CN102876774A - 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102876774A CN102876774A CN2012103205324A CN201210320532A CN102876774A CN 102876774 A CN102876774 A CN 102876774A CN 2012103205324 A CN2012103205324 A CN 2012103205324A CN 201210320532 A CN201210320532 A CN 201210320532A CN 102876774 A CN102876774 A CN 102876774A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- streptococcus pneumoniae
- sample
- primer
- quality control
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法，所述的引物包括正向引物和反向引物。所述的试剂盒可用于定量检测肺炎链球菌核酸，其中含有上述引物和荧光探针，还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品。利用本发明的引物和荧光探针及所述的试剂盒定量检测肺炎链球菌核酸的方法包括下列步骤：（1）采集样品；（2）样品处理；（3）加样；（4）PCR扩增；（5）分析判断。本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒能够精确定量，其检测方法能够快速检测肺炎链球菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）属链球菌科链球菌属细菌，革兰染色阳性。它不产生内、外毒素，其致病性主要是荚膜的侵袭作用：无荚膜的变异株无毒力，有荚膜的肺炎球菌可抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于细菌在宿主体内定居并繁殖。根据细菌荚膜的多糖抗原性可将肺炎链球菌分为多于90种血清型，不同血清型具有不同的致病性。
75%的成年人肺炎链球菌肺炎及50%以上严重的肺炎链球菌菌血症是由1～84型肺炎链球菌引起。成人肺炎链球菌肺炎中75%由1、2、3、4、5、7、8、12、14和19型引起，其中3型产生大量荚膜物质，毒性强而且病死率高。肺炎链球菌6、14、19及23型，常引起儿童肺炎链球菌性疾病，其中第14型肺炎链球菌感染最常见，可继发胸膜炎、脓胸、中耳炎、脑膜炎和败血症等。肺炎链球菌主要引起呼吸道感染，是目前常见的飞沫和呼吸道分泌物传播疾病。肺炎链球菌感染率与年龄、性别、地区和季节有关，在免疫能力弱或有不良生活习惯的人群中更容易被感染，也常在家庭、学校、托儿所或军队等密集人群中小规模流行。肺炎链球菌也可侵入机体其它部位，引起继发性胸膜炎、中耳炎、乳突炎以及心内膜炎等。因此对肺炎链球菌感染要尽快针对不同病情给以恰当的治疗。随着科技的进步，各种各样新的检测方法也都已应用到致病菌的检测中。现有技术中对肺炎链球菌的快速检测方法如下：1、传统的培养方法（国标法），即从血液或胸腔积液培养分离获得SP仍然作为诊断的金标准；2、乳胶凝集法，该法是一种针对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法；3、自动化方法，目前微生物检测的自动化仪器已普遍使用，对于肺炎链球菌检测常见方法有：API 20 Strep鉴定试条、VlTEK AMS系统、PHOENIX SMIC／ID鉴定板和MICRO-SAN Walk Away等；4、免疫层析法(Immunochromatography，ICT)，目前广泛用于SP诊断的快速方法，其检测为SP各血清型所共有的抗原C多糖。该方法可用于检测尿液、胸腔积液、脑脊液和支气管灌洗液；5、核酸扩增技术，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）属于一种核酸体外扩增 技术，靠寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，并采用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA；6、实时荧光定量PCR技术。
但上述的方法中仍然存在不足之处：采用传统的培养方法（国标法）、乳胶凝集法、免疫层析法和核酸扩增技术检测，会出现假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性；自动化方法由于自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性，而且目前尚无一个能包括所有细节鉴定资料的鉴定系统；核酸扩增技术虽然结果好于上述4种方法，但是PCR扩增产物需要进行后处理，而PCR产物后处理时存污染，仍会导致假阳性结果，并且会对环境造成污染，对实验人员有潜在的危害；实时荧光定量PCR技术虽然解决了核酸扩增技术污染的问题，而且比核酸扩增技术的检测结果特异性更高，但仍不能达到100%的特异性。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明实施例提供了一种对病原体的核酸具有高特异性及高灵敏度的引物和荧光探针，由其制备的能够快速、准确地对病原体直接进行精确定量检测的试剂盒及其检测方法，所述技术方案如下：
首先，一种肺炎链球菌核酸定量检测的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；
反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；
荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为上述序列SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3的5'端和/或3'端有延长的核苷酸片段的序列，如序列表中SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.7；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3的同源性大于85%的序列，如序列表中SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.10；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8SEQ ID NO.10的碱基互补的序列；
所述荧光探针的5'端和3'端分别用荧光基团修饰，其中修饰荧光探针的5'端的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰3'端的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
其次，一种肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒，包括上述的引物和荧光探针。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中：
所述PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含Mg2+离子的溶液、肺炎链球菌lytA基因正向引物、肺炎链球菌lytA基因反向引物和肺炎链球菌lytA基因荧光探针；
所述DNA提取液由无菌水、Triton-X 100（聚乙二醇辛基苯基醚）、NP-40（壬基酚聚氧乙烯（40）醚）和Tris-HCL组成；
所述阴性质控品为不含肺炎链球菌lytA基因的pUC57-T载体质粒DNA；
所述阳性质控品为1.0×106IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；
所述临界阳性质控品为1.0×104IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；
所述工作标准品为含有肺炎链球菌的lytA基因的150个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
具体地，所述工作标准品包括：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
具体地，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.01U/μL～0.05U/μL、dNTPs 0.2～0.6mM、10×PCR Buffer 1×、MgCl21.5～5.0mM、肺炎链球菌lytA基因正向引物0.05～0.9μM、肺炎链球菌lytA基因反向引物0.05～0.9μM及肺炎链球菌lytA基因荧光探针0.05～0.9μM，溶剂为无菌水。
具体地，所述DNA提取液中Triton-X 100的终浓度为0.03～0.3%、NP-40的终浓度为0.04～0.4%和pH值为8.3的Tris-HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水。
最后，一种利用上述的引物和荧光探针及上述的试剂盒的肺炎链球菌核酸定量检测的检测方法，包括下列步骤：
（1）采集样品：
①痰液的预处理：1）取痰样品加入样品体积1-3倍的4%NaOH溶液，液化15min，NaOH溶液的加入量视痰液样品粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2）吸出液化后样品置于离心管中，15000r/min离心5min，去上清。加液化后样 品体积0.8倍的灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀重复洗涤2次，样本管4℃保存备用；
②咽拭子标本处理：取出采集的样品，放入装有1mL PBS缓冲液（pH值为7.4）的玻璃管中，充分震荡摇匀后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，再加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，样本管4℃保存备用；
（2）样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品；
（3）加样：向装有所述的PCR反应液的PCR反应管中分别加入所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品和所述的工作标准品，所述PCR反应液与所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品或所述的工作标准品的体积比为1：4～100：1，再离心，经5,000rpm离心10s；
（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增：94℃5min，94℃30s、58℃45s，32个循环，收集荧光信号，读取荧光值；
（5）分析判断：Ct值小于28的为阳性，Ct值大于32的为阴性，Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR检测肺炎链球菌核酸的引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测。本发明实施例与普通PCR反应相比，使用本发明的DNA提取液处理样品的步骤简单、快速，也不需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理，简化了操作步骤，而且以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而降低交叉污染的可能性，提高特异性；本发明与实时TaqMan荧光定量PCR相比，由于本发明实施例提供的引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，因而具有更高的特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
图4是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
图5是本发明实施例6提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例6提供的荧光扩增曲线图；
图7是本发明实施例6提供的由图4得到的标准曲线图。
图中：Cycles为循环数、RFU为荧光值、Log Starting Quantity copy number为肺炎链球菌起始浓度的对数值、Ct（Threshold Cycle）值为循环数。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂主要购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例1.一种用于肺炎链球菌核酸定量检测的引物和荧光探针
（1）引物及荧光探针设计与合成：
选择肺炎链球菌特异性保守基因lytA基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.go v），获得肺炎链球菌目前已有的92个基因型的肺炎链球菌lytA基因序列，并在线（http://w ww.ebi.ac.uk/）分别对92个基因型的lytA基因序列进行序列比对，在基因区选择一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：GCCTCAAGTCGGCGTGCAACCATATAGGCA AGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGTACAGAATGAAGCGGATTATC ACTGGCGGAAAGACCCAGAATTAGGTTTTTTCTCGCACATTGTTGGGAACGGTTGCATC AT，利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件BeaconDesigner 7.0设计引物和荧光探针序列，引物和荧光探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保肺炎链球菌引物和荧光探针序列能检测全部92个基因型序列。
在本发明实施例中，修饰肺炎链球菌荧光探针的5'端的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；修饰3'端的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团为FAM、HEX、TET，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse、TAMRA、BHQ1。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式。设计结果如下表所示：
表1A组引物和荧光探针
SEQIDNO.1~SEQIDNO.3的5'端和/或3'端有延长的核苷酸片段的序列如下表所示：
表2B组引物和荧光探针
与SEQIDNO.1~SEQIDNO.3的同源性大于85%的序列如下表所示：
表3C组引物和荧光探针
5表中：F：forward，正向；肺炎链球菌-F表示肺炎链球菌正向引物。
R：reverse，反向；肺炎链球菌-R表示肺炎链球菌反向引物。
P：probe，荧光探针；肺炎链球菌-P表示肺炎链球菌荧光探针，荧光探针既可为TaqMan-MGB荧光探针也可为LNA荧光探针、MGB荧光探针、AllGloTM探针。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团为FAM，淬灭基团为Eclipse。
按照上表的设计结果，委托宝生物工程（大连）有限公司合成引物和荧光探针。
实施例2.一种用于肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒
按照本发明内容提供的技术方案制备的用于肺炎链球菌核酸定量检测的试剂盒含有下列试剂：
1.PCR反应液：PCR反应液各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL；浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL；10×PCR Buffer 5μL；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液5μL；浓度为10μmol/L的实施例1所述A组肺炎链球菌正向引物2.5μL；浓度为10μmol/L的A组肺炎链球菌反向引物2.5μL；浓度为10μmol/L的A组肺炎链球菌探针2.5μL；添加无菌水至体积为49.5μL。其中：
A组肺炎链球菌正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：
5'-AAGTCGGCGTGCAACCA-3'；
A组肺炎链球菌反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：
5'-GGGTCTTTCCGCCAGTGA-3'；
A组肺炎链球菌荧光探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：
FAM5'-CACGCACACTCAACTGGGAATCCG-3'Eclipse。
2．DNA提取液：Triton-X 100（聚乙二醇辛基苯基醚）的终浓度为0.03%、NP-40（壬基酚聚氧乙烯（40）醚）的终浓度为0.04%和Tris-HCL（pH值为8.3）的终浓度为0.01M，溶剂为无菌水。
3．阴性质控品制备：阴性质控品为不含肺炎链球菌lytA基因的pUC57-T质粒DNA。取不含肺炎链球菌lytA基因的pUC57-T载体质粒DNA溶液于样品准备区预处理，定量稀释至浓度为1×107IU/mL（比浊法），吸取质粒DNA溶液于离心管中，混匀，直接吸取0.5μL作模板。
4．阳性质控品制备：阳性质控品为高浓度的含肺炎链球菌基因组的DNA片段溶液。取含肺炎链球菌的菌液，菌株由中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC）提供，经培养后，取含肺炎链球菌的菌液100μL加入等体积的DNA提取液充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光 度计测A260定量，然后稀释至1.0×106IU/mL，即可作为阳性质控品模板。
5．临界阳性质控品制备：临界阳性质控品为低浓度的含肺炎链球菌基因组的DNA片段溶液。取含肺炎链球菌的菌液，菌株由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供，经培养后，取含肺炎链球菌的菌液100μL加入等体积的DNA提取液，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×104IU/mL，即可作为临界阳性质控品模板。
6．工作标准品1，含有约1.0×107IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有约1.0×106IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有约1.0×105IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有约1.0×104IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品，为含有肺炎链球菌的高度保守基因lytA基因的150个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×109IU/mL，-20℃保存。贮存浓度为1.0×109IU/mL，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS缓冲液(pH值为7.4)进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×107IU/mL，1.0×106IU/mL，1.0×105IU/mL和1.0×104IU/mL，使用前，经5,000rmp离心10s，取上清液作模板。
本发明的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：
本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，有效期6个月，适用仪器：ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P和达安7000等。
用本发明实施例2提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测肺炎链球菌核酸的方法
（1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品。
①痰液的预处理：1）取0.5ml痰样品加入样品体积1-3倍的4%NaOH溶液，液化15min，NaOH溶液的加入量视痰液样品粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2）吸出1ml液化后样品置于1.5ml离心管中，15000r/min离心5min，去上清。加800μL灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀用TE缓冲液重复洗涤2次，样本管4℃保存备用。
②咽拭子标本处理：取出采集的样品，放入装有1mL PBS缓冲液（pH值为7.4）的玻璃管中，充分震荡摇匀后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，再加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，样本管4℃保存备用。
标本保存和运输：如果标本不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标本长途运送应采用0℃冰壶。
（2）样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品。
（3）加样：向装有所述的PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品或工作标准品的体积比为99：1，经5,000rpm离心10s。
（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的Taqman荧光探针（本产品荧光报告基团为FAM，荧光淬 灭基团为Eclipse），定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品Unknown。
按下表进行PCR扩增：
在反应程序的第三步的终了读取荧光值；
（5）分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的试验结果如图1所示（图1在Ct值为32时已经可以判断出样品结果），具体检测结果见下表：
| 序号 | Ct |
| 1 | 19.69 |
| 2 | 27.07 |
| 3 | 25.23 |
| 4 | 22.32 |
| 5 | N/A |
| 6 | N/A |
| 7 | 23.11 |
| 8 | N/A |
其中，样品1，2，3，4，7在阳性范围内，为阳性样品；样品5，6，8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知的一致，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
注：N/A表示阴性。
实施例3.用本实施例提供的试剂盒检测样品中肺炎链球菌核酸
本实施例提供的试剂盒所包含的试剂中，除PCR反应液、DNA提取液如以下所述之外，其余阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、工作标准品的组成，配比及制备方法与实施例2所述的试剂盒相同：
（1）PCR反应液各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL；浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL；10×PCR Buffer 5μL；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液3μL；浓度为10μmol/L的实施例1所述A组肺炎链球菌正向引物0.25μL；浓度为10μmol/L的A组肺炎链球菌反向引物0.25μL；浓度为10μmol/L的A组肺炎链球菌探针0.25μL；添加无菌水至体积为10μL。
其中：
A组肺炎链球菌正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：
5'-AAGTCGGCGTGCAACCA-3'；
A组肺炎链球菌反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：
5'-GGGTCTTTCCGCCAGTGA-3'；
A组肺炎链球菌荧光探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：
FAM5'-CACGCACACTCAACTGGGAATCCG-3'Eclipse。
（2）DNA提取液中Triton-X 100的终浓度为0.1%、NP-40的终浓度为0.2%和Tris-HCL（pH值为8.3）的终浓度为0.05M，溶剂为无菌水。
本实施例的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：
用本实施例提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上按实施例2的方法检测肺炎链球菌核酸：
（1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品；
①痰液的预处理：同实施例2；
②咽拭子标本处理：同实施例2；
标本保存和运输：同实施例2。
（2）样品处理：同实施例2。
（3）加样：向装有10μLPCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
（4）PCR扩增：同实施例2.
（5）分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的试验结果如图2所示（图2在Ct值为32时已经可以判断出样品结果），具体检测结果见下表：
| 序号 | Ct |
| 1 | 31.99 |
| 2 | N/A |
| 3 | 26.72 |
| 4 | 29.38 |
| 5 | 24.92 |
| 6 | 22.57 |
| 7 | 23.00 |
| 8 | N/A |
| 9 | 19.00 |
| 10 | 21.83 |
其中，样品3、5、6、7、9和10在阳性范围内，为阳性样品，与已知检测结果相符；样品1和4在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品2和8在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
实施例4用本实施例提供的试剂盒检测样品中肺炎链球菌核酸
本实施例提供的试剂盒所包含的试剂中除PCR反应液、DNA提取液如以下所述之外，其余阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、工作标准品的组成，配比及制备方法与实施例2所述的试剂盒相同：
（1）PCR反应液各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL；浓度为10mmol/L 的dNTPs 3μL；10×PCR Buffer 5μL；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液10μL；浓度为10μmol/L的实施例1所述B组肺炎链球菌正向引物4.5μL；浓度为10μmol/L的B组肺炎链球菌反向引物4.5μL；浓度为10μmol/L的B组肺炎链球菌探针4.5μL；添加无菌水至体积为45μL。其中：
B组肺炎链球菌正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.5所示：
5'-TCAAGTCGGCGTGCAACCA-3'；
B组肺炎链球菌反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.6所示：
5'-CTGGGTCTTTCCGCCAGTGA-3'；
B组肺炎链球菌荧光探针的序列如序列表中SEQ ID NO.7所示：
HEX 5'-TACACGCACACTCAACTGGGAATCCGA-3'TAMRA。
（2）DNA提取液中Triton-X 100的终浓度为0.3%、NP-40的终浓度为0.4%和Tris-HCL（pH值为8.3）的终浓度为0.1M，溶剂为无菌水。
用本实施例提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测肺炎链球菌核酸的方法如下：
（1）采集样品：样品均来源于武汉大学人民医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品；
①痰液的预处理：同实施例2；
②咽拭子标本处理：同实施例2；
标本保存和运输：同实施例2。
（2）样品处理：同实施例2。
（3）加样：向装有PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品的体积比为9：1，盖好管盖，5,000rpm离心10s；
（4）PCR扩增：同实施例2。
本发明实施例提供的检测结果如图3所示（图3在Ct值为32时已经可以判断出样品结果），检测结果见下表：
| 序号 | Ct |
[0148]
| 1 | 36.80 |
| 2 | 34.95 |
| 3 | 31.41 |
| 4 | 26.22 |
| 5 | 25.96 |
| 6 | 22.79 |
| 7 | N/A |
| 8 | N/A |
其中，样品4，5和6在阳性范围内，为阳性样品，与检测已知结果相符；样品3在临界阳性范围内，为临界阳性样品；样品1，2，7和8在阴性范围内，为阴性样品，与检测已知结果相符，可见本发明实施例提供的试剂盒特异性为100%，阳性检出率为100%。
实施例5采用实施例1中的C组引物和荧光探针检测样品中的肺炎链球菌核酸
采用实施例1中浓度为10μmol/L的C组引物和荧光探针，并采用实施例2提供的试剂盒中的其他试剂和检测方法，按照实施例2的方法检测未知样品的肺炎链球菌核酸。序号1～4为样品，是来源于武汉大学人民医院的经检测已知的阳性样品，序号5～9是已知的阴性参照样品，也是来源于武汉大学人民医院，分别为肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷白杆菌和金黄色葡萄球菌，本发明实施例提供的试验结果如图4所示（图4在Ct值为32时已经可以判断出样品结果），检测结果见下表：
| 序号 | Ct |
| 1 | 19.69 |
| 2 | 25.74 |
| 3 | 25.23 |
| 4 | 22.32 |
| 5 | N/A |
| 6 | N/A |
| 7 | N/A |
| 8 | N/A |
| 9 | N/A |
其中，样品1～4的CT值均小于32，阳性范围内，为阳性样品。样品5～9均不起线，为阴性参照样品。可见本发明实施例提供的试剂盒特异性100%，阳性检出率为100%。可得出，本发明实施例提供的试剂盒具有高特异性。
实施例6用实施例4提供的试剂盒定量检测样品的肺炎链球菌核酸
利用本发明实施例4提供的试剂盒，其中荧光探针替换为VIC5'-TACACGCACACTCAA CTGGGAATCCGA-3'BHQ3，本实施例在进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样品反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还有5个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μL，按照实施例4的方法配制PCR反应体系，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对 于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×107IU/ml、1.0×106IU/ml、1.0×105IU/ml、1.0×104IU/ml及1.0×103IU/ml。
使用仪器Bio-Rad iQ5TM参照结果：
a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品肺炎链球菌DNA含量小于检测下限；
b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品肺炎链球菌DNA含量处于临界阳性范围；
c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：
若样品的C（“C”表示样品浓度或含量）＜5.0000E+01，则该样品的肺炎链球菌DNA总含量＜50基因拷贝；
若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的肺炎链球菌DNA总含量等于C基因拷贝；
若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的肺炎链球菌DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测；
根据下表绘制的标准曲线（图7）的荧光扩增曲线如图4所示（图4在Ct值为32时已经可以判断出样品结果）：
| 工作标准品 | Ct | C（初始浓度） |
| 1.0e+007 | 18.61 | 1.0e+007 |
| 1.0e+006 | 21.84 | 1.0e+006 |
| 1.0e+005 | 25.23 | 1.0e+005 |
| 1.0e+004 | 28.55 | 1.0e+004 |
| slope | -3.322 | - |
| intercept | 41.829 | - |
| R2 | 1.000 | - |
| 标准方程 | y=-3.322x+41.829 | - |
本发明实施例提供的样品的扩增曲线如图6所示（图6在Ct值为32时已经可以判断出样品结果），本发明实施例的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图7的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的的初始浓度如下表。
检测结果见下表：本发明的数据精确到0.01。
| 序号 | Ct | C（初始浓度） |
| 阳性质控品 | 19.69 | 4.617e+006 |
| 临界阳性质控品 | 29.29 | 5.950e+003 |
| 阴性质控品 | N/A | - |
| 1 | 26.15 | 5.245e+004 |
| 2 | 25.23 | 9.924e+004 |
| 3 | 34.90 | 1.218e+002 |
[0168]
| 4 | 22.32 | 7.459e+005 |
| 5 | N/A | - |
| 6 | N/A | - |
| 7 | N/A | - |
| 8 | 26.90 | 3.119e+004 |
扩增曲线均呈光滑"S"型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.32。检测下限可精确到5.000e+002，本试剂盒具有高灵敏度。
本发明涉及一种引起人类肺炎、中耳炎、脑膜炎、心内膜炎和菌血症等疾病的病原体基因检测技术，适用于肺炎链球菌定性定量检测。本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒能够精确定量，其检测方法能够快速检测肺炎链球菌。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明实施例不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间。在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数（Ct值）就可以直接报告出DNA起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种肺炎链球菌核酸定量检测引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于，其中：
正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；
反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；
荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为上述序列SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.3的5'端和/或3'端有延长的核苷酸片段的序列，如序列表中SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.7；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO.1~SEQ IDNO.3的同源性大于85%的序列，如序列表中SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.10；
或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO.1~SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.10的碱基互补的序列；
所述荧光探针的5'端和3'端分别用荧光基团修饰，其中修饰荧光探针的5'端的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰3'端的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.一种肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中：
所述PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer、含Mg2+离子的溶液、肺炎链球菌lytA基因正向引物、肺炎链球菌lytA基因反向引物和肺炎链球菌lytA基因荧光探针；
所述DNA提取液由无菌水、Triton-X 100、NP-40和Tris-HCL组成；
所述阴性质控品为不含肺炎链球菌lytA基因的pUC57-T载体质粒DNA；
所述阳性质控品为1.0×106IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；
所述临界阳性质控品为1.0×104IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；
所述工作标准品为含有肺炎链球菌的lytA基因的150个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL的肺炎链球菌lytA基因的非传染性DNA片段。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.01U/μL～0.05U/μL、dNTPs 0.2～0.6mM、10×PCR Buffer1×、MgCl2 1.5～5.0mM、肺炎链球菌lytA基因正向引物0.05～0.9μM、肺炎链球菌lytA基因反向引物0.05～0.9μM及肺炎链球菌lytA基因荧光探针0.05～0.9μM，溶剂为无菌水。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液中Triton-X 100的终浓度为0.03～0.3%、NP-40的终浓度为0.04～0.4%以及pH值为8.3的Tris-HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水。
8.一种利用权利要求1所述的引物和荧光探针及权利要求2-7任一项所述的试剂盒的肺炎链球菌核酸定量检测的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）采集样品：
①痰液的预处理：1）取痰样品加入样品体积1-3倍的4%NaOH溶液，液化15min，NaOH溶液的加入量视痰液样品粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2）吸出液化后样品置于离心管中，15000r/min离心5min，去上清。加液化后样品体积0.8倍的灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀用灭菌TE缓冲液重复洗涤2次，样本管4℃保存备用；
②咽拭子标本处理：取出采集的样品，放入装有1mL PBS缓冲液（pH值为7.4）的玻璃管中，充分震荡摇匀后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，再加入500μl PBS缓冲液（pH值为7.4），12,000rpm离心5min，弃上清，样本管4℃保存备用；
（2）样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品；
（3）加样：向装有所述的PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品和所述的工作标准品，所述PCR反应液与所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品或所述的工作标准品的体积比为1：4～99：1，经5,000rpm离心10s；
（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增：94℃5min，94℃30s、58℃45s，32个循环，收集荧光信号，读取荧光值；
（5）分析判断：Ct值小于28的为阳性，Ct值大于32的为阴性，Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210320532.4A CN102876774B (zh) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210320532.4A CN102876774B (zh) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102876774A true CN102876774A (zh) | 2013-01-16 |
| CN102876774B CN102876774B (zh) | 2014-01-01 |
Family
ID=47478284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210320532.4A Active CN102876774B (zh) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102876774B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103805702A (zh) * | 2014-01-29 | 2014-05-21 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒 |
| CN104164508A (zh) * | 2014-08-18 | 2014-11-26 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种检测肺炎链球菌的lamp引物组、试剂盒和方法 |
| CN104313174A (zh) * | 2014-11-12 | 2015-01-28 | 方华成 | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 |
| CN110387427A (zh) * | 2018-04-16 | 2019-10-29 | 马东礼 | 用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒 |
| CN114854888A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-08-05 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 一种基于荧光定量pcr技术检测肺炎链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006104486A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Sevices, Centers For Disease Control And Prevention | Development of a real-time pcr assay for detection of pneumococcal dna and diagnosis of pneumococcal disease |
| CN101855362A (zh) * | 2007-05-18 | 2010-10-06 | 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 | 用于检测肺炎链球菌的引物和探针 |
| KR20110001187A (ko) * | 2009-06-29 | 2011-01-06 | 중앙대학교 산학협력단 | 동시다중 유전자 증폭용 키트 및 이를 이용한 스트렙토코커스 미티스 속균의 동정방법 |
-
2012
- 2012-08-31 CN CN201210320532.4A patent/CN102876774B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006104486A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Sevices, Centers For Disease Control And Prevention | Development of a real-time pcr assay for detection of pneumococcal dna and diagnosis of pneumococcal disease |
| CN101855362A (zh) * | 2007-05-18 | 2010-10-06 | 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 | 用于检测肺炎链球菌的引物和探针 |
| KR20110001187A (ko) * | 2009-06-29 | 2011-01-06 | 중앙대학교 산학협력단 | 동시다중 유전자 증폭용 키트 및 이를 이용한 스트렙토코커스 미티스 속균의 동정방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 林琳: "细菌培养和实时荧光定量PCR方法检测痰中肺炎链球菌", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103805702A (zh) * | 2014-01-29 | 2014-05-21 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒 |
| CN103805702B (zh) * | 2014-01-29 | 2016-09-21 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种用于检测钩虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒 |
| CN104164508A (zh) * | 2014-08-18 | 2014-11-26 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种检测肺炎链球菌的lamp引物组、试剂盒和方法 |
| CN104164508B (zh) * | 2014-08-18 | 2016-05-04 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种检测肺炎链球菌的lamp引物组、试剂盒和方法 |
| CN104313174A (zh) * | 2014-11-12 | 2015-01-28 | 方华成 | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 |
| CN110387427A (zh) * | 2018-04-16 | 2019-10-29 | 马东礼 | 用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒 |
| CN114854888A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-08-05 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 一种基于荧光定量pcr技术检测肺炎链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102876774B (zh) | 2014-01-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Williams et al. | Oral Microbiology: Isolation and identification of candida from the oral cavity | |
| Klint et al. | High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis | |
| CN102876774B (zh) | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针及其试剂盒 | |
| Zasada et al. | The influence of a swab type on the results of point-of-care tests | |
| CN105420379A (zh) | 牛支原体的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 | |
| CN103642945B (zh) | 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 | |
| CN102174653A (zh) | 副猪嗜血杆菌实时荧光定量pcr检测方法 | |
| Artz et al. | Rapid screening for Streptococcus agalactiae in vaginal specimens of pregnant women by fluorescent in situ hybridization | |
| CN101979667B (zh) | 同步检测单纯疱疹病毒i型和ⅱ型的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN106148506A (zh) | 一种b族链球菌荧光定量pcr产前检测试剂盒及其应用 | |
| CN108048584A (zh) | Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒 | |
| CN1955310B (zh) | 检测猪链球菌2型的核苷酸序列、检测试剂盒和方法 | |
| CN105063218A (zh) | 快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量pcr试剂盒 | |
| Genné et al. | Enhancing the etiologic diagnosis of community-acquired pneumonia in adults using the urinary antigen assay (Binax NOW) | |
| CN104745689A (zh) | 一种用于检测百日咳杆菌的引物、探针和试剂盒 | |
| CN102634605B (zh) | 检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒 | |
| CN105695560A (zh) | 婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法 | |
| CN102424862B (zh) | 嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| CN104593486A (zh) | 一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒 | |
| CN102399876B (zh) | 一种金黄色葡萄球菌菌株pcr检测试剂盒 | |
| CN103773884B (zh) | 用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用 | |
| CN102154270A (zh) | 一种对阪崎肠杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用 | |
| CN101497926A (zh) | 快速同步检测沙眼衣原体、细小脲原体和解脲脲原体的试剂盒 | |
| CN104593485A (zh) | 一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒 | |
| CN101974621B (zh) | 一种牛巴贝斯虫lamp检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |