EP1044268A1 - Novel sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and use thereof - Google Patents

Novel sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and use thereof

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Publication number
EP1044268A1
EP1044268A1 EP98966818A EP98966818A EP1044268A1 EP 1044268 A1 EP1044268 A1 EP 1044268A1 EP 98966818 A EP98966818 A EP 98966818A EP 98966818 A EP98966818 A EP 98966818A EP 1044268 A1 EP1044268 A1 EP 1044268A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
beta2
diseases
sequence
disposition
variants
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98966818A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Margret Hoehe
Bernd Timmermann
Karla KÖPKE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP1044268A1 publication Critical patent/EP1044268A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • the invention relates to new sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and their use for the diagnosis of a spectrum of diseases, in particular for the determination of hypertension dispositions and for the development of therapeutic agents on the basis of pharmacogenetic principles.
  • the human beta2-adrenergic receptor is an important component of the sympathetic nervous system and, as such, regulates a spectrum of central and peripheral functions, e.g. Cardiovascular functions, metabolic functions, central nervous functions and neurosecretion. It is the target of pharmaceuticals / therapeutic agents with a wide range of indications, which are among the most commonly prescribed drugs.
  • This receptor could play a role in the pathogenesis / pathophysiology of a number of common diseases, e.g. hypertension and other cardiovascular diseases, various neuropsychiatric diseases such as Depression, and metabolic diseases such as Obesity (Insel PA (Ed) (1987) Adrenergic receptors in man, Marcel Dekker, New York, Basel).
  • the aim of the invention is to determine variants, polymorphisms, mutations and resulting haplotypes in the DNA sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene and to determine their correlations with disease dispositions. Based on these correlations, a method for diagnosing these disease predispositions, for predicting severity, course and survival time, a system for predicting individual responsiveness to beta2 active therapeutic agents, for developing individually specific beta2 receptor agonists and antagonists, and a system for developing a new one Class of beta2 effective therapeutic agents, as well as the development of test systems for researching pathophysiological relationships and development of the above-mentioned therapeutic agents.
  • an individually optimal therapeutic agent can be predicted or developed for each beta2 genotype.
  • the object is achieved according to the claims, the subclaims are preferred variants. 2
  • the invention then relates to the sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene, which is at positions 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, and 2826 in whole or is partially mutated.
  • sequences are particularly important:
  • the invention furthermore relates to a method for determining disease dispositions, it being possible for all sequences and variants of the beta2-adrenergic receptor gene from the individual mutation to all possible combinations of all variants (including any absolute number of variants which can be included) to be genotyped and enable the corresponding statements about disease dispositions.
  • the method is characterized in that the DNA of a test subject is isolated and genotyped at least in one of the exchanged positions and subsequently compared with the reference DNA sequence.
  • Embodiments are preferred in which at least position 1633, at least the three positions 1541, 1633 and 1666 or the four last-mentioned positions (1541, 1568, 1633 and 1666) or at the seven positions 245, 565 934, 11541, 1568, 1633 and genotyped in 1666. 3
  • the method can also be varied by genotyping at least 3 of the 4 positions 1541, 1568, 1633 and 1666 and subsequently comparing them with the reference DNA sequence. Genotyping of positions 1541, 1633 and 1666 is preferred here.
  • Genotyping is performed by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of point mutations. This includes PCR-based genotyping methods such as B. allele-specific PCR, other genotyping methods using ohgonucleotides (examples would be 'dot blotting' or 'oligonucleotide ligation assays' (OLA)), methods using restriction enzymes, and' single nucleotide polymorphism '(SNP) analysis using' matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI), as well as in principle any future method for variant detection including chip technology in all its technological versions.
  • PCR-based genotyping methods such as B. allele-specific PCR, other genotyping methods using ohgonucleotides (examples would be 'dot blotting' or 'oligonucleotide ligation assays' (OLA)), methods using restriction enzymes, and' single nucleotide polymorphism '
  • the method according to the invention is suitable for determining a broad spectrum of the most diverse disease dispositions.
  • a disposition for high blood pressure e.g. to determine a disposition for high blood pressure (or the prediction of the range of individual blood pressure values as such), and other cardiovascular diseases, including myocardial infarction and stroke, in the broadest sense the development of end-stage renal failure (requiring dialysis).
  • Another preferred embodiment variant allows e.g. the determination of a disposition for neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety disorders, attention deficit disorder (with hyperactivity), eating disorders, e.g. for anorexia nervosa and bulimia, or disorders caused by post-traumatic stress; or for diseases of the autonomic nervous system, e.g. Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome as well as selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines.
  • neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety disorders, attention deficit disorder (with hyperactivity), eating disorders, e.g. for anorexia nervosa and bulimia, or disorders caused by post-traumatic stress
  • diseases of the autonomic nervous system e.g. Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome as well as selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines.
  • Another area of application is the determination of a disposition for metabolic diseases such as obesity (as well as familial 'morbid obesity'), including a prediction of the weight range as such or a disposition for weight change, and finally a prediction of the ratio of the body measurements as such, as they are e.g. Express 'body mass index' (BMI). 4
  • the method also allows the course and severity of diseases to be determined, and the prediction of survival after serious medical diseases, e.g. after myocardial infarction, heart failure and / or stroke.
  • a further preferred embodiment variant enables the determination of an individually different reactivity of the autonomic nervous system, in particular on endogenous and exogenous stress (as expressed, for example, in particular by an individually different disposition to changes in blood pressure and / or heart rate (deflections) on endogenous and exogenous stress comes), or by individually different blood pressure changes to endogenously or exogenously induced changes in the salt concentration in the blood (individually different salt sensitivity or resistance), and in the broadest sense also by individually different salt and water regulation or reabsorption in the kidney (related volume regulation ) is expressed.
  • Another important object of the invention is the use of the claimed sequence variants a) for predicting the individually different responsiveness to previously known therapeutic agents (beta2 receptor ligands) and the individually different responsiveness to the endogenous ligands adrenaline and noradrenaline; b) preferably for the development of individually specific beta2 receptor agonists and antagonists; c) in particular also for the development of a new class of therapeutic agents which are directed to the beta2 receptor gene at the 5 'regulatory region, promoter region, in particular e.g. attack the leader peptide and act by regulating transcription, translation and by influencing their efficiency, primarily by regulating expression.
  • another object of the invention is the prediction of individual habituation to drug administration (tachyphylaxis), as well as a different disposition for drug side effects. Overall, it is possible to predict individually optimal therapeutic agents, which are based on different mechanisms of action.
  • kits or methods can advantageously be used to predict individual disease disposition or individual responsiveness to various beta2 therapeutics.
  • Cultures (cells) that express the various combinations of individual ß2 variants mentioned can thus serve as test models for the development of individually specific therapeutic agents (ß2 agonists and antagonists, as well as beta2 expression-regulating DNA therapeutic agents). This corresponds to test models in vitro, but also in vivo test models are included (transgenic animals that carry these individual receptor variants).
  • the three mutations described have a significant effect on phenotypic parameters such as heart rate, noradrenaline concentrations, blood pressure changes on experimentally induced physical and mental stress, 'coping styles' and personality dimensions, as well as weight and weight change.
  • phenotypic parameters such as heart rate, noradrenaline concentrations, blood pressure changes on experimentally induced physical and mental stress, 'coping styles' and personality dimensions, as well as weight and weight change.
  • an association of the leader peptide mutation with hypertension was also shown.
  • beta2-agonist-induced vasodilation and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence and a relationship between beta2-receptor expression in fibroblast cultures of genotyped individuals and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence, could be established.
  • Combination 1 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel)
  • Combination 2 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allele)
  • combination 3 1541 T (Cys Allele), 1568 T, 1633 G (Gly Allele), 1666 C (Gin Allele)
  • Combination 1 was observed significantly more frequently in individuals who were inherited with hypertension and is therefore a genetic risk factor.
  • Detection of specific beta2 'haplotypes' consisting of seven variants Taking all variants into account, 'haplotypes' consisting of seven variants (including the three mutations mentioned) could be extracted; The calculations were based on the goal of identifying 'haplotypes' from the entirety of the genome which were sufficient to distinguish the patient group from the control group. A specific 'haplotype', combination 1, can be observed more frequently in cases of genetic hypertension, and this can be extended to other phenotypes.
  • Combination 1 245 G, 565 G, 934 A, 1541 T (Cys allele), 1568 T, 1633 A (Arg allele),
  • Combination 2 245 A, 565 A, 934 G, 1541 C (Arg allele), 1568 C, 1633 G (Gly allele),
  • Combination 3 245 G, 565 G, 934 G, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel),
  • the multiplex PCR sequencing method was used for the collection of the entire polymorphic spectrum of the beta2-receptor gene.
  • the entire promoter region known to date and the coding region were divided into eight fragments and amplified by means of PCR (see FIG. 1). These PCR fragments were pooled and sequenced simultaneously.
  • the fragments of the terrination reactions were separated on a sequence gel and transferred to a nylon membrane by direct transfer electrophoresis (DTE).
  • DTE direct transfer electrophoresis
  • the individual sequence ladders were decoded by successive hybridization with specific oligonucleotides.
  • fragment II was amplified with hooves of the two primers ADRBR-F2: 5 ' -GCATACCCCCGCTCCAGATAAA-3 ' and ADRBR-R2: 5 ' -GCACGCACATACAGGCACAAATAC-3 ' .
  • fragment III it was the two primers ADRBR-F3: 5 ' -GGCCGCGTTTCTGTGTTGG-3 ' and ADRBR-R3: 5 ' -AGTGCGTTCTGCCCGTTATGTG-3 ' .
  • fragment VIII the two primers ADRBR-F8: 5 ' -GGTACTGTGCCTAGCGATAAC-3 ' and ADRBR-R8: 5 ' - TAAAATACCCCGTGTGAGCAAATAAGAG-3 ' .
  • the reaction conditions for these four fragments were as follows: 10 x PCR buffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl 2 x 6 H 2 O, 500 mM KC1, pH 8.3), dNTP 2 mM, 30 ⁇ M Primer F, 30 ⁇ M primer R, 50 ng genomic DNA and 5 U of a Taq DNA polymerase. Three fragments were amplified with the following temperature profile: 94 ° C for 4 min; 35 cycles: 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
  • Fragment IV was generated using the two primers ADRBR-F4: 5 - GGGGAGGGAAAGGGGAGGAG-3 ' and ADRBR-R4: 5 ' -
  • TACCCTCAAGTTAAATAGTCTGTT-3 used.
  • the conditions for these two PCR reactions were as follows: 10 x PCR buffer (160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween-20, 500 mM KOH, pH), dNTP 2 mM, 30 ⁇ M Primer F , 30 ⁇ M Primer R, 50 ng genomic DNA and 4 U of a mixture of the Taq DNA polymerase and a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermits thermophilus.
  • Fragment V was amplified using the two primers ADRBR-F5: 5 - ATGCGCCGGACCACGAC-3 ' and ADRBR-R5: 5 - GTAGAAGGACACGATGGA-3, fragment VI using the two primers ADRBR-F6: 5 - GCTACTTTGCCATTACTTCACC-3 ' and ADRBR-R6: 5 ' -
  • AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 ' AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 ' .
  • These two fragments were amplified using Perkin Elmer's 'AmpliTaq Gold Kit'.
  • the temperature profile for these two fragments was as follows: 94 C 10 min; 35 cycles: 94 C 30 sec, 56 ° C [fragment V] or 58 ° C [fragment VI] 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
  • the sequencing was done using the 'Thermo Sequenase cycle sequencing kit' from Amersham.
  • the PCR primers described above were used as sequencing primers.
  • the sequencing was carried out in four multiplex pools.
  • Pool 1 contained the sequencing primers ADRBR-Fl, ADRBR-F3, ADRBR-F5 and ADRBR-F7;
  • Pool 2 the sequencing primers ADRBR-Rl, ADRBR-R3, ADRBR-R5 and ADRBR-R7.
  • the PCR fragments I, III, V and VII were used in both sequencing pools.
  • Pool 3 on the other hand, contained the sequencing primers ADRBR-F2, F4, F6 and F8;
  • Pool 4 the sequencing primers ADRBR-R2, R4, R6 and R8.
  • the fragments ⁇ , IV, VI and VIII were inserted into these two pools.
  • Parola AL and KobUa BK The peptide product of a 5 ' leader cistron in the beta 2 adrenergic receptor mRNA inhibits receptor synthesis. J Biol Chem. 269 (6): 4497-505 (1994).

Abstract

The invention relates to novel sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and to their use for diagnosing a range of diseases, especially for detecting a predisposition to high blood pressure, for diagnosing reactivity to therapeutic agents where this varies from one case to the next, and for developing therapeutic agents on the basis of pharmacogenetic principles.

Description

Neue Sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens und ihre VerwendungNew sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and their use
Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Bluthochdruck-Dispositionen und zur Therapeutika- Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.The invention relates to new sequence variants of the human beta2-adrenergic receptor gene and their use for the diagnosis of a spectrum of diseases, in particular for the determination of hypertension dispositions and for the development of therapeutic agents on the basis of pharmacogenetic principles.
Der menschliche beta2-adrenerge Rezeptor ist eine wichtige Komponente des sympathischen Nervensystems und reguliert als solche ein Spektrum zentraler und peripherer Funktionen, wie z.B. Herz-Kreislauf-Funktionen, metabolische Funktionen, zentralnervöse Funktionen und Neurosekretion. Er ist Angriffspunkt von Pharmaka/Therapeutika mit einem breiten Indikationsspektrum, die mit zu den am häufigsten verordneten Medikamenten gehören. Vielfältige Befunde weisen daraufhin, daß dieser Rezeptor eine Rolle in der Pathogenese/Pathophysiologie einer Reihe häufiger Erkrankungen spielen könnte, wie z.B. der Hypertonie und anderen Herz-Kreislauf-Erkrankungen, verschiedenen neu- ropsychiatrischen Erkrankungen wie z.B. Depression, und metabolischen Erkrankungen wie z.B. Fettsucht (Insel PA (Ed) (1987) Adrenergic receptors in man, Marcel Dekker, New York, Basel).The human beta2-adrenergic receptor is an important component of the sympathetic nervous system and, as such, regulates a spectrum of central and peripheral functions, e.g. Cardiovascular functions, metabolic functions, central nervous functions and neurosecretion. It is the target of pharmaceuticals / therapeutic agents with a wide range of indications, which are among the most commonly prescribed drugs. A variety of findings indicate that this receptor could play a role in the pathogenesis / pathophysiology of a number of common diseases, e.g. hypertension and other cardiovascular diseases, various neuropsychiatric diseases such as Depression, and metabolic diseases such as Obesity (Insel PA (Ed) (1987) Adrenergic receptors in man, Marcel Dekker, New York, Basel).
Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens zu ermitteln und deren Korrelationen mit Krankheitsdispositionen festzustellen. Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsdispositionen, zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit, ein System zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit auf beta2 aktive Therapeutika, zur Entwicklung individuell spezifischer beta2 Rezeptoragonisten und -antagonisten, und ein System zur Entwicklung einer neuen Klasse von beta2 wirksamen Therapeutika, sowie die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika, entwickelt werden. Zusammenfassend kann für jeden beta2 Genotyp ein individuell optimales Therapeutikum vorhergesagt oder entwickelt werden. Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. 2The aim of the invention is to determine variants, polymorphisms, mutations and resulting haplotypes in the DNA sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene and to determine their correlations with disease dispositions. Based on these correlations, a method for diagnosing these disease predispositions, for predicting severity, course and survival time, a system for predicting individual responsiveness to beta2 active therapeutic agents, for developing individually specific beta2 receptor agonists and antagonists, and a system for developing a new one Class of beta2 effective therapeutic agents, as well as the development of test systems for researching pathophysiological relationships and development of the above-mentioned therapeutic agents. In summary, an individually optimal therapeutic agent can be predicted or developed for each beta2 genotype. The object is achieved according to the claims, the subclaims are preferred variants. 2
Es wurde gefunden, daß in der 5 '-regulierenden Region der Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens neben den 3 schon bekannten Mutationen in der kodierenden Region (an den Positionen 1633, 1666 und 2078) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese genetischen Varianten mit der Disposition für verschiedene Krankheiten, z. B. Bluthochdruck, korrelieren.It was found that, in addition to the 3 mutations already known in the coding region (at positions 1633, 1666 and 2078), further variants are present in the 5 'regulating region of the sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene. It has also been found that these genetic variants are predisposed to various diseases, e.g. B. hypertension correlate.
Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens, die an den Positionen 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, und 2826 ganz oder teilweise mutiert ist. Es handelt sich insbesondere um eine Sequenz, die ganz oder teilweise die Mutationen T-»A (Position 159), A→G (Position 245), G→A (Position 565), G→A (Position 934), G→C (Position 1120), C→T (Position 1221), C→T (Arg- > Cys) (Position 1541), T→C (Position 1568), A→G (Arg->Gly) (Position 1633), C→G (Gln→Glu) (Position 1666), G- >A (Position 1839), C->T (Thr- >Ile) (Position 2078), C->A (Position 2110), G-> C (Position 2640), und G- >A (Position 2826) enthält (Abbildungen 1, 2a und 2b).The invention then relates to the sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene, which is at positions 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, and 2826 in whole or is partially mutated. It is in particular a sequence which completely or partially the mutations T- »A (position 159), A → G (position 245), G → A (position 565), G → A (position 934), G → C (Position 1120), C → T (position 1221), C → T (Arg-> Cys) (position 1541), T → C (position 1568), A → G (Arg-> Gly) (position 1633), C → G (Gln → Glu) (position 1666), G-> A (position 1839), C-> T (Thr-> Ile) (position 2078), C-> A (position 2110), G-> C ( Item 2640), and G-> A (Item 2826) contains (Figures 1, 2a and 2b).
Besonders wichtig sind folgende Sequenzen (Haplotypen):The following sequences (haplotypes) are particularly important:
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1633 A und 1666 C,Sequence with mutations 1541 T, 1633 A and 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 C, 1633 G und 1666 G,Sequence with mutations 1541 C, 1633 G and 1666 G,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1633 G und 1666 C,Sequence with mutations 1541 T, 1633 G and 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1568 T, 1633 A und 1666 C,Sequence with mutations 1541 T, 1568 T, 1633 A and 1666 C,
- Sequenz mit den Mutationen 1541 C, 1568 C, 1633 G und 1666 G sowie die- Sequence with the mutations 1541 C, 1568 C, 1633 G and 1666 G as well as the
- Sequenz mit den Mutationen 1541 T, 1568 T, 1633 G und 1666 C.- Sequence with mutations 1541 T, 1568 T, 1633 G and 1666 C.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, wobei alle Sequenzen und Varianten des beta2-adrenergen Rezeptorgens von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten (einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten, die mit einbezogen werden können) genotypisiert werden können und die entsprechende Aussagen über Krankheitsdispositionen ermöglichen.The invention furthermore relates to a method for determining disease dispositions, it being possible for all sequences and variants of the beta2-adrenergic receptor gene from the individual mutation to all possible combinations of all variants (including any absolute number of variants which can be included) to be genotyped and enable the corresponding statements about disease dispositions.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen mindestens die Position 1633, mindestens die drei Positionen 1541, 1633 und 1666 bzw. die vier letztgenannten Positionen (1541, 1568, 1633 und 1666) oder an den sieben Positionen 245, 565 934, 11541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden. 3The method is characterized in that the DNA of a test subject is isolated and genotyped at least in one of the exchanged positions and subsequently compared with the reference DNA sequence. Embodiments are preferred in which at least position 1633, at least the three positions 1541, 1633 and 1666 or the four last-mentioned positions (1541, 1568, 1633 and 1666) or at the seven positions 245, 565 934, 11541, 1568, 1633 and genotyped in 1666. 3
Das Verfahren kann auch variiert werden, indem mindestens 3 der 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird. Bevorzugt ist hier die Genotypisierung der Positionen 1541, 1633 und 1666.The method can also be varied by genotyping at least 3 of the 4 positions 1541, 1568, 1633 and 1666 and subsequently comparing them with the reference DNA sequence. Genotyping of positions 1541, 1633 and 1666 is preferred here.
Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Ohgonukleotiden (Beispiele wären 'dot blotting', oder 'Oligonucleotide Ligation Assays' (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, und 'Single Nucleotide Polymorphism' (SNP) Analyse mittels 'Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI), sowie prinzipiell jedwede zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Chip- Technologie in all ihren technologischen Ausführungen.Genotyping is performed by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of point mutations. This includes PCR-based genotyping methods such as B. allele-specific PCR, other genotyping methods using ohgonucleotides (examples would be 'dot blotting' or 'oligonucleotide ligation assays' (OLA)), methods using restriction enzymes, and' single nucleotide polymorphism '(SNP) analysis using' matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI), as well as in principle any future method for variant detection including chip technology in all its technological versions.
Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedenster Krankheitsdispositionen geeignet.Proceeding from this, the method according to the invention is suitable for determining a broad spectrum of the most diverse disease dispositions.
In einer Ausführungsvariante z.B. zur Bestimmung einer Disposition für Bluthochdruck, (bzw. der Vorhersage des Bereichs der individuellen Blutdruckwerte als solche), und anderer cardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich Myokardinfarkt und Schlaganfall, im weitesten Sinne die Entstehung einer terminalen Niereninsuffizienz (mit Dialysebedarf).In one embodiment, e.g. to determine a disposition for high blood pressure (or the prediction of the range of individual blood pressure values as such), and other cardiovascular diseases, including myocardial infarction and stroke, in the broadest sense the development of end-stage renal failure (requiring dialysis).
Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet z.B. die Bestimmung einer Disposition für neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen und Angstsyndromen (anxiety disorders), attention deficit disorder (mit Hyperactivity), Eßstörungen, z.B. für Anorexia nervosa und Bulimie, oder durch posttraumatischen Streß ausgelöste Störungen; oder für Krankheiten des autonomen Nervensystem, wie z.B. Bradbury-Eggleston, Sky- Drager und Riley-Day Syndrom sowie selektive noradrenerge und Barorezeptor- Dispositionen, oder Migräne.Another preferred embodiment variant allows e.g. the determination of a disposition for neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety disorders, attention deficit disorder (with hyperactivity), eating disorders, e.g. for anorexia nervosa and bulimia, or disorders caused by post-traumatic stress; or for diseases of the autonomic nervous system, e.g. Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome as well as selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines.
Außerdem ist es auch für den Nachweis von Dispositionen für allergische Erkrankungen, insbesondere Astiima und atopische Störungen, geeignet.It is also suitable for the detection of dispositions for allergic diseases, especially astiima and atopic disorders.
Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Bestimmung einer Disposition für metabolische Erkrankungen wie Fettsucht (sowie familiäre 'morbid obesity'), einschließlich einer Vorhersage des Gewichtsbereichs als solchen oder einer Disposition für Gewichtsveränderung, schließlich eine Voraussage des Verhältnisses der Körpermaße als solche, wie sie sich z.B. im 'body mass index'(BMI) ausdrücken. 4Another area of application is the determination of a disposition for metabolic diseases such as obesity (as well as familial 'morbid obesity'), including a prediction of the weight range as such or a disposition for weight change, and finally a prediction of the ratio of the body measurements as such, as they are e.g. Express 'body mass index' (BMI). 4
Desweiteren erlaubt das Verfahren auch die Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrads von Erkrankungen, sowie die Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen Erkrankungen, z.B. nach Myokardinfarkt, Herzversagen und/oder Schlaganfall.Furthermore, the method also allows the course and severity of diseases to be determined, and the prediction of survival after serious medical diseases, e.g. after myocardial infarction, heart failure and / or stroke.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet die Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Reaktivität des autonomen Nervensystems, im besonderen auf endogenen und exogenen Streß (wie sie z.B. insbesondere durch eine individuell unterschiedliche Disposition zu Blutdruck- und/oder Herzfrequenzveränderungen (-auslenkungen) auf endogenen und exogenen Streß zum Ausdruck kommt), oder durch individuell unterschiedliche Blutdruckveränderungen auf endogen oder exogen induzierte Veränderungen der Salzkonzentration im Blut (individuell unterschiedliche Salzsensivität oder -resistenz), und im weitesten Sinne auch durch individuell unterschiedhche Salz- und Wasserregulation bzw. -rückresorption in der Niere (damit zusammenhängend Volumenregulation) zum Ausdruck kommt.A further preferred embodiment variant enables the determination of an individually different reactivity of the autonomic nervous system, in particular on endogenous and exogenous stress (as expressed, for example, in particular by an individually different disposition to changes in blood pressure and / or heart rate (deflections) on endogenous and exogenous stress comes), or by individually different blood pressure changes to endogenously or exogenously induced changes in the salt concentration in the blood (individually different salt sensitivity or resistance), and in the broadest sense also by individually different salt and water regulation or reabsorption in the kidney (related volume regulation ) is expressed.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten Sequenzvarianten a) zur Vorhersage der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte Therapeutika (beta2 Rezeptorliganden) sowie der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin; b) vorzugsweise zur Entwicklung individuell spezifischer beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten; c) insbesondere auch zur Entwicklung einer neuen Klasse von Therapeutika, die auf das beta2 Rezeptorgen gerichtet sind, am 5' regulatorischen Bereich, Promotorbereich, insbesondere z.B. am Leaderpeptid angreifen, und via Regulation der Transkription, der Translation sowie durch Beeinflussung deren Effizienz, vornehmlich durch Regulation der Expression, wirken.Another important object of the invention is the use of the claimed sequence variants a) for predicting the individually different responsiveness to previously known therapeutic agents (beta2 receptor ligands) and the individually different responsiveness to the endogenous ligands adrenaline and noradrenaline; b) preferably for the development of individually specific beta2 receptor agonists and antagonists; c) in particular also for the development of a new class of therapeutic agents which are directed to the beta2 receptor gene at the 5 'regulatory region, promoter region, in particular e.g. attack the leader peptide and act by regulating transcription, translation and by influencing their efficiency, primarily by regulating expression.
In diesem Zusammenhang ist weiterer Gegenstand der Erfindung die Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe (Tachyphylaxie), sowie einer unterschiedhchen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen. Insgesamt wird eine Prädiktion individuell optimaler Therapeutika, denen somit unterschiedliche Wirkmechanismen zugrundeliegen, möglich.In this context, another object of the invention is the prediction of individual habituation to drug administration (tachyphylaxis), as well as a different disposition for drug side effects. Overall, it is possible to predict individually optimal therapeutic agents, which are based on different mechanisms of action.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten Sequenzvarianten zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen sowie zur Entwicklung eines diagnostischen Kits oder jedweder diagnostischer Verfahren. Solche Kits oder Verfahren können vorteilhaft zur Vorhersage der individuellen Krankheitsdisposition oder der individuellen Ansprechbarkeit auf verschiedene beta2-Therapeutika eingesetzt werden. 5Another important object of the invention is the use of the claimed sequence variants for the construction of genes or vectors, in particular for the development of pharmaceutically relevant substances and for the development of a diagnostic kit or any diagnostic method. Such kits or methods can advantageously be used to predict individual disease disposition or individual responsiveness to various beta2 therapeutics. 5
Kulturen (Zellen), die die genannten unterschiedUchsten Kombinationen von individuellen ß2- Varianten exprimieren, können somit als Testmodelle für die Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (ß2-Agonisten und -antagonisten, sowie beta2- expressionsregulierende DNA-Therapeutika) dienen. Das entspricht Testmodellen in vitro, aber auch in vivo Testmodelle sind eingeschlossen (transgene Tiere, die diese individuellen Rezeptorvarianten tragen).Cultures (cells) that express the various combinations of individual ß2 variants mentioned can thus serve as test models for the development of individually specific therapeutic agents (ß2 agonists and antagonists, as well as beta2 expression-regulating DNA therapeutic agents). This corresponds to test models in vitro, but also in vivo test models are included (transgenic animals that carry these individual receptor variants).
Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (=ex vivo) eine Vorhersage zum individuellen Funktionszustand des beta2-Rezeptors bzw. der von ihm vermittelten Funktionen.As individual test models, they allow in vitro (= ex vivo) prediction of the individual functional state of the beta2 receptor or the functions mediated by it.
Der Umfang der beanspruchten Erfindung wird im folgenden ausführlich dargestellt. Zur Erarbeitung der Erfindung wurde die gesamte bekannte DNA-Sequenz des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptorgens einschließlich seiner regulierenden und kodierenden Regionen in Patienten und Kontrollen mittels der 'Multiplex PCR Sequenzierung' untersucht, und zunächst eine Reihe von genetischen Varianten identifiziert. In der 5' regulierenden Region wurden zum bestehenden Zeitpunkt acht neue Varianten entdeckt, deren wichtigste der Austausch eines hochkonservierten Arg-> Cys im 'Leader Peptide' des Genes (Position 1541) zu sein scheint, das die Translation des Rezeptorgens reguliert (Position -47 relativ zum Translationsstartpunkt), d.h. seine Expression.The scope of the claimed invention is detailed below. To develop the invention, the entire known DNA sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene, including its regulating and coding regions, was examined in patients and controls by means of the 'multiplex PCR sequencing', and a number of genetic variants were initially identified. Eight new variants were discovered in the 5 'regulating region, the most important of which appears to be the exchange of a highly conserved Arg-> Cys in the' leader peptide 'of the gene (position 1541), which regulates the translation of the receptor gene (position -47 relative to the translation start point), ie its expression.
Zusammenfassung der neu identifizierten Varianten (Nukleotidposition vor dem Austausch ist in Bezug auf die veröffentlichte beta2-Rezeptorgensequenz, (Kobilka B.K et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA; 84(1): 46-50 (1987)[Acc. No. J02960]; die Angabe in Klammern hinter dem Austausch bezieht sich auf den Translationsstart):Summary of the newly identified variants (nucleotide position before the exchange is in relation to the published beta2 receptor sequence, (Kobilka BK et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA; 84 (1): 46-50 (1987) [Acc. No . J02960]; the information in brackets after the exchange refers to the translation start):
159 T → A (-1429)159 T → A (-1429)
245 A → G (-1343)245 A → G (-1343)
565 G → A (-1023)565 G → A (-1023)
934 G → A (-654)934 G → A (-654)
1120 G → C (-468)1120 G → C (-468)
1221 C → T (-367)1221 C → T (-367)
1541 C → T (-47) Arg → Cys Austausch im 'Leader Peptide' des beta2-Rezeptorgens1541 C → T (-47) Arg → Cys exchange in the leader peptide of the beta2-receptor gene
1568 T → C (-20)1568 T → C (-20)
Diese Varianten sind in den Abbildungen 1, 2a und 2b übersichtlich dargestellt. 6These variants are clearly shown in Figures 1, 2a and 2b. 6
Korrelationen mit Erkrankungen bzw. klinisch relevanten Phänotypen: Spezifische Einflüsse der beiden bisher bekannten Mutationen Arg-> Gly (an Position +46 relativ zum Translationsstartpunkt, entspricht Position 16 der Aminosäurensequenz) und Gln->Glu (an Position +79 relativ zum Translationsstartpunkt, entspricht Position 27 der Aminosäurensequenz), sowie der neu entdeckten 'Leader Peptide' Mutation Arg- >Cys (an Position -47 relativ zum Translationsstartpunkt) auf eine Reihe von klinisch und pathogenetisch relevanten Phänotypen wurden in mehreren Studien nachgewiesen. So wurde eine signifikante Assoziation der Allele an Position 16 der Aminosäurensequenz mit genetischer Prädisposition zur Hypertonie, sowie extremer ausgelenkten Blutdruckwerten festgestellt. Im weiteren haben die beschriebenen drei Mutationen einen signifikanten Effekt auf phänotypische Parameter wie Herzfrequenz, Noradrenalin-Konzentrationen, Blutdruckveränderungen auf experimentell induzierten physischen und mentalen Stress, 'coping styles' und Persönlichkeitsdimensionen, sowie Gewicht und Gewichtsveränderung. Im besonderen wurde auch eine Assoziation der 'Leader Peptide'-Mutation mit Hypertonie gezeigt. Im weiteren konnte eine Beziehung zwischen beta2-Agonist-induzierter Vasodilatation und beta2 Rezeptormutationen, vorzugsweise an Position 16 der Aminosäurensequenz, hergestellt werden, sowie eine Beziehung zwischen beta2-Rezeptorexpression an Fibroblastenkulturen genotypisierter Individuen und beta2 Rezeptormutationen, vorzugsweise an Position 16 der Aminosäurensequenz.Correlations with diseases or clinically relevant phenotypes: Specific influences of the two previously known mutations Arg-> Gly (at position +46 relative to the translation start point, corresponds to position 16 of the amino acid sequence) and Gln-> Glu (at position +79 relative to the translation start point, corresponds Position 27 of the amino acid sequence), as well as the newly discovered 'Leader Peptide' mutation Arg-> Cys (at position -47 relative to the translation start point) on a number of clinically and pathogenetically relevant phenotypes have been demonstrated in several studies. A significant association of the alleles at position 16 of the amino acid sequence with a genetic predisposition to hypertension and extreme deflected blood pressure values was found. Furthermore, the three mutations described have a significant effect on phenotypic parameters such as heart rate, noradrenaline concentrations, blood pressure changes on experimentally induced physical and mental stress, 'coping styles' and personality dimensions, as well as weight and weight change. In particular, an association of the leader peptide mutation with hypertension was also shown. Furthermore, a relationship between beta2-agonist-induced vasodilation and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence, and a relationship between beta2-receptor expression in fibroblast cultures of genotyped individuals and beta2 receptor mutations, preferably at position 16 of the amino acid sequence, could be established.
Detektion spezifischer Dreierkombinationen der Mutationen an Positionen (relativ zur veröffentlichten beta2-Sequenz, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' Mutation Arg- > Cys), 1633 A - > G (Arg- > Gly), und 1666 C - > G (Gin- > Glu): Kombination 1: 1541 T (Cys Allel), 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel) Kombination 2: 1541 C (Arg Allel), 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allel) Kombination 3: 1541 T (Cys Allel), 1633 G (Gly Allel), 1666 C (Gin Allel)Detection of specific combinations of three of the mutations at positions (relative to the published beta2 sequence, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' mutation Arg-> Cys), 1633 A -> G (Arg-> Gly), and 1666 C -> G (Gin-> Glu): combination 1: 1541 T (Cys allele), 1633 A (Arg allele), 1666 C (Gin allele) combination 2: 1541 C (Arg allele), 1633 G (Gly allele ), 1666 G (Glu Allel) combination 3: 1541 T (Cys Allel), 1633 G (Gly Allel), 1666 C (Gin Allel)
Diese drei spezifischen Kombinationen kommen in 80 - 95% der Bevölkerung vor, sie scheinen evolutionär aus der Gesamtanzahl zu erwartender Kombinationen selektioniert zu sein und stellen verschiedene funktionale Zustände des menschlichen beta2-adrenergen Rezeptors dar, die der Variabilität physiologischer und pathophysiologischer Funktionen zugrundehegen. Im besonderen sind sie mit einer individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf endogene Liganden wie Adrenalin und Noradrenalin verbunden, sowie mit einer unterschiedlichen therapeutischen Ansprechbarkeit auf beta2 Rezeptoragonisten und -antagonisten, was diese 'Kombinationen' zum Ausgangspunkt zur Entwicklung 'individuell maßgeschneiderter Pharmakotherapie' machen kann. 7These three specific combinations occur in 80 - 95% of the population, they appear to be evolutionarily selected from the total number of combinations to be expected and represent different functional states of the human beta2-adrenergic receptor which underlie the variability of physiological and pathophysiological functions. In particular, they are associated with an individually different responsiveness to endogenous ligands such as adrenaline and norepinephrine, as well as a different therapeutic responsiveness to beta2 receptor agonists and antagonists, which can make these 'combinations' the starting point for the development of 'individually tailored pharmacotherapy'. 7
Detektion spezifischer beta2- 'Haplotypen' bestehend aus vier Varianten: an Positionen (relativ zur veröffentlichten beta2-Sequenz, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' Mutation Arg- > Cys), 1568 T->C; 1633 A -> G (Arg- > Gly), und 1666 C -> G(Gln->Glu):Detection of specific beta2- 'haplotypes' consisting of four variants: at positions (relative to the published beta2 sequence, Kobilka et al. 1987) 1541 C → T ('Leader Peptide' mutation Arg-> Cys), 1568 T-> C; 1633 A -> G (Arg-> Gly), and 1666 C -> G (Gln-> Glu):
Kombination 1 : 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel) Kombination 2: 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allel) Kombination 3: 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel), 1666 C (Gin Allel)Combination 1: 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel), 1666 C (Gin Allel) Combination 2: 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel), 1666 G (Glu Allele) combination 3: 1541 T (Cys Allele), 1568 T, 1633 G (Gly Allele), 1666 C (Gin Allele)
Kombination 1 wurde signifikant häufiger bei Individuen beobachtet, die erblich mit Hypertonie belastet waren, und stellt somit einen genetischen Risikofaktor dar.Combination 1 was observed significantly more frequently in individuals who were inherited with hypertension and is therefore a genetic risk factor.
Detektion spezifischer beta2- 'Haplotypen' bestehend aus sieben Varianten: Unter rechnerischer Berücksichtigung aller Varianten konnten 'Haplotypen', die aus sieben Varianten (einschließlich der drei genannten Mutationen) bestehen, extrahiert werden; den Berechnungen lag das Ziel zugrunde, 'Haplotypen' aus der Gesamtheit des Genoms zu identifizieren, die hinreichend waren, die Patientengruppe von der Kontrollgruppe zu unterscheiden. Ein spezifischer 'Haplotyp', Kombination 1, läßt sich bei genetischer Belastung mit Hypertonie häufiger beobachten, und dies läßt sich auf andere Phänotypen erweitern.Detection of specific beta2 'haplotypes' consisting of seven variants: Taking all variants into account, 'haplotypes' consisting of seven variants (including the three mutations mentioned) could be extracted; The calculations were based on the goal of identifying 'haplotypes' from the entirety of the genome which were sufficient to distinguish the patient group from the control group. A specific 'haplotype', combination 1, can be observed more frequently in cases of genetic hypertension, and this can be extended to other phenotypes.
Kombination 1: 245 G, 565 G, 934 A, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 A (Arg Allel),Combination 1: 245 G, 565 G, 934 A, 1541 T (Cys allele), 1568 T, 1633 A (Arg allele),
1666 C (Gin Allel)1666 C (gin allele)
Kombination 2: 245 A, 565 A, 934 G, 1541 C (Arg Allel), 1568 C, 1633 G (Gly Allel),Combination 2: 245 A, 565 A, 934 G, 1541 C (Arg allele), 1568 C, 1633 G (Gly allele),
1666 G (Glu Allel)1666 G (Glu allele)
Kombination 3: 245 G, 565 G, 934 G, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel),Combination 3: 245 G, 565 G, 934 G, 1541 T (Cys Allel), 1568 T, 1633 G (Gly Allel),
1666 C (Gin Allel)1666 C (gin allele)
Diese zuletzt beschriebenen 'Haplotypen' beschreiben schließlich den realen, gesamten individuellen Funktionszustand des Rezeptors. Der Erfindung liegt das Konzept zugrunde, daß es nicht einzelne Mutationen sind, die unterschiedhchen funktioneUen (dysfunktionalen) Rezeptorzuständen zugrundeliegen, sondern diese durch die individuelle 'polymorphe' Gesamtgensequenz als funktionsdeterminierender Einheit bedingt werden. 8These last described 'haplotypes' finally describe the real, overall individual functional state of the receptor. The invention is based on the concept that it is not individual mutations which are based on different functional (dysfunctional) receptor states, but these are caused by the individual 'polymorphic' overall gene sequence as a function-determining unit. 8th
Die Erfindung wird anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.The invention is explained in more detail by an embodiment.
Material und Methodenmaterial and methods
Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des beta2-Rezeptorgens wurde die Multiplex-PCR-Sequenziermethode verwendet. Hierzu wurde die gesamte bisher bekannte Promoterregion und die kodierende Region in acht Fragmente unterteilt und mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 1). Diese PCR Fragmente wurden gepoolt und simultan sequenziert. Die Fragmente der Terrninationsreaktionen wurden auf einem Sequenzgel aufgetrennt und mittels Direkter Transfer Elektrophorese (DTE) auf eine Nylonmembran übertragen. Die Dekodierung der einzelnen Sequenzleitern erfolgte durch sukzessives Hybridisieren mit spezifischen Oligonukleotiden. Die spezifischen Bedingungen für die Amplifikation waren wie folgt: Für Fragment I wurde der Vorwärtsprimer ADRBR-Fl mit der Sequenz 5 - TATTGGCCAGGATCTTTTGCTTTCTAT-3 'und der Rückwärtsprimer ADRBR-Rl mit der Sequenz 5 '-TAACATTAAGAACATTTTGAAGC-3 'verwendet. Fragment II wurde mit Hufe der beiden Primer ADRBR-F2: 5 '-GCATACCCCCGCTCCAGATAAA-3 'und ADRBR-R2: 5 '-GCACGCACATACAGGCACAAATAC-3 'ampüfiziert. Für Fragment III waren es die beiden Primer ADRBR-F3: 5 '-GGCCGCGTTTCTGTGTTGG-3 'und ADRBR-R3: 5 '-AGTGCGTTCTGCCCGTTATGTG-3 '. Für das Fragment VIII die beiden Primer ADRBR-F8: 5 '-GGTACTGTGCCTAGCGATAAC-3 'und ADRBR-R8: 5 '- TAAAATACCCCGTGTGAGCAAATAAGAG-3 '. Die Reaktionsbedingungen für diese vier Fragmente waren wie folgt: 10 x PCR Puffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2 x 6 H2O, 500 mM KC1, pH 8,3), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F, 30 μM Primer R, 50 ng genomische DNA und 5 U einer Taq DNA Polymerase. AUe drei Fragmente wurden mit folgendem Temperaturprofil ampüfiziert: 94 °C 4 min; 35 Zyklen: 94 °C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 1 min und abschließend 72 °C 10 min.The multiplex PCR sequencing method was used for the collection of the entire polymorphic spectrum of the beta2-receptor gene. For this purpose, the entire promoter region known to date and the coding region were divided into eight fragments and amplified by means of PCR (see FIG. 1). These PCR fragments were pooled and sequenced simultaneously. The fragments of the terrination reactions were separated on a sequence gel and transferred to a nylon membrane by direct transfer electrophoresis (DTE). The individual sequence ladders were decoded by successive hybridization with specific oligonucleotides. The specific conditions for the amplification were as follows: For fragment I, the forward primer ADRBR-F1 with the sequence 5 - TATTGGCCAGGATCTTTTGCTTTCTAT-3 ' and the reverse primer ADRBR-R1 with the sequence 5 ' -TAACATTAAGAACATTTTGAAGC-3 'were used. Fragment II was amplified with hooves of the two primers ADRBR-F2: 5 ' -GCATACCCCCGCTCCAGATAAA-3 ' and ADRBR-R2: 5 ' -GCACGCACATACAGGCACAAATAC-3 ' . For fragment III it was the two primers ADRBR-F3: 5 ' -GGCCGCGTTTCTGTGTTGG-3 ' and ADRBR-R3: 5 ' -AGTGCGTTCTGCCCGTTATGTG-3 ' . For fragment VIII the two primers ADRBR-F8: 5 ' -GGTACTGTGCCTAGCGATAAC-3 ' and ADRBR-R8: 5 ' - TAAAATACCCCGTGTGAGCAAATAAGAG-3 ' . The reaction conditions for these four fragments were as follows: 10 x PCR buffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl 2 x 6 H 2 O, 500 mM KC1, pH 8.3), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F, 30 μM primer R, 50 ng genomic DNA and 5 U of a Taq DNA polymerase. Three fragments were amplified with the following temperature profile: 94 ° C for 4 min; 35 cycles: 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
Fragment IV wurde mit Hilfe der beiden Primer ADRBR-F4: 5 - GGGGAGGGAAAGGGGAGGAG-3 ' und ADRBR-R4: 5 '-Fragment IV was generated using the two primers ADRBR-F4: 5 - GGGGAGGGAAAGGGGAGGAG-3 ' and ADRBR-R4: 5 ' -
CTGCCAGGCCCATGACCAGAT-3 'amplifiziert. Für Fragment VII wurden die Primer ADRBR-F7: 5 '-CTGGCTGCCCTTCTTCATCGTT-3 ' und ADRBR-R7: 5 '-CTGCCAGGCCCATGACCAGAT-3 ' amplified. For fragment VII, the primers ADRBR-F7: 5 ' -CTGGCTGCCCTTCTTCATCGTT-3 ' and ADRBR-R7: 5 ' -
TACCCTCAAGTTAAATAGTCTGTT-3 'verwendet. Die Bedingungen für diese beiden PCR-Reaktionen waren wie folgt: 10 x PCR Puffer (160 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween- 20, 500 mM KOH, pH), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F, 30 μM Primer R, 50 ng genomische DNA und 4 U eines Gemisches aus der Taq DNA Polymerase und einer thermostabilen inorganischen Pyrophosphatase von Thermits thermophilus. Beide Fragmente wurden mit folgendem Temperaturprofil amplifiziert: 94 °C 4 min; 35 Zyklen: 94 °C 30 sec, 66 °C [Fragment IV] bzw. 60 °C [Fragment VII] 30 sec, 72 °C 1 min und abschlie- 9TACCCTCAAGTTAAATAGTCTGTT-3 ' used. The conditions for these two PCR reactions were as follows: 10 x PCR buffer (160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Tween-20, 500 mM KOH, pH), dNTP 2 mM, 30 μM Primer F , 30 μM Primer R, 50 ng genomic DNA and 4 U of a mixture of the Taq DNA polymerase and a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermits thermophilus. Both fragments were amplified with the following temperature profile: 94 ° C for 4 min; 35 cycles: 94 ° C 30 sec, 66 ° C [Fragment IV] or 60 ° C [Fragment VII] 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 9
ßend 72 °C 10 min.at 72 ° C for 10 min.
Fragment V wurde mittels der beiden Primer ADRBR-F5: 5 - ATGCGCCGGACCACGAC-3 ' und ADRBR-R5: 5 - GTAGAAGGACACGATGGA- 3 amplifiziert, Fragment VI mit den beiden Primern ADRBR-F6: 5 - GCTACTTTGCCATTACTTCACC-3 ' und ADRBR-R6: 5 '-Fragment V was amplified using the two primers ADRBR-F5: 5 - ATGCGCCGGACCACGAC-3 ' and ADRBR-R5: 5 - GTAGAAGGACACGATGGA-3, fragment VI using the two primers ADRBR-F6: 5 - GCTACTTTGCCATTACTTCACC-3 ' and ADRBR-R6: 5 ' -
AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 '. Diese beiden Fragmente wurden mit Hilfe des 'AmpliTaq Gold Kits' von Perkin Eimer amplifiziert. Das Temperaturprofil bei diesen beiden Fragmenten war wie folgt: 94 C 10 min; 35 Zyklen: 94 C 30 sec, 56 °C [Fragment V] bzw. 58 °C [Fragment VI] 30 sec, 72 °C 1 min und abschließend 72 °C 10 min.AAATCTGGGCTCCGGCAGTAGATAAG-3 ' . These two fragments were amplified using Perkin Elmer's 'AmpliTaq Gold Kit'. The temperature profile for these two fragments was as follows: 94 C 10 min; 35 cycles: 94 C 30 sec, 56 ° C [fragment V] or 58 ° C [fragment VI] 30 sec, 72 ° C 1 min and finally 72 ° C 10 min.
Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des 'Thermo Sequenase cycle sequencing kit' von Amersham. Als Sequenzierprimer wurden die oben beschriebenen PCR Primer verwendet. Die Sequenzierung wurde in vier Multiplex-Pools durchgeführt. Pool 1 enthielt die Sequenzierprimer ADRBR-Fl, ADRBR-F3, ADRBR-F5 und ADRBR-F7; Pool 2 die Sequenzierprimer ADRBR-Rl, ADRBR-R3, ADRBR-R5 und ADRBR-R7. In beide Se- quenzier-Poole wurden die PCR-Fragmente I, III, V und VII eingesetzt. Pool 3 hingegen enthielt die Sequenzierprimer ADRBR-F2, F4, F6 und F8; Pool 4 die Sequenzierprimer ADRBR-R2, R4, R6 und R8. In diese beiden Poole wurden die Fragmente π, IV, VI und VIII eingesetzt.The sequencing was done using the 'Thermo Sequenase cycle sequencing kit' from Amersham. The PCR primers described above were used as sequencing primers. The sequencing was carried out in four multiplex pools. Pool 1 contained the sequencing primers ADRBR-Fl, ADRBR-F3, ADRBR-F5 and ADRBR-F7; Pool 2 the sequencing primers ADRBR-Rl, ADRBR-R3, ADRBR-R5 and ADRBR-R7. The PCR fragments I, III, V and VII were used in both sequencing pools. Pool 3, on the other hand, contained the sequencing primers ADRBR-F2, F4, F6 and F8; Pool 4 the sequencing primers ADRBR-R2, R4, R6 and R8. The fragments π, IV, VI and VIII were inserted into these two pools.
Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden in einem PTC 225 Cycler von MJ Research durchgeführt.All PCR and sequencing reactions were carried out in a PTC 225 cycler from MJ Research.
Die Produkte der Sequenzreaktionen wurden auf einem 100 μm dicken Acrylamidgel (5% Acrylamid, 7 M Harnstoff) aufgetrennt und unter Standard DTE Bedingungen (siehe Richterich and Church, 1993), auf eine Biodyne A Membran (Pall) übertragen. Die Membran wurde dann mit 32P- markierten Oügonukleotiden hybridisiert und die einzelnen Sequenzleitern mit Hilfe eines Phospho-Fluorimager (Storm 860, Molecular Dynamics) detektiert. The products of the sequence reactions were separated on a 100 μm thick acrylamide gel (5% acrylamide, 7 M urea) and transferred to a Biodyne A membrane (Pall) under standard DTE conditions (see Richterich and Church, 1993). The membrane was then hybridized with 32 P-labeled ougonucleotides and the individual sequence conductors were detected using a phosphofluorimager (Storm 860, Molecular Dynamics).
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Literatur:Literature:
Kobilka B.K., Dixon R.A., FrieUe T., Dohlman H.G., Bolanowski M.A., Sigal I.S., Yang Feng T.L., Francke U., Caron M.G., Lefkowitz R.J.: cDNA for the beta 2- adrenergic receptor: a protein with multiple membrane-spanning domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with that of the receptor for platelet-derived growth facto. Proc NatlAcad Sei USA.; 84 (1): 46-50 (1987).Kobilka BK, Dixon RA, FrieUe T., Dohlman HG, Bolanowski MA, Sigal IS, Yang Feng TL, Francke U., Caron MG, Lefkowitz RJ: cDNA for the beta 2-adrenergic receptor: a protein with multiple membrane-spanning domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with that of the receptor for platelet-derived growth facto. Proc NatlAcad Sei USA .; 84 (1): 46-50 (1987).
Parola A.L. and KobUa B.K. The peptide produet of a 5 ' leader cistron in the beta 2 adrenergic receptor mRNA inhibits receptor synthesis. J Biol Chem. 269 (6): 4497-505 (1994).Parola AL and KobUa BK The peptide product of a 5 ' leader cistron in the beta 2 adrenergic receptor mRNA inhibits receptor synthesis. J Biol Chem. 269 (6): 4497-505 (1994).
Richterich P. and Church G.M.: DNA sequencing with direct transfer electrophoresis and nonradioactive detection. Methods Enzyrnσl. 218: 187-222 (1993).Richterich P. and Church G.M .: DNA sequencing with direct transfer electrophoresis and nonradioactive detection. Methods Enzyrnσl. 218: 187-222 (1993).
Legenden zu den Abbildungen:Legends for the pictures:
Abbildung 1illustration 1
Polymorphes Spektrum des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptorgens Varianten sind entsprechend ihrer Nukleotidposition eingezeichnet (Referenzsequenz Kobilka et al. 1987).Polymorphic spectrum of the human beta 2-adrenergic receptor gene variants are shown according to their nucleotide position (reference sequence Kobilka et al. 1987).
Abbildung 2 aFigure 2 a
Sequenz des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptors (Kobilka et al. 1987) Varianten sind entsprechend ihrer Position eingezeichnet.Sequence of the human beta 2-adrenergic receptor (Kobilka et al. 1987) variants are shown according to their position.
Abbildung 2 bFigure 2 b
Sequenz des menschlichen beta 2-adrenergen Rezeptors (Kobilka et al. 1997). Eingezeichnet sind die Varianten (Nukleotid- bzw. Aminosäureaustausch).Sequence of the human beta 2-adrenergic receptor (Kobilka et al. 1997). The variants (nucleotide or amino acid exchange) are shown.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP CORRECTED SHEET (RULE 91) ISA / EP

Claims

11Patentansprüche 11 Patent claims
1. Sequenz des menschlichen beta2-adrenergenen Rezeptorgens, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an den Positionen 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, und 2826 ganz oder teilweise ausgetauscht sind.1. Sequence of the human beta2-adrenergic receptor gene, characterized in that the bases at positions 159, 245, 565, 934, 1120, 1221, 1541, 1568, 1633, 1666, 1839, 2078, 2110, 2640, and 2826 entirely or partially replaced.
2. Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teüweise die Basenaustausche T→A (Position 159), A→G (Position 245), G→A (Position 565), G→A (Position 934), G→C (Position 1120), C→T (Position 1221), C→T (Position 1541), T→C (Position 1568), A→G (Position 1633), C→G (Position 1666), G→A (Position 1839), C→T (Position 2078), C→A (Position 2110), G→C (Position 2640), und G→A (Position 2826) enthält.2. Sequence according to claim 1, characterized in that it completely or partially the base exchanges T → A (position 159), A → G (position 245), G → A (position 565), G → A (position 934), G → C (position 1120), C → T (position 1221), C → T (position 1541), T → C (position 1568), A → G (position 1633), C → G (position 1666), G → A (Position 1839), C → T (position 2078), C → A (position 2110), G → C (position 2640), and G → A (position 2826).
3. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1633 A und 1666 C.3. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 T, 1633 A and 1666 C.
4. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 C, 1633 G und 1666 G.4. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 C, 1633 G and 1666 G.
5. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1633 G und 1666 C.5. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 T, 1633 G and 1666 C.
6. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1568 T 1633 A und 1666 C.6. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 T, 1568 T 1633 A and 1666 C.
7. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 C, 1568 C 1633 G und 1666 G.7. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 C, 1568 C 1633 G and 1666 G.
8. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 1541 T, 1568 T 1633 G und 1666 C.8. Sequence according to claim 1 and 2, characterized by the mutations 1541 T, 1568 T 1633 G and 1666 C.
9. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird, wobei ggf. aüe möglichen Kombinationen von Varianten von der Einzelmutation bis zu allen mögüchen Kombinationen aller Varianten einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten einbezogen werden. 129. A method for determining disease predispositions, characterized in that the DNA of a subject is isolated and genotyped at least at one of the exchanged positions and subsequently compared with the reference DNA sequence, with possible combinations of variants from the individual mutation up to all possible combinations of all variants, including any absolute number of variants, are included. 12
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoüert und mindestens an der Position 1633 genotypisiert wird.10. The method according to claim 9, characterized in that the DNA of a subject is isolated and genotyped at least at position 1633.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 3 Positionen 1541, 1633 und 1666 genotypisiert wird.11. The method according to claim 9, characterized in that the DNA of a subject is isolated and genotyped at least at the 3 positions 1541, 1633 and 1666.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert wird.12. The method according to claim 9, characterized in that the DNA of a subject is isolated and genotyped at least at the 4 positions 1541, 1568, 1633 and 1666.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den 7 Positionen 245, 565, 934, 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.13. The method according to claim 9, characterized in that the DNA of a subject is isolated and genotyped at least at the 7 positions 245, 565, 934, 1541, 1568, 1633 and 1666.
14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.14. The method according to claim 9 or 12, characterized in that the positions 1541, 1568, 1633 and 1666 are genotyped.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 3 der 4 Positionen 1541, 1568, 1633 und 1666 genotypisiert werden.15. The method according to claim 14, characterized in that at least 3 of the 4 positions 1541, 1568, 1633 and 1666 are genotyped.
16. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen 9, 11 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionen 1541, 1633 und 1666 genotypisiert werden.16. A method for determining disease dispositions 9, 11 or 15, characterized in that positions 1541, 1633 and 1666 are genotyped.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Genotypisierung durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für den Nachweis von Varianten geeignet sind, erfolgt.17. The method according to any one of claims 9 to 16, characterized in that the genotyping is carried out by sequencing or by other methods which are suitable for the detection of variants.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer Disposition für Bluthochdruck sowie für Blutdruckabweichungen von der Norm und andere cardiovasku- läre Erkrankungen, einschließüch Myokardinfarkt und SchlaganfaU; zur Bestimmung einer Disposition für neuropsychiatrische Erkrankungen wie Depressionen, Angstsyndro- men, attention deficit disorder mit Hyperactivity, Eßstörungen, z.B. Anorexia nervosa und Bulimie, oder für durch posttraumatischen Streß ausgelöste Störungen; zur Bestimmung einer Disposition für Krankheiten des autonomen Nervensystem, wie z.B. Bradbu- ry-Eggleston, Sky-Drager und Riley-Day Syndrom sowie selektive noradrenerge und Ba- rorezeptor-Dispositionen, oder Migräne; zur Bestimmung einer Disposition für aüergische Erkrankungen, insbesondere Asthma und atopische Störungen; zur Bestimmung einer Disposition für metabolische Erkrankungen wie Fettsucht sowie famüiäre 'morbid obesity', 1318. The method according to any one of claims 9 to 17 for determining a disposition for high blood pressure and for blood pressure deviations from the norm and other cardiovascular diseases, including myocardial infarction and stroke; for determining a disposition for neuropsychiatric diseases such as depression, anxiety syndromes, attention deficit disorder with hyperactivity, eating disorders, eg anorexia nervosa and bulimia, or for disorders triggered by post-traumatic stress; for determining a disposition for diseases of the autonomic nervous system, such as Bradbury-Eggleston, Sky-Drager and Riley-Day syndrome, and selective noradrenergic and baroreceptor dispositions, or migraines; to determine a disposition for allergic diseases, especially asthma and atopic disorders; to determine a disposition for metabolic diseases such as obesity and family morbid obesity, 13
einschüeßlich einer Vorhersage des Gewichtsbereichs als solchen oder einer Disposition für Gewichtsveränderung, schließlich eine Voraussage des Verhältnisses der Körpermaße als solche, wie sie sich z.B. im 'body mass index' (BMI) ausdrücken.including a prediction of the weight range as such or a disposition for weight change, finally a prediction of the ratio of the body measurements as such, e.g. Express in the 'body mass index' (BMI).
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Reaktivität des autonomen Nervensystems, im besonderen auf endogenen und exogenen Streß.19. The method according to any one of claims 9 to 17 for determining an individually different reactivity of the autonomic nervous system, in particular on endogenous and exogenous stress.
20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung einer individuell unterschiedlichen Disposition für Blutdruck- und/oder Herzfrequenzveränderungen/-auslenkungen auf endogenen und exogenen Streß, oder einer individuell unterschiedhchen Salzsensitivität/- resistenz.20. The method according to claim 19 for determining an individually different disposition for blood pressure and / or heart rate changes / deflections on endogenous and exogenous stress, or an individually different salt sensitivity / resistance.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrads von Erkrankungen,wie z.B. unter Anspruch 18 aufgeführt, z. B. von neu- ropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen und Angstsyndromen, von cardiovas- kulären Erkrankungen, einschheßlich Myokardinfarkt und SchlaganfaU, von Krankheiten des autonomen Nervensystems sowie von aüergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma.21. The method according to any one of claims 9 to 17 for determining the course and severity of diseases, such as listed under claim 18, e.g. B. neuropsychiatric diseases such as depression and anxiety syndromes, cardiovascular diseases, including myocardial infarction and stroke, diseases of the autonomic nervous system and allergic diseases such as e.g. Asthma.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Bestimmung einer Disposition für metaboüsche Erkrankungen wie Fettsucht.22. The method according to any one of claims 9 to 17 for determining a disposition for metabolic diseases such as obesity.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen Erkrankungen, z.B. nach Myokardinfarkt, Herzversagen und/oder SchlaganfaU.23. The method according to any one of claims 9 to 17 for predicting the survival after serious medical diseases, e.g. after myocardial infarction, heart failure and / or stroke.
24. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 8 zur Entwicklung von Therapeutika und/oder Lifestyle-drugs.24. Use of the sequence variants according to claim 1 to 8 for the development of therapeutic agents and / or lifestyle drugs.
25. Verwendung nach Anspruch 24 zur Entwicklung einer neuen Klasse von Therapeutika, die auf das beta2-Rezeptorgen gerichtet sind, und am 5 'regulatorischen Bereich, im Promotorbereich, sowie am Leaderpeptid angreifen, via Regulation der Transkription und Translation sowie durch Beeinflussung von deren Effizienz, vornehmlich durch Regulation der Expression, wirken.25. Use according to claim 24 for the development of a new class of therapeutic agents which are directed to the beta2 receptor gene and which attack the 5 'regulatory region, the promoter region and the leader peptide, by regulating the transcription and translation and by influencing their efficiency , primarily by regulating expression.
26. Verwendung nach Anspruch 24 zur Entwicklung von beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten, insbesondere von individuell spezifischen beta2-Rezeptoragonisten und - antagonisten. 1426. Use according to claim 24 for the development of beta2-receptor agonists and - antagonists, in particular of individually specific beta2-receptor agonists and - antagonists. 14
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Prädiktion der individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte, wie beta2-Rezeptorüganden, sowie zukünftig, auch unter Anspruch 24 bis 26 entwickelte Therapeutika, und der individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin.27. Use according to one of claims 9 to 17 for predicting the individually different responsiveness to previously known, such as beta2-receptor ligands, as well as therapeutics developed in the future, also under claims 24 to 26, and the individually different responsiveness to the endogenous ligands adrenaline and noradrenaline.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe (Tachyphylaxie), sowie einer unterschiedlichen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen.28. Use according to one of claims 9 to 17 for predicting the individual habituation to medication (tachyphylaxis), as well as a different disposition for drug side effects.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Optimierung der individueüen, auf den beta2-Rezeptor und sein Gen gerichteten Therapie bzw. Intervention.29. Use according to one of claims 9 to 17 for optimizing the individual therapy or intervention directed at the beta2 receptor and its gene.
30. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 8 zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen.30. Use of the sequence variants according to claims 1 to 8 for the construction of genes or vectors, in particular for the development of pharmaceutically relevant substances.
31. Verwendung nach Anspruch 24 bis 30 zur Entwicklung eines diagnostischen Kits, oder jedweden Verfahrens zur Genotypisierung.31. Use according to claim 24 to 30 for the development of a diagnostic kit, or any method for genotyping.
32. Verwendung nach Anspruch 24 bis 31 zur Entwicklung eines diagnostischen Kits zur Vorhersage der individueüen Ansprechbarkeit auf verschiedene beta2-Rezeptor-agonisten sowie -antagonisten, sowie auf jedwede neu entwickelten beta2 aktiven Therapeutika , im besonderen auch nach Anspruch 25; zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit von Pharmaka, deren Wirkmechanismus Veränderungen der beta2-Rezeptorstruktur, - regula- tion, oder - expression miteinbezieht; zur Vorhersage der individuell unterschiedhchen Ansprechbarkeit auf die endogenen Liganden Adrenalin und Noradrenalin; zur Vorhersage der individuellen Gewöhnung auf Medikamentengabe - Tachyphylaxie - , sowie einer unterschiedlichen Disposition für Arzneimittelnebenwirkungen; zur Optimierung der individuellen, auf den beta2-Rezeptor und sein Gen gerichteten Therapie bzw. Intervention.32. Use according to claims 24 to 31 for the development of a diagnostic kit for predicting the individual responsiveness to various beta2 receptor agonists and antagonists, as well as to any newly developed beta2 active therapeutic agents, in particular also according to claim 25; to predict the therapeutic efficacy of pharmaceuticals whose mechanism of action includes changes in the beta2 receptor structure, regulation or expression; to predict individual responsiveness to the endogenous ligands epinephrine and noradrenaline; to predict individual habituation to drug administration - tachyphylaxis - as well as a different disposition for drug side effects; to optimize the individual therapy or intervention aimed at the beta2 receptor and its gene.
33. Verwendung nach Anspruch 1 bis 8 sowie 9 bis 32 zur Entwicklung von in vitro (z.B. Zellkulturen) und in vivo (z.B. transgene Tiere) Testsystemen, die individueüe Formen des beta2-Rezeptorgens exprimieren, wobei die Testsysteme zur Untersuchung der Patho- physiologie von Erkrankungen von generell medizinisch wichtigen Merkmalen mit Betei- ligung des beta2-Rezeptorgens dienen, sowie zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika und 'lifestyle- drugs' und von beta2-gerichteten Substanzen im allgemeinen. 33. Use according to claims 1 to 8 and 9 to 32 for the development of in vitro (for example cell cultures) and in vivo (for example transgenic animals) test systems which express individual forms of the beta2-receptor gene, the test systems for examining the pathophysiology of Diseases of generally medically important characteristics with the participation of the beta2 prescription gene serve, as well as for the development and testing of individually specific therapeutic agents and 'lifestyle drugs' and of beta2-directed substances in general.
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