CN111187828A - 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体的，涉及叶酸代谢能力检测领域。提供了一种组合物，其检测叶酸代谢能力；与此同时，还提供了所述组合物用于检测叶酸代谢能力的用途、包含所述组合物的试剂盒以及用于检测叶酸代谢能力的方法，使用本发明的组合物以及方法，可以实现一种通道同时检测两种SNP类型，实现了一管多测，节约了时间和成本，并且使得上机检测的样本能够增加。

Description

检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，更具体的，属于人叶酸代谢基因多态性检测领域。
背景技术
叶酸是一种水溶性B族维生素，其代谢产生的活性结构-四氢叶酸，是影响体内同型半胱氨酸代谢的最主要因素。全世界已经公认，妇女围孕期增补叶酸可以预防胎儿神经管缺陷(NTDs)的初发及再发。由于叶酸与DNA的合成密切相关，妇女围孕期若摄入叶酸不足，则会导致同型半胱氨酸(HCY)向甲硫氨酸转化出现障碍，导致高HCY血症或低甲硫氨酸血症。高HCY血症可引起血管内皮损伤、促进血管平滑肌细胞增生，同时引起凝血和纤溶系统功能失调，使血液处于高凝状态。近年来研究发现，血浆中HCY水平升高与习惯性流产、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎、早产、低体重儿等现象的发生密切相关。此外，有研究证明妇女在怀孕的前6周内如果摄入叶酸不足，则生育无脑儿和脑脊柱裂的畸形儿的可能性会增加4倍。
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是由甲硫氨酸(methionine)脱甲基分解产生的一种具有细胞毒性的含硫氨基酸，在代谢过程中由于N5,10～亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的活性低则会导致血浆Hcy含量增高，引起高同型半胱氨酸血症(HHcy)，而SLC19A1 A80G 位点突变可引起叶酸转运缺陷，进而使得对正在发育的胚胎，特别是叶酸穿过胎盘的运输有重要影响。而HHcy是心脑血管疾病、早产、脑梗死、唇腭裂、神经管畸形等的危险因子。对人类体细胞MTHFR基因的C677T、A1298C基因多态性、MTRR基因的A66G基因多态性以及SLC19A1基因的A80G基因多态性做检测，可以发现不同个体对叶酸的吸收利用水平，实现个性化增补叶酸。
中国专利公开CN110257507A公开了一种孕期叶酸代谢检测方法，其中涉及MTHFRC677T位点、MTHFR A1298C位点(MTHFR S2位点)、MTRR A66G 位点(MTRR S2位点)和SLC19A1A80G位点(SLC19A1S1位点)。但是其采用多重PCR-LDR技术结合遗传分析仪的毛细管电泳技术进行检测，此方法需要专业人员才能进行，并且所需检测时间较长，成本较高。因此，针对此问题，现有技术当中采用荧光定量PCR进行检测，中国公开CN108034710A公开了一种基于荧光定量PCR检测MTHFR C677T位点、MTHFR A1298C位点、 MTRR A66G位点的方法，但其一个通道只能检测一种SNP类型，并且其只能实现一管一测，不能实现一管多测，使得上机检测样本受到限制，同时其也未能检测SLC19A1 A80G位点。
有鉴于此，本领域需要一种检测位点全面，可以实现一管多测，从而节约时间和成本，并且使得上机检测的样本增加的产品。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明的提供一种能够检测叶酸代谢能力的组合物，所述组合物包括：
第一组：检测MTHFR C677T位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:3和4所示的探针，和检测MTRR A66G位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物、如SEQ ID NO:6所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:7和8所示的探针；
第二组：检测NTHFR A1298C位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:9 所示的上游引物、如SEQ ID NO:10所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:11所示的下游引物，和检测SLC19A1 A80G位点的寡核苷酸，包括如SEQ ID NO:12 所示的上游引物、如SEQ ID NO:13所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:14所示的下游引物；
其中，第一组与第二组内分别检测两种位点的4种SNP类型所采用的荧光报告基团互不相同且互不干涉。
本发明的组合物能够检测叶酸代谢能力，不需要进行凝胶电泳或其他的一些专业分析，因为不需要专业人员使用。使用本发明的组合物中，能够同时适用全血样本和口腔拭子样本，同时采用荧光探针法和熔解曲线法使得一个通道可以同时检测两个SNP类型，这样，本发明的组合可以一管同时检测4个SNP 位点8种类型，使得整个过程的操作都极其简单，结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定，节约了时间和成本，并且使得上机检测的样本能够增加，并且如实施例3所述，使用本发明组合物的检测结果与二代测序结果一致，表明本发明组合物具有很高的准确性。
在本发明中，荧光报告基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、 CY5、5～TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
第一组寡核苷酸适用于荧光探针法，荧光基团在其探针上；第二组寡核苷酸适用于熔解曲线法，荧光基团在其上游引物上。
进一步地，荧光探针以及具有荧光基团的引物还连有猝灭基团。猝灭基团可以互补干涉地选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB-λ、Dabcyl-λ、TAMRA，但不限于此。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μmol/L；所述组合物中探针的用量为0.2～0.4μmol/L。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测叶酸代谢能力的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR 缓冲液中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还可以包括Mg2+、糖基化酶、dUTP。
在具体的实施方案中，所述核酸释放试剂包括0.01～0.5mmol/L莎梵婷(surfactin)、100～200mmol/L氯化钾、50～200mmol/L氯化锂、质量/体积比为 0.1％～1％十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1％～1％乙基苯基聚乙二醇 (NP～40)、质量/体积比为0.01％～2％十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05％～1％乙醇等组分中的一种或几种。
通过使用这种核酸释放试剂，不需要进行核酸提取，方法及其简单，不需要纯化离心也不需要高温加热，仅需要加入核酸释放试剂进行吹打即可，同时使得核酸释放非常完全，便于后续的PCR扩增操作，提高了检测的准确度，并且也使得能够同时适用全血和口腔拭子的样本检测，可直接检测指尖血样本和口腔拭子样本，口腔拭子样本对人体没有伤害，仅用拭子刮取口腔内壁脱落细胞即可，样本常温保存，输送方便，可真正达到无创取样的目的。
在具体的实施方案中，所述DNA聚合酶为5U/μL～15U/μL；所述糖基化酶为0.05U/μL～0.2U/μL。
通过设置尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)+dUTP防污染体系，利用UNG 酶将可能存在的PCR产物污染充分降解，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还具有阴性对照和阳性对照，其中，阳性对照包含8种SNP靶序列在内的质粒DNA混合液，具体如下：
MTHFR基因677C质粒序列(SEQ ID NO:15)：
CCTGTGGTCTCTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTC TCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGC AGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCG GGAGCCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTC CGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCC CGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCC TCCA；
MTHFR基因677T质粒序列(SEQ ID NO:16)：
CCTGTGGTCTCTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTC TCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGC AGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCG GGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTC CGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCC CGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCC TCCA；
MTHFR基因1298A质粒序列(SEQ ID NO:17)：
GTGCCCTGACCTCTGGGCACCCCTCTGCCAGGGGCAATTCCTCTTCC CCTGCCTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACCTGAAGAGCAA GTCCCCCAAGGAGGAGCTGCTGAAGATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGT GAAGAAAGTGTCTTTGAAGTCTTCGTTCTTTACCTCTCGGGAGAACCAAA CCGGAATGGTCACAAAGTGAGTGATGCTGGAGTGGGGACCCTGGTTCATC CCCTGCCCCTGGCCTGACCCCAGCTGCAGGCCAGGCTGCGGGGCTGTGA CTTCCC；
MTHFR基因1298C质粒序列(SEQ ID NO:18)：
GTGCCCTGACCTCTGGGCACCCCTCTGCCAGGGGCAATTCCTCTTCC CCTGCCTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACCTGAAGAGCAA GTCCCCCAAGGAGGAGCTGCTGAAGATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGT GAAGCAAGTGTCTTTGAAGTCTTCGTTCTTTACCTCTCGGGAGAACCAAA CCGGAATGGTCACAAAGTGAGTGATGCTGGAGTGGGGACCCTGGTTCATC CCCTGCCCCTGGCCTGACCCCAGCTGCAGGCCAGGCTGCGGGGCTGTGA CTTCCC；
MTRR基因66A质粒序列(SEQ ID NO:19)：
AATATCTTTAGGTTGTTACTGCTTCATTAAAAAGAGGATCTTTTTTCCC CCATTTTTCAGTTTCACTGTTACATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTG TTACTATATGCTACACAGCAGGGACAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT ATGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGATTTTCTGCAGATCTTCACTGTATTAG TGAATCCGATAAGGTTAGAGCCGTTACAGTGGATTTTACCGTTTTGTGCTT TGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTGATATTTATGAAACAAAAGGACACTAA；
MTRR基因66G质粒序列(SEQ ID NO:20)：
AATATCTTTAGGTTGTTACTGCTTCATTAAAAAGAGGATCTTTTTTCCC CCATTTTTCAGTTTCACTGTTACATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTG TTACTATATGCTACACAGCAGGGACAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT GTGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGATTTTCTGCAGATCTTCACTGTATTAG TGAATCCGATAAGGTTAGAGCCGTTACAGTGGATTTTACCGTTTTGTGCTT TGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTGATATTTATGAAACAAAAGGACACTAA；
SLC19A1基因80A质粒序列(SEQ ID NO:21)：
CTGACTCCACCCCTCCTTCCAGGCACAGCGTCACCTTCGTCCCCTCC GGAGCTGCACGTGGCCTGAGCAGGATGGTGCCCTCCAGCCCAGCGGTGG AGAAGCAGGTGCCCGTGGAACCTGGGCCTGACCCCGAGCTCCGGTCCTG GCGGCACCTCGTGTGCTACCTTTGCTTCTACGGCTTCATGGCGCAGATACG GCCAGGGGAGAGCTTCATCACCCCCTACCTCCTGGGGCCCGACAAGAACT TCACGCGGGAGCAGGCATGTGGGTGCCGGGGTGCCGGGCGGCCGCCTGT GGGTGG；
SLC19A1基因80G质粒序列(SEQ ID NO:22)：
CTGACTCCACCCCTCCTTCCAGGCACAGCGTCACCTTCGTCCCCTCC GGAGCTGCACGTGGCCTGAGCAGGATGGTGCCCTCCAGCCCAGCGGTGG AGAAGCAGGTGCCCGTGGAACCTGGGCCTGACCCCGAGCTCCGGTCCTG GCGGCGCCTCGTGTGCTACCTTTGCTTCTACGGCTTCATGGCGCAGATACG GCCAGGGGAGAGCTTCATCACCCCCTACCTCCTGGGGCCCGACAAGAACT TCACGCGGGAGCAGGCATGTGGGTGCCGGGGTGCCGGGCGGCCGCCTGT GGGTGG；
阴性对照：0.9％生理盐水。
第四方面，提供了一种用于检测叶酸代谢能力的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是全血、口腔拭子等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0002382231950000071
在具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0002382231950000072
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0002382231950000073
Figure BDA0002382231950000081
附图说明
图1为本发明组合物检测外周血的MTHFR 677C扩增曲线；
图2为本发明组合物检测外周血的MTHFR 677T扩增曲线；
图3为本发明组合物检测外周血的MTHFR1298A熔解曲线；
图4为本发明组合物检测外周血的MTHFR 1298C熔解曲线；
图5为本发明组合物检测外周血的MTRR 66A扩增曲线；
图6为本发明组合物检测外周血的MTRR 66G扩增曲线；
图7为本发明组合物检测外周血的SLC19A1 80A熔解曲线；
图8为本发明组合物检测外周血的SLC19A1 80G熔解曲线；
图9为本发明组合物检测口腔拭子的MTHFR 677C扩增曲线；
图10为本发明组合物检测口腔拭子的MTHFR 677T扩增曲线；
图11为本发明组合物检测口腔拭子的MTHFR1298A熔解曲线；
图12为本发明组合物检测口腔拭子的MTHFR 1298C熔解曲线；
图13为本发明组合物检测口腔拭子的MTRR 66A扩增曲线；
图14为本发明组合物检测口腔拭子的MTRR 66G扩增曲线；
图15为本发明组合物检测口腔拭子的SLC19A1 80A熔解曲线；
图16为本发明组合物检测口腔拭子的SLC19A1 80G熔解曲线；
图17为本发明对比例组合物检测阳性对照的四通道扩增曲线；
图18为本发明对比例组合物检测阳性对照的四通道熔解曲线。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于 MTHFR基因rs1801133(C677T)和rs1801131位点(A1298C)、MTRR基因 rs1801394位点(A66G)和SLC19A1基因rs1051266位点(A80G)前后150bp 分别作为靶区域。
MTHFR基因C677T引物探针序列如下：
MTHFR-677-F：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAG-3’(SEQ ID NO:1)；
MTHFR-677-R：5’-CGGTGCATGCCTTCACAAA-3’(SEQ ID NO:2)；
MTHFR-677C-P：5’-ATGAAATCGGCTCCC-3’(SEQ ID NO:3)；
MTHFR-677T-P：5’-TGGAGTCGATTTCA-3’(SEQ ID NO:4)；
确定MTRR基因引A66G物探针序列如下：
MTRR-66-F：5’-GTTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT-3’(SEQ ID NO:5)；
MTRR-66-R：5’-GATCTGCAGAACATCCATGTACCAC-3’(SEQ ID NO:6)；
MTRR-66A-P：5’-ATCGCAGAAGAAATATGTG-3’(SEQ ID NO:7)；
MTRR-66G-P：5’-TCGCAGAAGAAATGTGTG-3’(SEQ ID NO:8)；
MTHFR基因A1298C引物探针序列如下(在近3’端T碱基上标记荧光基团)：
MTHFR-1298A-F：5’-CGGGAGGAGCTGACCAGTGAAGA-3’(SEQ ID NO:9)；
MTHFR-1298C-F：5’-CGGGAGGAGCTGACCAGTGAAGC-3’(SEQ ID NO:10)；
MTHFR-1298-R：5’-CCCACTCCAGCATCACTCACT-3’(SEQ ID NO:11)；
确定SLC19A1基因A80G引物探针序列如下(近3’端T碱基上标记荧光基团)：
SLC19A1-80A-F：5’-ACCCCGAGCTCCGGTCCTGGCGGCA-3’(SEQ ID NO:12)；
SLC19A1-80G-F：5’-ACCCCGAGCTCCGGTCCTGGCGGCG-3’(SEQ ID NO:13)；
SLC19A1-80-R：5’-AGCCGTAGAAGCAAAGGTAGCA-3’(SEQ ID NO:14)。
其中，MTRR-66A-P和MTHFR-1298A-F的荧光基团为FAM；MTRR-66G-P 和MTHFR-1298C-F的荧光基团为HEX；MTRR-66A-P和SLC19A1～80A～F的荧光基团为ROX；MTRR-66G-P和SLC19A1-80G-F的荧光基团为CY5；与此同时，荧光探针的3’端还连有MGB，具有荧光基团的引物5’端还连有BHQ1。
实施例2、检测叶酸代谢能力的方法
1、试剂准备：
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(反应液42～46μL/ 人份+酶混合液2～3μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR～mix，瞬时离心后备用。
2、样本处理
(1)样本采集
a.指尖采血：先用酒精棉球在无名指内侧消毒，然后用一次性采血针穿刺，让血液自然流出，收集血液至抗凝管，总量约0.2～0.3毫升。采血结束用干棉球压住穿刺部位2～3分钟；
b.口腔拭子：采样前用清水漱口两次去除口腔异物，用拭子采样头擦拭两侧口腔壁10次左右，将采样头折断放入保存管，拧紧管盖即完成一次采样。注意在取样前30分钟不要吃食、吸烟、饮酒等；
(2)每个PCR反应管中加入核酸释放剂3～7μL(建议深吸浅打，避免出现气泡)，并依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照各3～7μL，吸打3～5次混匀；
(3)取1～6μL样本混合液至PCR反应管中，各管加入44～49μL PCR～mix，吸打混匀2～3次，盖上管盖，2000rpm离心30秒。
3荧光PCR反应与结果分析
(1)将PCR反应管放入扩增仪样本槽，按对应顺序设置待测样本名称。
(2)根据所使用的荧光基团选择荧光检测通道：
选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测MTHFR 677C和 1298A；
选择HEX通道(Reportere:CY5,Quencher:None)检测MTHFR 677T和 1298C；
选择ROX通道(Reportere:HEX,Quencher:None)检测MTRR 66A和 SLC19A1 80A；
选择CY5通道(Reportere:ROX,Quencher:None)检测MTRR 66G和 SLC19A1 80G。
(3)荧光定量PCR反应条件为：
Figure BDA0002382231950000111
(4)结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，也可以利用仪器自带的结果解读软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值、Tm从而得出分型结果。仪器软件可根据各样本Ct值和 Tm值自动判读分型结果。具体如下：
若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示MTHFR基因677C 检测结果为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；若FAM通道检测到Tm (64.5～66.7℃)特征峰，表示MTHFR基因1298A检测结果为阳性，若无熔解曲线特征峰或Tm不在64.5～66.7℃之间，则为阴性；
B)若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示MTHFR基因677T检测结果为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；若HEX通道检测到 Tm(64.5～67.3℃)特征峰，表示MTHFR基因1298C检测结果为阳性，若无熔解曲线特征峰或Tm不在64.5～67.3℃之间，则为阴性；
C)若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示MTRR基因 66A检测结果为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；若ROX通道检测到Tm (68.5～71.0℃)特征峰，表示SLC19A1基因80A检测结果为阳性，若无熔解曲线特征峰或Tm不在68.5～71.0℃之间，则为阴性；
D)若CY5通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示MTRR基因 66G检测结果为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；若CY5通道检测到Tm (63.5～65.8℃)特征峰，表示SLC19A1基因80G检测结果为阳性，若无熔解曲线特征峰或Tm不在63.5～65.8℃之间，则为阴性；
总的来说，阴阳性判断方法如下表1所示：
表1
Figure 1
Figure 2
获取外周血和口腔拭子样本，按照上述方法进行检测，检测结果分别如图 1～16所示。
实施例3、检测结果与二代测序结果对比测试
按照本发明提供的实验方案测试检测结果未知的8例外周血样本与Sanger 测序结果进行对比，结果如下：
Figure BDA0002382231950000132
Figure BDA0002382231950000141
结论：本发明测试外周血样本各种基因型均能很好地检出，人MTHFR基因、MTRR基因和SLC19A1基因多态性核酸检测试剂盒检测结果与MTHFR 基因rs1801133(C677T)和rs1801131位点(A1298C)、MTRR基因rs1801394 位点(A66G)和SLC19A1基因rs1051266位点(A80G)基因多态性检测Sanger 测序检测结果完全一致。
对比例1、对比引物和探针的检测结果
在引物和探针设计过程中，发明人还设计了其余的引物和探针同样用于检测叶酸代谢能力。具体如以下序列所示：
MTHFR基因C677T引物探针序列如下：
MTHFR-677-F：5’-GCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’(SEQ ID NO:23)；
MTHFR-677-R：5’-GGGCAAGTGATGCCCATGT-3’(SEQ ID NO:24)；
MTHFR-677C-P：5’-ATGAAATCGGCTCCC-3’(SEQ ID NO:3)；
MTHFR-677T-P：5’-ATGATGAAATCGACTCCC-3’(SEQ ID NO:26)；
确定MTRR基因引A66G物探针序列如下：
MTRR-66-F：5’-GATGAGGAGGTTTCTGTTACTATATGCTAC-3’(SEQ ID NO:27)；
MTRR-66-R：5’-CGAACCTTATCGGATTCACTAATACAG-3’(SEQ ID NO:28)；
MTRR-66A-P：5’-CTTGCTCACATATTTC-3’(SEQ ID NO:29)；
MTRR-66G-P：5’-TTGCTCACACATTTC-3’(SEQ ID NO:30)；
MTHFR基因A1298C引物探针序列如下(在近3’端T碱基上标记荧光基团)：
MTHFR-1298A-F：5’-CGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’(SEQ ID NO:31)；
MTHFR-1298C-F：5’-CGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’(SEQ ID NO:32)；
MTHFR-1298-R：5’-GACCATTCCGGTTTGGTTCTC-3’(SEQ ID NO:33)；
确定SLC19A1基因A80G引物探针序列如下(近3’端T碱基上标记荧光基团)：
SLC19A1-80A-F：5’-ACCCCGAGCTCCGGTCCTGGCGCCA-3’(SEQ ID NO:34)；
SLC19A1-80G-F：5’-ACCCCGAGCTCCGGTCCTGGCGCCG-3’(SEQ ID NO:35)；
SLC19A1-80-R：5’-AGGTAGGGGGTGATGAAGCTCTC-3’(SEQ ID NO:36)。
将如上所述的组合物用于检测8种混合质粒的阳性对照，得到的结果如图 17-18所示，由图中可以看出检测的四通道扩增曲线和四通道熔解曲线效果均不好，扩增曲线中仅有一条通道具有扩增曲线，溶解曲线的通道也有未有峰值的通道，因此，该组合物不能检测出对应的突变。

Claims (10)

1.一种能够检测叶酸代谢能力的组合物，所述组合物包括：
第一组：检测MTHFR C677T位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:3和4所示的探针，和检测MTRR A66G位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物、如SEQ ID NO:6所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:7和8所示的探针；
第二组：检测NTHFR A1298C位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:9所示的上游引物、如SEQ ID NO:10所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:11所示的下游引物，和检测SLC19A1A80G位点的寡核苷酸，包括如SEQ ID NO:12所示的上游引物、如SEQ ID NO:13所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:14所示的下游引物；
其中，第一组与第二组内分别检测两种位点的4种SNP类型所采用的荧光报告基团互不相同且互不干涉。
2.根据权利要求1所示的组合物，其中，所述荧光报告基团可以且互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5～TAMRA、TET、CY3和JOE。
3.权利要求1或2所述的组合物在制备检测叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。
4.一种用于检测叶酸代谢能力的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种；优选的，dNTP为2～3mmol/L、PCR缓冲液为3～7μL、DNA聚合酶为5U/μL～15U/μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述核酸释放试剂包括0.01～0.5mmol/L的莎梵婷(surfactin)、100～200mmol/L的氯化钾、50～200mmol/L的氯化锂、质量/体积比为0.1％～1％的十二烷基硫酸三叶酸胺、体积/体积比为0.1％～1％的乙基苯基聚乙二醇(NP～40)、质量/体积比为0.01％～2％的十二烷基磺酸钠和体积/体积比为0.05％～1％的乙醇。
7.一种用于检测叶酸代谢能力的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；优选地，所述样本为全血或者口腔拭子；
2)使用如权利要求1或2所述的组合物或权利要求4～6中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
8.根据权利要求7所述的方法，所述第一组寡核苷酸适用于荧光探针法，所述第二组寡核苷酸适用于熔解曲线法。
9.根据权利要求8所述的方法，通过判断扩增曲线和CT值来分析结果。
10.根据权利要求7～9任一项所述的方法，其中，所述荧光定量PCR的反应条件为：
Figure FDA0002382231940000021
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