CN103805702A - 一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒，属于生物检测技术领域。所述用于检测钩虫核酸的引物和荧光探针，引物包括正向引物和反向引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3。所述用于检测钩虫核酸的试剂盒包括上述的引物和荧光探针。本发明提供的引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测。

Description

一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。
背景技术
寄生于人体的钩虫（Hookworm，HW）主要包括十二指肠钩口线虫（Ancylostomaduodenale Dubini）、美洲板口线虫（Necator americanusStiles）、锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum Loose）以及巴西钩虫（Ancylostoma braziliense），其中，锡兰钩虫和巴西钩虫会偶尔寄生于人体。钩虫病是指钩虫寄生于脊椎动物体内引起的疾病，目前全世界约有13亿人感染钩虫病，钩虫病的流行导致每年约55000人死亡，作为影响人类健康的主要寄生虫病之一，钩虫病仍是一些热带及亚热带发展中国家的主要公共卫生问题。现有技术中对钩虫的快速检测方法为实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，实时荧光定量PCR技术与传统的核酸扩增技术方法相比，避免了核酸扩增技术的污染以及检测结果易出现假阳性或假阴性结果的问题，且实时荧光定量PCR技术比核酸扩增技术的检测结果特异性更高。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
虽然实时荧光定量PCR技术检测的结果特异性高，但仍不能达到100%的特异性和准确性，现有的实时荧光定量PCR技术的扩增效率甚至不能达到90-110%，PCR扩增效率越低，那么灵敏度也越低，导致其准确度也越低，使得现有的检测方法并不能准确地检测出人体是否患有钩虫病。
发明内容
为了解决现有技术中检测方法不准确且效率低的问题，本发明实施例提供了一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。所述技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种用于检测钩虫核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；
所述反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；
所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3；
所述荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的所述荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
另一方面，本发明提供了一种用于检测钩虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和荧光探针。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，其中：
所述PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer和含Mg离子的溶液。
所述核酸释放试剂由无菌水、Triton-X100、NP-40和Tris-HCL组成。
所述阴性质控品为不含钩虫的5.8S rRNA基因的pUC57-T载体质粒DNA。
所述阳性质控品为1.0×106IU/mL含所述钩虫的基因组DNA片段。
所述临界阳性质控品为1.0×104IU/mL含所述钩虫的基因组DNA片段。
具体地，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
进一步地，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL，所述dNTPs的终浓度为0.2～0.6mM，所述10×PCR Buffer的终浓度为1×，所述MgCl2的终浓度为1.5～5.0mM，溶剂为无菌水。
具体地，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。
具体地，所述核酸释放试剂中所述Triton-X100的终浓度为0.03～0.3%，所述NP-40的终浓度为0.04～0.4%，所述Tris-HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水。
进一步地，所述Tris-HCL的pH值为8.3。
进一步地，所述试剂盒还包括工作标准品，所述工作标准品为含有所述钩虫的5.8S rRNA基因的90个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
具体地，所述工作标准品包括：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例通过在十二指肠钩虫、美洲钩虫、锡兰钩口线虫以及巴西钩虫的5.8S rRNA上选择一段保守序列，并针对该序列设计引物和探针，使得该引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测，且本发明能够准确检测出待测样品中是否含有十二指肠钩虫、美洲钩虫、锡兰钩口线虫以及巴西钩虫中的任一种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例二提供的荧光扩增曲线图；
图2是本发明实施例三提供的荧光扩增曲线图；
图3是本发明实施例四提供的荧光扩增曲线图；
图4是本发明实施例四提供的四种标准品的荧光扩增曲线图；
图5是本发明实施例四提供的荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例四提供的由图4得到的标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
以下实施例中所用试剂主要购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例一
本发明实施例提供一种用于检测钩虫核酸的引物和荧光探针，其中，选择钩虫的特异性保守基因5.8S rRNA基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），获得钩虫5.8S rRNA基因序列，并在线（http://www.ebi.ac.uk/）分别对十二指肠钩虫、美洲钩虫、锡兰钩口线虫以及巴西钩虫的5.8SrRNA基因序列进行序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：CGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTATTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCG，利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件BeaconDesigner7.0设计引物和荧光探针序列，引物和荧光探针序列要满足软件中各项指标。
在本发明实施例中，修饰荧光探针的5'端的荧光报告基团可以为：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；修饰荧光探针的3'端的淬灭基团可以为：TAMRA，Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量PCR的扩增，只需根据探针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团：FAM、HEX、TET和FAM的激发波长为470-650nm，接收波长为500-700nm；淬灭基团：Eclipse、TAMRA、BHQ1。引物合成后的纯化方式可以为：HAP、PAGE和HPLC纯化方式。具体设计结果如表1所示：
表1本发明实施例一提供的引物和荧光探针
Figure BDA0000463758270000041
表中：F：forward，正向；HW-F表示用于检测钩虫核酸的正向引物。
R：reverse，反向；HW-R表示用于检测钩虫核酸的反向引物。
P：probe，荧光探针；HW-P表示用于检测钩虫核酸的荧光探针，该荧光探针为TaqMan荧光探针。
表1中设计的引物和荧光探针均委托宝生物工程（大连）有限公司合成。
实施例二
本发明实施例提供一种用于检测钩虫核酸的试剂盒，该试剂盒的总体积为50μL（包括样品体积），该试剂盒包括实施例一提供的引物和荧光探针，其中，正向引物、反向引物和荧光探针的浓度为10μmol/L 2.5μL，该试剂盒还包括：PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中：
1、PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer和含Mg离子的溶液。其中，浓度为5U/μL的具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶0.3μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL，10×PCR Buffer 5μL，浓度为25mmol/L的MgCl2溶液5μL，添加无菌水至体积为42μL。其中，具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶可以为Taq酶。
2、核酸释放试剂由终浓度为0.03%的Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）、终浓度为0.04%的NP-40（壬基酚聚氧乙烯（40）醚）和终浓度为0.01M的Tris-HCL，溶剂为无菌水组成，其中，Tris-HCL的pH值为8.3。
3、阴性质控品为不含钩虫的5.8S rRNA基因的pUC57-T载体质粒DNA。具体地，取不含钩虫的5.8S rRNA基因的pUC57-T载体质粒DNA溶液于进行预处理，采用比浊法定量稀释至浓度为1×107IU/mL，吸取该质粒DNA溶液于离心管中，混匀，直接吸取混匀后的液体0.5μL作模板。其中，pUC57-T载体为基因工程中常用的载体，在GenBank中序列号为Y14837.1。
4、阳性质控品为1.0×106IU/mL含钩虫的基因组DNA片段。具体地，该阳性质控品为高浓度（例如1×107IU/mL）的含钩虫发热基因组的DNA片段溶液100μL加入等体积的核酸释放试剂充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×106IU/mL，即可作为阳性质控品模板。
5、临界阳性质控品为1.0×104IU/mL含钩虫的基因组DNA片段。取含钩虫的菌液100μL加入等体积的核酸释放试剂，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×104IU/mL，即可作为临界阳性质控品模板。
6、工作标准品为含有钩虫的5.8S rRNA基因的90个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。该工作标准品用于制备标准曲线，以便于对钩虫进行定量检测。
进一步地，工作标准品包括：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
具体地，工作标准品为含有钩虫的高度保守基因5.8S rRNA基因的90个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×109IU/mL，-20℃保存。贮存浓度为1.0×109IU/mL，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS缓冲液（phosphate buffersolution，磷酸缓冲液）进行10倍梯度的系列稀释，其中PBS缓冲液的pH值为7.4。工作标准品的工作浓度依次为1.0×107IU/mL，1.0×106IU/mL，1.0×105IU/mL和1.0×104IU/mL，使用前，经5000rmp离心10s，取离心后的上清液作为模板。本发明的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：
表2为本发明实施例二提供试剂盒组成
Figure BDA0000463758270000071
本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，有效期6个月，适用仪器：ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、StratageneMx3005P和达安7000等。
采用本发明实施例二提供的试剂盒在ABI7500荧光定量PCR仪上检测的方法，具体如下：
（1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品。
①自然排便法（常规方法）：参与实验的8个人自然排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便约2-3g（液体粪便则取絮状物1-3ml）盛于灭菌广口瓶或蜡纸盒送检。若无粘液、脓血，则在粪便上多点采集送检。
②直肠拭子法：本法只适用于排便困难患者或婴幼儿，不推荐使用拭子做常规性病原菌培养。可用肥皂水将肛门周围洗净，用蘸有无菌生理盐水的棉拭子插入肛门，成人约4-5cm，儿童约2-3cm，与直肠粘膜表面接触，轻轻轻旋转拭子，可在拭子上明显见到粪便，插入运送培养基内，立即送检。
样品保存和运输：如果样品不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标品长途运送应采用0℃冰壶。
（2）样品处理：采用盐水浮聚法，取适量大小粪便，采用20%盐水浮聚法于10ml的20%盐水进行浮聚30min，挑去上层粪渣，吸取200μl上清液进行核酸提取，取待测样品和等量体积核酸释放试剂充分混匀后，即为处理后的样品。
（3）加样：向装有PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品以及临界阳性质控品的体积比为84：1：1：1：1，经5000rpm离心10s。
（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的Taqman荧光探针（本产品荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为Eclipse），定义样品孔：阴性质控品为NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品为Unknown。按表3提供的扩增程序进行PCR扩增：
表3为PCR扩增反应扩增程序
Figure BDA0000463758270000081
在扩增程序的第三步的终了读取荧光值；
（5）分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于37的为临界阳性。本发明实施例提供的试验结果如图1所示（图1在Ct值为37时已经可以判断出样品结果），具体检测结果见下表：
表4为本发明实施例二提供的检测结果
序号 Ct
1 30.11
2 27.83
3 N/A
4 26.72
5 25.87
6 N/A
7 23.01
8 N/A
注：N/A表示阴性。
其中，样品2、4、5、7在阳性范围内，为阳性样品；样品1在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品3、6、8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知结果一致，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
实施例三
本发明提供的实施例与实施例二的区别为试剂盒中试剂的含量不同，该区别具体如下：
本发明实施例采用实施例一提供的正向引物、反向引物和荧光探针的浓度为10μmol/L0.25μL，并且，本实施例中的荧光探针的5'端的荧光报告基团为TET；修饰荧光探针的3'端的淬灭基团为BHQ1。
1、PCR反应液包括：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL；浓度为10mmol/L的dNTPs1μL；10×PCR Buffer5μL；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液3μL，加入无菌水至体积为9.25μL。
2、核酸释放试剂中终浓度为0.1%的Triton-X100、终浓度为0.2%的NP-40和终浓度为0.05M的Tris-HCL，溶剂为无菌水。本实施例的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：
表5为本发明实施例三提供的试剂盒组成
Figure BDA0000463758270000091
用本实施例提供的试剂盒在SLAN8.2荧光定量PCR仪上按实施例2的方法检测钩虫核酸：
（1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品；
①自然排便法：同实施例2；
②直肠拭子法：同实施例2；
标品保存和运输：同实施例2。
（2）样品处理：同实施例2。
（3）加样：向装有9.25μLPCR反应液的PCR反应管中加入引物和探针，然后再分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5000rpm离心10s。
（4）PCR扩增：同实施例2。
（5）分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于37的为临界阳性。本发明实施例提供的试验结果如图2所示（图2在Ct值为37时已经可以判断出样品结果），具体检测结果见下表：
表6为本发明实施例三提供的检测结果
序号 Ct
1 25.81
2 N/A
3 N/A
4 26.23
5 30.07
6 25.63
7 25.48
8 24.08
9 21.57
10 26.91
其中，样品1、4、6、7、8、9和10在阳性范围内，为阳性样品，与已知检测结果相符；样品5在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品2和3在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
实施例四
本发明提供的实施例与实施例二和实施例三的区别为试剂盒中试剂的含量不同，该区别具体如下：
本发明实施例采用实施例一提供的正向引物、反向引物和荧光探针的浓度为10μmol/L 4.5μL，并且，荧光探针的5'端的荧光报告基团为HEX；修饰3'端的淬灭基团为TAMRA。
1、PCR反应液包括：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL；浓度为10mmol/L的dNTPs 3μL；10×PCR Buffer 5μL；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液10μL，加入无菌水至体积为31.5μL。
2、核酸释放试剂中Triton-X100的终浓度为0.3%、NP-40的终浓度为0.4%和Tris-HCL的终浓度为0.1M，溶剂为无菌水。
表7为本发明实施例四提供的试剂盒成分
Figure BDA0000463758270000121
用本实施例提供的试剂盒在SLAN8.2荧光定量PCR仪上检测钩虫核酸的方法如下：
1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品；
①自然排便法：同实施例2；
②直肠拭子法：同实施例2；
标品保存和运输：同实施例2。
（2）样品处理：同实施例2。
（3）加样：向装有PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品的体积比为6.3：1：1：1：1，盖好管盖，5000rpm离心10s；
（4）PCR扩增：同实施例2。
本发明实施例提供的检测结果如图3所示（图3在Ct值为37时已经可以判断出样品结果），检测结果见下表：
表8为本发明实施例四提供的检测结果
序号 Ct
1 N/A
2 39.53
3 30.07
4 25.63
5 24.08
6 34.27
7 35.37
8 26.91
其中，样品4、5和8在阳性范围内，为阳性样品，与检测已知结果相符；样品3、6和7在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品1和2在阴性范围内，为阴性样品，与检测已知结果相符，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
前述实施例提供的试剂盒还可以用于定量分析钩虫核酸，具体过程如下：以4个工作标准品的拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线（参见图6），该标准曲线用于定量分析钩虫核酸，具体地，取8个样品反应管，另取3个反应管分别加入阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，再另取4个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的4个工作标准品各5μL，按照本实施例的方法配制PCR反应液，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。在仪器上，针对工作标准品选择Standard，并在Quantity栏中分别输入1.0×107IU/ml、1.0×106IU/ml、1.0×105IU/ml和1.0×104IU/ml。
使用仪器ABI7500参照结果：
a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞37，则判定样品中钩虫的DNA含量小于检测下限；
b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤37，则样品中钩虫的DNA含量处于临界阳性范围；
c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：
若样品的C（“C”表示样品的浓度或含量）满足：C＜5.0000E+01，则该样品中钩虫的DNA总含量＜50基因拷贝；
若样品的C满足：5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品中钩虫的DNA总含量等于C基因拷贝；
若样品的C满足：C＞5.0000E+07，则该样品中钩虫的DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测，其中，线性范围为1.0×107IU/ml-1.0×102IU/ml。
根据下表绘制的工作标准品的荧光扩增曲线（参见图4），图4在Ct值为37时已经可以判断出样品结果，参见表9：
表9为实施例四提供的扩增后的检测结果：
工作标准品 Ct C（初始浓度）
1.0e+007 18.67 1.0e+007
1.0e+006 21.98 1.0e+006
1.0e+005 25.36 1.0e+005
1.0e+004 28.61 1.0e+004
slope -3.322 —
intercept 44.926 —
R2 1.000 —
标准方程 y=-3.322x+44.926 —
上述结果中，R2为1.000表示：当0<|r|<1时，表示x和y两变量存在一定程度的线性相关，且|r|越接近1，两变量间线性关系越密切；|r|越接近于0，表示两变量的线性相关越弱；斜率slope为-3.322表示：扩增效率E为100%（按照10-1/slope-1=Ex或E=10-1/S-1计算可知），扩增效率E越高，以保证定量的准确性。
本发明实施例提供的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的初始浓度如下表：
表10为工作标准品和8个样品的初始浓度
序号 Ct C（初始浓度）
阳性质控品 24.96 1.024e+006
临界阳性质控品 29.95 3.222e+004
阴性质控品 N/A —
1 34.98 9.862e+002
2 26.96 2.560e+005
3 23.97 2.036e+006
4 N/A —
5 N/A —
6 30.16 2.785e+004
7 24.95 1.031e+006
8 23.95 2.062e+006
表10中的数据精确到0.01。
如图5所示，图5为根据表10的8个样本绘制的荧光扩增曲线，在Ct值为37时已经可以判断出样品结果。表10中样品均来源于武汉大学人民医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品，样品2、3、7和8在阳性范围内，为阳性样品，与检测已知结果相符；样品1和6在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品4和5在阴性范围内，为阴性样品，与检测已知结果相符，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
如图4和图6所示，图4中扩增曲线均呈光滑"S"型，图6中标准曲线为一条直线，Ct值在18-29之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.32。检测下限可精确到102，证明本发明提供的试剂盒具有高灵敏度。
本发明实施例提供的用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒，通过在十二指肠钩虫、美洲钩虫、锡兰钩口线虫以及巴西钩虫的5.8S rRNA上选择一段保守序列，并针对该序列设计引物和探针，使得该引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测，且本发明能够准确检测出待测样品中是否含有十二指肠钩虫、美洲钩虫、锡兰钩口线虫以及巴西钩虫中的任一种钩虫。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间，同时，在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数（Ct值）就可以直接报告出DNA起始拷贝数，进一步可用于人类钩蚴性皮炎、钩虫性哮喘、消化道病变和贫血等疾病的病原体基因检测技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>武汉百泰基因工程有限公司
<120>一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒
<160>4
<170>PatentIn version3.4
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cgattcgcgt atcgatgaaa a                    21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cgctatgcgt tcaaaatttc ac                   22
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgcgttattt accacgaatt gcagacgc                                      28
<210>4
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cgattcgcgt atcgatgaaa aacgcagcta gctgcgttat ttaccacgaa ttgcagacgc   60
ttagagtggt gaaattttga acgcatagcg                                    90
Figure IDA0000463758360000011

Claims (10)

1.一种用于检测钩虫核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于，
所述正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；
所述反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；
所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3；
所述荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.一种用于检测钩虫核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，其中：
所述PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer和含Mg离子的溶液；
所述核酸释放试剂由无菌水、Triton-X100、NP-40和Tris-HCL组成；
所述阴性质控品为不含钩虫的5.8S rRNA基因的pUC57-T载体质粒DNA；
所述阳性质控品为1.0×106IU/mL含所述钩虫的基因组DNA片段；
所述临界阳性质控品为1.0×104IU/mL含所述钩虫的基因组DNA片段。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL，所述dNTPs的终浓度为0.2～0.6mM，所述10×PCR Buffer的终浓度为1×，所述MgCl2的终浓度为1.5～5.0mM，溶剂为无菌水。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放试剂中所述Triton-X100的终浓度为0.03～0.3%，所述NP-40的终浓度为0.04～0.4%，所述Tris-HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCL的pH值为8.3。
9.根据权利要求3-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括工作标准品，所述工作标准品为含有所述钩虫的5.8S rRNA基因的90个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL所述钩虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
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