DE60125596T2

DE60125596T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur bestimmung von perioperativen genomprofile

Info

Publication number: DE60125596T2
Application number: DE60125596T
Authority: DE
Inventors: Kirk Madison Hogan
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-07-11
Also published as: ATE349551T1; EP1930447A3; EP1816214B1; WO2002006536A3; US20110183335A1; EP1930447A2; DE60125596D1; EP1816214A1; JP2004514418A; ES2309892T3; US20020110823A1; WO2002006536A2; EP1366185A2; ATE399216T1; DK1816214T3; DE60134591D1; EP1366185B1; AU2001281318A1; EP1366185B9

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Methoden für das perioperative genomische Screening von Subjekten, insbesondere auf das perioperative Screening auf Marker, die auf Reaktion bei Narkose und anderen perioperativen oder operativen Behandlungen und Maßnahmen hinweisen. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen bereit, die in Screeningmethoden verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Obwohl die Chirurgie viele Leben rettet, führen chirurgische Komplikationen in vielen Fällen zum Tod und zur Morbidität. Komplikationen in Bezug auf die Chirurgie und Anästhesie schließen Infektionen, exzessiven Blutverlust, Thrombose, Übelkeit und Erbrechen und Narkosereaktionen ein. Diese Komplikationen führen zu einer erhöhten Hospitalisierung, verlangsamter Erholung von dem chirurgischen Eingriff und manchmal sogar zum Tod. Die Reaktionen auf die Anästhesie sind ein Beispiel für solche Komplikationen.
Die Anwendung von lokaler, regionaler und Vollnarkose ist notwendig, um Schmerz vorzubeugen und die Patienten sicher und stabil während des chirurgischen Eingriffes zu halten. Es gibt eine Vielzahl Möglichkeiten an Techniken für die Anästhesie und spezifische Betäubungsmittel. Die Auswahl des anästhetischen Regimes, des Mittels und der Dosis hängt von der Art des chirurgischen Eingriffes oder der Maßnahme, anderen derzeitigen Medikationen und anderen zu Grunde liegenden Krankheiten oder Prädispositionen, die ein Patient haben kann, ab. Nichts desto trotz hat einer von 170 Patienten in Bezug auf die Betäubung Komplikationen und von 2.500 Todesfällen bei einem chirurgischen Eingriff kann einer auf die mit der Anästhesie in Zusammenhang stehenden Komplikationen zurückgeführt werden (Dan Med Bull., 41: 319 [1994]). Viele Komplikationen sind nicht das Ergebnis eines Fehlers, sondern eher eines Systems an Fehlern, wie beispielsweise eine unzulängliche Diagnose mittels vorhandener Technologien. Es wird geschätzt, dass Systemfehler für bis zu 88 % der Gesamtfehler in der klinischen Praxis verantwortlich sind (Liang und Cullen, Anesthesiology, 91: 609 [1999]).
Eine anästhesiebezogene Komplikation ist die maligne Hyperthermie (MH). MH ist ein autosomales dominantes Merkmal, das ein schweres, unkontrollierbares Fieber auslöst, wenn eine Anästhesie verabreicht wird. Bei einem von 5.000 bis 15.000 Kindern und 1 von 50.000 Erwachsenen zeigt sich MH als Reaktion auf die Verabreichung von Anästhetika. Fehlende sofortige Behandlung kann zu Herzrhythmusstörungen, Nierenversagen und Tod führen. MH wird mit dem spezifischen Gegenmittel Dantrolennatrium behandelt, jedoch ist die beste Intervention die Vorbeugung. Wenn ein Patient als solcher vor der Anästhesie identifiziert wird, so können alternative anästhetische Arzneimittel ausgewählt werden, die kein MH-Risiko aufweisen. Risikopatienten können selten mittels einer Familienhistorie in Bezug auf anästhetische Reaktionen oder frühere anästhetische Reaktionen beim Pati enten ermittelt werden. Überzeugende, einfache diagnostische Screeningmethoden stehen nicht zur Verfügung.
Subjekte mit Defekten in den Enzymen, die lokale Anästhetika und darauf bezogene Zusammensetzungen metabolisieren, können schlecht reagieren, wenn solche Arzneimittel, vor, während oder nach dem chirurgischen Eingriff gegeben werden. Werden beispielsweise Muskelentspannungsmittel, zum Beispiel Succinylcholin oder Mivacurium, wie sie üblicherweise zusammen mit der Anästhesie verabreicht werden, eingesetzt, so kann dies eine länger anhaltende Paralyse und Atemstillstand bei einem Patienten hervorrufen, nachdem der Patient aus der Anästhesie erwacht ist. Die Paralyse, die durch Mutationen in dem Butrylcholinesterase-Gen (BChE) verursacht wird, wird als autosomales rezessives Merkmal vererbt. Die einzige zur Verfügung stehende Behandlung ist die künstliche Beatmung und Beruhigung bis die Paralyse abklingt (30 Minuten bis 8 Stunden). Des Weiteren ist BChE für den Metabolismus von Ester lokalen Anästhetika verantwortlich. Somit können Mutationen in BChE ebenfalls zu einem verlangsamten Metabolismus und möglicher Toxizität führen, wenn Ester lokale Anästhetika verwendet werden. Biochemikalische Assays, die BChE messen, sind kostenintensiv, zeitaufwendig und lassen Präzision vermissen. Ein überzeugender, schneller Screening-Assay auf BChE-Mutationen steht nicht zur Verfügung.
Des Weiteren können Subjekte mit Mutationen in Cytochrom-P450-Enzymen, welche eine Vielzahl an Arzneimitteln metabolisieren, die üblicherweise bei chirurgischen Verfahren verabreicht werden, nachteilige Reaktionen haben, begründet entweder in der Unfähigkeit bestimmte Arzneimittel zu aktivieren oder zu metabolisieren (z.B. morphine Deriva te und Anti-Dysrrhthmika). Die Komplikationen können durch die Substituierung mittels anderer Medikationen oder eine Dosisanpassung vermieden werden.
Die Reaktionen auf Arzneimittel, die während der Chirurgie gegeben werden, sind nicht die einzigen chirurgischen Komplikationen. Komplikationen können ebenfalls in der Erholungsphase nach der Chirurgie auftreten. Eine ernsthafte post-chirurgische Komplikation ist Sepsis, eine systemische Reaktion, die durch Infektion verursacht wird, und durch arterielle Hypotonie, metabolische Acidose, verringerte systemische vaskuläre Resistenz, Tachypnea und organische Fehlfunktionen charakterisiert ist. Sepsis ist der Hauptgrund für die Morbidität und Mortalität beim Menschen und anderen Tieren. Es wird geschätzt, dass 400.000-500.000 Fälle von Sepsis zu 100.000-175.000 Todesfällen in den Vereinigten Staaten allein 1991 führten. Trotz der großen Fortschritte in den letzten Jahrzehnten bei der Behandlung von ernsthaften Infektionen setzt sich der Anstieg des Auftretens und der Mortalität auf Grund der Sepsis fort (Wolff, New Eng. J. Med., 324: 486-488 [1991]). Subjekte, die das TNF2-Allel des TNFα-Gen tragen, haben eine erhöhte Anfälligkeit für Sepsis und den Tod infolge von Sepsis nach einer chirurgischen Behandlung (Mira, JAMA 282: 561-568 [1999]). Jedoch sind die einzig zur Verfügung stehenden Assays zur direkten Messung der Cytokinproduktion teuer, schwankend und unbequem. Ein überzeugender schneller Screening-Assay auf die Anwesenheit von TNF2-Allelen steht nicht zur Verfügung.
Eine geeignete Auswahl an Anästhetika, damit in Zusammenhang stehende Arzneimittel und andere Behandlungsfaktoren können die Komplikationen und die Morbidität und Mor talität, die mit der Chirurgie verbunden ist, reduzieren. Es werden bequeme, schnelle Assays zur Voraussage des Risikos chirurgischer Komplikationen benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und bezieht sich auf Methoden für das perioperative genomische Screening von Subjekten, insbesondere auf das perioperative Screening auf Marker, die indikativ für die Reaktionen auf Anästhesie und andere perioperative oder operative Behandlungen und Prozeduren sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen zur Verwendung in Screeningmethoden bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode bereit, die aufweist: Bereitstellung einer von einem perioperativen Subjekt erhaltenen Probe (z.B. eine Gewebeprobe oder eine genetische Information); Bereitstellung eines Assays zur Feststellung von zwei oder mehr genetischen Markern, wobei die Marker eine Mutation in zwei oder mehr Genen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BChE, CYP2D6, MTHRF, MS, CBS, F 5 Leiden, Prothrombin, RYR1, CACNA1S und CPT2 aufweisen, und Einbringen der Probe in den Assay zur Erzeugung eines genomischen Profils zur Verwendung in der Auswahl bei einem Operationsablauf, wobei der genannte Ablauf die Verabreichung einer Anästhesie während einer chirurgischen Behandlung ist. In einigen Ausführungsformen ist die Narkose eine Vollnarkose. In anderen Ausführungsformen ist die Narkose eine Teilnarkose. In einigen Ausführungsformen ist die chirurgische Behandlung eine nicht-invasive chirurgische Behandlung. In anderen Ausführungsformen ist die chirurgische Behandlung eine invasive chirurgische Behandlung.
In einigen Ausführungsformen umfasst das genomische Profil der vorliegenden Erfindung Informationen in Bezug auf ein pharmakodynamisches Risiko. In anderen Ausführungsformen umfasst das genomische Profil Informationen in Bezug auf ein pharmakokinetisches Risiko. In weiteren Ausführungsformen umfasst das genomische Profil eine vorsymptomatische Diagnose. In noch anderen Ausführungsformen umfasst das genomische Profil Informationen in Bezug auf verschiedene Diagnosen von koexistierenden Krankheiten.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls nützlich in einer Methode, die aufweist: Bereitstellung von einer Probe von einem Subjekt; Bereitstellung eines Assays zur Feststellung von zwei oder mehreren genetischen Markern; und Einbringen der Probe in den Assay zur Erzeugung eines genomischen Profils zur Verwendung in. der Auswahl einer medizinischen Behandlung. Die Probe kann von dem Subjekt aus den folgenden Zeitfenstern gewählt sein: vor der medizinischen Behandlung, während der medizinischen Behandlung und nach der medizinischen Behandlung. Die medizinische Behandlung kann nicht-chirurgisch oder chirurgisch sein.
Die vorliegende Erfindung ist des Weiteren nützlich in einer Methode, die aufweist: Bereitstellung einer von einem Subjekt erhaltenen Probe; Bereitstellung eines Assays zur Feststellung von zwei oder mehr genetischen Markern, die mit einer pharmakologischen Reaktion assoziiert sind; Testung der Probe in dem Assay zur Generierung eines genomischen Profils; und Unterziehung des Subjektes einer chirurgischen Behandlung, wobei die Bedingungen für die Be handlung auf dem genomischen Profil basieren. In einigen Verfahren bezieht sich die pharmakologische Reaktion auf ein Anästhetikum. In einigen Verfahren ist die Bedingung für das Verfahren die Auswahl des Anästhetikums. In einigen Verfahren sind die beiden oder mehreren genetischen Marker eine Mutation in zwei oder mehreren Genen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus BChE, CYP2D6, MTHFR, MS, CBS, F 5 Leiden, Prothrombin, RYR1, CACNA1S und CPT 2.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls für ein System nützlich, das ein Assay zur Generierung eines genomischen Profils eines perioperativen Subjekts aufweist, wobei der Assay zwei oder mehr genetische Marker aufweist, die für eine medizinische Behandlung indikativ sind. In einigen Systemen ist die Behandlung eine chirurgische Behandlung; in anderen Systemen ist die Behandlung die Verabreichung einer Anästhesie während eines chirurgischen Eingriffs.
In einigen Systemen weist das genomische. Profil Informationen in Bezug auf ein pharmakodynamisches Risiko auf. In anderen Systemen weist das genomische Profil Informationen in Bezug auf ein pharmakokinetisches Risiko auf. In einigen Systemen weist das genomische Profil eine präsymptomatische Diagnose auf. In anderen Systemen weist das genomische Profil Informationen in Bezug auf eine erkannte koexistierende Krankheit auf.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt einen Überblick über den Informations fluss in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt den Durchlauf einer genomischen Probe und der Daten, die von der Probe in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und bezieht sich auf Methoden für das perioperative genomische Screening von Subjekten, insbesondere auf das perioperative Screening auf Marker, die für Reaktionen auf eine Anästhesie und andere perioperative oder operative Behandlungen und Prozeduren indikativ sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen zur Verwendung in Screeningmethoden bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Diagnosemittel bereit, das auf dem chirurgischen Gebiet nicht zur Verfügung steht. Es gibt keine derzeitig verfügbare Technologie, die die Information des perioperativen genomischen Profils der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stellt. In der Tat ist der gegenwärtige Stand auf dem chirurgischen Gebiet der, dass das perioperative Testieren reduziert oder eliminiert werden soll. Somit stellt die vorliegende Erfindung Problemlösungen bereit, ohne dass es zur Verfügung stehende Alternativen gibt. Bei dem Fehlen jeglicher konkurrierender Technologie für die Quantifizierung des genetischen Beitrags des Subjekts auf ein perioperatives Risiko werden Allele (d.h. bekannte Allele) getestet (z.B. unter Verwendung bekannter Methoden) entsprechend expliziter Se lektionskategorien und Kriterien en bloc, um ein genomisches Profil zu erstellen.
Bisher wird ein breites Screening-Paneel (z.B. Blut- und Urinanalysen, EKG und Thorax-X-Bestrahlung) vor dem chirurgischen Eingriff routinemäßig durchgeführt. Jedoch ist die gegenwärtige Verfahrensweise, einfach den Patienten zu fragen, ob sie früher irgendwelche Probleme bei der Anästhesie oder bei einem chirurgischen Eingriff hatten. Manchmal, jedoch nicht immer, wird eine kurze physische Untersuchung durchgeführt. Die Anwendung von Labortests wurde für relativ gesunde Patienten reduziert oder abgeschafft. Die Gründe für die Abschaffung schließen die Kosten der Screeningtests, die Ungenauigkeit und das Fehlen der Spezifizität und die Unsicherheit, wie die Behandlungsmethode in Bezug auf die Ergebnisse geändert werden soll, und einen zukünftigen Schaden für den Patienten durch eine invasive Aufarbeitung im Ergebnis eines zufälligen Befundes ein. In der Tat betonen gegenwärtige anästhesiologische Texte, dass neueste Studien darauf hinweisen, dass routinemäßige Laboruntersuchungen als Methode für die präoperative Patientenanalyse keinen Vorteil aufweisen. Diese Texte betonen, dass ein optimales Kosten-Nutzen-Verhältnis nur erhalten werden kann, wenn die Untersuchung auf das beschränkt wird, was durch die Vorgeschichte angedeutet ist (siehe z.B. RD Miller, (ed.), Anesthesia, 5. Auflage, Churchill Livingstone, [2000], Seiten 824-883).
Die vorliegende Erfindung vereinigt ganz verschiedene Felder der Medizin (z.B. Anästhesie und Chirurgie) mit der Genetik. Die perioperative genomische Untersuchung der vorliegenden Erfindung ist im direkten Gegensatz zu den Testpaneelen, die derzeit zur Verfügung stehen. Die perio perativen genomischen Profile der vorliegenden Erfindung lösen viele der oben genannten Probleme, die von den präoperativen Labortests weggeführt haben. Die perioperativen genomischen Profile sind kosten- und zeiteffizient. Die einbezogenen Marker werden in Bezug auf ihre Genauigkeit, Spezifizität und den Vorhersehbarkeitswert ausgewählt. Die perioperativen Profile der vorliegenden Erfindung erlauben die Individualisierung der Behandlungsoptionen für jedes Subjekt, welches einer medizinischen oder chirurgischen Behandlung unterzogen wird.
Die Untersuchung aller präoperativen Patienten mit einem Paneelassay erlaubt die Untersuchung von Markern, die selten, aber von Nutzen sind. So ist beispielsweise ein Assay, welches viele Allele einschließt, selbst wenn sie selten sind, mit einem positiven Ergebnis in einer ausreichenden Anzahl von Subjekten verbunden, was den Assay lohnenswert macht. Die perioperativen genomischen Paneele der vorliegenden Erfindung stellen ebenfalls den Vorteil der Feststellung von additiven oder synergistischen Effekten von Krankheiten bereit, für die mehr als ein Allel prophezeit wird. Die perioperativen genomischen Profile bieten des Weiteren den Vorteil, dass zwischen homozygoten und heterozygoten Mutationen unterschieden werden kann.
In einigen Ausführungsformen sagen die Marker die Reaktion eines Subjekts auf Anästhesie oder andere Medikationen, einschließend der, jedoch nicht auf diese beschränkt, die in Verbindung mit der Anästhesie gegeben werden, voraus (z.B. Defekte im Metabolismus, die zu Komplikationen, wie Paralyse oder Arzneimitteltoxizität führen). In einigen Ausführungsformen sagen die Marker das Risiko eines Subjekts in Bezug auf anästhesie-bezogene Komplikationen (z.B. maligne Hyperthermie) voraus. In einigen Ausführungsformen sagen die Marker potentielle Komplikationen voraus, die während der Erholung des Subjektes von dem chirurgischen Eingriff auftreten können (z.B. das Risiko einer Thrombose oder Sepsis).
Die Marker werden ebenfalls so ausgewählt, dass die Wirkungsweise auf zeit- und kosteneffiziente Art geändert werden kann, um ungewünschte chirurgische Komplikationen zu eliminieren oder zu reduzieren. Zum Beispiel kann ein praktischer Arzt ein bestimmtes Anästhetikum oder Analgetikum auswählen, um eine lebensbedrohliche Reaktion zu vermeiden. Ein negatives Ergebnis für einen gegebenen Marker trägt somit das Potential, genausoviel therapeutischen Nutzen bereitzustellen, wie ein positives Ergebnis. Wenn zum Beispiel bei einem Subjekt ein Marker festgestellt wird, der darauf hinweist, dass es zu keiner Reaktion auf ein gegebenes Arzneimittel, wie es bei Notfallreanimationen verabreicht wird, kommt, so wird. keine wertvolle Zeit für die Verabreichung des Arzneimittels vergeudet. Wenn bei einem Subjekt festgestellt wird, dass es keine zu Grunde liegende Krankheit gibt, so kann des Weiteren diese Krankheit von denen ausgeschlossen werden, die für eine differentielle Diagnose in Betracht kommen, was die Zeit verringert, die vergeht, bis der lebenserhaltende Eingriff beginnen kann.
In einigen Ausführungsformen werden die durch das perioperative genomische Profil erhaltenen Informationen verwendet, um die Prognose oder Überlebenschancen des Objektes zu ermitteln. In einigen Ausführungsformen werden die Informationen verwendet um die sicherste und am meisten effiziente chirurgische Methode auszuwählen. In einigen Ausführungsformen werden die Informationen verwendet, um das Niveau des post-chirurgischen Monitorings festzulegen (z.B. ob das Subjekt am selben Tag nach Hause geschickt werden kann oder über Nacht hospitalisiert werden soll, oder ob das Subjekt auf die Intensivstation gebracht werden soll oder auch nicht). Ein Subjekt, für welches ein Risiko für post-chirurgische Komplikationen gefunden wurde, kann zum Beispiel sorgfältig überwacht werden (z.B. auf der Intensivstation), so dass ein lebenserhaltender Eingriff so schnell wie möglich begonnen werden kann.
Die durch die perioperativen genomischen Profile der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Informationen sind für das Klinikpersonal selbst dann von Nutzen, wenn die Profile bei dem Beginn des chirurgischen Eingriffes nicht zur Verfügung stehen (z.B. im Falle einer Notfalloperation, wo der Zeitintervall zwischen der Diagnose und dem chirurgischen Eingriff kurz ist). Wenn das genomische Profil während des chirurgischen Eingriffes fertig gestellt ist, kann die Behandlungsmethode zu diesem Zeitpunkt, sofern notwendig, geändert werden. Auch sind Informationen in Bezug auf die post-chirurgische Erholungsphase nützlich, selbst nach dem chirurgischen Eingriff.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung des Weiteren ein integriertes, elektronisches (z.B. Web-basiertes) System für die Erfassung, Auswertung und Verteilung der genetischen Daten bereit, die für die Behandlungsmethode relevant sind (siehe 1 für einen Überblick über den Informationsfluss in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung). Die vorliegende Erfindung stellt somit für die praktischen Ärzte lebensrettende und Kosten sparende Informationen auf schnellere Weise in Bezug auf herkömmliche Diagnosen bereit.
DEFINITIONEN
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, werden nachfolgend eine Reihe von Begriffen definiert.
Der Begriff „Gen" bezieht sich auf eine Nukleinsäure (z.B. DNA oder RNA) Sequenz, die eine codierende Sequenz aufweist, die für die Herstellung eines Polypeptids oder Precursors notwendig ist. Das Polypeptid kann durch eine volllängencodierende Sequenz oder durch jeglichen Teil der codierenden Sequenz codiert werden, solange die gewünschte Aktivität oder funktionellen Eigenschaften (z.B. enzymatische Aktivität, Ligandenbindung etc.) der Volllänge oder des Fragments erhalten bleiben. Der Begriff schließt die codierende Region eines strukturellen Gens und die eingeschlossenen Sequenzen ein, die sich in Nähe der codierenden Region zu beiden Seiten der 5'- und 3'-Enden, in einem Abstand von etwa 1 kb auf beiden Seiten der Enden, befinden, so dass das Gen der Volllängen-mRNA entspricht. Die Sequenzen, die sich 5' der codierenden Region befinden und bei der mRNA vorhanden sind, werden als 5' nicht-translatierende Sequenzen bezeichnet. Die Sequenzen, die 3' oder downstream der codierenden Region liegen und bei der mRNA vorliegen, werden als 3' nicht-translatierende Sequenzen bezeichnet. Der Begriff „Gen" schließt sowohl cDNA als auch genomische Formen eines Gens ein. Eine genomische Form oder ein Klon eines Gens enthält die codierende Region, die durch nicht-codierende Sequenzen, definiert als „Introns" oder „Zwischenregionen" oder „Zwischensequenzen", unterbrochen. Introne sind Gensegmente, die in nukleare RNA (hnRNA) transkribiert werden; Introne können regulatorische Elemen te, z.B. Enhancer, enthalten. Introne werden aus dem nuklearen oder primären Transkript entfernt oder „herausgespliced"; deshalb fehlen Introne in dem messenger RNA (mRNA) Transkript. Die mRNA dient während der Translation der Spezifizierung der Sequenz oder Ordnung der Aminosäuren in dem in Entstehung begriffenen Polypeptid.
Wenn „Aminosäuresequenz" hier zitiert wird, so bezieht es sich auf eine Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteinmoleküls, „Aminosäuresequenz" und ähnliche Begriffe, beispielsweise „Polypeptid" oder „Protein", sind nicht in der Form gemeint, dass die Aminosäuresequenz auf die vollständige, natürliche Aminosäuresequenz, wie sie mit den zitierten Proteinen verbunden ist, beschränkt ist.
Zusätzlich zu den Intronen, die enthalten sein können, können die genomischen Formen eines Gens ebenfalls Sequenzen einschließen, die zu beiden Seiten, dem 5'- und 3'-Ende, der Sequenzen liegen, die in dem RNA-Transkript vorliegen. Diese Sequenzen werden als „flankierende" Sequenzen oder Regionen bezeichnet (diese flankierenden Sequenzen liegen 5' oder 3' in Bezug auf die nicht-translatierenden Sequenzen, die auf dem mRNA-Transkript vorliegen). Die 5'-flankierende Region kann regulatorische Sequenzen, wie zum Beispiel Promotoren und Enhancer, aufweisen, die die Transkription der Gene kontrollieren oder beeinflussen. Die 3'-flankierende Region kann Sequenzen enthalten, die die Terminierung der Transkription, der post-transkriptionalen Spaltung und Polyadenylisierung enthalten.
Der Begriff „Wildtyp" bezieht sich auf ein Gen oder Genprodukt, welches die Merkmale des Gens oder Genprodukts hat, wenn es aus einer natürlich vorkommenden Quelle iso liert wurde. Ein Wildtyp-Gen ist ein solches, welches am häufigsten in einer Population festgestellt wird und somit willkürlich als „Normal-" oder „Wildtyp"-Form des Genes bestimmt wird. Im Unterschied dazu beziehen sich die Begriffe „modifiziert", „mutiert" und „Variante" auf ein Gen oder Genprodukt, das Änderungen in der Sequenz oder funktionellen Eigenschaften (d.h. geänderte Charakteristiken) im Vergleich zu dem Wildtyp-Gen oder Genprodukt aufweist. Es sei gesagt, dass natürlich vorkommende Mutanten isoliert werden können; diese werden durch den Umstand identifiziert, dass sie geänderte Charakteristiken im Vergleich zu dem Wildtyp-Gen oder Genprodukt aufweisen.
Die Begriffe „Nukleinsäuremolekül codierend", „DNA-Sequenz codierend" und „DNA codierend", wie hier verwendet, beziehen sich auf die Folge oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Stranges von Desoxyribonukleinsäuren. Die Folge dieser Desoxyribonukleotide bestimmt die Folge der Aminosäuren entlang der Polypeptid (Protein) Kette. Die DNA Sequenz codiert somit die Aminosäuresequenz.
Den DNA Molekülen wurden „5'-Enden" und „3'-Enden" zugeschrieben, da die Mononukleotide zur Herstellung von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden auf solche Art miteinander reagieren gelassen werden, dass das 5'-Phosphat von einem Mononukleotidpentosering an das 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in eine Richtung mittels einer Phosphodiesterverbindung befestigt ist. Deshalb wird ein Ende eines Oligonukleotides oder Polynukleotides als „5'-Ende" bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht mit dem 3'-Sauerstoff eines Mononukleotidpentoserings verbunden ist, und als das „3'-Ende", wenn sein 3'-Sauerstoff nicht an das 5'-Phosphat eines nachfolgenden Mononukleotidpentoserings gebunden ist.
Eine Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, sogar wenn sie im Inneren eines größeren Oligonukleotids oder Polynukleotids liegt, kann ebenfalls wie gesagt 5'- und 3'-Enden haben. Sowohl bei linearen als auch zirkulären DNA-Molekülen werden diskrete Elemente als „upstream" oder 5' in Bezug auf „downstream" oder 3'-Elemente bezeichnet. Diese Terminologie spiegelt die Tatsache wieder, dass die Transkription in 5' nach 3' Richtung entlang des DNA-Stranges erfolgt. Die Promotor- und Enhancerelemente, die die Transkription eines verbundenen Genes regeln, liegen gewöhnlich 5' oder upstream von der codierenden Region. Jedoch können Enhancerelemente ihren Effekt selbst dann ausüben, wenn sie 3' von dem Promotorelement und der codierenden Region liegen. Die Signale für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung liegen 3' oder downstream von der codierenden Region.
Die Begriffe „ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die ein Gen codiert" und „Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die ein Gen codiert", wie hier verwendet, bezeichnen eine Nukleinsäuresequenz, die eine codierende Region eines Genes, oder in anderen Worten die Nukleinsäuresequenz, die ein Genprodukt codiert, aufweist. Die codierende Region kann entweder in einer cDNA-, genomischen DNA- oder RNA-Form vorliegen. Wenn sie in einer DNA-Form vorliegt, können die Oligonukleotide oder Polynukleotide einzelsträngig (d.h. der Sense-Strang) oder doppelsträngig sein. Geeignete Kontrollelemente, beispielsweise Enhancer/Promotoren, Splice-Abzweigungen, Polyadenylierungssignale, etc. können in unmittelbare Nähe zu der codierenden Region des Gens bei Bedarf angeordnet sein, um einen richtigen Start der Transkription und/oder eine richtige Prozessierung des primären RNA-Transkriptes zu ermög lichen. Alternativ kann die codierende Region, wie sie in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, endogene Enhancer/Promotoren, Splice-Abzweigungen, unterbrechende Sequenzen, Polyadenylierungssignale etc. oder eine Kombination von beiden, endogenen und exogenen Kontrollelementen, enthalten.
Der Begriff „regulatorisches Element", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein genetisches Element, das verschiedene Aspekte der Expression der Nukleinsäuresequenzen kontrolliert. Beispielsweise ist ein Promotor ein regulatorisches Element, das den Start der Transkription einer operabel verbundenen codierenden Region ermöglicht. Andere regulatorische Elemente schließen Splice-Signale, Polyadenylisierungssignale, Terminierungssignale etc. ein.
Die Begriffe „komplementär" oder „Komplementarität", wie hier verwendet, beziehen sich auf Polynukleotide (d.h. eine Sequenz von Nukleotiden) in Bezug auf die Basenpaarungsregeln. So ist zum Beispiel die Sequenz „5'-A-G-T-3'" komplementär zu der Sequenz „3'-T-C-A-5'". Die Komplementarität kann „teilweise" sein, wobei nur einige der Nukleinsäurenbasen entsprechend den Basenpaarungsregeln passen. Oder es kann „vollständige" oder „totale" Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren vorliegen. Der Grad der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuresträngen hat wesentliche Einflüsse auf die Effizienz und Stärke der Hybridisation zwischen den Nukleinsäuresträngen. Dies ist von besonderer Bedeutung bei Amplifikationsreaktionen, genauso wie bei Untersuchungsmethoden, die auf der Bindung zwischen Nukleinsäuren beruhen.
Der Begriff „Homologie" bezieht sich auf den Grad der Komplementarität. Es kann partielle Homologie oder vollständige Homologie (d.h. Identität) vorliegen. Eine partiell komplementäre Sequenz ist eine Sequenz, die zumindest teilweise eine vollständig komplementäre Sequenz von der Hybridisierung an eine Zielnukleinsäure abhält und wofür der funktionelle Begriff „im Wesentlichen homolog" verwendet wird. Die Unterdrückung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann mittels eines Hybridisierungsassays (Southern oder Northern Blot, Hybridisierung in Lösung) unter schwach-stringenten Bedingungen untersucht werden. Eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder Probe wird um die Bindung konkurrieren und die Bindung (d.h. die Hybridisierung) des vollständigen Homologs an das Ziel unter schwach-stringenten Bedingungen unterdrücken. Das bedeutet nicht, dass die schwach-stringenten Bedingungen solche sind, dass keine spezifische Bindung erlaubt ist; schwach-stringente Bedingungen erfordern, dass die Bindung von zwei Sequenzen an eine andere mittels einer spezifischen (d.h. selektiven) Wechselwirkung stattfindet. Das Fehlen einer nicht-spezifischen Bindung kann durch die Verwendung eines zweiten Ziels, dem sogar teilweise ein Grad an Komplementarität fehlt (z.B. weniger als etwa 30 % Identität) getestet werden; bei dem Fehlen einer nicht-spezifischen Bindung wird die Probe nicht mit dem zweiten nicht-komplementären Ziel hybridisieren.
Wenn der Begriff „im Wesentlichen homolog" in Bezug auf eine doppelsträngige Nukleinsäuresequenz, beispielsweise eine cDNA oder einen genomischen Klon, verwendet wird, so bezieht er sich auf eine beliebige Probe, die mit einem der beiden oder beiden Strängen der doppelsträngigen Nuk leinsäuresequenz unter schwach-stringenten Bedingungen, wie oben genannt, hybridisieren kann.
Ein Gen kann eine Vielzahl an RNA-Arten bilden, die durch verschiedenes Splicen des primären RNA-Transkripts erhalten werden. cDNAs, die Splice-Varianten desselben Gens sind, enthalten Regionen mit Sequenzidentität oder vollständiger Homologie (die die Anwesenheit desselben Exons oder Teilen desselben Exons auf beiden cDNAs aufweisen) und Regionen vollständiger Nicht-Identität (z.B. dem Vorhandensein eines Exons „A" auf der cDNA 1, während stattdessen die cDNA 2 das Exon „B" enthält). Da die beiden cDNA-Regionen mit Sequenzidentität enthalten, hybridisieren beide mit einer Probe, die von dem gesamten Gen oder Teilen des Gens, welches Sequenzen aufweist, die sich auf beiden cDNAs finden, abgeleitet sind; die beiden Splice-Varianten sind deshalb in Bezug auf eine solche Probe und zueinander homolog.
Der Begriff „im Wesentlichen homolog", wenn er in Bezug auf eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz verwendet wird, bezieht sich auf jegliche Probe, die mit einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz unter schwach-stringenten Bedingungen, wie oben beschrieben, hybridisieren kann (d.h. es ist das Gegenstück davon).
Der Begriff „Hybridisierung", wie hier verwendet, wird in Bezug auf die Paarung der komplementären Nukleinsäuren verwendet. Die Hybridisierung und die Stärke der Hybridisierung (d.h. die Stärke der Verbindung zwischen den Nukleinsäuren) wird beeinflusst durch solche Faktoren, wie der Grad der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren, den angewendeten stringenten Bedingungen, der T_m des gebil deten Hybrids und dem G:C-Verhältnis innerhalb der Nukleinsäuren.
Der Begriff „T_m", wie hier verwendet, wird verwendet in Bezug auf die „Schmelztemperatur". Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der eine Population von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zur Hälfte in Einzelstränge dissoziiert. Die Gleichung für die Berechnung der T_m der Nukleinsäuren ist im Stand der Technik gut bekannt. Wie durch die Standardreferenzen angegeben, kann der T_m-Wert einfach überschlagen werden durch die Gleichung: T_m = 81,5 + 0,41 (% G + C), wenn eine Nukleinsäure in einer wässrigen Lösung bei 1 M NaCl vorliegt (siehe bspw. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]). Andere Quellen schließen kompliziertere Berechnungen ein, in die strukturelle als auch Sequenzcharakteristiken bei der Berechnung des T_m einfließen.
Der Begriff „Stringenz", wie hier verwendet, wird in Bezug auf die Bedingungen für die Temperatur, die Ionenstärke und die Anwesenheit anderer Stoffe, wie beispielsweise organische Lösungsmittel, unter denen die Nukleinsäurehybridisierung stattfindet, verwendet. Der Fachmann des Standes der Technik wird erkennen, dass „stringente" Bedingungen durch die Variation der gerade beschriebenen Parameter, entweder individuell oder gemeinsam, geändert werden können. Mit „hoch-stringenten" Bedingungen wird die Nukleinsäurebasenpaarung nur zwischen Nukleinsäurefragmenten stattfinden, die eine hohe Frequenz oder Komplementarität der Basensequenzen aufweisen (z.B. Hybridisierung unter „hoch-stringenten" Bedingungen können zwischen Homologen mit einer Identität von etwa 85-100 %, vorzugsweise etwa 70-100 %, stattfinden). Unter mittleren stringenten Bedingungen wird die Nukleinsäurebasenpaarung zwischen den Nukleinsäuren mit einer mittleren Sequenz von komplementären Basensequenzen stattfinden (z.B. Hybridisierung unter „mittel-stringenten" Bedingungen können zwischen Homologen mit etwa 50-70 % Identität stattfinden). Somit sind „schwach-" oder „gering-"stringente Bedingungen häufig bei Nukleinsäuren erforderlich, die von genetisch unterschiedlichen Organismen stammen, da die Frequenz der komplementären Sequenzen üblicherweise geringer ist.
Die „Amplifikation" ist ein Spezialfall der Nukleinsäurenreplikation, die eine Template-Spezifizität einschließt. Sie unterscheidet sich von der nicht-spezifischen Template-Replikation (d.h. die Replikation ist Template-abhängig, hängt jedoch nicht von einem spezifischen Template ab). Die Template-Spezifizität ist hier zu unterscheiden von der Replikationsgenauigkeit (d.h. der Synthese der korrekten Polynukleotidsequenz) und Nukleotid (ribo- oder desoxyribo-) Spezifizität. Die Template-Spezifizität wird häufig als „Ziel-"Spezifizität beschrieben. Zielsequenzen sind „Ziele" in dem Sinne, dass sie von anderen Nukleinsäuren aussortiert werden können. Die Amplifikationstechniken wurden primär für dieses Aussortieren designt.
Die Template-Spezifizität wird bei den meisten Amplifikationstechniken durch die Auswahl des Enzyms erreicht. Amplifikationsenzyme sind solche Enzyme, die unter den Bedingungen, unter denen sie verwendet werden, nur spezifische Sequenzen von Nukleinsäuren in einem heterogenen Gemisch von Nukleinsäuren prozessieren. So ist zum Beispiel im Falle der Qβ-Replikase das MDV-1 RNA das spezifische Template für die Replikase (Kacian et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 69: 3038 [1972]). Andere Nukleinsäuren werden durch dieses Amplifikationsenzym nicht repliziert. Im Falle der T7 RNA Polymerase hat dieses Amplifikationsenzym, in gleicher Weise, eine stringente Spezifizität für ihre eigenen Promotoren (Chamberlin et al., Nature, 228: 227 [1970]). Im Falle der T4 DNA Ligase wird das Enzym nicht die beiden Oligonukleotide oder Polynukleotide binden, wo ein Versatz zwischen den Oligonukleotid- oder Polynukleotidsubstrat und dem Template an der Verbindungsstelle vorliegt (Wu und Wallace, Genomics, 4: 560 [1989]). Schließlich die Taq und Pfu Polymerasen, die Kraft ihrer Fähigkeit bei hohen Temperaturen funktionieren, für die gefunden wurde, dass sie hohe Spezifizität für die gebundenen, und somit durch die Primer definierten, Sequenzen aufweisen; die hohe Temperatur führt zu thermodynamischen Bedingungen, die die Primerhybridisierung mit den Target-Sequenzen begünstigt und nicht die Hybridisierung mit den Nicht-Target-Sequenzen (H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989]).
Der Begriff „amplifizierbare Nukleinsäure", wie hier verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuren, die durch jegliche Amplifikationsmethode amplifiziert werden können. Es sei gesagt, dass „amplifizierbare Nukleinsäure" üblicherweise ein „Proben-Template" umfasst.
Der Begriff „Proben-Template", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die von einer Probe abstammt, die auf Anwesenheit eines „Ziels" (weiter unten definiert) analysiert wird. Im Unterschied dazu wird „Hintergrund-Template" in Bezug auf Nukleinsäuren verwendet, die, anders als das Proben-Template, in der Probe vorhanden sein können, oder auch nicht. Das Hintergrund-Template ist in den meisten Fällen unerwünscht. Es kann das Ergebnis einer Verschleppung oder auf die Anwesenheit von Nukleinsäurekontaminationen zurückzuführen sein, die man glaubte durch die Reinigung aus der Probe entfernt zu haben. Zum Beispiel können Nukleinsäuren aus Organismen, die sich von den zu untersuchenden unterscheiden, als Hintergrund in einer Testprobe vorhanden sein.
Der Begriff „Primer", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, entweder natürlich vorkommend, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch hergestellt, welches in der Lage ist, als Anfangspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen eingesetzt wird, in welchen die Synthese eines Primerextensionsproduktes, welches komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induziert wird (z.B. in der Anwesenheit von Nukleotiden und einem induzierenden Stoff, beispielsweise eine DNR-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und geeigneten pH). Für die maximale Effizienz der Amplifikation ist der Primer vorzugsweise einzelsträngig, kann aber alternativ auch doppelsträngig sein. Wenn der Primer doppelsträngig ist, wird der Primer als erstes behandelt, um die Stränge voneinander zu trennen, bevor diese zur Herstellung Extensionsprodukten verwendet werden. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonukleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese der Extensionsprodukte in Anwesenheit des induzierenden Agenten zu starten. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren, einschließlich der Temperatur, der Primerquelle und der Verwendung der Methode ab.
Der Begriff „Probe", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid (d.h. eine Sequenz von Nukleo tiden), entweder natürlich vorkommend wie in gereinigten Restriktionsverdaus, oder synthetisch, rekombinant oder durch PCR-Amplifikation hergestellt, der in der Lage ist, mit einem anderen Oligonukleotid von Interesse zu hybridisieren. Eine Probe kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Proben sind nützlich für die Detektion, Identifizierung und Isolierung von bestimmten Gensequenzen. Es sei gesagt, dass jegliche Probe, die in vorliegender Erfindung verwendet wird, mit einem „Reportermolekül" markiert wird, so dass sie in jeglichem Detektionssystem, einschließlicher derer unter Verwendung von Enzymen (z.B. ELISA, genauso wie enzym-basierende histochemische Assays), Fluoreszenz, radioaktiver oder Lumineszenzsysteme, ohne auf diese beschränkt zu sein, detektiert werden kann. Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung auf irgendein spezielles Detektionssystem oder eine Markierung eingeschränkt ist.
Der Begriff „Ziel", wie hier verwendet, wenn er in Bezug auf die Polymerasen-Kettenreaktionen verwendet wird, bezieht sich auf eine Region einer Nukleinsäure, die durch die Primer, die für die Polymerasen-Kettenreaktionen verwendet werden, gebunden ist. Somit kann das „Ziel" von anderen Nukleinsäuresequenzen aussortiert werden. Ein „Segment" ist als Region einer Nukleinsäure innerhalb der Zielsequenz definiert.
Der Begriff „Polymerasen-Kettenreaktion" („PCR"), wie hier verwendet, bezieht sich auf die Methode von K.B. Mullis U.S. Patente Nummer 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188, die hiermit durch die Zitierung inkorporiert sind, die eine Methode zur Erhöhung der Konzentration eines Segments einer Zielsequenz in einer Mischung genomischer DNA ohne Klonierung und Reinigung beschreiben. Dieser Prozess zur Amplifizierung der Zielsequenz besteht in der Einführung von zwei Oligonukleotidprimern im Überschuss zu der DNA-Mischung, die die gewünschte Zielsequenz enthält, gefolgt von einer genauen Abfolge von thermischen Zyklen in Anwesenheit einer DNA-Polymerase. Die beiden Primer sind zu ihren entsprechenden Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz komplementär. Um die Amplifikation zu bewirken, wird die Mischung denaturiert und die Primer dann an ihre komplementären Sequenzen innerhalb des Zielmoleküls angelagert. Nach der Anlagerung werden die Primer mit einer Polymerase verlängert, so dass sie ein neues Paar an komplementären Strängen bilden. Die Schritte der Denaturierung, Primeranlagerung und polymerasen Verlängerung können viele Male wiederholt werden (d.h. Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung bilden einen „Zyklus"; es können eine Vielzahl an „Zyklen" stattfinden) um eine hohe Konzentration eines amplifizierten Segments der gewünschten Zielsequenz zu erhalten. Die Länge des amplifizierten Segments der gewünschten Zielsequenz wird durch die Relativposition der Primer in Bezug aufeinander bestimmt, und deshalb ist die Länge ein kontrollierbares Parameter. Aufgrund der wiederholenden Aspekte des Prozesses wird die Methode als „Polymerasen-Kettenreaktion" (nachfolgend „PCR") bezeichnet. Da die gewünschten amplifizierten Segmente der Zielsequenz die vorherrschenden Sequenzen (in Bezug auf die Konzentration) in der Mischung werden, werden sie als „PCR-amplifiziert" bezeichnet.
Mit der PCR ist es möglich, eine Einzelkopie einer spezifischen Zielsequenz in der genomischen DNA auf ein solches Niveau zu amplifizieren, dass es durch verschiedene Methodologien nachweisbar ist (z.B. Hybridisierung mit ei ner markierten Probe, Inkorporierung von biotinylisierten Primern, gefolgt von einer Avidin-Enzym-Konjugatdetektierung; Inkorporierung von ³²P-markierten Desoxynukleotidtriphosphaten, beispielsweise dCTP oder dATP, in das amplifizierte Segment). Neben der genomischen DNA kann jegliche Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenz mit dem entsprechenden Set an Primermolekülen amplifiziert werden. Insbesondere die amplifizierten Segmente, die durch den PCR-Prozess selbst kreiert wurden, sind effiziente Templats für nachfolgende PCR-Amplifikationen.
Die Begriffe „PCR-Produkt", „PCR-Fragment" und „Amplifikationsprodukt", wie hier verwendet, beziehen sich auf die resultierende Mischung der Verbindungen nach zwei oder mehr vollständigen Zyklen der PCR-Schritte der Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung. Diese Begriffe schließen den Fall ein, bei dem eine Amplifikation eines oder mehrerer Segmente von einer oder mehreren Zielsequenzen stattgefunden hat.
Der Begriff „Amplifikationsreagenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Reagenzien (Desoxyribonukleotidtriphosphate, Puffer, etc.), die für die Amplifikation, abgesehen von den Primern, Nukleinsäure-Template und dem Amplifikationsenzym, benötigt werden. Üblicherweise werden die Amplifikationsreagenzen zusammen mit den anderen Reaktionskomponenten in ein Reaktionsgefäß gegeben (Teströhrchen, Mikroplatte, etc.).
Der Begriff „reverse Transkriptase" oder „RT-PCR", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen PCR-Typ, bei dem das Startmaterial mRNA ist. Die mRNA, mit der begonnen wird, wird enzymatisch zu der komplementären DNA oder „cDNA" unter Verwendung eines reversen Transkriptaseenzyms umgewandelt. Die cDNA wird dann als „Template" für die „PCR"-Reaktion verwendet.
Die Begriffe „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme", wie hier verwendet, beziehen sich auf bakterielle Enzyme, von denen jedes eine doppelsträngige DNA an oder in der Nähe einer spezifischen Nukleotidsequenz schneiden kann.
Der Begriff „antisens", wie hier verwendet, wird in Bezug auf eine RNA-Sequenzen verwendet, die komplementär zu einer spezifischen RNA-Sequenz (z.B. mRNA) sind. Von dieser Definition werden antisens RNA („asRNR") Moleküle umfasst, die in die Genregulation bei Bakterien involviert sind. Antisens RNA kann durch jegliche Methoden hergestellt werden, einschließlich der Synthese durch Splicen der gewünschten Gene in einer reversen Orientierung zu einem viralen Promotor, was die Synthese eines codierenden Stranges erlaubt. Sobald in ein Embryo eingeführt, kombiniert dieser transkribierte Strang mit der natürlichen mRNA, die durch den Embryo produziert wird, und bildet Duplexe. Diese Duplexe blockieren dann entweder die weitere Transkription der mRNA oder ihre Translation. Auf diese Weise können mutante Phenotypen generiert werden. Der Begriff „antisens-Strang" wird in Bezug auf einen Nukleinsäurestrang verwendet, der komplementär zu dem „sens"-Strang ist. Die Bezeichnung (–) (d.h. „negativ") wird manchmal in Bezug auf den antisens-Strang verwendet, und mit der Bezeichnung (+) wird manchmal der sens-(d.h. „positive")-Strang bezeichnet.
Der Begriff „isoliert", wenn er in Bezug auf Nukleinsäuren, wie in „ein isolierter Oligonukleotid" oder „isoliertes Polynukleotid" verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die identifiziert und von mindestens einer kontaminanten Nukleinsäure, mit der sie ursprünglich in der natürlichen Quelle assoziiert war, separiert wurde. Die isolierten Nukleinsäuren liegen in einer Form oder einer Situation vor, die unterschiedlich ist von der, wie sie in der Natur vorkommt. Im Unterschied dazu sind nicht-isolierte Nukleinsäuren Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, die in dem Stadium vorkommen, wie sie in der Natur existieren. Zum Beispiel wird eine gegebene DNA-Sequenz (z.B. ein Gen) auf dem Wirtszellenchromosom in der Nähe benachbarter Gene gefunden; RNA-Sequenzen, wie spezifische mRNR-Sequenzen, die ein spezifisches Protein codieren, werden in der Zelle als Mischung mit verschiedenen anderen mRNAs gefunden, die eine Vielzahl an Proteinen codieren. Isolierte Nukleinsäuren schließen jedoch ebenfalls Nukleinsäuren in Zellen ein, die gewöhnlich ein gegebenes Protein expressieren, wobei die Nukleinsäure an einem chromosomalen Ort vorliegt, der sich von den von natürlichen Zellen unterscheidet, oder ist anderweitig durch verschiedene Nukleinsäuresequenzen, als die die in der Natur gefunden werden, flankiert. Die isolierten Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder Polynukleotide können in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen. Wenn eine isolierte Nukleinsäure, ein Oligonukleotid oder Polynukleotid für die Expression eines Proteins verwendet werden soll, wird das Oligonukleotid oder Polynukleotid mindestens den sens- oder codierenden Strang (d.h. der Oligonukleotid oder Polynukleotid kann einzelsträngig sein) enthalten, kann jedoch ebenfalls sowohl den sens-, als auch den antisens-Strang (d.h. der Oligonukleotid oder Polynukleotid kann doppelsträngig sein) enthalten.
Ein „Teil eines Chromosoms", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen diskreten Abschnitt auf dem Chromosom. Chromosomen werden in Sites oder Abschnitte durch die Cytogenetiker auf folgende Art unterschieden: der (in Bezug auf das Centromer) kurze Arm eines Chromosoms wird als „p"-Arm bezeichnet; der lange Arm wird als „q"-Arm bezeichnet. Jeder Arm ist in zwei Regionen unterteilt, die als Region 1 und Region 2 bezeichnet werden (Region 1 ist dichter am Centromer). Jede Region ist des Weiteren in Banden unterteilt. Die Banden können des Weiteren in Unterbanden unterteilt sein. So befindet sich zum Beispiel der 11p15,5-Teil des menschlichen Chromosoms 11 auf dem Chromosom 11 (11) auf dem kurzen Arm (p) in der ersten Region (1) in dem fünften Band (5) in dem Unterband 5 (,5). Ein Teil eines Chromosoms kann „umgebaut" sein; beispielsweise kann der gesamte Teil wegen einer Deletion fehlen oder umgebaut sein (z.B. Inversionen, Translokationen, ausgedehnte oder zusammengezogene wegen Änderungen in sich wiederholenden Regionen). Im Falle einer Deletion kann der Versuch der Hybridisierung (d.h. einer spezifischen Bindung) einer Probe, die zu einem bestimmten Teil eines Chromosoms homolog ist, zu einem negativen Ergebnis führen (d.h. die Probe kann nicht an die Probe binden, die das genetische Material enthält, welches in Verdacht steht, den fehlenden Teil des Chromosoms zu enthalten). Somit kann die Hybridisierung einer Probe, die zu einem bestimmten Teil eines Chromosoms homolog ist, verwendet werden, um Veränderungen in einem Teil eines Chromosoms festzustellen.
Der Begriff „Sequenzen, die mit einem Chromosom assoziiert sind" meint die Präparierung von Chromosomen (z.B. Spreads von Metaphasenchromosomen), Nukleinsäuren, die von einer Probe, die chromosomale DNA enthält, extrahiert wurde (z.B. Präparationen von genomischer DNA); RNA, die durch Transkription von Genen, die auf einem Chromosom liegen, hergestellt wurde (z.B. hnRNA und mRNA) und cDNA-Kopien der RNA, die von der DNA, die auf einem Chromosom lokalisiert ist, transkribiert wurde. Sequenzen, die mit einem Chromosom assoziiert sind, können durch eine Vielzahl an Techniken detektiert werden, einschließlich der Untersuchung mittels Southern und Northern blots und in situ Hybridisierung auf RNA, DNA oder Metaphasenchromosomen mit Proben, die Sequenzen aufweisen, die homolog zu den Nukleinsäuren der oben gelisteten Präparationen sind.
Der Begriff „codierende Region", wie hier verwendet, wenn er in Bezug auf ein strukturelles Gen verwendet wird, bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die Aminosäuren codieren, die in dem heranreifenden Polypeptid als Ergebnis der Translation eines mRNA-Moleküls gefunden wurden. Die codierende Region wird in Eukaryoten an der 5'-Seite durch das Nukleotidtriplet „ATG", das den Initiator Methionin codiert und auf der 3'-Seite durch eines der drei Triplets, welche die Stopcodons spezifizieren (d.h. TAA, TAG, TGA), begrenzt.
Der Begriff „gereinigt" oder „zu reinigen", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Entfernung von Kontaminanten aus einer Probe. Zum Beispiel werden Nukleinsäuren, die in einer Probe (z.B. Blut oder Serum) enthalten sind, durch die Entfernung von kontaminierenden Proteinen und kleinen Molekülen; die in der Probe enthalten sind, gereinigt. Nukleinsäuren können durch jegliche geeignete Methode gereinigt werden.
Der Begriff „rekombinantes DNA-Molekül", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das aus DNA-Segmenten besteht, die mittels molekularer biologischer Techniken miteinander verbunden sind.
Der Begriff „Teil", wie hier verwendet, wenn er in Bezug auf eine Nukleotidsequenz verwendet wird (wie in „ein Teil einer gegebenen Nukleotidsequenz"), bezieht sich auf Fragmente dieser Sequenz. Die Fragmente können eine Größe von vier Nukleotiden bis zu der gesamten Nukleotidsequenz minus einem Nukleotid aufweisen.
Der Begriff „rekombinantes Protein" oder „rekombinantes Polypeptid", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Proteinmolekül, das von einem rekombinanten DNA-Molekül expressiert wird.
Der Begriff „natives Protein" wird hier verwendet, um darauf hinzuweisen, dass ein Protein keine Aminosäurereste enthält, die durch Vektorsequenzen codiert werden; d.h. das native Protein enthält nur solche Aminosäuren, die das Protein, wie es in der Natur vorkommt, enthält. Ein natives Protein kann durch rekombinante Mittel oder aus einer natürlich vorkommenden Quelle hergestellt werden.
Der Begriff „Teil", wie hier verwendet, wenn er in Bezug auf ein Protein verwendet wird (wie in „ein Teil eines gegebenen Proteins"), bezieht sich auf Fragmente dieses Proteins. Die Fragmente können eine Größe von vier Aminosäureresten bis zu der gesamten Aminosäuresequenz minus einer Aminosäure aufweisen.
Der Begriff „Southern Blot" bezieht sich auf die Analyse von DNA in Agarose- oder Acrylamid-Gelen, um die DNA entsprechend ihrer Größe zu fraktionieren, gefolgt von einer Übertragung der DNA aus dem Gel auf eine feste Unterlage, beispielsweise auf eine Nitrocellulose- oder eine Nylonmembran. Die immobilisierte DNA wird dann mit einer markierten Probe markiert, um DNR-Spezien zu detektieren, die komplementär zu der verwendeten Probe sind. Die DNA kann vor der Elektrophorese mit Restriktionsenzymen geschnitten werden. Nach der Elektrophorese kann die DNA teilweise depurinisiert und denaturiert werden, bevor oder während sie auf die feste Oberfläche übertragen wird. Southern Blots sind das Standardhilfsmittel für Molekularbiologen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Seiten 9.31-9.58 [1989]).
Der Begriff „Northern Blot", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Analyse von RNA mittels Elektrophorese von RNA in Agaraose-Gelen, um die RNA entsprechend ihrer Größe zu fraktionieren, gefolgt von dem Transfer der RNA aus dem Gel auf eine feste Unterlage, beispielsweise auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran. Die immobilisierte RNA wird dann mit einer markierten Probe behandelt, um RNA-Spezien zu detektieren, die komplementär zu der verwendeten Probe sind. Northern blots sind Standardhilfsmittel für Molekularbiologen (Sambrook et al., supra, Seiten 7.39-7.52 [1989]).
Der Begriff „Western Blot" bezieht sich auf die Analyse eines Proteins oder von Proteinen (oder Polypeptiden), die auf einer Unterlage, z.B. auf Nitrocellulose oder einer Membran, immobilisiert sind. Die Proteine werden in einem Acrylamid-Gel laufen gelassen, um die Proteine zu separie ren, gefolgt von dem Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine feste Unterlage, beispielsweise auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran. Die immobilisierten Proteine werden dann Antikörpern ausgesetzt, die gegenüber den Antigenen von Interesse reaktiv sind. Die Bindung der Antikörper kann mittels verschiedener Methoden, einschließlich der Verwendung radiomarkierter Antikörper, detektiert werden.
Der Begriff „antigene Determinante", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Teil eines Antigens, welcher den Kontakt mit einem bestimmten Antikörper bereitstellt (d.h. ein Epitop). Wenn ein Protein oder ein Fragment eines Proteins für die Immunisierung eines Wirtstiers verwendet wird, können viele Regionen des Proteins die Produktion des Antikörpers induzieren, der spezifisch an eine gegebene Region oder dreidimensionale Struktur an dem Protein bindet; diese Regionen oder Strukturen werden als antigene Determinanten bezeichnet. Eine antigene Determinante kann mit dem intakten Antigen (d.h. das „Immunogen", das verwendet wird, um die Immunantwort hervorzurufen) um die Bindung an den Antikörper konkurrieren.
Der Begriff „Transgen", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein fremdes Gen, das in einen Organismus mittels Einführung des fremden Gens in gerade fertilisierte Eier oder frühe Embryonen eingeführt wurde, verbracht ist. Der Begriff „fremdes Gen" bezieht sich auf jegliche Nukleinsäure (z.B. eine Gensequenz), die in das Genom eines Tieres durch experimentelle Manipulationen eingeführt wurde, und kann Gensequenzen einschließen, die in dem Tier gefunden wurden, solange wie das eingeführte Gen nicht in dem selben Bereich liegt, in dem das natürlich vorkommende Gen lokalisiert ist.
Der Begriff „Vektor", wie hier verwendet, wird in Bezug auf ein Nukleinsäuremoleküle verwendet, die ein DNA-Segment oder DNA-Segmente von einer Zelle zu einer anderen übertragen. Der Begriff „Vehikel" wird manchmal austauschbar mit „Vektor" verwendet.
Der Begriff „Expressionsvektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine gewünschte codierende Sequenz und geeignete Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression der operabel verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind, aufweist. Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression in Prokaryoten üblicherweise notwendig sind, schließen einem Promotor, einen (optionalen) Operator und ein Ribosomenbindungssite, oft in Verbindung mit anderen Sequenzen, ein. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntermaßen Promotoren, Enhancer, Terminierungs- und Polyadenylisierungssignale.
Die Begriffe „Überexpression" und „überexprimierend" und grammatikalische Äquivalente beziehen sich auf die Transkription und Translation eines Gens. Eine solche Transkription und Translation kann in vivo oder in vitro stattfinden.
Der Begriff „Transfektion", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Einführung von fremder DNA in eukaryotische Zellen. Die Transfektion kann mit einer Vielzahl an Mitteln vollendet werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, einschließlich der Kalziumphosphat-DNA-Coprecipitation, DEAE-Dextran-vermittelten Transfektion, der Polybrene-vermittelten Transfektion, der Elektroporati on, der Mikroinjektion, der Liposomenfusion, der Lipofektion, der Protoplastenfusion, der retroviralen Infektion und der Biolistik.
Der Begriff „stabile Transfektion" oder „stabil transfiziert" bezieht sich auf die Einführung und Integration fremder DNA in das Genom einer transfizierten Zelle. Der Begriff „stabiler Transfektant" bezieht sich auf eine Zelle, die fremde DNA in die genomische DNA stabil integriert hat.
Der Begriff „transiente Transfektion" oder „transient transfiziert" bezieht sich auf die Einführung von fremder DNA in eine Zelle, wobei die fremde DNA sich nicht in das Genom der transfizierten Zelle integriert. Die fremde DNA hält sich in dem Kern der transfizierten Zelle über einige Tage. Während dieser Zeit unterliegt die fremde DNA der regulatorischen Kontrolle, die die Expression der endogenen Gene in den Chromosomen bestimmt. Der Begriff „transienter Transfektant" bezieht sich auf Zellen, die fremde DNA aufgenommen haben, diese DNA jedoch nicht integriert haben.
Der Begriff „Kalziumphosphat-Coprecipitation" bezieht sich auf eine Technik für die Einführung von Nukleinsäuren in eine Zelle. Die Aufnahme der Nukleinsäuren durch die Zelle wird verstärkt, wenn die Nukleinsäure als Kalziumphosphat-Nukleinsäurecoprecipitat vorliegt. Die ursprüngliche Technik von Graham und Var Der Eb (Graham und Van Der Eb, Virol., 52: 456 [1973]) wurde durch verschiedene Gruppen modifiziert, um die Bedingungen für bestimmte Zelltypen zu optimieren. Aus dem Stand der Technik sind diese vielzähligen Modifikationen bekannt.
Eine „Zusammensetzung enthaltend eine gegebene Polynukleotidsequenz", wie hier verwendet, bezieht sich im weitesten Sinne auf jegliche Zusammensetzung, die die gegebene Polynukleotidsequenz enthält. Die Zusammensetzung kann eine wässrige Lösung beinhalten. Zusammensetzungen, die Polynukleotidsequenzen enthalten, die ein Polypeptid oder Fragmente davon codieren, können als Hybridisationsproben verwendet werden. In diesem Fall werden die Polynukleotidsequenzen typischerweise als wässrige Lösung enthaltende Salze (z.B. NaCl), Detergens (z.B. SDS) und andere Komponenten (z.B. Denhardt's Lösung, Trockenmilch, Salmon Spermium DNA, etc.) verwendet.
Der Begriff „perioperativ", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Zeitpunkt rund um eine chirurgische Operation. Der Begriff schließt die Zeit vor, während und nach einer „chirurgischen Operation" ein. Die „perioperative" Zeit beginnt, wenn der chirurgische Eingriff als erstes in Betracht gezogen wird (z.B. wenn der Patient für den chirurgischen Eingriff geplant wird) und endet, wenn die Erholung von dem chirurgischen Eingriff abgeschlossen ist (z.B. wenn die Dienstleistungen eines behandelnden Arztes nicht länger erforderlich sind).
Der Begriff „chirurgischer Eingriff" und die verbundenen Begriffe „chirurgisch", „chirurgische Operation" oder „chirurgische Intervention", wie hier verwendet, beziehen sich auf jegliche medizinische Prozedur, die einen Schnitt in ein Gewebe involviert.
Der Begriff „prä-chirurgisch", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Zeit unmittelbar vor dem chirurgischen Eingriff. Die „prä-chirurgische" Zeit wird üblicherweise für die Vorbereitung des Subjekts auf den chirurgischen Eingriff verwendet. Während der „prä-chirurgischen" Zeit können die relevanten Tests und Screens durchgeführt werden. Es ist nicht vorgesehen, dass die „prä-chirurgische" Zeit auf einen spezifischen Zeitrahmen vor dem chirurgischen Einschnitt beschränkt ist. In einigen Fällen ist die Prä-Chirurgie jeglicher Zeitrahmen von einigen Stunden bis einige Minuten vor dem chirurgischen Eingriff (z.B. im Falle eines dringenden chirurgischen Eingriffs oder einer Notsituation). In anderen Fällen kann die „prä-chirurgische" Zeit einige Tage oder Wochen vor dem chirurgischen Eingriff sein (im Falle eines nicht-notfall operativen Eingriffes oder eines gewählten operativen Eingriffes).
Der Begriff „medizinische Prozedur", wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliche klinische oder diagnostische Prozedur, die durch einen medizinisch Praktizierenden durchgeführt werden kann (z.B. einschließlich einem Arzt oder medizinischen Assistenten, einer Krankenschwester oder einem Tierarzt, ohne auf diese beschränkt zu sein).
Der Begriff „invasiver chirurgischer Eingriff", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine „chirurgische Prozedur", die einen umfangreichen Schnitt erfordert. Die invasive Chirurgie erfordert häufig eine „Vollnarkose". Der Begriff „nicht-invasive Chirurgie", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine „chirurgische Prozedur", die einen minimalen Schnitt erfordert. Die „nicht-invasive Chirurgie" wird häufig unter „regionaler Narkose" oder „lokaler Narkose", begleitet mit einer Beruhigung des Bewusstseins, durchgeführt. Die „nicht-invasive Chirurgie" wird häufig als ambulante Prozedur durchgeführt.
Der Begriff „Anästhetikum", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Medikation, die einen reversiblen Verlust der Sinneseindrücke verursacht. „Anästhetika" verursachen manchmal einen vorübergehenden Verlust des Bewusstseins und Paralyse. „Anästhetika" werden häufig während der „Chirurgie" verwendet, um Schmerzen zu unterdrücken.
Der Begriff „lokale Betäubung", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Betäubung, die einen Teil des Körpers betäubt (ohne einen anderen Teil des Körpers zu beeinflussen) über einen kurzen Zeitraum. Wenn eine „lokale Betäubung" einem Subjekt verabreicht wird, so bleibt dem Subjekt üblicherweise das Bewusstsein erhalten. Beispiele für „lokale Anästhetika" schließen Bupivacaine und Lidocaine ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Begriff „regionale Betäubung", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Betäubung, die einen Teil des Körpers betäubt (ohne einen anderen Teil des Körpers zu ergreifen) für bis zu einige Stunden. Wenn die „regionale Betäubung" einem Subjekt verabreicht wird, behält das Subjekt üblicherweise sein Bewusstsein. Beispiele für „regionale Betäubung" schließen beispielsweise die auf die Wirbelsäule oder epidoral bezogene Verabreichung ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Der Begriff „Vollnarkose", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Narkose, die den gesamten Körper während des „chirurgischen Eingriffs" betäubt. Die „Vollnarkose" wird üblicherweise kontinuierlich (z.B. intravenös oder tracheal) während der Prozedur verabreicht. Wenn die „Vollnarkose" einem Subjekt verabreicht wird, bleibt dem Subjekt üblicherweise nicht das Bewusstsein erhalten. Des Weiteren erfordert die „Vollnarkose" oftmals eine künstliche Beatmung (z.B. Intubation).
Der Begriff „genomisch", wie hier verwendet, bezieht sich auf den genetischen Aufbau eines „Subjekts" (d.h. sein Genom oder seine Gene). Ein „genomisches Profil" bezieht sich zum Beispiel auf ein Set an Informationen über die Gene eines gegebenen „Subjekts" (z.B. das Vorhandensein oder das Fehlen eines spezifischen Sets an Mutationen oder „SNPs"). Der Begriff „perioperatives genomisches Profilieren", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein „genomisches Profil", das während des „perioperativen" Zeitintervalls erhalten wurde.
Der Begriff „pharmakologischer Stoff", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Zusammensetzung (z.B. ein anorganisches Molekül oder ein Protein), das einen physiologischen Effekt oder eine „pharmakologische Antwort" hat. Ein Beispiel für einen „pharmakologischen Stoff" ist ein Arzneimittel oder eine Medikation. Der Begriff „pharmakodynamisches Risiko", wie hier verwendet, bezieht sich auf das Risiko auf eine klinische Antwort einer anormalen Abweichung auf einen „pharmakologischen Stoff" bei einem „Subjekt". Der Begriff „pharmakokinetisches Risiko", wie hier verwendet, bezieht sich auf das Risiko einer anormalen Aufnahme, Metabolisierung (z.B. keine Verwertung oder zu schnelle Verwertung), Verteilung und Ausscheidung eine s „pharmakologischen Stoffes" bei einem „Subjekt".
Der Begriff „präsymptomatische Diagnose", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Diagnose einer medizinischen Krankheit vor der Manifestierung der Symptome. In ei nigen Fällen diagnostiziert die „präsymptomatische Diagnose" eine genetische Krankheit oder Veranlagung.
Der Begriff „differentielle Diagnose", wie in „differentielle Diagnose von symptomatischen Krankheiten", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Unterscheidung von mehreren Krankheiten, die vom äußeren Erscheinungsbild her ähnlich sind (z.B. die dieselben Anzeichen oder Symptome haben), denen jedoch unterschiedliche Gründe zu Grunde liegen und die folglich auch unterschiedliche Eingriffe erfordern.
Der Begriff „koexistierende Krankheit", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Krankheit, gegen die eine „medizinische" oder „chirurgische" Prozedur nicht gerichtet ist, die jedoch in Bezug auf verschiedene Aspekte relevant sein kann (z.B. die Verabreichung der Narkose oder des Analgetikums) während einer gegebenen „medizinischen" oder „chirurgischen" Prozedur.
Der Begriff „Auswahl einer medizinischen Behandlungsmethode", oder im Falle eines „chirurgischen Eingriffs", „Auswahl einer chirurgischen Behandlungsmethode", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Versorgung während einer gegebenen „medizinischen" oder „chirurgischen" Prozedur und schließt die Auswahl des „pharmakologischen Stoffes", der Art des „Anästhetikums" oder der Art des „chirurgischen Eingriffs" ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Der Begriff „Marker", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Referenzpunkt (z.B. ein Punkt auf einem Chromosom) zur Feststellung einer Änderung oder einer Mutation (z.B. einer Nukleotidänderung). Der Begriff „geneti scher Marker", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Punkt (z.B. auf einem Chromosom oder einer viralen Nukleinsäure, oder einer mitochondrialen Nukleinsäure), bei dem eine Veränderung (z.B. eine Mutation oder ein Polymorphismus) eine genotypische oder phenotypische Veränderung verursacht. Ein Beispiel für einen „genetischen Marker" ist ein „SNP".
Die Begriffe „SNP", „SNPs" oder „Einzelnukleotidpolymorphismus", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Einzelbasenpaarveränderung an einem spezifischen Ort in dem Genom von einem Organismus (z.B. eines Menschen). „SNPs" können in dem Teil eines Genoms vorliegen, der nicht für ein Gen codiert. Alternativ dazu kann ein „SNP" in der codierenden Region eines Gens vorliegen. In diesem Fall kann der „SNP" die Struktur und Funktion des Proteins, in welchem er vorliegt, ändern. In einigen Fällen kann ein „SNP" die Antwort eines Individuums in Bezug auf eine medizinische Prozedur oder einen medizinischen Eingriff beeinflussen (z.B. die Antwort auf ein Anästhetikum oder eine Schmerzmedikation). Die Lage und Sequenzen vieler „SNPs" sind in öffentlichen Datenbanken verfügbar (siehe z.B. NCBl's dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)), genauso wie in privaten Datenbanken.
Der Begriff „Assay", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Methode zur Detektierung eines „genetischen Markers". In einem Assay können ein oder mehrere „genetische Marker" (z.B. „SNPs") detektiert werden. Einige Assays können ein „genomisches Profil" generieren.
Der Begriff „Probe", wie hier verwendet, wird im weitesten Sinne verwendet. In einem Sinne kann es sich auf Gewebe- oder Nukleinsäureproben beziehen. In einem anderen Sinne fallen darunter Proben oder Kulturen, die von irgendeiner Quelle erhalten wurden. Biologische Proben können von Tieren (einschließlich Menschen) erhalten werden und schließen Flüssigkeiten, Feststoffe, Gewebe und Gase ein. Biologische Proben schließen Blutprodukte, beispielsweise Plasma, Serum und dergleichen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Eine „Probe" kann ebenfalls eine genetische Information sein. Zum Beispiel die Sequenzdaten eines Subjektes, die auf einem Datenträger (z.B. einer Diskette) gespeichert sind. Diese Beispiele sind nicht so auszulegen, dass sie die Probentypen, die für vorliegende Erfindung geeignet sind, limitieren.
Der Begriff „Subjekt", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Tier (z.B. einen Menschen) der einer „medizinischen" oder „chirurgischen" Prozedur unterzogen wird. Ein „Subjekt" kann ein Mensch oder ein nicht-menschliches Tier sein.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Zusammensetzungen für das perioperative genomische Screening bereit. In einigen Ausführungsformen ist das genomische Screening für die Untersuchung auf Mutationen und Polymorphismen in Bezug auf das Risiko auf Narkose-bezogene Komplikationen bei einem Subjekt ausgelegt. In anderen Ausführungsformen ist die perioperative genomische Untersuchung für die Untersuchung spezifischer Mutationen oder Polymorphismen ausgelegt, die für andere Arten der Chirurgie, der chirurgischen Behandlungen und chirurgischen Prozeduren relevant sind, einschließlich, jedoch nicht auf diese be schränkt, der Herzchirurgie (z.B. Angioplastie, Bypass), der Gehirnchirurgie, der Abdominalchirurgie (z.B. Nieren- oder Leberverpflanzungen), der Brustamputation, der Knochenmarktransplantation, der Blasenchirurgie, der Darmchirurgie (z.B. der Dickdarm- oder Eingeweidechirurgie), der Lungenchirurgie, der Wirbelsäulenchirurgie, der kosmetischen und wiederherstellenden Chirurgie, der Gallenblasenchirurgie, der orthopädischen Chirurgie und der pädiatrischen Chirurgie (aller Typen). Dem Fachmann des Standes der Technik ist verständlich, dass die vorliegende Erfindung auch perioperative genomische Profile für weitere chirurgische Techniken umfasst, neben den vorgenannten aufgelisteten.
Die Marker für die Einbeziehung in die perioperativen genomischen Profile werden auf Grundlage spezifischer Kriterien ausgewählt. Es sollten die Sequenzen der Mutation oder des Polymorphismusses, genauso wie der klinische Erfolg des Tragens eines mutanten Alleles bekannt sein. In bevorzugten Ausführungsformen werden solche Marker ausgewählt, für die derzeit keine alternativen diagnostischen Untersuchungen zur Verfügung stehen oder wo der zur Verfügung stehende Test für ein perioperatives Screening ungeeignet ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden Marker ausgewählt, für welche die klinische Behandlungsmethode in Abhängigkeit von der Antwort auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation oder eines Polymorphismusses geändert werden kann.
Nach der Auswahl der Marker für die Verwendung in einem gegebenen genomischen Profil wird ein Assay für die Detektierung bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen ist der Assay ein Direktsequenzassay. In anderen Ausfüh rungsformen ist der Assay ein Fragmentlängenpolymorphismusassay. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Assay ein Hybridisierungsassay. In einigen bevorzugten Ausführungsformen in der Assay ein Hybridisierungsassay, bei dem die Detektierung durch enzymatische Mittel stattfindet. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der Assay ein MALDI-TOF-Massenspectrophotometrischer Assay. Jedoch können die genomischen Profile der vorliegenden Erfindung mit jeglicher Detektionsmethode verwendet werden, die in der Lage ist, spezifische Sequenzen zu detektieren, und kann für Detektionsmethoden verwendet werden, die in der Zukunft entwickelt werden, welche ihre Grundlage in der Nukleinsäurenhybridisierung haben, oder auch nicht. In einigen Ausführungsformen ist der Prozess der Markerauswahl, der Durchführung des Detektionsassays und die Verteilung der Daten auf die Subjekte und Ärzte durch ein integriertes elektronisches (z.B. Web-basiertes) System organisiert.
I. Auswahl der Marker für das genomische Profil
Um die perioperativen genetischen Profile der vorliegenden Erfindung zu generieren, werden als erstes die Marker für die Einbeziehung in das Profil ausgewählt. Die Sequenz der Marker sollte bekannt sein. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Marker Mutationen in gegebenen Genen, von denen ein damit verbundener Phenotyp bekannt ist. Große Mengen an Sequenzdaten und bekannten Mutationen oder Polymorphismen sind bekannt und zugänglich. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Marker in Bezug auf ihre Verwendbarkeit zur Bereitstellung der Informationen, die für die perioperative Versorgung relevant sind, ausgewählt.
A. Sequenzdaten
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die genetischen Markern Einzelnukleotidpolymorphismen („SNPs"). Bekannte SNPs sind aus privaten und öffentlichen Datenbanken (siehe oben) bekannt. In anderen Ausführungsformen sind die Marker Mutationen (z.B. Nukleotiddeletionen oder -insertionen). In einigen Ausführungsformen stellen die Marker Splice-Varianten dar. In anderen Ausführungsformen stellen die Marker Mutationen in der mitochondrialen DNA dar.
Zusätzlich zu den bekannten SNPs sind eine Vielzahl an Nukleotidsequenzinformationen bekannt, die Wildtyp- und Mutanten-Allele einer großen Anzahl von Genen beschreiben, die in öffentlichen Datenbanken zur Verfügung stehen, ohne auf diese begrenzt zu sein, zum Beispiel DbEST (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/dbES); EBI/EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ mutations); EBI (http://www.ebi.ac.uk/ebi_home.html); EMBL (http://www.ebi.ac.uk/queries/queries.html); GDB (http:// www.gdb.org/gdb/gdbtop.html); GeneCards (http://bio informatics.weizmann.ac.il/cards/index.html); GeneClinics (http://www.geneclinics.org); Genethon (http://www.gene thon.fr/genethon_en.html); GSDB (http://www.ncgr.org); HGP (http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html); Human Gene Mutation Databoase (http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/ mg/search); NCBl (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); OMIM (htt p://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/); PubMed (http://www.ncbi. nhn.nih.gov/PubMed/); Research Tools (NCBl) (http://www. ncbi.nhn.nih.gov/SCIENCE96/ResTools.html); RHdb (http:// www.ebi.ac.uk/RHdb); Stanford Human Genome Center (http:// www.shgc.standford.edu/); HUGO (http://www.gene.ucl.ac.ukl hugo); TIGR (http://www.tigr.org/); The National Human Genome Research Institute (http://www.nhgri.nih.gov/); The Whitehead Institute Center for Genome (http://www.genome. wi.mit.edu/); Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/ index.html); University of Oklahoma (http://www.dnal.chem. ou.edu/index.html); und WEHI (http://www.wehih.wehi.edu.au/ srs/srsc/). Dem Fachmann des Standes der Technik ist verständlich, dass die Nukleotidsequenzdaten ebenfalls von weiteren Quellen erhalten werden können, die öffentliche und private Datenbanken, genauso wie experimentelle Quellen einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein.
B. Kriterien für die Auswahl der Marker
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die genetischen Marker, die für das perioperative genomische Profil ausgewählt sind, für eine spezifische medizinische oder chirurgische Prozedur maßgeschneidert. Die Auswahl der Marker basiert auf verschiedenen Kriterien, und schließt die analytische Validität, die klinische Validität, den klinischen Nutzen und den kommerziellen Wert ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Marker in Bezug auf ihre analytische Validität (d.h. die Detektionsgenauigkeit bei Verwendung einer bestimmten Detektionstechnik) ausgewählt. Die Marker werden ebenfalls basierend auf ihrer klinischen Validität oder ihrem vorhersehbaren Effekt ausgewählt (z.B. sagt ein Marker genau die Antwort auf einen spezifischen Aspekt oder eine spezifische Behandlung des Subjekts voraus). Die Sequenz und alle Mutationen oder Polymorphismen, die untersucht werden sollen, sollten zur Verfügung stehen. Bei Markern mit vielzähligen SNPs oder Mutationen sollte der phenotypische Effekt jeder Nukleotidänderung vorzugsweise bekannt sein. Vorzugsweise werden des Weiteren solche Marker ausgewählt, für die es nicht möglich ist, eine Prädisposition zu bestimmen (z.B. kann diese nicht kostengünstig oder effizient bestimmt werden) mittels alternativer Detektionsmittel, beispielsweise einer medizinischen Vorgeschichte, einer körperlichen Untersuchung oder eines nicht-genomischen Assays.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Marker ausgewählt, für die eine alternative Behandlung einen geringen oder keinen Kosteneffekt hat oder für das Subjekt unzweckmäßig ist. Somit werden Marker ausgewählt, für die weder ein falsch negatives Ergebnis (die ursprüngliche Behandlung wird durchgeführt und der Patient ist in keiner schlimmeren Situation, gegenüber der Situation, wenn der Assay nicht stattgefunden hätte) noch ein falsch positives Ergebnis (die alternative Behandlung verursacht äquivalente Kosten und Risiken im Vergleich zu der ursprünglichen Behandlung) einen nachteiligen Effekt auf das resultierende Ergebnis bei dem Subjekt haben.
In einigen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil zwei oder mehr Marker ein. In anderen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil fünf oder mehr Marker ein. Ein einigen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil 10 oder mehr Marker ein. In einigen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil 20 oder mehr Marker ein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil 50 oder mehr Marker ein. In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil 100 oder mehr Marker ein. Der Nutzen des Assays wird jedoch primär durch das Vorher sageergebnis der individuellen Marker oder Kombination von Markern bestimmt und nicht durch die Quantität der verwendeten Marker.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden Marker ausgewählt, die eine Information bereitstellen, die für die Änderung der Behandlungsmethode verwendet werden kann (d.h. die Marker haben klinischen Nutzen). Wenn zum Beispiel bei einem Subjekt gefunden wird, dass es eine Veranlagung hat, auf eine oder verschiedene Arzneimittel schlecht zu reagieren, die während einer chirurgischen Prozedur gegeben werden, so kann der Arzt ein alternatives Arzneimittel auswählen. Von besonderem Nutzen sind Marker für die Vorhersage, für welche eine alternative Behandlung, die in Bezug auf die Kosten und die Bequemlichkeit der Verabreichung äquivalent sind, substituiert werden können, so dass Leben gerettet werden können und die Anzahl der teuren lebenserhaltenden Traumas verringert werden können (z.B. hat der zu verwendende gegebene Marker einen zusätzlichen kommerziellen Wertvorteil). Des Weiteren werden Marker ausgewählt, für die ein negatives Ergebnis (z.B. das Fehlen einer zu Grunde liegenden Krankheit) einen klinischen Nutzen hat (z.B. Hilfe in der differentiellen Diagnose einer Krankheit).
In einigen Ausführungsformen wird die Hinzufügung oder die Wegnahme von Markern für das genomische Profil experimentell bestimmt. Wenn zum Beispiel festgestellt wird, dass ein Marker nicht mit der Antwort des Subjekts auf eine gegebene Komponente einer Behandlung korreliert, so wird der Marker weggenommen. Der Einschluss von neuen Markern kann ebenfalls empirisch bestimmt werden. Wenn zum Beispiel ein Marker gefunden wird, der eine gute Vorhersageeigen schaft hat, sei es alleine oder in Kombination mit anderen Markern, so wird dieser Marker dem genomischen Profil zugefügt.
C. Kategorien von Markern
In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden Marker eingeschlossen, die die Messung des pharmakogenetischen Risikos eines Subjekts (die Antwort auf eine pharmakologische Zusammensetzung) erlauben. In einigen Ausführungsformen werden Marker für ein pharmakodynamisches Risiko (eine Antwort von unnormaler Stärke, die durch einen pharmakologischen Stoff ausgelöst wurde; z.B. maligne Hyperthermie in Antwort auf ein Anästhetikum oder Bronchospasm, die durch eine unnormale β1 adrenergische Rezeptorantwort auf ein β1 Agonisten ungemindert ist) in das perioperative genomische Profil eingeschlossen. In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden Marker in das perioperative genomische Profil eingeschlossen, die für ein Subjekt die pharmakokinetische Antwort vorhersagen (abnormale Adsorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung des Arzneimittels, was zu einer Überdosis oder einer fehlenden Wirksamkeit eines Arzneimittels führen kann; z.B. Cytochrom P450 Mutationen, die den Metabolismus einer Vielzahl an Arzneimitteln beeinflussen).
In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden Marker mit diagnostischem Nutzen in das perioperative genomische Profil eingeschlossen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden Marker in das perioperative genomische Profil eingeschlossen, die vorexistierende, jedoch nicht symptomatische Krankheiten identifizieren, welche für die chirurgische Prozedur relevant sind (z.B. langes QT-Syndrom oder das Sichelzellenmerkmal, die sich nach einem chirurgischen Eingriff manifestieren können).
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind Marker eingeschlossen, die die differentielle Diagnose von symptomatischen Krankheiten, die vom äußeren Erscheinungsbild einander ähneln, jedoch unterschiedliche Behandlungen während des chirurgischen Eingriffs erfordern, etablieren. Beispiele hierfür sind die Klassen der zyklischen Paralyse oder Typen von Porphyrie, ohne auf diese beschränkt zu sein.
In einigen Ausführungsformen schließt der perioperative Screeningassay Marker ein, die auf die spezifische chirurgische Prozedur, die durchgeführt wird, zugeschnitten sind (z.B. Transplantatempfänger, Herzchirurgie oder routinemäßige ambulante Chirurgie). In einigen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil Marker ein, die für ein Subjekt in einer bestimmten Gruppe (z.B. in Bezug auf das Alter, den ethnischen Hintergrund oder das Geschlecht) einzigartig sind.
In einigen Ausführungsformen sind in das genomische Profil Marker eingeschlossen, die Haplotypen oder die natürliche Variante eines Genes sind, das für eine gegebene Gruppe von Subjekten einzigartig ist (z.B. eine Familie von Blutsverwandten). Eine Haplotypen sagen die Antwort auf einen gegebenen pharmazeutischen Stoff voraus (z.B. das Fehlen einer Antwort auf ein gegebenes Arzneimittel).
In einigen Ausführungsformen sind zusätzliche Marker eingeschlossen, die nicht für die chirurgische Prozedur, die durchgeführt wird, spezifisch sind, jedoch den allge meinen Erfolg des chirurgischen Eingriffes und der damit in Zusammenhang stehenden Prozeduren vorhersagen. Beispiele hierfür, ohne auf diese beschränkt zu sein, sind Marker für die Aminoglycosidototoxizität, APO_ε4, Wundcytokine, Sepsisrisiko (TNF_α), Blutgruppen, Coagulationsfaktoren und das Thromboserisiko. In einigen Ausführungsformen schließt der perioperative Screeningassay andere Tests ein, die keinen Bezug zu den genomischen Profil für die hauptsächliche chirurgische Anwendung haben, jedoch in dem Fall relevant sind, wenn es zu einer Komplikation kommt, die einen Notfalleingriff erfordert (z.B. die Blutgruppenbestimmung). In einigen Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil einen einzigartigen genomischen Identifikator ein (z.B. eine Serie von polymorphen nicht codierenden SNPs), wodurch eine sichere, exakte interne Referenz für die Archivierung und Verarbeitung der genetischen Daten, die spezifisch für das bestimmte Objekt sind, bereitgestellt wird.
D. Anwendungen und Verwendungen von spezifischen Markern
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein genomisches Profil für das perioperative Screening einer Antwort auf eine Narkose (Vollnarkose, regionale oder lokale Narkose) bei einem Subjekt generiert. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Marker so ausgewählt, dass sie nicht nur die Vorhersage einer Antwort eines Subjektes auf eine bestimmte Narkose erlauben, sondern ebenfalls für bekannte oder unbekannte vorexistierende Krankheiten, die die Antwort eines Subjekts auf eine bestimmte Narkose oder Medikation, die in Verbindung mit der Narkose gegeben wird, beeinflussen kann. In einigen bevorzugten Ausführungsformen schließt das genomische Profil zu sätzlich Marker ein, die auf die spezifische chirurgische Prozedur, die durchgeführt wird, zugeschnitten sind.
In bevorzugten Ausführungsformen, bei denen das perioperative Screening auf Narkoseantworten involviert ist, werden die Marker in Bezug auf ihre Antworten auf spezifische Narkosen oder Arzneimittel, die zusammen mit der Narkose verabreicht werden (z.B. Muskelentspannungsmittel oder Schmerzmedikationen) ausgewählt. In einigen Ausführungsformen sind Marker für Mutationen in dem BChE-Gen für das perioperative genomische Profil eingeschlossen. Marker, die BChE-Defizienzen vorhersagen, sind bekannt (siehe z.B. La Du et al., Cell. and Molec. Neurobiol., 11: 79 [1991]). Der einzig verfügbare Assay für BChE ist ein biochemischer Assay, welcher zu zeitaufwendig und teuer ist, um in einem routinemäßigen perioperativen Screening verwendet zu werden. Des Weiteren können bei einem Subjekt, für welches ein vorhersehbarer Marker für die BChE-Defizienz gefunden wurde, leicht durch alternative Arzneimittel ohne zusätzliche Kosten oder Unbequemlichkeiten ersetzt werden.
In einigen Ausführungsformen sind Marker für debrisoquine Metabolismus (z.B. Cytochrom P450)-Defekte in das perioperative genomische Profil eingeschlossen. Es ist beschrieben, dass für Defekte in dem CYP2D6-Gen bekannt ist, dass sie die Pharmakokinetiken verschiedener Arzneimittel stören (siehe z.B. Sachse et al., Am. J. Hum. Genet., 60: 284 [1997]). Die derzeitigen biochemikalischen Assays für CYP2D6-Mutationen sind zu teuer und zu unbequem, um in das perioperative Screening eingeschlossen zu werden. Wenn die Prädisposition eines Subjektes in Bezug auf einen gestörten oder beschleunigten P450 Metabolismus bekannt ist, so können die nachteiligen Arzneimittelreaktionen leicht durch die Substituierung mittels anderen Medikationen oder Dosisanpassungen vermieden werden.
Des Weiteren beziehen sich die Marker in einigen Ausführungsformen auf weitere Defekte, die im Zusammenhang mit dem Arzneimittelmetabolismus stehen, und schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Anfälligkeit für die Stickstoffoxidtoxizität oder Homocysteinemie, die Stickstoffoxid-assoziiert ist (z.B. Mutationen in der Cystathion-β-Synthase, MTHFR und Methionin-Synthase-Genen), die ebenfalls in das perioperative genomische Profil eingeschlossen sind. In einigen Ausführungsformen erlauben die Marker Subjekte mit zu Grunde liegenden Krankheiten zu identifizieren, die die Aussage erlauben, dass diese wahrscheinlich schlecht auf die Narkose reagieren und in das perioperative genomische Profil eingeschlossen sind. In einigen Ausführungsformen sind zum Beispiel Marker für die maligne Hyperthermie (MH) in das genomische Profil eingeschlossen. Aus dem Stand der Technik sind Mutationen, die MH vorhersagen können, bekannt (siehe z.B. Vladutiu et al., Am. J. Hum. Genet., 29: A5 [1998]; Monnier et al., Am. J. Hum. Genet., 60: 1316 [1997]). Des Weiteren ist der einzig verfügbare diagnostische Test auf MH ein teurer in vitro Kontraktur-Test, der eine Muskelprobe erfordert (siehe z.B. Brandt et al., Hum. Mol. Genet., 8: 2055 [1999]). Des Weiteren stehen wirksame alternative Behandlungsmethoden zur Vorbeugung von MH zur Verfügung. Wenn bei einem Subjekt ein Marker gefunden wird, der auf ein erhöhtes Risiko für MH hinweist, werden Anästhetika, die MH auslösen können, vermieden. Des Weiteren kann dem Subjekt Dantrolen verabreicht werden, um MH vorzubeugen.
In einigen Ausführungsformen sind ebenfalls Marker für genetische Krankheiten eingeschlossen, die nicht symptomatisch sind, aber nichts desto trotz die Antwort auf die Narkose beeinflussen können. Beispielsweise sind Marker für vererbbare arrthymogene Krankheiten eingeschlossen (siehe z.B. Priori et al., Circulation, 99: 518 [1999]). Eine vererbbare arrthymogene Krankheit ist das lange QT-Syndrom, das durch eine anormale verlängerte ventrikuläre Repolarisation und ein hohes Risiko für maligne ventrikulare Tachyarrhythmia charakterisiert ist. Perioden von starkem physischem Stress (z.B. ein chirurgischer Eingriff und Narkose) können in anfälligen Individuen eine Attacke auslösen. Die Identifizierung von Individuen mit einem Marker, der eine Prognose des langen QT-Syndroms erlaubt, ermöglicht dem Arzt, das Individuum noch genauer in Bezug auf Anzeichen für Herzabnormalitäten zu untersuchen, problematische Arzneimittel zu vermeiden und zu behandeln, bevor es zu refraktären Rhythmen kommt.
In einigen Ausführungsformen schließen die perioperativen genomischen Profile Marker für Blutcoagulationsproteine oder Blutplättchendefizienzen (z.B. Methylentetrahydrofolatreductase, Methioninsynthase, Cystathion-β-Synthase, Faktor V Leiden und Prothrombin) ein, für die bekannt ist, dass sie das Risiko von Thrombosen (Blutgerinnsel) erhöhen oder verringern. Viele Vorkommen von venösen Thrombosen sind mit einem chirurgischen Eingriff oder anderen Traumen assoziiert und führen zu teuren Therapien und Morbidität. Etwa 50 % aller Thrombosen sind erblich (Brick, Seminars in Thrombosis and Hemostatis, 25: 251 [1999]). Es ist bekannt, dass Mutationen und Polymorphismen in diesen Genen, die identifiziert wurden, das Risiko von Thrombosen erhöhen (siehe z.B. Frosst et al., Nature Genet., 10: 111 [1995]; Harmon et al., Genet. Epidemiol., 17: 298 [1999], Tsai et al., Am. J. Hum. Genet., 59: 1262 [1996]; Simoni et al., New Eng. J. Med., 336: 399 [1997]; DeStefano et al., New Eng. J. Med., 341: 801 [1999]). Wenn für ein Subjekt ein Risiko für Thrombosen identifiziert wurde, kann eine alternative Narkose oder Medikation ausgewählt werden. Eine prophylaktische Behandlung (z.B. gegen eine Coagulation gerichtete Medikationen, Positionierung und Kompressierungsvorrichtungen) und eine nähere Überwachung können die Häufigkeit und Stärke von Thrombosen verringern.
In einigen Ausführungsformen sind Marker in das perioperative genomische Profil eingeschlossen, die spezifisch für Coagulationsdefekte (voraussagend für ein erhöhtes Blutungsrisiko und assoziierte Apoplexie) sind. Beispiele hierfür sind, ohne auf diese beschränkt zu sein, Polymorphismen im Gewebeplasminogenaktivator (TPA), PAI-1 und Fibrinogen. Wenn bei einem Patienten ein erhöhtes Risiko für die Blutung gefunden wurde, kann eine spezifische postchirurgische Überwachung implementiert werden, die einen zeitigen Eingriff erlaubt. Des Weiteren können pharmazeutische Stoffe verwendet werden, die ein geringeres Risiko in Bezug auf ein erschwerendes Blutungspotential aufweisen.
In einigen Ausführungsformen sind Marker in das perioperative genomische Profil eingeschlossen, die Marker für Polymorphismen in Blutplättchenoberflächenadhäsionsmolekülen (z.B. GP IIb/IIIa Fibrinogenadhäsionssite), Endothelfunktionen und Entzündungen (Cytokine) sind. Polymorphismen in diesen Faktoren können ein erhöhtes Risiko für einen Herzinfarkt (MI; Herzanfall) vorhersagen. Wenn bei einem Subjekt ein Marker gefunden wurde, der ein erhöhtes Risiko auf MI vorhersagt, können geeignete pharmazeuti sche Stoffe für die Vorbeugung und den Eingriff ausgewählt werden und der Patient kann besonders auf Anzeichen von MI überwacht werden.
In einigen Ausführungsformen sind Marker für weitere zu Grunde liegende Krankheiten eingeschlossen, die die Auswahl der Narkose oder andere Handhabungen beeinflussen können. Beispiele und geänderte Handlungsweisen schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, die idiopathische hypertrophische subaortische Stenose (z.B. um positive Inotrope zu vermeiden), die dilatierte Kardiomyopathie (z.B. zur Vermeidung negativer Inotrope), die Antitrypsindefizienz (z.B. die genauere Überwachung in Bezug auf pulmonale Komplikationen), die Hemachromatosis (z.B. um Transfusionen zu vermeiden), die Leber'sche optische Atrophie (z.B. um Natriumnitroprusside zu vermeiden), das Sichelmerkmal und die Thalassämie (z.B. um die Anemia näher zu überwachen), die in das perioperative genomische Profil eingeschlossen sind. In einigen Ausführungsformen sind Marker für koexistierende Krankheiten eingeschlossen, die eine individuelle Antwort auf eine bestimmte Narkose beeinflussen können (z.B. die Klasse der periodischen Paralyse [das betrifft die Entscheidung, entweder Kalium zu verabreichen oder zu vermeiden] oder den Typ der Porphyrie [betrifft die Entscheidung; Natriumthiopental zu verabreichen oder zu vermeiden]).
In einigen bevorzugten Ausführungsformen schließt das perioperative genomische Profil des Weiteren Marker ein, die spezifisch für die Auswahl einer gegebenen chirurgischen Prozedur sind. So werden beispielsweise Subjekte, die für einen kardiopulmonalen Bypass vorgesehen sind, auf Apolipoprotein-E-Allele getestet. Wenn bei einem Patienten ein E-ε4-Allel festgestellt wurde (was auf ein erhöhtes Risiko für einen post-operativen Abfall in Bezug auf die kognitiven Funktionen hinweist), kann eine Nicht-Bypass-Prozedur implementiert werden (z.B. eine minimal invasive Herzschlagchirurgie und eine „off-pump bypass coronary artery grafting" unter Verwendung der Mini-Thorakotomie oder Mini-Sternotomie Herangehensweisen und eines Druck-Plattentyp-Stabilisators).
In einigen weiteren Ausführungsformen schließen die Tests auf Marker des Weiteren weitere übliche chirurgische Variablen ein, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Wundheilungsfaktoren, Cytokine und Anlagen für die Antibiotikatoxizität, die ebenfalls eingeschlossen sind. In einigen Ausführungsformen schließen die Marker für übliche genomische Variablen Blutserotypen (siehe z.B. Yamamoto et al., Nature, 345: 229 [1990] für spezifische Marker) und die Veranlagung für Allergien (z.B. auf Antibiotika oder Latex) ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. In einigen Ausführungsformen sind Marker in das perioperative genomische Profil eingeschlossen, die die Verhaltensweise bei einem Notfalleingriff beeinflussen (z.B. das Fehlen einer Antwort auf β-Adreanalin-bedingte Bronchodilatoren oder Blutserotypen). In einigen Ausführungsformen sind Marker für pathogene Infektionen eingeschlossen, die die Antwort auf einen chirurgischen Eingriff beeinflussen könnten (z.B. Hepatitis B Virus und Hepatitis C Virus).
In noch weiteren Ausführungsformen sind Marker eingeschlossen, die eine Vorhersage auf mögliche Komplikationen während der Erholungsphase von dem chirurgischen Eingriff erlauben, einschließlich der Marker für eine Anfälligkeit auf Sepsis (z.B. TNF-Allele), ohne auf diese be schränkt zu sein. Die TNF2-Allele von TNFα sind mit einer erhöhten Sepsisstärke verbunden. Wenn bei einem Subjekt ein TNF2-Allel festgestellt wird, kann die intensive Versorgungsüberwachung nach dem chirurgischen Eingriff erhöht werden, was die Chance, an Sepsis zu sterben, verringert. Des Weiteren kann der Arzt die Anwesenheit des TNF2-Allels als Faktor bei der Auswahl einer nicht-chirurgischen Behandlung mit einem geringen Sepsis-Risiko verwenden. In einigen Ausführungsformen werden in das perioperative genomische Profil Marker für Pathogene eingeschlossen, für die bekannt ist, dass sie für die Verursachung septischer Infektionen verantwortlich sind (z.B. bakterielle DNA, die in dem Blutstrom vorhanden ist). Der Fachmann des Standes der Technik versteht, dass weitere Marker in den vorgenannten perioperativen genomischen Profilen verwendet werden können, die für die perioperative Behandlung von Nutzen sind.
II. Assays für die Generierung genomischer Profile
Sobald die bestimmten SNPs und Mutationen für ein gegebenes perioperatives genomisches Paneel festgelegt wurden, wird ein Profil generiert. Genomische Profile werden mittels der Detektion von SNPs und Mutationen in einer DNA-Probe (z.B. eine Gewebeprobe oder eine genetische Informationsprobe) von einem Subjekt generiert. Assays für die Detektion von Polymorphismen oder Mutationen fallen in verschiedene Kategorien und schließen Direktesequenzierassays, Fragmentpolymorphismenassays, Hybridisationsassays und die Computer-basierende Datenanalyse ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Protokolle und kommerziell erhältliche Kits oder Dienstleistungen für die Durchführung vieler Variationen dieser Assays stehen zur Verfügung. In einigen Ausführungsformen werden die Assays in Kombination oder ge mischt durchgeführt (z.B. werden verschiedene Reagenzien oder Technologien aus verschiedenen Assays kombiniert, um einen Assay zu bilden).
A. Direktesequenzierungsassays
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden genomische Profile unter Verwendung einer Direktsequenzierungstechnik generiert. In diesen Assays werden die DNA-Proben zunächst aus einem Subjekt unter Verwendung jeglicher geeigneter Methode isoliert. In einigen Ausführungsformen wird die Region von Interesse in einem geeigneten Vektor kloniert und durch Wachstum in einer Wirtszelle (z.B. einem Bakterium) amplifiziert. In anderen Ausführungsformen wird die DNA in der Region von Interesse unter Verwendung der PCR amplifiziert.
Nach der Amplifikation wird die DNA in der Region von Interesse (z.B. die Region, die den SNP oder die Mutation von Interesse enthält) unter Verwendung jeglicher geeigneter Methode sequenziert, einschließlich dem manuellen Sequenzieren unter Verwendung radioaktiver Markernukleotide oder der automatisierten Sequenzierung, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Ergebnisse der Sequenzierung werden unter Verwendung jeglicher geeigneter Methode sichtbar gemacht. Die Sequenz wird untersucht und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines gegebenen SNP oder einer Mutation wird festgestellt.
B. Fragmentlängenpolymorphismenassays
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden genomische Profile unter Verwendung eines Frag mentlängenpolymorphismenassays generiert. Bei einem Fragmentlängenpolymorphismenassay wird unter Verwendung von einem Enzym (z.B. ein Restriktionsenzym oder ein CLEAVASE I Enzym [Third Wave Technologies, Madison, WI] ein einzigartiges DNA Bandenmuster, basierend auf der Spaltung der DNA in einer Reihe von Positionen, generiert. DNA-Fragmente von einer Probe, die ein SNP oder eine Mutation enthält, werden ein anderes Bandenmuster aufweisen, als das des Wildtyps.
1. RFLP Assay
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein genomisches Profil unter Verwendung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismenassays (RFLP) generiert. Die Region von Interesse wird zunächst unter Verwendung von PCR isoliert. Das PCR-Produkt wird dann mit Restriktionsenzymen gespalten, für die bekannt ist, dass sie ein einzigartiges Längenfragment für einen bestimmten Polymorphismus geben. Die durch die Restriktionsenzyme verdauten PCR-Produkte werden durch eine Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und durch eine Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Länge der Fragmente wird mit dem Molekulargewicht der Marker und den Fragmenten, die von den Wildtyp- und Mutantenkontrollen generiert wurden, verglichen.
2. CFLP Assay
In anderen Ausführungsformen wird ein genomisches Profil unter Verwendung eines CLEAVASE Fragmentlängenpolymorphismenassay generiert (CFLP; Third Wave Technologies, Madison, WI; siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5,843,654; 5,843,669; 5,719,208 und 5,888,780; von denen jedes hiermit durch Zitierung inkorporiert wurde). Dieser Assay basiert auf der Beobachtung, dass, wenn sich Einzel-DNA-Stränge selbst falten, sie höher geordnete Strukturen annehmen, die stark individuell in Bezug auf die genaue Sequenz des DNA-Moleküls sind. Diese sekundären Strukturen schließen partielle Duplex-Regionen der DNA ein, so dass einzelsträngige Regionen in unmittelbare Nähe zu doppelsträngigen DNA-Haarnadelstrukturen gelangen. Das CLEAVASE I Enzym ist eine strukturspezifische, thermostabile Nuklease, die die Verbindung zwischen diesen doppelsträngigen und einzelsträngigen Regionen erkennt und spaltet.
Die Region von Interesse wird als erstes isoliert, beispielsweise unter Verwendung von PCR. Dann werden die DNA-Stränge durch Erwärmung getrennt. Als nächstes werden die Reaktionen gekühlt, um die Bildung von sekundären Strukturen im Inneren des Stranges zu erlauben. Die PCR-Produkte werden dann mit dem CLEAVASE I Enzym behandelt, um eine Serie von Fragmenten zu generieren, die einzigartig für einen gegebenen SNP oder eine Mutation sind. Die mit dem CLEAVASE Enzym behandelten PCR-Produkte werden voneinander getrennt und detektiert (z.B. mittels einer Agarose-Gel-Elektrophorese) und sichtbar gemacht (z.B. mittels Ethidiumbromid-Färbung). Die Länge der Fragmente wird mit dem Molekulargewicht der Marker und Fragmenten verglichen, die vom Wildtyp und Mutantenkontrollen generiert wurden.
C. Hybridisierungsassays
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden genomische Profile unter Verwendung eines Hybridisierungsassays generiert. In einem Hybridisierungsassay wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines gegebe nen SNP oder einer Mutation, basierend auf der Fähigkeit der DNA, von einer Probe mit einem komplementären DNA-Molekül zu hybridisieren (z.B. einer Oligonukleotidprobe), ermittelt. Eine Vielzahl an Hybridisierungsassays unter Verwendung einer Vielzahl an Technologien für die Hybridisierung und Detektierung stehen zur Verfügung. Weiter unten wird eine Beschreibung für eine Auswahl an Assays bereitgestellt.
1. Die direkte Detektierung der Hybridisierung
In einigen Ausführungsformen wird die Hybridisierung einer Probe an die Sequenz von Interesse (z.B. ein SNP oder eine Mutation) direkt durch die Visualisierung einer gebundenen Probe (z.B. ein Northern oder Southern Assay; siehe z.B. Ausabel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY [1991]) entdeckt. In diesen Assays wird genomische DNA (Southern) oder RNA (Northern) von einem Subjekt isoliert. Die DNA oder RNA wird dann mit einer Serie an Restriktionsenzymen, die in dem Genom selten und nicht in der Nähe der im Assay verwendeten Marker schneiden, geschnitten. Die DNA oder RNA wird dann aufgetrennt (z.B. in einem Agarose-Gel) und auf eine Membran übertragen. Einer markierten Probe oder Proben (z.B. durch die Inkorporierung eines Radionukleotids), die spezifisch für den SNP oder die Mutation ist, die detektiert werden soll, wird erlaubt, mit der Membran unter schwachen, mittleren oder hoch-stringenten Bedingungen in Kontakt zu treten. Die ungebundene Probe wird entfernt und das Vorhandensein einer Bindung durch die Visualisierung der markierten Probe festgestellt.
2. Detektierung und Hybridisierung unter Verwendung von „DNA Chip" Assays
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden genomische Profile unter Verwendung eines DNA Chip Hybridisationsassays generiert. In diesem Assay sind eine Reihe von Oligonukleotidproben an einer festen Unterlage fixiert. Die Oligonukleotidproben sind so designt, dass sie für einen gegebenen SNP oder eine Mutation einzigartig sind. Die DNA-Probe von Interesse wird mit dem DNA „Chip" in Kontakt gebracht und die Hybridisierung detektiert.
In einigen Ausführungsformen ist der DNA Chip Assay ein GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA; siehe z.B. U.S. Patente Nr. 6,045,996; 5,925,525 und 5,858,659; wovon jedes hiermit durch vorliegende Zitierung inkorporiert ist) Assay. Die GeneChip Technologie verwendet miniaturisierte, hochverdichtete Arrays von Oligonukleotidproben, die auf dem „Chip" befestigt sind. Die Proben-Arrays werden durch den Affymetrix Licht-gesteuerten chemikalischen Syntheseprozess hergestellt, welcher die festphasenchemikalische Synthese mit der fotolithographischen Herstellungstechnik, wie sie in der Halbleiterindustrie verwendet wird, kombiniert. Unter Verwendung einer Reihe von fotolithographischen Masken, die die Punkte auf dem Chip festlegen, die einer Bestrahlung ausgesetzt werden, gefolgt von spezifischen chemikalischen Syntheseschritten werden hochdichte Arrays von Oligonukleotiden erstellt, wobei jede Probe an einer vordefinierten Position in dem Array vorliegt. Eine Vielzahl an Proben-Arrays werden gleichzeitig an einem großen Glasswafer synthetisiert. Die Wafer werden dann in Mikroplättchen zerlegt und die individuellen Proben-Arrays in injektionsgegossene Plastikpatronen verpackt, die diese vor der Umwelt schützen und als Kammer für die Hybridisierung dienen.
Die zu analysierende Nukleinsäure wird isoliert, durch PCR amplifiziert und mit einer fluoreszierenden Reportergruppe markiert. Die markierte DNA wird dann mit dem Array unter Verwendung einer Fluid-Technikstation inkubiert. Das Array wird dann in den Scanner gegeben, in dem die Hybridisationsmuster untersucht werden. Die Daten der Hybridisierung werden in Form des Lichts, welches von den fluoreszenten Reportergruppen, die bereits in das Ziel inkorporiert sind, welches an den Proben-Array gebunden ist, abgegeben wird, erfasst. Proben, die perfekt zu dem Ziel passen, produzieren üblicherweise stärkere Signale als die, die nicht passen. Da die Sequenz und Position jeder Probe auf dem Array bekannt ist, kann, wegen der Komplementarität, die Identität der Zielnukleinsäure, die auf dem Proben-Array verwendet wurde, determiniert werden.
In anderen Ausführungsformen wird ein DNA Mikrochip verwendet, der elektronisch gefangene Proben (Nanogen, San Diego, CA) enthält (siehe z.B. U.S. Patente Nr. 6,017,696; 6,068,818 und 6,051,380; jedes von denen hiermit durch Zitierung inkorporiert ist). Durch die Verwendung der Mikroelektronik ermöglicht die Nanogen-Technologie die aktive Bewegung und Konzentration der geladenen Moleküle zu und von einem vorgesehenen Testsite auf seinem Halbleitermikrochip. Die DNA einfangenden Proben sind einzigartig für ein gegebenes SNP oder eine Mutation und elektronisch platziert auf, oder „adressiert" für einen spezifischen Site auf dem Mikrochip. Da die DNA eine starke negative Ladung hat, kann sie elektronisch zu einem Gebiet einer positiven Ladung bewegt werden.
Als erstes wird ein Testsite oder eine Reihe an Testsites auf dem Mikrochip elektronisch mit einer positiven Ladung aktiviert. Als nächstes wird eine Lösung, die die DNA-Proben enthält, auf den Mikrochip gegeben. Die negativ geladenen Proben bewegen sich schnell zu den positiv geladenen Sites, wo sie sich anreichern und chemisch an den Site auf dem Mikrochip binden. Der Mikrochip wird dann gewaschen und eine andere Lösung mit bestimmten DNA-Proben hinzugefügt, bis der Array für spezifisch gebundene DNA-Proben vollständig ist.
Eine Testprobe wird dann in Bezug auf die Anwesenheit eines Ziel-DNA-Moleküls analysiert, indem festgestellt wird, welche der DNA-gefangenen Proben mit der komplementären DNA in der Testprobe (z.B. ein mittels PCR amplifiziertes Gen von Interesse) hybridisieren. Eine elektronische Ladung wird ebenfalls verwendet, um die Zielmoleküle zu einem oder mehreren Testsites auf dem Mikrochip zu bewegen und anzureichern. Die elektronische Konzentrierung der Proben-DNA an jedem Testsite begünstigt die schnelle Hybridisierung der Proben-DNA mit den komplementären Einfangproben (die Hybridisierung kann in Minuten stattfinden). Um von jedem Site die ungebundene oder nicht spezifisch gebundene DNA zu entfernen, wird die Polarität oder Ladung des Sites in das negative umgekehrt, wodurch jegliche ungebundene oder nicht spezifisch gebundene DNA von den Einfangproben weg zurück in die Lösung gebracht wird. Ein Laserbasierender Fluoreszenzscanner wird dann verwendet, um die Bindung zu detektieren.
In noch anderen Ausführungsformen wird eine Array-Technologie, basierend auf der Segregation von Flüssigkeiten auf einer flachen Oberfläche (Chip) durch Unterschiede in der Oberflächentension (ProtoGene, Palo Alto, CA) verwendet (siehe z.B. U.S. Patente Nr. 6,001,311; 5,985,551 und 5,474,796; jedes von denen durch ihre Zitierung hiermit inkorporiert ist). Die Protogene-Technologie basiert auf der Tatsache, dass Flüssigkeiten auf einer flachen Oberfläche durch Unterschiede in der Oberflächentension, die durch chemische Überzüge vermittelt wird, abgetrennt werden können. Sobald sie somit abgetrennt sind, können die Oligonukleotidproben direkt auf dem Chip mittels Ink-Jet Druck der Reagenzien synthetisiert werden. Das Array mit seinen Reaktionssites, die durch die Oberflächentension definiert sind, ist an einer X/Y-Translationsplatform unter einem Set von vier piezoelektrischen Düsen, jede für eine der vier Standard-DNA-Basen, befestigt. Die Translationsplatform bewegt sich entlang jeder der Reihen des Arrays und jedes geeignete Reagenz wird zu jeder der Reaktionssites geliefert. Beispielsweise wird das A Amidit nur zu den Sites geliefert, wo Amidit A während des Syntheseschrittes angekoppelt werden soll, und so weiter. Gewöhnliche Reagenzien und Wellenschläge werden durch die Überflutung der gesamten Oberfläche verabreicht und dann durch Umdrehen entfernt.
Unter Verwendung der Technologie von Protogene werden DNA-Proben, die einzigartig für den SNP oder eine Mutation von Interesse sind, an dem Chip befestigt. Der Chip wird dann mit den PCR-amplifizierten Genen von Interesse in Kontakt gebracht. Nach der Hybridisierung wird die ungebundene DNA entfernt und die Hybridisierung unter Verwendung jeglicher geeigneter Methode (z.B. durch Fluoreszenz delöschen einer eingebauten Fluoreszenzgruppe) detektiert.
In noch anderen Ausführungsformen wird ein „Kugel-Array" für die Generierung genomischer Profile verwendet (Illumina, San Diego, CA; siehe z.B. PCT-Publikationen WO 99/67641 und WO 00/39587; jede von denen hiermit durch ihre Zitierung inkorporiert ist). Illumina verwendet die BEAD ARRAY Technologie, die fiberoptische Bündel und Kugeln, die sich selbst in ein Array assemblieren, kombiniert. Jedes der fiberoptischen Bündel enthält tausende bis Millionen von einzelnen Fasern, abhängig von dem Durchmesser der Faser. Die Kugeln sind mit einem Oligonukleotid überzogen, der spezifisch für die Detektion eines gegebenen SNP oder einer Mutation ist. Es werden Chargen von Kugeln kombiniert, um ein Pool zu bilden, der spezifisch für das Array ist. Um das Array durchzuführen, wird das BEAD ARRAY mit einer vorbereiteten Probe eines Subjekts (z.B. DNA) in Kontakt gebracht. Die Hybridisierung wird unter Verwendung einer geeigneten Methode festgestellt.
3. Enzymatische Detektierung der Hybridisation
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die genomischen Profile unter Verwendung eines Assays, der die Hybridisierung mittels enzymatischer Spaltung von bestimmten Strukturen detektiert (INVADER Assay, Third Wave Technologies; siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5,846,717; 6,001,567; 5,985,557 und 5,994,069; jedes von denen hiermit durch die Zitierung inkorporiert ist), generiert. Das INVADER Assay detektiert spezifische DNA- und RNA-Sequenzen unter Verwendung strukturspezifischer Enzyme zur Spaltung eines Komplexes, der durch die Hybridisierung überlappender Oligonukleotidproben gebildet wird. Eine erhöhte Temperatur und ein Überschuss an einer der Proben er laubt es, eine Vielzahl an Proben für jede vorhandene Zielsequenz ohne Temperaturzyklen zu spalten. Diese gespaltenen Proben führen dann zu der Spaltung einer zweiten markierten Probe. Der zweite Probenoligonukleotid kann an dem 5'-Ende mit Fluorescin markiert sein, das durch einen internen Farbstoff unterdrückt ist. Nach der Spaltung kann das nicht mehr unterdrückte Fluorescin-markierte Produkt unter Verwendung eines üblichen Fluoreszenzplattenlesers detektiert werden.
Der INVADER Assay detektiert spezifische Mutationen und SNPs in nicht-amplifizierter genomischer DNA. Die isolierte DNA-Probe wird mit der ersten Probe, die entweder für eine SNP/Mutation oder eine Wildtypsequenz spezifisch ist, in Kontakt gebracht und hybridisieren gelassen. Dann wird eine zweite Probe, die zu der ersten Probe spezifisch ist und die Fluorescin-Markierung enthält, hybridisiert und das Enzym hinzugefügt. Die Bindung wird unter Verwendung eines Fluoreszenzplattenlesegeräts und durch Vergleich der Signale der Testprobe mit den bekannten positiven und negativen Kontrollen detektiert.
In einigen Ausführungsformen wird die Hybridisierung einer gebundenen Probe unter Verwendung eines TagMan Assays detektiert (PE Biosystems, Foster City, CA; siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5,962,233 und 5,538,848; jedes von denen hiermit durch Zitierung inkorporiert ist). Der Assay wird während einer PCR-Reaktion durchgeführt. Der TaqMan Assay nutzt die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der AMPLITAQ GOLD DNA Polymerase aus. Eine Probe, die spezifisch für ein gegebenes Allel oder eine Mutation ist, wird in die PCR-Reaktion eingeschlossen. Die Probe besteht aus einem Oligonukleotid mit einem 5'-Reporterfarbstoff (z.B. ein Fluoreszenzfarb stoff) und einem 3'-Unterdrückungsfarbstoff. Während der PCR, wenn die Probe an ihr Ziel gebunden ist, spaltet die 5'-3'-nukleolytische Aktivität der AMPLITAQ GOLD Polymerase die Probe zwischen dem Reporter- und dem Unterdrückungsfarbstoff. Die Trennung des Reporterfarbstoffs von dem Unterdrückungsfarbstoff führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz. Das Signal akkumuliert mit jedem PCR-Zyklus und kann mit einem Fluorimeter überwacht werden.
In noch weiteren Ausführungsformen können genomische Profile unter Verwendung des SNP-IT-Primererstreckungsassays (Orchid Biosciences, Princeton, NJ; siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5,952,174 und 5,919,626; jedes von denen hiermit durch ihre Zitierung inkorporiert ist) generiert werden. In diesem Assay werden die SNPs unter Verwendung spezieller synthetisierter DNA-Primer und einer DNA-Polymerase zur selektiven Erweiterung der DNA-Kette um eine Base an dem vermuteten SNP-Ort identifiziert. Die DNA wird in der Region von Interesse amplifiziert und denaturiert. Dann werden die Polymerasenreaktionen unter Verwendung eines miniaturisierten Systems, Mikrofluidics genannt, durchgeführt. Die Detektierung wird durch die Hinzufügung einer Markierung an das Nukleotid, von dem vermutet wird, dass es an dem SNP oder der Mutation lokalisiert ist, vollendet. Die Inkorporierung der Markierung in die DNA kann durch jegliche geeignete Methode (z.B. wenn die Nukleotide eine Biotinmarkierung enthalten, kann die Detektion mittels eines Fluoreszenz-markierten Antikörpers, der spezifisch für Biotin ist, detektiert werden) detektiert werden.
D. Massenspektroskopisches Assay
In einigen Ausführungsformen wird ein MassARRAY System (Sequenom, San Diego, CA) verwendet, um genomische Profile zu generieren (siehe z.B. U.S. Patente Nr. 6,043,031; 5,777,324 und 5,605,798; jedes von denen hiermit durch seine Zitierung inkorporiert ist). DNA wird von Blutproben unter Verwendung von Standardverfahren isoliert. Als nächstes werden spezifische DNA-Regionen, die die Mutation oder ein SNP von Interesse enthalten, die etwa 200 Basenpaare lang sind, durch PCR amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente werden dann durch einen Strang an einer festen Oberfläche befestigt und der nicht-immobilisierte Strang durch eine übliche Denaturierung und Waschung entfernt. Der verbleibende immobilisierte Einzelstrang dient dann als Ziel für automatisierte enzymatische Reaktionen, die genotypspezifische diagnostische Produkte ergeben.
Sehr kleine Mengen des enzymatischen Produkts, typischerweise fünf bis zehn Nanoliter, werden dann auf ein SpectroCHIP Array für nachfolgende automatisierte Analysen mit dem SpectroREADER Massenspektrometer übertragen. Jeder Fleck ist mit lichtabsorbierenden Kristallen vorgeladen, die eine Matrix mit dem verabreichten diagnostischen Produkt bilden. Das MassARRAY System verwendet die MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Flugzeit) Massenspektrometrie. In einem Prozess, der als Desorption bekannt ist, wird die Matrix mit einem Impuls von einem Laserstrahl getroffen. Die Energie von dem Laserstrahl wird auf die Matrix übertragen und dampft diese ein, was zu einer kleinen Menge des diagnostischen Produktes führt, das in ein Flugröhrchen getrieben ist. Da das diagnostische Produkt geladen wird, wenn anschließend ein elektrischer Feldimpuls auf das Röhrchen einwirkt, sind sie in dem unteren Bereich des Flugröhrchens in Richtung des Detektors lanciert. Die Zeit zwischen der Anwendung des elektrischen Feldimpulses und der Kollision des diagnostischen Produktes mit dem Detektor wird als Flugzeit bezeichnet. Dies ist eine sehr genaue Messung für das Molekulargewicht der Produkte, da die Masse eines Moleküls direkt mit der Flugzeit korreliert, wobei kleine Moleküle schneller als große Moleküle fliegen. Der gesamte Assay ist in weniger als einem Tausendstel einer Sekunde abgeschlossen, was es erlaubt, die Proben insgesamt in 3-5 Sekunden, einschließlich wiederholender Datensammlungen, zu analysieren. Die SpectroTYPER Software berechnet dann, zeichnet auf und vergleicht und berichtet die Genotypen bei einer Geschwindigkeit von drei Sekunden pro Probe.
E. Computer-basierte Datenanalyse
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden perioperative genomische Profile unter Verwendung einer Computer-basierten Datenanalyse einer genetischen Informationsprobe (z.B. gespeicherte Nukleinsäuresequenzinformationen) generiert. Eine Probe wird von einem Subjekt zu einer beliebigen Zeit (z.B. bei der Geburt) gesammelt, die Sequenzinformation generiert (z.B. mittels DNA-Sequenzierung) und die Information dann gespeichert (z.B. als digitale Information auf einem portablen Chip). Während der perioperativen Zeit wird die Sequenzinformation des Subjekts in Bezug auf die vorselektierten Marker durch ein Computerprogramm gescannt. Ein Befund (z.B. ein perioperatives genomisches Profil) wird generiert.
III. Analyse und Ablage der Daten
In einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Information, die durch die perioperative genomische Profilierung gewonnen wurde, auf automatisierte Weise verteilt und koordiniert. Ein Diagramm, das den Informationsfluss in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umreißt, ist in 1 dargestellt. 1 zeigt, dass verschiede Kriterien bei der Entscheidung, ob und wie ein perioperatives genomisches Profil generiert werden soll, in Betracht kommen. Insbesondere wird eine Entscheidung getroffen, ob ein Subjekt, welches für einen chirurgischen Eingriff vorgesehen ist, ein Kandidat für die genomische Profilierung ist (z.B. wird es einer Prozedur unterzogen, die geändert werden kann, in Abhängigkeit von dem Informationsgehalt eines genomischen Profils). Ebenfalls wird die analytische Validität bewertet. Insbesondere wird die Methode für die Generierung des genomischen Profils auf Grundlage ihrer Fähigkeit ausgewählt, nützliche Informationen für eine bestimmte Anwendung und ihre Anwendbarkeit (z.B. die Sicherheit für die oder den mitwirkende(n) Assistentin/en, die Kosteneffektivität, die Effizienz) bereitzustellen. Schließlich wird die Validität eines bestimmten Profilierungsassays in Bezug auf den klinischen Nutzen (z.B. die Fähigkeit, eine Vorhersage eines Phenotypes bezogen auf einen Genotypen, bereitzustellen) bewertet. Wenn erst einmal ein geeignetes Kandidatensubjekt, eine geeignete Assay-Technik und ein Assay ausgewählt sind, wird ein genomisches Profil generiert durch die Verwendung einer genomischen Probe (z.B. eine Gewebeprobe oder eine vorbestimmte genetische Information) von dem Subjekt in der Assay-Technik unter Verwendung der ausgewählten bestimmten genetischen Marker. Beispielsweise kann ein Subjekt eine Probe (z.B. Blut, Gewebe oder genetische Informationen) perioperativ (z.B. einige Wochen vor dem chirurgi schen Eingriff in dem Büro eines Arztes oder in der Notaufnahme) bereitstellen und die Probe wird für die Generierung eines genomischen Profils unter Verwendung des entsprechenden Assays generiert. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Daten unter Verwendung elektronischer Kommunikationssysteme (z.B. Internet-basierte Methoden) generiert, verarbeitet und/oder verwaltet.
In einigen Ausführungsformen wird ein Computerbasiertes Analyseprogramm verwendet, um die durch das genomische Profil generierten Rohdaten (z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit eines gegebenen SNP oder einer Mutation) in Daten von vorhersehbarem Wert für den Arzt umzuwandeln (z.B. die Wahrscheinlichkeit einer anormalen pharmakologischen Antwort, das Vorliegen zu Grunde liegender Krankheiten oder unterschiedliche Diagnosen von bekannten Krankheiten). Der Arzt (z.B. der Chirurg oder Narkosearzt) kann auf die voraussagenden Daten unter Verwendung eines geeigneten Mittels zugreifen. Somit weist die vorliegende Erfindung in einigen bevorzugten Ausführungsformen den weiteren Vorteil auf, dass der Arzt, der wahrscheinlich nicht in der Genetik oder Molekularbiologie ausgebildet ist, nicht die Rohdaten des genomischen Profils verstehen muss. Die Daten werden dem Arzt in ihrer am besten geeigneten Form direkt zur Verfügung gestellt. Der Arzt ist dann sofort in der Lage, die Informationen zu verwerten, um die perioperative Versorgung des Subjekts zu optimieren.
Die vorliegende Erfindung schließt jegliche Methode ein, die in der Lage ist, die Information zu erhalten, zu verarbeiten und zu übermitteln in Bezug auf und von medizinischem Personal und dem Objekt. 2 illustriert die Umwandlung einer Probe (z.B. einer Gewebeprobe oder einer ge netischen Information) in Daten, die für den Arzt, das Subjekt oder den Wissenschaftler nützlich sind. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel eine Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde, zu einem genomischen Profilservice übertragen (z.B. ein klinisches Laboratorium an einer medizinischen Einrichtung, eine genomische Profilierungsfirma etc.), um Rohdaten zu generieren. Wenn die Probe ein Gewebe oder eine andere biologische Probe umfasst, kann das Subjekt ein medizinisches Zentrum besuchen, damit die Probe erhalten und an das genomische Profilzentrum geschickt werden kann, oder das Subjekt stellt die Probe selbst bereit und sendet sie direkt an ein genomisches Profilierungszentrum. Wenn die Probe früher festgestellte genetische Informationen aufweist (z.B. Sequenzinformationen, SNP oder Mutationsinformationen, etc.), kann durch das Subjekt die Information direkt an den genomischen Profilierungsservice gesandt werden (z.B. eine Informationskarte, die die genetischen Informationen enthält, kann durch einen Computer gescannt und die Daten auf einen Computer des genomischen Profilierungszentrums unter Verwendung eines elektronischen Kommunikationssystems übertragen werden). Wenn diese durch den genomischen Profilierungsservice erhalten wurden, wird die Probe bearbeitet und ein genomisches Profil (d.h. genomische Daten) erzeugt, die spezifisch für die medizinische oder chirurgische Prozedur sind, denen das Subjekt ausgesetzt sein wird.
Die genomischen Profildaten werden dann in ein Format vorbereitet, das eine Interpretation durch einen behandelnden Arzt ermöglicht. Beispielsweise kann anstelle der Bereitstellung der Rohsequenzdaten das vorbereitete Format eine Risikoanalyse für verschiedene Behandlungsoptionen darstellen, die der Arzt verwenden oder als Empfehlungen für bestimmte Behandlungsoptionen ansehen kann. Die Daten können dem Arzt durch jegliche geeignete Methode dargestellt werden. In einigen Ausführungsformen generiert der genomische Profilierungsservice beispielsweise einen Befund, der für den Arzt gedruckt (z.B. zum Zeitpunkt der Versorgung) oder dem Arzt auf einem Computermonitor dargestellt werden kann.
Eine beispielhafte Ausführungsform eines solchen Systems kann unter den Bedingungen der Notfallchirurgie verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Probe von einem Subjekt unmittelbar nach dem ersten Kontakt des medizinischen Personals mit dem Subjekt; welches eine Notfallbehandlung benötigt, genommen werden (z.B. kann diese durch ein Notfallteam an dem Unfallort genommen werden). Die Probe kann unter Verwendung geeigneter Detektionstechniken in einem Notfallfahrzeug verarbeitet werden, während das Subjekt in die Notaufnahme eines medizinischen Zentrums transportiert wird. Die durch diesen Assay generierten Daten können in ein genomisches Profil in einem Computersystem des Notfallwagens konvertiert werden oder für die Aufbereitung zu entfernten Computersystemen übertragen werden. Sobald das genomische Profil generiert ist, wird der Befund zu dem behandelnden Arzt gesendet, so dass die vorchirurgische Präparation (z.B. die Auswahl der geeigneten Arzneimittel) vorbereitet werden kann, bevor das Subjekt in der Notaufnahme ankommt, oder so, dass die Prozedur während des chirurgischen Eingriffes geändert werden kann, wenn die Information nach dem Beginn der Behandlung eintrifft.
In einigen Ausführungsformen wird die genomische Information (z.B. eine Gewebeprobe oder genetische Informati on) als erstes an dem Behandlungsort oder einer regionalen Einrichtung analysiert. Die Rohdaten werden dann an eine zentrale Verarbeitungseinrichtung für die weitere Analyse in genomische Daten und klinische Daten oder Patientendaten gesendet. Die zentrale Verarbeitungseinrichtung hat den Vorteil des Datenschutzes (alle genomischen Daten werden in einer zentralen Einrichtung mit gleichen Sicherheitsprotokollen gespeichert), der Schnelligkeit und Einheitlichkeit der Datenanalyse. Die zentrale Verarbeitungseinrichtung kann das Schicksal der Daten nach dem chirurgischen Eingriff kontrollieren. Beispielsweise kann die zentrale Einrichtung unter Verwendung eines elektronischen Kommunikationssystems die Daten dem Arzt, dem Subjekt oder den Wissenschaftlern bereitstellen.
Nach der medizinischen oder chirurgischen Prozedur können die Proben und die Daten des Subjekts, die durch das genomische Profil generiert wurden, einen der verschiedenen Wege gehen. Das Schicksal der Probe und der genomischen Daten wird durch das Subjekt bestimmt, dem ein Menü (z.B. elektronisch) an Auswahlmöglichkeiten gegeben wird. Die Probe kann zerstört, archiviert oder für wissenschaftliche Untersuchungen gespendet werden. Die genomischen Daten können zerstört werden, ohne dass sie von irgendjemandem, mit Ausnahme des Arztes (oder durch den Arzt in einer beschränkten Weise gesehen) gesehen wurden. Eine solche Zerstörung kann gewünscht sein, um die Privatsphäre des Subjekts zu erhalten. Im Falle eines menschlichen Subjekts kann dieses Subjekt um Zugang zu den Daten für spätere Verwendungen bitten. Im Falle eines nicht-menschlichen Subjekts kann dem Betreuer des Subjekts (z.B. dem Eigentümer) Zugang zu den Daten für spätere Verwendungen gegeben werden. In einigen Ausführungsformen kann das Subjekt in der Lage sein, direk ten Zugang zu den Daten unter Verwendung elektronischer Kommunikationssysteme zu haben. Das Subjekt kann sich für einen weiteren Eingriff oder eine Beratung, basierend auf den Ergebnissen, entscheiden. In einigen Ausführungsformen werden die Daten für die Forschung verwendet. Zum Beispiel können die Daten für die weitere Optimierung der Aufnahme oder des Ausschlusses von Markern in das genomische Profil verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein einzigartiges System für die spezifische Überwachung und Nachverfolgung empirischer Ergebnisse bereit. So kann beispielsweise der Erfolg oder Misserfolg einer bestimmten Behandlungsoption, die ausgewählt wurde unter Verwendung der genomischen Profile der vorliegenden Erfindung, in eine Datenbank kompiliert werden, um empirisch noch genauere Systeme zur Generierung und Auswertung von Profilen zu bestimmen. Solche Daten können darauf hinweisen, dass bestimmte Marker, die in einem Assay verwendet werden, besonders gute Vorhersagen über den Erfolg erlauben, oder dass andere Marker, die vorher als vorhersagend in Betracht gezogen wurden, beschränkten Wert haben. Unter Verwendung dieses Überwachungs- und Verfolgungssystems entwickeln die genomischen Profile der vorliegenden Erfindung kontinuierlich verbesserte Ergebnisse. Die Verwendung solcher Systeme durch die medizinischen Einrichtungen verbessert die Standardversorgung, während eine höhere Effizienz und Vorhersehbarkeit in dem Management des medizinischen Geschäfts kreiert wird. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein koordiniertes, zeit- und kosteneffektives System für den Erhalt, die Analyse und Verteilung lebenserhaltender Informationen bereit.
EXPERIMENTELLER TEIL
Das folgende Beispiel wird bereitgestellt, um verschiedene bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren und des Weiteren zu illustrieren und ist nicht dahingehend auszulegen, dass es den Anwendungsbereich dieser beschränkt.
In der experimentellen Offenbarung, welche folgt, werden die folgenden Abkürzungen verwendet: μM (mikromolar); mol (Mole); mmol (Millimole); μmol (Mikromole); nmol (Nanomole); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); l oder L (Liter), ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); U (Anteil); mU (Millianteil); min. (Minuten); % (Prozent); PEG (Polyethylenglycol); kb (Kilobasen); bp (Basenpaar); PCR (Polymerasenkettenreaktion); Third Wave Technologies (Third Wave Technologies, Madison, WI); Beckman (Beckman Coulter, Fullerton, CA); Gentra Systems (Gentra Systems, Minneapolis, MN); MJ Research (MJ Research, Watertown, MA) und NEB (New England Biolabs, Beverly, MA).
PERIOPERATIVES GENOMISCHES SCREENING AUF NARKOSEMARKER
Dieses Beispiel illustriert die Generierung eines Profils für das perioperative genomische Screening für die Reaktion eines Patienten auf eine Narkose und damit verbundene Medikationen. Erwachsene, die zuvor zugestimmt hatten und für einen ambulanten chirurgischen Eingriff vorgesehen waren, wurden in Bezug auf die in den Tabellen 1-4 dargestellten Variablen gescreent. Tabelle 1 listet die Marker für die Butyrylcholinesterasedefizienz (Mutationen in dem Butyrylcholinesterasegen (BChE)) auf. Tabelle 2 listet die Marker auf, die auf einen schlechten Debrisioquine-Metabolismus hinweisen. Tabelle 3 listet die Marker auf, die auf ein erhöhtes Risiko für eine Blutgerinnselbildung hinweisen. Mutationen liegen in dem Methylentetrahyrofolatreductasegen (MTHFR), dem Methioninsynthasegen (MS), dem Cystathionin-β-Synthasegen (CBS), dem Faktor 5 Leiden-Gen (F 5 Leiden) und dem Prothrombingen vor. Tabelle 4 listet die Marker auf, die auf ein erhöhtes Risiko für maligne Hyperthermie hinweisen.
Die Patienten stellen eine 10 ml Blutprobe bereit. Die Leukozyten-DNA wird aus dem Leukozytenfilm des zitratanticoagulierten Blutes unter Verwendung des Gentra Systems Puregene Isolation Kits entsprechend den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die DNA-Proben wurden durch eine UV-Spektroskopie unter Verwendung eines Beckman DU06 Spektrophotometers quantifiziert.
Die DNA wurde auf die oben genannten Mutationen und Polymorphismen unter Verwendung eines PCR-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Assays bei Anwendung von Standardmethoden gescreent. Die DNA in der Region von Interesse wurde unter Verwendung von PCR amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden an einem MJ Research PTC-200 Thermocycler durchgeführt. Als nächstes wurden die Fragmente mit Restriktionsenzymen (NEB) geschnitten, für die bekannt ist, dass sie eine einzigartige Fragmentlänge für einen gegebenen Polymorphismus geben. Die durch die Restriktionsenzyme verdauten PCR-Produkte wurden mittels einer Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und durch eine Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Länge der Fragmente wird mit dem Molekulargewicht der Marker (NEB) verglichen.
Zusätzlich zu der RFLP-Analyse wurden die DNA-Proben unter Verwendung eines „flap endonuclease assay" (INVADER, Third Wave Technologies; siehe z.B. Kwiatkowski et al., Molecular Diagnosis, 4: 353 [1999]) analysiert. Für mutante und Wildtyp-Allele wurden separate Reaktionen durchgeführt. Jede Reaktion wurde dreifach durchgeführt. Für jedes Allel wurden 8 μl einer primären Reaktionsmischung (5 μl 16 PEG, 2 μl 100 mM MOPS und 1 μl 0,5 μM primäre spezifische Oligonukleotide) in eine 96 Punkte Reaktionsmikroplatte (MJ Research) aliquotiert. Ebenfalls wurden Kontrollreaktionen durchgeführt, einschließlich ohne einem DNA-Ziel, einem Wildtyp, einer Mutante und heterozygoten DNA-Kontrollproben, die von bekannten genomischen Kontrollen erhalten wurden und durch PCR amplifiziert wurden. Die Proben wurden für 5 min bei 95°C in einen Thermocycler (MJ Research PTC-200) inkubiert. Dann wurde die Temperatur auf 63°C abgesenkt und 5 μl der entsprechenden Probenreaktionsmischung zu jedem Punkt der Platte gegeben. Die Proben wurden dann bei 63°C für 120 min. inkubiert.
Als nächstes wurden die sekundären Reaktionen unter Verwendung der üblichen Reagenzien, für den Wildtyp als auch den Mutanten-Assay durchgeführt. Die inkubierten Reaktionen wurden auf 56°C gekühlt und 5 μl der sekundären Reaktionsmischung hinzugefügt (1 μl H₂O, 0,5 μl 100 mM MOPS, 0,5 μl 75 mM MgCl₂, 1 μl 30 μl Arrestor, 1 μl sekundäres DNA-Ziel und 1 μl FRET-Probe). Die Reaktionen werden bei 56°C für 120 min. inkubiert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 175 μl 10 mM EDTA gestoppt und 180 μl von jeder Reaktion in eine Mikrotiterplatte übertragen, um in einem CytoFluor Serie 4000 Fluoreszenzvielpunktplattenleser bei einer anregenden Wellenlänge von 485 nM und einer Emissionswellenlänge von 530 nM ausgelesen zu werden.
Abweichungen zwischen dem RFLP und dem „flap" Endonukleasen-Assays wurden durch direkte Sequenzierung unter Verwendung eines ABI Modell 377 automatisierten Sequenzierapparates unter Verwendung eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffterminators aufgelöst.
Die Ergebnisse des genomischen Profils wurden verwendet, um die entsprechenden Entscheidungen über die Versorgung des Patienten, einschließlich der Auswahl der Analgetika und Anästhetika, der Überwachung nach dem chirurgischen Eingriff und zusätzliche Medikationen oder Behandlungen, zu treffen.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4

Claims

Verfahren das aufweist: a) Bereitstellung i) einer von einem perioperativen Subjekt erhaltene Probe; und ii) eines Assays zur Feststellung von zwei oder mehr genetischen Markern, wobei die Marker eine Mutation in zwei oder mehr Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BChE, CYP2D6, MTHFR, MS, CBS, F 5 Leiden, Prothrombin, RYR1, CACNA1S und CPT 2 aufweisen; und b) Einbringen der Probe in den Assay zur Erzeugung eines genomischen Profils zur Verwendung in der Auswahl von Narkosebedingungen bei einer chirurgischen Behandlung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Narkose eine Vollnarkose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Narkose eine Teilnarkose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chirurgische Behandlung eine nicht-invasive chirurgische Behandlung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chirurgische Behandlung eine invasive chi rurgische Behandlung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genomische Profil Informationen in Bezug auf ein pharmakodynamisches Risiko aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genomische Profil Informationen in Bezug auf ein pharmakokinetisches Risiko aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genomische Profil eine vorsymptomatische Diagnose aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genomische Profil Informationen in Bezug auf verschiedene Diagnosen von koexistierenden Krankheiten aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich die pharmakologische Reaktion auf ein Narkosemittel bezieht.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bedingungen für die genannte Verfahrensweise die Auswahl des Narkosemittels ist.