphism '
  • the method according to the invention is suitable for determining a broad spectrum of the most diverse disease dispositions.
  • a disposition for high blood pressure e.g. to determine a disposition for high blood pressure (or the prediction of the range of individual blood pressure values as such), and other cardiovascular diseases, including myocardial infarction and stroke, in the broadest sense the development of end-stage renal failure (requiring dialysis).
  • Another preferred embodiment variant allows e.g. the determination of a disposition for neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety disorders, attention deficit disorder (with hyperactivity), eating disorders, e.g. for anorexia nervosa and bulimia, or disorders caused by post-traumatic stress; or for diseases of the autonomic nervous system, e.g. Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome as well as selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines.
  • neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety disorders, attention deficit disorder (with hyperactivity), eating disorders, e.g. for anorexia nervosa and bulimia, or disorders caused by post-traumatic stress
  • diseases of the autonomic nervous system e.g. Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome as well as selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines.
  • Another area of application is the determination of a disposition for metabolic diseases such as obesity (as well as familial 'morbid obesity'), including a prediction of the weight range as such or a disposition for weight change, and finally a prediction of the ratio of the body measurements as such, as they are e.g. Express 'body mass index' (BMI). 4
  • the method also allows the course and severity of diseases to be determined, and the prediction of survival after serious medical diseases, e.g. after myocardial infarction, heart failure and / or stroke.
  • a further preferred embodiment variant enables the determination of an individually different reactivity of the autonomic nervous system, in particular on endogenous and exogenous stress (as expressed, for example, in particular by an individually different disposition to changes in blood pressure and / or heart rate (deflections) on endogenous and exogenous stress comes), or by individually different blood pressure changes to endogenously or exogenously induced changes in the salt concentration in the blood (individually different salt sensitivity or resistance), and in the broadest sense also by individually different salt and water regulation or reabsorption in the kidney (related volume regulation ) is expressed.
  • Another important object of the invention is the use of the claimed sequence variants a) for predicting the individually different responsiveness to previously known therapeutic agents (beta2 receptor ligands) and the individually different responsiveness to the endogenous ligands adrenaline and noradrenaline; b) preferably for the development of individually specific beta2 receptor agonists and antagonists; c) in particular also for the development of a new class of therapeutic agents which are directed to the beta2 receptor gene at the 5 'regulatory region, promoter region, in particular e.g. attack the leader peptide and act by regulating transcription, translation and by influencing their efficiency, primarily by regulating expression.
  • another object of the invention is the prediction of individual habituation to drug administration (tachyphylaxis), as well as a different disposition for drug side effects. Overall, it is possible to predict individually optimal therapeutic agents, which are based on different mechanisms of action.
  • kits or methods can advantageously be used to predict individual disease disposition or individual responsiveness to various beta2 therapeutics.
  • Cultures (cells) that express the various combinations of individual ß2 variants mentioned can thus serve as test models for the development of individually specific therapeutic agents (ß2 agonists and antagonists, as well as beta2 expression-regulating DNA therapeutic agents). This corresponds to test models in vitro, but also in vivo test models are included (transgenic animals that carry these individual receptor variants).
  • the three mutations described have a significant effect on phenotypic parameters such as heart rate, noradrenaline concentrations, blood pressure changes on experimentally induced physical and mental stress, 'coping styles' and personality dimensions, as well as weight and weight change.
  • phenotypic parameters such as heart rate, noradrenaline concentrations, blood pressure changes on experimentally induced physical and mental stress, 'coping styles' and personality dimensions, as well as weight and weight change.
  • an association of the leader peptide mutation with hypertension was also shown.
  • beta2-agonist-induced vasodilation and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence and a relationship between beta2-receptor expression in fibroblast cultures of genotyped individuals and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence, could be established.
  • Combination 1 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel)
  • Combination 2 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allele)
  • combination 3 1541 T (Cys Allele), 1568 T, 1633 G (Gly Allele), 1666 C (Gin Allele)
  • Combination 1 was observed significantly more frequently in individuals who were inherited with hypertension and is therefore a genetic risk factor.
  • Detection of specific beta2 'haplotypes' consisting of seven variants Taking all variants into account, 'haplotypes' consisting of seven variants (including the three mutations mentioned) could be extracted; The calculations were based on the goal of identifying 'haplotypes' from the entirety of the genome which were sufficient to distinguish the patient group from the control group. A specific 'haplotype', combination 1, can be observed more frequently in cases of genetic hypertension, and this can be extended to other phenotypes.
  • Combination 1 245 G, 565 G, 934 A, 1541 T (Cys allele), 1568 T, 1633 A (Arg allele),
  • Combination 2 245 A, 565 A, 934 G, 1541 C (Arg allele), 1568 C, 1633 G (Gly allele),
  • Combination 3 245 G, 565 G, 934 G, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel),
  • the multiplex PCR sequencing method was used for the collection of the entire polymorphic spectrum of the beta2-receptor gene.
  • the entire promoter region known to date and the coding region were divided into eight fragments and amplified by means of PCR (see FIG. 1). These PCR fragments were pooled and sequenced simultaneously.
  • the fragments of the terrination reactions were separated on a sequence gel and transferred to a nylon membrane by direct transfer electrophoresis (DTE).
  • DTE direct transfer electrophoresis
  • the individual sequence ladders were decoded by successive hybridization with specific oligonucleotides.
  • fragment II was amplified with hooves of the two primers ADRBR-F2: 5 ' -GCATACCCCCGCTCCAGATAAA-3 ' and ADRBR-R2: 5 ' -GCACGCACATACAGGCACAAATAC-3 ' .
  • fragment III it was the two primers ADRBR-F3: 5 ' -GGCCGCGTTTCTGTGTTGG-3 ' and ADRBR-R3: 5 ' -AGTGCGTTCTGCCCGTTATGTG-3 ' .
  • fragment VIII the two primers ADRBR-F8: 5 ' -GGTACTGTGCCTAGCGATAAC-3 ' and ADRBR-R8: 5 ' - TAAAATACCCCGTGTGAGCAAATAAGAG-3 ' .
  • the reaction conditions for these four fragments were as follows: 10 x PCR buffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl 2 x 6 H 2 O, 500 mM KC1, pH 8.3), dNTP 2 mM, 30 ⁇ M Primer F, 30 ⁇ M primer R, 50 ng genomic DNA and 5 U of a Taq DNA polymerase. Three fragments were amplified with the following temperature profile: 94 ° C for 4 min; 35 cycles: 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
  • Fragment IV was generated using the two primers ADRBR-F4: 5 - GGGGAGGGAAAGGGGAGGAG-3 ' and ADRBR-R4: 5 ' -
  • TACCCTCAAGTTAAATAGTCTGTT-3 used.
  • the conditions for these two PCR reactions were as follows: 10 x PCR buffer (160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween-20, 500 mM KOH, pH), dNTP 2 mM, 30 ⁇ M Primer F , 30 ⁇ M Primer R, 50 ng genomic DNA and 4 U of a mixture of the Taq DNA polymerase and a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermits thermophilus.
  • Fragment V was amplified using the two primers ADRBR-F5: 5 - ATGCGCCGGACCACGAC-3 ' and ADRBR-R5: 5 - GTAGAAGGACACGATGGA-3, fragment VI using the two primers ADRBR-F6: 5 - GCTACTTTGCCATTACTTCACC-3 ' and ADRBR-R6: 5 ' -
  • AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 ' AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 ' .
  • These two fragments were amplified using Perkin Elmer's 'AmpliTaq Gold Kit'.
  • the temperature profile for these two fragments was as follows: 94 C 10 min; 35 cycles: 94 C 30 sec, 56 ° C [fragment V] or 58 ° C [fragment VI] 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
  • the sequencing was done using the 'Thermo Sequenase cycle sequencing kit' from Amersham.
  • the PCR primers described above were used as sequencing primers.
  • the sequencing was carried out in four multiplex pools.
  • Pool 1 contained the sequencing primers ADRBR-Fl, ADRBR-F3, ADRBR-F5 and ADRBR-F7;
  • Pool 2 the sequencing primers ADRBR-Rl, ADRBR-R3, ADRBR-R5 and ADRBR-R7.
  • the PCR fragments I, III, V and VII were used in both sequencing pools.
  • Pool 3 on the other hand, contained the sequencing primers ADRBR-F2, F4, F6 and F8;
  • Pool 4 the sequencing primers ADRBR-R2, R4, R6 and R8.
  • the fragments ⁇ , IV, VI and VIII were inserted into these two pools.
  • Parola AL and KobUa BK The peptide product of a 5 ' leader cistron in the beta 2 adrenergic receptor mRNA inhibits receptor synthesis. J Biol Chem. 269 (6): 4497-505 (1994).

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Bluthochdruck-Dispositionen, zur Diagnose einer individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf Therapeutika und zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.

Description

Neue Sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Bluthochdruck-Dispositionen und zur Therapeutika- Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.
Der menschliche beta2-adrenerge Rezeptor ist eine wichtige Komponente des sympathischen Nervensystems und reguliert als solche ein Spektrum zentraler und peripherer Funktionen, wie z.B. Herz-Kreislauf-Funktionen, metabolische Funktionen, zentralnervöse Funktionen und Neurosekretion. Er ist Angriffspunkt von Pharmaka/Therapeutika mit einem breiten Indikationsspektrum, die mit zu den am häufigsten verordneten Medikamenten gehören. Vielfältige Befunde weisen daraufhin, daß dieser Rezeptor eine Rolle in der Pathogenese/Pathophysiologie einer Reihe häufiger Erkrankungen spielen könnte, wie z.B. der Hypertonie und anderen Herz-Kreislauf-Erkrankungen, verschiedenen neu- ropsychiatrischen Erkrankungen wie z.B. Depression, und metabolischen Erkrankungen wie z.B. Fettsucht (Insel PA (Ed) (1987) Adrenergic receptors in man, Marcel Dekker, New York, Basel).
Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens zu ermitteln und deren Korrelationen mit Krankheitsdispositionen festzustellen. Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsdispositionen, zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit, ein System zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit auf beta2 aktive Therapeutika, zur Entwicklung individuell spezifischer beta2 Rezeptoragonisten und -antagonisten, und ein System zur Entwicklung einer neuen Klasse von beta2 wirksamen Therapeutika, sowie die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika, entwickelt werden. Zusammenfassend kann für jeden beta2 Genotyp ein individuell optimales Therapeutikum vorhergesagt oder entwickelt werden. Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. 2
Es wurde gefunden, daß in der 5 '-regulierenden Region der Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens neben den 3 schon bekannten Mutationen in der kodierenden Region (an den Positionen 1633, 1666 und 2078) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese genetischen Varianten mit der Disposition für verschiedene Krankheiten, z. B. Bluthochdruck, korrelieren.
Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens, die an den Positionen 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, und 2826 ganz oder teilweise mutiert ist. Es handelt sich insbesondere um eine Sequenz, die ganz oder teilweise die Mutationen T-»A (Position 159), A→G (Position 245), G→A (Position 565), G→A (Position 934), G→C (Position 1120), C→T (Position 1221), C→T (Arg- > Cys) (Position 1541), T→C (Position 1568), A→G (Arg->Gly) (Position 1633), C→G (Gln→Glu) (Position 1666), G- >A (Position 1839), C->T (Thr- >Ile) (Position 2078), C->A (Position 2110), G-> C (Position 2640), und G- >A (Position 2826) enthält (Abbildungen 1, 2a und 2b).
Besonders wichtig sind folgende Sequenzen (Haplotypen):
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1633 A und 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 C, 1633 G und 1666 G,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1633 G und 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1568 T, 1633 A und 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 C, 1568 C, 1633 G und 1666 G sowie die
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1568 T, 1633 G und 1666 C.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, wobei alle Sequenzen und Varianten des beta2-adrenergen Rezeptorgens von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten (einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten, die mit einbezogen werden können) genotypisiert werden können und die entsprechende Aussagen über Krankheitsdispositionen ermöglichen.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen mindestens die Position 1633, mindestens die drei Positionen 1541, 1633 und 1666 bzw. die vier letztgenannten Positionen (1541, 1568, 1633 und 1666) oder an den sieben Positionen 245, 565 934, 11541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden. 3
Das Verfahren kann auch variiert werden, indem mindestens 3 der 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird. Bevorzugt ist hier die Genotypisierung der Positionen 1541, 1633 und 1666.
Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Ohgonukleotiden (Beispiele wären 'dot blotting', oder 'Oligonucleotide Ligation Assays' (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, und 'Single Nucleotide Polymorphism' (SNP) Analyse mittels 'Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI), sowie prinzipiell jedwede zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Chip- Technologie in all ihren technologischen Ausführungen.
Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedenster Krankheitsdispositionen geeignet.
In einer Ausführungsvariante z.B. zur Bestimmung einer Disposition für Bluthochdruck, (bzw. der Vorhersage des Bereichs der individuellen Blutdruckwerte als solche), und anderer cardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich Myokardinfarkt und Schlaganfall, im weitesten Sinne die Entstehung einer terminalen Niereninsuffizienz (mit Dialysebedarf).
Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet z.B. die Bestimmung einer Disposition für neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen und Angstsyndromen (anxiety disorders), attention deficit disorder (mit Hyperactivity), Eßstörungen, z.B. für Anorexia nervosa und Bulimie, oder durch posttraumatischen Streß ausgelöste Störungen; oder für Krankheiten des autonomen Nervensystem, wie z.B. Bradbury-Eggleston, Sky- Drager und Riley-Day Syndrom sowie selektive noradrenerge und Barorezeptor- Dispositionen, oder Migräne.
Außerdem ist es auch für den Nachweis von Dispositionen für allergische Erkrankungen, insbesondere Astiima und atopische Störungen, geeignet.
Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Bestimmung einer Disposition für metabolische Erkrankungen wie Fettsucht (sowie familiäre 'morbid obesity'), einschließlich einer Vorhersage des Gewichtsbereichs als solchen oder einer Disposition für Gewichtsveränderung, schließlich eine Voraussage des Verhältnisses der Körpermaße als solche, wie sie sich z.B. im 'body mass index'(BMI) ausdrücken. 4
Desweiteren erlaubt das Verfahren auch die Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrads von Erkrankungen, sowie die Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen Erkrankungen, z.B. nach Myokardinfarkt, Herzversagen und/oder Schlaganfall.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet die Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Reaktivität des autonomen Nervensystems, im besonderen auf endogenen und exogenen Streß (wie sie z.B. insbesondere durch eine individuell unterschiedliche Disposition zu Blutdruck- und/oder Herzfrequenzveränderungen (-auslenkungen) auf endogenen und exogenen Streß zum Ausdruck kommt), oder durch individuell unterschiedliche Blutdruckveränderungen auf endogen oder exogen induzierte Veränderungen der Salzkonzentration im Blut (individuell unterschiedliche Salzsensivität oder -resistenz), und im weitesten Sinne auch durch individuell unterschiedhche Salz- und Wasserregulation bzw. -rückresorption in der Niere (damit zusammenhängend Volumenregulation) zum Ausdruck kommt.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten Sequenzvarianten a) zur Vorhersage der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte Therapeutika (beta2 Rezeptorliganden) sowie der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin; b) vorzugsweise zur Entwicklung individuell spezifischer beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten; c) insbesondere auch zur Entwicklung einer neuen Klasse von Therapeutika, die auf das beta2 Rezeptorgen gerichtet sind, am 5' regulatorischen Bereich, Promotorbereich, insbesondere z.B. am Leaderpeptid angreifen, und via Regulation der Transkription, der Translation sowie durch Beeinflussung deren Effizienz, vornehmlich durch Regulation der Expression, wirken.
In diesem Zusammenhang ist weiterer Gegenstand der Erfindung die Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe (Tachyphylaxie), sowie einer unterschiedhchen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen. Insgesamt wird eine Prädiktion individuell optimaler Therapeutika, denen somit unterschiedliche Wirkmechanismen zugrundeliegen, möglich.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten Sequenzvarianten zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen sowie zur Entwicklung eines diagnostischen Kits oder jedweder diagnostischer Verfahren. Solche Kits oder Verfahren können vorteilhaft zur Vorhersage der individuellen Krankheitsdisposition oder der individuellen Ansprechbarkeit auf verschiedene beta2-Therapeutika eingesetzt werden. 5
Kulturen (Zellen), die die genannten unterschiedUchsten Kombinationen von individuellen ß2- Varianten exprimieren, können somit als Testmodelle für die Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (ß2-Agonisten und -antagonisten, sowie beta2- expressionsregulierende DNA-Therapeutika) dienen. Das entspricht Testmodellen in vitro, aber auch in vivo Testmodelle sind eingeschlossen (transgene Tiere, die diese individuellen Rezeptorvarianten tragen).
Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (=ex vivo) eine Vorhersage zum individuellen Funktionszustand des beta2-Rezeptors bzw. der von ihm vermittelten Funktionen.
Der Umfang der beanspruchten Erfindung wird im folgenden ausführlich dargestellt. Zur Erarbeitung der Erfindung wurde die gesamte bekannte DNA-Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens einschließlich seiner regulierenden und kodierenden Regionen in Patienten und Kontrollen mittels der 'Multiplex PCR Sequenzierung' untersucht, und zunächst eine Reihe von genetischen Varianten identifiziert. In der 5' regulierenden Region wurden zum bestehenden Zeitpunkt acht neue Varianten entdeckt, deren wichtigste der Austausch eines hochkonservierten Arg-> Cys im 'Leader Peptide' des Genes (Position 1541) zu sein scheint, das die Translation des Rezeptorgens reguliert (Position -47 relativ zum Translationsstartpunkt), d.h. seine Expression.
Zusammenfassung der neu identifizierten Varianten (Nukleotidposition vor dem Austausch ist in Bezug auf die veröffentlichte beta2-Rezeptorgensequenz, (Kobilka B.K et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA; 84(1): 46-50 (1987)[Acc. No. J02960]; die Angabe in Klammern hinter dem Austausch bezieht sich auf den Translationsstart):
159 T → A (-1429)
245 A → G (-1343)
565 G → A (-1023)
934 G → A (-654)
1120 G → C (-468)
1221 C → T (-367)
1541 C → T (-47) Arg → Cys Austausch im 'Leader Peptide' des beta2-Rezeptorgens
1568 T → C (-20)
Diese Varianten sind in den Abbildungen 1, 2a und 2b übersichtlich dargestellt. 6
Korrelationen mit Erkrankungen bzw. klinisch relevanten Phänotypen: Spezifische Einflüsse der beiden bisher bekannten Mutationen Arg-> Gly (an Position +46 relativ zum Translationsstartpunkt, entspricht Position 16 der Aminosäurensequenz) und Gln->Glu (an Position +79 relativ zum Translationsstartpunkt, entspricht Position 27 der Aminosäurensequenz), sowie der neu entdeckten 'Leader Peptide' Mutation Arg- >Cys (an Position -47 relativ zum Translationsstartpunkt) auf eine Reihe von klinisch und pathogenetisch relevanten Phänotypen wurden in mehreren Studien nachgewiesen. So wurde eine signifikante Assoziation der Allele an Position 16 der Aminosäurensequenz mit genetischer Prädisposition zur Hypertonie, sowie extremer ausgelenkten Blutdruckwerten festgestellt. Im weiteren haben die beschriebenen drei Mutationen einen signifikanten Effekt auf phänotypische Parameter wie Herzfrequenz, Noradrenalin-Konzentrationen, Blutdruckveränderungen auf experimentell induzierten physischen und mentalen Stress, 'coping styles' und Persönlichkeitsdimensionen, sowie Gewicht und Gewichtsveränderung. Im besonderen wurde auch eine Assoziation der 'Leader Peptide'-Mutation mit Hypertonie gezeigt. Im weiteren konnte eine Beziehung zwischen beta2-Agonist-induzierter Vasodilatation und beta2 Rezeptormutationen, vorzugsweise an Position 16 der Aminosäurensequenz, hergestellt werden, sowie eine Beziehung zwischen beta2-Rezeptorexpression an Fibroblastenkulturen genotypisierter Individuen und beta2 Rezeptormutationen, vorzugsweise an Position 16 der Aminosäurensequenz.
Detektion spezifischer Dreierkombinationen der Mutationen an Positionen (relativ zur veröffentlichten beta2-Sequenz, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' Mutation Arg- > Cys), 1633 A - > G (Arg- > Gly), und 1666 C - > G (Gin- > Glu): Kombination 1: 1541 T (Cys Allel), 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel) Kombination 2: 1541 C (Arg Allel), 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allel) Kombination 3: 1541 T (Cys Allel), 1633 G (Gly Allel), 1666 C (Gin Allel)
Diese drei spezifischen Kombinationen kommen in 80 - 95% der Bevölkerung vor, sie scheinen evolutionär aus der Gesamtanzahl zu erwartender Kombinationen selektioniert zu sein und stellen verschiedene funktionale Zustände des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptors dar, die der Variabilität physiologischer und pathophysiologischer Funktionen zugrundehegen. Im besonderen sind sie mit einer individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf endogene Liganden wie Adrenalin und Noradrenalin verbunden, sowie mit einer unterschiedlichen therapeutischen Ansprechbarkeit auf beta2 Rezeptoragonisten und -antagonisten, was diese 'Kombinationen' zum Ausgangspunkt zur Entwicklung 'individuell maßgeschneiderter Pharmakotherapie' machen kann. 7
Detektion spezifischer beta2- 'Haplotypen' bestehend aus vier Varianten: an Positionen (relativ zur veröffentlichten beta2-Sequenz, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' Mutation Arg- > Cys), 1568 T->C; 1633 A -> G (Arg- > Gly), und 1666 C -> G(Gln->Glu):
Kombination 1 : 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel) Kombination 2: 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allel) Kombination 3: 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel), 1666 C (Gin Allel)
Kombination 1 wurde signifikant häufiger bei Individuen beobachtet, die erblich mit Hypertonie belastet waren, und stellt somit einen genetischen Risikofaktor dar.
Detektion spezifischer beta2- 'Haplotypen' bestehend aus sieben Varianten: Unter rechnerischer Berücksichtigung aller Varianten konnten 'Haplotypen', die aus sieben Varianten (einschließlich der drei genannten Mutationen) bestehen, extrahiert werden; den Berechnungen lag das Ziel zugrunde, 'Haplotypen' aus der Gesamtheit des Genoms zu identifizieren, die hinreichend waren, die Patientengruppe von der Kontrollgruppe zu unterscheiden. Ein spezifischer 'Haplotyp', Kombination 1, läßt sich bei genetischer Belastung mit Hypertonie häufiger beobachten, und dies läßt sich auf andere Phänotypen erweitern.
Kombination 1: 245 G, 565 G, 934 A, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel),
1666 C (Gin Allel)
Kombination 2: 245 A, 565 A, 934 G, 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel),
1666 G (Glu Allel)
Kombination 3: 245 G, 565 G, 934 G, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel),
1666 C (Gin Allel)
Diese zuletzt beschriebenen 'Haplotypen' beschreiben schließlich den realen, gesamten individuellen Funktionszustand des Rezeptors. Der Erfindung liegt das Konzept zugrunde, daß es nicht einzelne Mutationen sind, die unterschiedhchen funktioneUen (dysfunktionalen) Rezeptorzuständen zugrundeliegen, sondern diese durch die individuelle 'polymorphe' Gesamtgensequenz als funktionsdeterminierender Einheit bedingt werden. 8
Die Erfindung wird anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Material und Methoden
Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des beta2-Rezeptorgens wurde die Multiplex-PCR-Sequenziermethode verwendet. Hierzu wurde die gesamte bisher bekannte Promoterregion und die kodierende Region in acht Fragmente unterteilt und mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 1). Diese PCR Fragmente wurden gepoolt und simultan sequenziert. Die Fragmente der Terrninationsreaktionen wurden auf einem Sequenzgel aufgetrennt und mittels Direkter Transfer Elektrophorese (DTE) auf eine Nylonmembran übertragen. Die Dekodierung der einzelnen Sequenzleitern erfolgte durch sukzessives Hybridisieren mit spezifischen Oligonukleotiden. Die spezifischen Bedingungen für die Amplifikation waren wie folgt: Für Fragment I wurde der Vorwärtsprimer ADRBR-Fl mit der Sequenz 5 - TATTGGCCAGGATCTTTTGCTTTCTAT-3 'und der Rückwärtsprimer ADRBR-Rl mit der Sequenz 5 '-TAACATTAAGAACATTTTGAAGC-3 'verwendet. Fragment II wurde mit Hufe der beiden Primer ADRBR-F2: 5 '-GCATACCCCCGCTCCAGATAAA-3 'und ADRBR-R2: 5 '-GCACGCACATACAGGCACAAATAC-3 'ampüfiziert. Für Fragment III waren es die beiden Primer ADRBR-F3: 5 '-GGCCGCGTTTCTGTGTTGG-3 'und ADRBR-R3: 5 '-AGTGCGTTCTGCCCGTTATGTG-3 '. Für das Fragment VIII die beiden Primer ADRBR-F8: 5 '-GGTACTGTGCCTAGCGATAAC-3 'und ADRBR-R8: 5 '- TAAAATACCCCGTGTGAGCAAATAAGAG-3 '. Die Reaktionsbedingungen für diese vier Fragmente waren wie folgt: 10 x PCR Puffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2 x 6 H2O, 500 mM KC1, pH 8,3), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F, 30 μM Primer R, 50 ng genomische DNA und 5 U einer Taq DNA Polymerase. AUe drei Fragmente wurden mit folgendem Temperaturprofil ampüfiziert: 94 °C 4 min; 35 Zyklen: 94 °C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 1 min und abschließend 72 °C 10 min.
Fragment IV wurde mit Hilfe der beiden Primer ADRBR-F4: 5 - GGGGAGGGAAAGGGGAGGAG-3 ' und ADRBR-R4: 5 '-
CTGCCAGGCCCATGACCAGAT-3 'amplifiziert. Für Fragment VII wurden die Primer ADRBR-F7: 5 '-CTGGCTGCCCTTCTTCATCGTT-3 ' und ADRBR-R7: 5 '-
TACCCTCAAGTTAAATAGTCTGTT-3 'verwendet. Die Bedingungen für diese beiden PCR-Reaktionen waren wie folgt: 10 x PCR Puffer (160 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween- 20, 500 mM KOH, pH), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F, 30 μM Primer R, 50 ng genomische DNA und 4 U eines Gemisches aus der Taq DNA Polymerase und einer thermostabilen inorganischen Pyrophosphatase von Thermits thermophilus. Beide Fragmente wurden mit folgendem Temperaturprofil amplifiziert: 94 °C 4 min; 35 Zyklen: 94 °C 30 sec, 66 °C [Fragment IV] bzw. 60 °C [Fragment VII] 30 sec, 72 °C 1 min und abschlie- 9
ßend 72 °C 10 min.
Fragment V wurde mittels der beiden Primer ADRBR-F5: 5 - ATGCGCCGGACCACGAC-3 ' und ADRBR-R5: 5 - GTAGAAGGACACGATGGA- 3 amplifiziert, Fragment VI mit den beiden Primern ADRBR-F6: 5 - GCTACTTTGCCATTACTTCACC-3 ' und ADRBR-R6: 5 '-
AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 '. Diese beiden Fragmente wurden mit Hilfe des 'AmpliTaq Gold Kits' von Perkin Eimer amplifiziert. Das Temperaturprofil bei diesen beiden Fragmenten war wie folgt: 94 C 10 min; 35 Zyklen: 94 C 30 sec, 56 °C [Fragment V] bzw. 58 °C [Fragment VI] 30 sec, 72 °C 1 min und abschließend 72 °C 10 min.
Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des 'Thermo Sequenase cycle sequencing kit' von Amersham. Als Sequenzierprimer wurden die oben beschriebenen PCR Primer verwendet. Die Sequenzierung wurde in vier Multiplex-Pools durchgeführt. Pool 1 enthielt die Sequenzierprimer ADRBR-Fl, ADRBR-F3, ADRBR-F5 und ADRBR-F7; Pool 2 die Sequenzierprimer ADRBR-Rl, ADRBR-R3, ADRBR-R5 und ADRBR-R7. In beide Se- quenzier-Poole wurden die PCR-Fragmente I, III, V und VII eingesetzt. Pool 3 hingegen enthielt die Sequenzierprimer ADRBR-F2, F4, F6 und F8; Pool 4 die Sequenzierprimer ADRBR-R2, R4, R6 und R8. In diese beiden Poole wurden die Fragmente π, IV, VI und VIII eingesetzt.
Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden in einem PTC 225 Cycler von MJ Research durchgeführt.
Die Produkte der Sequenzreaktionen wurden auf einem 100 μm dicken Acrylamidgel (5% Acrylamid, 7 M Harnstoff) aufgetrennt und unter Standard DTE Bedingungen (siehe Richterich and Church, 1993), auf eine Biodyne A Membran (Pall) übertragen. Die Membran wurde dann mit 32P- markierten Oügonukleotiden hybridisiert und die einzelnen Sequenzleitern mit Hilfe eines Phospho-Fluorimager (Storm 860, Molecular Dynamics) detektiert.
10
Literatur:
Kobilka B.K., Dixon R.A., FrieUe T., Dohlman H.G., Bolanowski M.A., Sigal I.S., Yang Feng T.L., Francke U., Caron M.G., Lefkowitz R.J.: cDNA for the beta 2- adrenergic receptor: a protein with multiple membrane-spanning domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with that of the receptor for platelet-derived growth facto. Proc NatlAcad Sei USA.; 84 (1): 46-50 (1987).
Parola A.L. and KobUa B.K. The peptide produet of a 5 ' leader cistron in the beta 2 adrenergic receptor mRNA inhibits receptor synthesis. J Biol Chem. 269 (6): 4497-505 (1994).
Richterich P. and Church G.M.: DNA sequencing with direct transfer electrophoresis and nonradioactive detection. Methods Enzyrnσl. 218: 187-222 (1993).
Legenden zu den Abbildungen:
Abbildung 1
Polymorphes Spektrum des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptorgens Varianten sind entsprechend ihrer Nukleotidposition eingezeichnet (Referenzsequenz Kobilka et al. 1987).
Abbildung 2 a
Sequenz des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptors (Kobilka et al. 1987) Varianten sind entsprechend ihrer Position eingezeichnet.
Abbildung 2 b
Sequenz des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptors (Kobilka et al. 1997). Eingezeichnet sind die Varianten (Nukleotid- bzw. Aminosäureaustausch).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP

Claims

11Patentansprüche
1. Sequenz des menschlichen beta2-adrenergenen Rezeptorgens, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an den Positionen 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, und 2826 ganz oder teilweise ausgetauscht sind.
2. Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teüweise die Basenaustausche T→A (Position 159), A→G (Position 245), G→A (Position 565), G→A (Position 934), G→C (Position 1120), C→T (Position 1221), C→T (Position 1541), T→C (Position 1568), A→G (Position 1633), C→G (Position 1666), G→A (Position 1839), C→T (Position 2078), C→A (Position 2110), G→C (Position 2640), und G→A (Position 2826) enthält.
3. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1633 A und 1666 C.
4. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 C, 1633 G und 1666 G.
5. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1633 G und 1666 C.
6. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1568 T 1633 A und 1666 C.
7. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 C, 1568 C 1633 G und 1666 G.
8. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1568 T 1633 G und 1666 C.
9. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird, wobei ggf. aüe möglichen Kombinationen von Varianten von der Einzelmutation bis zu allen mögüchen Kombinationen aller Varianten einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten einbezogen werden. 12
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoüert und mindestens an der Position 1633 genotypisiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 3 Positionen 1541, 1633 und 1666 genotypisiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 7 Positionen 245, 565, 934, 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 3 der 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.
16. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen 9, 11 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionen 1541, 1633 und 1666 genotypisiert werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Genotypisierung durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für den Nachweis von Varianten geeignet sind, erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer Disposition für Bluthochdruck sowie für Blutdruckabweichungen von der Norm und andere cardiovasku- läre Erkrankungen, einschließüch Myokardinfarkt und SchlaganfaU; zur Bestimmung einer Disposition für neuropsychiatrische Erkrankungen wie Depressionen, Angstsyndro- men, attention deficit disorder mit Hyperactivity, Eßstörungen, z.B. Anorexia nervosa und Bulimie, oder für durch posttraumatischen Streß ausgelöste Störungen; zur Bestimmung einer Disposition für Krankheiten des autonomen Nervensystem, wie z.B. Bradbu- ry-Eggleston, Sky-Drager und Riley-Day Syndrom sowie selektive noradrenerge und Ba- rorezeptor-Dispositionen, oder Migräne; zur Bestimmung einer Disposition für aüergische Erkrankungen, insbesondere Asthma und atopische Störungen; zur Bestimmung einer Disposition für metabolische Erkrankungen wie Fettsucht sowie famüiäre 'morbid obesity', 13
einschüeßlich einer Vorhersage des Gewichtsbereichs als solchen oder einer Disposition für Gewichtsveränderung, schließlich eine Voraussage des Verhältnisses der Körpermaße als solche, wie sie sich z.B. im 'body mass index' (BMI) ausdrücken.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Reaktivität des autonomen Nervensystems, im besonderen auf endogenen und exogenen Streß.
20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Disposition für Blutdruck- und/oder Herzfrequenzveränderungen/-auslenkungen auf endogenen und exogenen Streß, oder einer individuell unterschiedhchen Salzsensitivität/- resistenz.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrads von Erkrankungen,wie z.B. unter Anspruch 18 aufgeführt, z. B. von neu- ropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen und Angstsyndromen, von cardiovas- kulären Erkrankungen, einschheßlich Myokardinfarkt und SchlaganfaU, von Krankheiten des autonomen Nervensystems sowie von aüergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer Disposition für metaboüsche Erkrankungen wie Fettsucht.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen Erkrankungen, z.B. nach Myokardinfarkt, Herzversagen und/oder SchlaganfaU.
24. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 8 zur Entwicklung von Therapeutika und/oder Lifestyle-drugs.
25. Verwendung nach Anspruch 24 zur Entwicklung einer neuen Klasse von Therapeutika, die auf das beta2-Rezeptorgen gerichtet sind, und am 5 'regulatorischen Bereich, im Promotorbereich, sowie am Leaderpeptid angreifen, via Regulation der Transkription und Translation sowie durch Beeinflussung von deren Effizienz, vornehmlich durch Regulation der Expression, wirken.
26. Verwendung nach Anspruch 24 zur Entwicklung von beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten, insbesondere von individuell spezifischen beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten. 14
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Prädiktion der individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte, wie beta2-Rezeptorüganden, sowie zukünftig, auch unter Anspruch 24 bis 26 entwickelte Therapeutika, und der individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe (Tachyphylaxie), sowie einer unterschiedlichen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Optimierung der individueüen, auf den beta2-Rezeptor und sein Gen gerichteten Therapie bzw. Intervention.
30. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 8 zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen.
31. Verwendung nach Anspruch 24 bis 30 zur Entwicklung eines diagnostischen Kits, oder jedweden Verfahrens zur Genotypisierung.
32. Verwendung nach Anspruch 24 bis 31 zur Entwicklung eines diagnostischen Kits zur Vorhersage der individueüen Ansprechbarkeit auf verschiedene beta2-Rezeptor-agonisten sowie -antagonisten, sowie auf jedwede neu entwickelten beta2 aktiven Therapeutika , im besonderen auch nach Anspruch 25; zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit von Pharmaka, deren Wirkmechanismus Veränderungen der beta2-Rezeptorstruktur, - regula- tion, oder - expression miteinbezieht; zur Vorhersage der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin; zur Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe - Tachyphylaxie - , sowie einer unterschiedlichen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen; zur Optimierung der individuellen, auf den beta2-Rezeptor und sein Gen gerichteten Therapie bzw. Intervention.
33. Verwendung nach Anspruch 1 bis 8 sowie 9 bis 32 zur Entwicklung von in vitro (z.B. Zellkulturen) und in vivo (z.B. transgene Tiere) Testsystemen, die individueüe Formen des beta2-Rezeptorgens exprimieren, wobei die Testsysteme zur Untersuchung der Patho- physiologie von Erkrankungen von generell medizinisch wichtigen Merkmalen mit Betei- ligung des beta2-Rezeptorgens dienen, sowie zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika und 'lifestyle- drugs' und von beta2-gerichteten Substanzen im allgemeinen.
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