CN109055512A - 一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法；克服现有基因多态性检测技术的缺陷和不足，提供了检测MTHFR和MTRR多态性的引物、探针；该引物、探针能够检测MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，灵敏度高，特异性强，本发明还提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，此外，本发明还提供了使用上述试剂盒检测人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

Description

一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法。
背景技术
叶酸(Folic acid)是一含有蝶啶环的谷氨酸，是人体自身无法合成而需通过食物摄取的B族水溶性维生素，称维生素M、维生素Bc或维生素B9，是米切尔(H.K.Mitchell,1941)从菠菜中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸是细胞生长、分化、修复和宿主防御方面的重要物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸缺乏或代谢障碍会导致DNA生物合成及体内甲基化水平受到干扰，导致疾病的发生。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺陷，而导致畸形。叶酸是胸腺嘧啶、嘌呤核苷酸合成和同型半胱氨酸(Hcy)再甲基化为甲硫氨酸过程中不可缺少的物质。叶酸缺乏会导致高同型半胱氨酸血症，引起机体出现多系统损伤，也是癌症、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、肝细胞受损、血栓闭塞性心脏病、巨幼红细胞性贫血和白细胞减少症、抑郁症、动脉粥样硬化及其他心血管疾病的重要危险因素之一。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成。其基因某些位点变异会对酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸和甲硫氨酸代谢。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR 677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸(A)变成缬氨酸(V)，引起耐热性和酶活性下降，纯合677TT酶活性下降65％以上，杂合MTHFR677CT活性下降30％，在低叶酸的环境下，纯合677TT可显著升高血浆同型氨酸浓度，从而引起静脉栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病，带MTHFR 677TT基因型的母亲在低叶酸环境情况下生育神经管缺陷的病儿的风险也大增加。MTHFR A1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸(E)转变为丙氨酸(A)，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFR C677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接关系，但与MTHFR C677T突变有协同效应。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸保持在无毒水平。其报道最多的单核苷酸多态性是66A>G，中国人群发生率为25.7％，突变导致其酶活与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。因此，对人叶酸代谢基因MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性进行定性检测，可辅助医生对高同型半胱氨酸血症、孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，指导叶酸的个体化服用。
目前检测叶酸MTHFR和MTRR基因多态性的方法主要有测序法、基因芯片发等。其中测序法检测周期长、操作复杂、灵敏度低而且仪器昂贵，不利于推广；基因芯片发机器要求高，成本昂贵，不利于大规模推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有基因多态性检测技术的缺陷和不足，提供了检测MTHFR和MTRR多态性的引物、探针。该引物、探针能够检测MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，灵敏度高，特异性强，本发明还提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，此外，本发明还提供了使用上述试剂盒检测人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。
本发明包括如下内容：
一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，包括引物组和探针：
所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，
所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12。
优选地，所述的试剂盒中所述探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
优选地，所述的试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针，所述引物组包括SEQID NO.13和SEQ ID NO.14，所述探针为SEQ ID NO.15。
优选地，所述的试剂盒中所述针对内参基因的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
优选地，所述的试剂盒包括针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；还包括针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以及针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
优选地，所述的试剂盒中探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
优选地，所述的试剂盒还包括PCR预混液，PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和dUTP。
优选地，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为7种重组质粒的混合液，所述7种重组质粒为含有MTHFR 677C、MTHFR 66T、MTHFR 1298A、MTHFR1298C、MTRR 66A、MTRR 66G和GUSB序列的重组质粒，所述阴性对照品为灭菌超纯水。
一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)设计得到引物和探针，所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR677C>T位点的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；针对MTHFR1298A>C位点的引物SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6；针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，
所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12；
(2)提取待检样本DNA，作为检测模板；
(3)分别配置检测MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C和MTRR 66A>G的PCR反应液；
(4)分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中。
(4)进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火1分钟，50循环。
(5)根据多重荧光定量PCR结果判定基因多态性。
在60℃退火阶段收集荧光信号。
本发明中，上述各个序列编号所涉及的基因序列如下：
SEQ ID NO.1：5’TGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT3’
SEQ ID NO.2：5’GCTGACCTGAAGCACTTGAAG3’
SEQ ID NO.3：FAM-ATGATGAAATCGACTCCCGCAGAC-BHQ1
SEQ ID NO.4：HEX-ATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-BHQ1
SEQ ID NO.5：5’CCCGAGAGGTAAAGAACGAA3’
SEQ ID NO.6：5’GGAGCTGCTGAAGATGTGG3’
SEQ ID NO.7：FAM-CTTCAAAGACACTTGTCTTCACTGGTCAGC-BHQ1
SEQ ID NO.8：HEX-CTTCAAAGACACTTTCTTCACTGGTCAGC-BHQ1
SEQ ID NO.9：5’CAGCAGGGACAGGCAAAG3’
SEQ ID NO.10：5’GAAGATCTGCAGAAAATCCATG3’
SEQ ID NO.11：FAM-TCGCAGAAGAAATGTGTGAGCAAGCT-BHQ1
SEQ ID NO.12：HEX-TCGCAGAAGAAATATGTGAGCAAGCTG-BHQ1
SEQ ID NO.13：5’GATGTTCACTGAAGAGTACCAGAAA3’
SEQ ID NO.14：5’CCACGTATTTTCTGCGTTTTTG3’
SEQ ID NO.15：CY5-TCTGCTAGAGCAGTACCATCTGGGTCTGG-BHQ1
与现有技术相比，本发明有以下优点：
1、本发明提供的人MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针具有高特异性和高灵敏度；
2、使用多重荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭关反应，且添加防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行分型检测，确保结果真实可信；
3、操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中MTHFR 677C/C纯合图；
图2为本发明实施例2中MTHFR 677C/T杂合图；
图3为本发明实施例2中MTHFR 677T/T纯合图；
图4为本发明实施例2中MTHFR 1298A/A纯合图；
图5为本发明实施例2中MTHFR 1298A/C杂合图；
图6为本发明实施例2中MTHFR 1298C/C纯合图；
图7为本发明实施例2中MTRR 66A/A纯合图；
图8为本发明实施例2中MTRR 66A/G杂合图；
图9为本发明实施例2中MTRR 66G/G纯合图；
图10为本发明实施例2中MTHFR 677C/C纯合图(测序)；
图11为本发明实施例2中MTHFR 677C/T杂合图(测序)；
图12为本发明实施例2中MTHFR 677T/T纯合图(测序)；
图13为本发明实施例2中MTHFR 1298A/A纯合图(测序)；
图14为本发明实施例2中MTHFR 1298A/C杂合图(测序)；
图15为本发明实施例2中MTHFR 1298C/C纯合图(测序)；
图16为本发明实施例2中MTRR 66A/A纯合图(测序)；
图17为本发明实施例2中MTRR 66A/G杂合图(测序)；
图18为本发明实施例2中MTRR 66G/G纯合图(测序)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，所使用原料来源于市售，所采用基因检测方法未详细描述的均为本领域技术人员公知的常规操作方法，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
根据目标基因序列设计特异性引物和特异性探针，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。具体引物和探针如下所示：
引物1(MTHFR 677-Fo)：5’TGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT3’
引物2(MTHFR 677-Re)：5’GCTGACCTGAAGCACTTGAAG3’
引物3(MTHFR 1298-Fo)：5’CCCGAGAGGTAAAGAACGAA3’
引物4(MTHFR 1298-Re)：5’GGAGCTGCTGAAGATGTGG3’
引物5(MTRR 66-Fo)：5’CAGCAGGGACAGGCAAAG3’
引物6(MTRR 66-Re)：5’GAAGATCTGCAGAAAATCCATG3’
引物7(GUSB-Fo)：5’GATGTTCACTGAAGAGTACCAGAAA3’
引物8(GUSB-Re)：5’CCACGTATTTTCTGCGTTTTTG3’
探针1(MTHFR 677T-Pr)：FAM-ATGATGAAATCGACTCCCGCAGAC-BHQ1
探针2(MTHFR 677C-Pr)：HEX-ATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-BHQ1
探针3(MTHFR 1298C-Pr)：FAM-CTTCAAAGACACTTGTCTTCACTGGTCAGC-BHQ1
探针4(MTHFR 1298A-Pr)：HEX-CTTCAAAGACACTTTCTTCACTGGTCAGC-BHQ1
探针5(MTRR 66G-Pr)：FAM-TCGCAGAAGAAATGTGTGAGCAAGCT-BHQ1
探针6(MTRR 66A-Pr)：HEX-TCGCAGAAGAAATATGTGAGCAAGCTG-BHQ1
探针7(GUSB-Pr)：CY5-TCTGCTAGAGCAGTACCATCTGGGTCTGG-BHQ1
本实施例的人MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒包含三组探针引物混合液，分别为：
MTHFR C677T探针引物混合液：用于MTHFR 677C>T位点检测，包含特异性上游引物MTHFR 677-Fo和下游引物MTHFR 677-Re，内参基因上游引物GUSB-Fo和下游引物GUSB-Re，特异性探针MTHFR 677T-Pr和MTHFR 677C-Pr，内参基因探针GUSB-Pr。
MTHFR A1298C探针引物混合液：用于MTHFR 1298A>C位点检测，包括上游引物MTHFR 1298-Fo和下游引物MTHFR 1298-Re，内参基因上游引物GUSB-Fo和下游引物GUSB-Re，特异性探针MTHFR 1298C-Pr和MTHFR 1298A-Pr，内参基因探针GUSB-Pr。
MTRRA66G探针引物混合液：用于MTRR 66A>G位点检测，包括上游引物MTRR 66-Fo和下游引物MTRR 66-Re，内参基因上游引物GUSB-Fo和下游引物GUSB-Re，特异性探针包括MTRR 66G-Pr和MTRR 66A-Pr，内参基因探针GUSB-Pr。
PCR预混液包含PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR buffer、MgC l 2、dNTPs和dUTP。
阳性对照品为含有MTHFR677C、MTHFR677T、MTHFR1298A、MTHFR1298C、MTRR66A、MTRR66G、GUSB在内的重组质粒混合液；阴性对照品为灭菌超纯水。
实施例2：
采用本发明实施例1的试剂盒检测人MTHFR和MTRR基因多态性，包括以下步骤：
(1)待测样本处理和模板提取；
随机抽取75人在知情同意下按照医疗常规抽取外周血，用提取试剂盒提取DNA，提取DNA原液作为PCR检测模板。
(2)体系配制将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制各反应混合液(见表1)。
表1检测反应液配制公式
(3)PCR扩增，程序见表2
表2：PCR扩增程序
结果分析
阈值设定：根据不同机型设定阈值，Ct值确定：选择STD反应管，NTC和样品反应管一并划定阈值，得到各体系和内参Ct值
阴性无模板空白对照(NTC)应无扩增曲线升起；
根据△Ct值(△Ct＝FAM信号Ct值-HEX信号Ct值)，判定对应样本的基因多态性，结果判定详见表3。
表3：结果判定
MTHFR和MTRR基因多态性结果见说明图(图1-图9)
76例MTHFR和MTRR基因多态性检测结果，见表:4.
表4 76例MTHFR和MTRR基因多态性检测结果统计
(4)结果验证本发明对上述样本同时进行了测序验证，结果表明75例的检测结果与测序结果完全符合，MTHFR和MTRR基因多态性测序结果分析图见图10-18。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其原料、产品所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括引物组和探针：
所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，
所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQID NO.7和SEQ ID NO.8；针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括针对内参基因的引物组和探针，所述引物组包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，所述探针为SEQ ID NO.15。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，以及针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；还包括针对MTHFR677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8，以及针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液，PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和dUTP。
8.根据权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为7种重组质粒的混合液，所述7种重组质粒为含有MTHFR677C、MTHFR 66T、MTHFR1298A、MTHFR 1298C、MTRR 66A、MTRR 66G和GUSB序列的重组质粒，所述阴性对照品为灭菌超纯水。
9.一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计得到引物和探针，所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，
所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQID NO.7和SEQ ID NO.8；针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
(2)提取待检样本DNA，作为检测模板；
(3)分别配置检测MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C和MTRR66A>G的PCR反应液；
(4)分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；
(4)进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火1分钟，50循环；
(5)根据多重荧光定量PCR结果判定基因多态性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在60℃退火阶段收集荧光信号。
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