CN104164508A - 一种检测肺炎链球菌的lamp引物组、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种LAMP引物组，该引物组可以用于检测肺炎链球菌，其特异性良好，该引物精密度高，稳定性良好；本发明还在该LAMP引物组中引入环引物，使反应出峰时间减少，该引物组检测限可达300pg/μL，14min反应出峰，临床检测时间为30min。应用本发明建立的环介导等温扩增技术检测肺炎链球菌，在特异性、灵敏度和精密性方面均可以获得较理想的检测结果。

Description

一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及一种引物组，具体涉及一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒和方法。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)普遍定植于人类呼吸道，是重要的侵袭性病原菌之一，是社区获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、菌血症等疾病的主要致病菌，其引起的脑膜炎和菌血症死亡率高，约为30—40％和15—24％。肺炎链球菌主要感染2岁以下幼儿及65岁以上老年人，是导致儿童死亡的最重要原因之一，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估计每年约有160万人死于肺炎链球菌感染，其中70～100万为5岁以下儿童。而且肺炎链球菌耐药现象越来越严重，给人类健康带来严重的威胁。肺炎链球菌的快速诊断是一个系带解决的问题。
2000年Notomi等开发出的一种新的DNA检测技术环介导恒温扩增技术，之后Nagamine等研究表明，通过设计两条环引物可使反应速度提升1/3-1/2，目前该方法已经在多种细菌及病毒的检测方面均已建立了相关成熟的方法，并具有较高的应用价值。2011年Naomi首次报将实时荧光LAMP(Rea-LAMP)技术用于疟疾的诊断，其检测的敏感度为96.7％，特异度为91.7％。实时荧光LAMP技术是在实时荧光PCR技术和传统LAMP技术的基础上开发的一种新的核酸检测技术。该技术克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。由于该技术检测的是荧光信号，其检测敏感性显著提高且在极大程度上缩短了检测时间。荧光定量LAMP技术是一种便捷、灵敏、特异性高的快速检测基因方法，该技术一旦应用临床将会在感染性疾病的早期诊断中发挥重要作用，同时精确的量化能为临床治疗起到指导作用。在疾病的预防控制中可起到早期检测预防疾病扩散的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒、方法，以及该LAMP引物组在检测肺炎链球菌中的用途。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，包括以下引物：
外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ ID:NO.1)；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ ID:NO.2)；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQID:NO.4)。
优选地，所述LAMP引物组还包括：
环引物FLP:ACAGGCTGGTACTACCTCA(SEQ ID:NO.5)；
环引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC(SEQ ID:NO.6)。
本发明所述LAMP引物组中加入上述环引物后，使反应出峰时间明显缩短，进而使得整个反应时间缩短。
本发明还提供了一种检测肺炎链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的LAMP引物组。
优选地，所述试剂盒还包括反应液、显色剂、Bst大片断DNA聚合酶、阳性对照品、阴性对照品和超纯水；所述反应液包括Tris-HCl(PH8.8)、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱以及dNTP。
优选地，所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；
或者所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述环引物FLP和BLP各0.8μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL。
优选地，所述荧光显色剂为SYBR Green I，所述阳性对照品为30ng/μL的肺炎链球菌DNA，所述阴性对照品为ddH2O。
本发明还提供了一种检测肺炎链球菌的方法，所述方法为采用上述所述的LAMP引物组检测肺炎链球菌。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1a)提取待检样品的DNA；
(2a)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应60min。
或者所述方法包括以下步骤：
(1b)提取待检样品的DNA；
(2b)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，1μL环引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mMMgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应30min。
优选地，所述步骤(1b)或(2b)中显色剂为SYBR Green I。
本发明还提供了上述所述的LAMP引物组在检测肺炎链球菌中的用途。所述用途为非疾病治疗或诊断目的的。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种LAMP引物组，该引物组可以用于检测肺炎链球菌，其特异性良好，该引物精密度高，稳定性良好；本发明还在该LAMP引物组中引入环引物，使反应出峰时间减少，该引物组检测限可达300pg/μL，14min反应出峰，临床检测时间为30min。应用本发明建立的环介导等温扩增技术检测肺炎链球菌，在特异性、灵敏度和精密性方面均可以获得较理想的检测结果。
附图说明
图1为本发明所述肺炎链球菌LAMP引物组的引物组成及对应区域；
图2为本发明所述肺炎链球菌LAMP引物组(不加环引物)的LAMP反应曲线图；
图3为本发明所述肺炎链球菌LAMP引物组(加环引物)的LAMP反应曲线图；
图4、图5、图6均为本发明所述肺炎链球菌LAMP引物组的特异性验证曲线图；
图7为本发明所述LAMP引物组的灵敏度验证曲线图；
图8、图9均为本发明所述LAMP引物组的精密度验证曲线图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
用于检测肺炎链球菌的LAMP引物组设计以及性能评价
1、材料和方法
1.1.实验材料
1.1.1肺炎链球菌DNA
1.1.2其他品系及物种
铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念球菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、鸟分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌共15种对照菌株。
1.2主要试剂和耗材
(1)LAMP反应试剂：
Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；
甜菜碱(Betaine)、MgCl2，Sigma公司。
dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司。
(2)显色剂：SYBR Green I荧光染料，Invitrogen。
(3)LAMP引物组(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物FLF、反向环引物FLB)，生工生物工程(上海)有限公司。
1.3主要仪器设备
(1)-80℃冻存柜，DAYA-024，Thermo Fisher Scientific；
(2)高速台式离心机，PICO17，Thermo Fisher Scientific；
(3)ESEQuant TubeSanner，广州迪澳生物科技有限公司
(4)漩涡混合器，MS 2，德国IKA公司；
(5)微量移液器，1000μl、200μl、100μl、10μl，2.5μl，德国Eppendorf公司；
(6)分析天平，AL104，梅特勒-托利多仪器有限公司；
(7)超净工作台，SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司；
1.4方法
1.4.1引物的设计
1.4.1.1LAMP引物的设计步骤
①查阅肺炎链球菌相关文献，了解肺炎链球菌目前核酸检测的靶序列为溶血素A基因(pneumolysin A，ply A)。
②在NCBI网站中查找该序列；
③使用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)和LAMP Designer软件设计特异引物，目的片段选取肺炎链球菌溶血素A基因中的特异、保区域；
1.4.1.2LAMP引物简介
LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，特异结合靶序列上的6个特异区域。内引物FIP包含F1c(与F1区域互补)和F2序列，内引物BIP包含B1c(与B1区域互补)和B2序列，外引物为F3和B3序列，本发明在内外引物的基础上引入环引物FLP和BLP，大大缩短了反应时间，具体引物信息见图1。
1.4.1.3LAMP反应引物序列
肺炎链球菌LAMP引物组见表1，靶基因：肺炎链球菌溶血素A基因(pneumolysin A，ply A)。
表1  肺炎链球菌LAMP引物组
1.4.2DNA浓度及纯度的测定
取50μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至500μL，使用紫外分光光度计测260nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得：
C＝OD×50μg/mL式中：
C——DNA浓度(ng/μL)；
OD——260nm处的测得的OD值，约为0.666；
1OD260nm＝50ng/μL双链DNA；
C＝0.666x50＝33.3μg/mL。
1.4.3LAMP引物筛选及反应体系的建立
参考文献中的数据，初步确定25μL的LAMP反应体系，其成分包括：FIP和BIP各1.6μM，F3和B3各0.2μM，FLP和BLP各0.8μM，反应液(20mMTris-HCl(PH8.8)，10mMKCl，8mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，1M甜菜碱，1.6mMdNTP)，8U/μL Bst大片断DNA聚合酶，2μl DNA。
具体操作时先在冰上准备LAMP反应混合液，扩增反应体系如下：
12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，1μL环引物，0.5μL显色剂，1μLBst酶以及2μL模板。
将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23μL，加入20μL密封液后再分别加入2μL模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心。所述密封液成分为矿物油。
最后参照LAMP ESEQuant TubeSanner使用说明书，将混合物置于ESEQuantTubeSanner反应孔中，于63℃恒温反应60min，激发光强度为40。反应结束后，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物。
1.4.4LAMP引物特异性实验
用铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念球菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、鸟分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌共15种对照菌株的DNA作为LAMP反应的模板，以300ng/μL肺炎链球菌DNA和ddH2O分别作为阳性、阴性对照，在ESEQuant Tube Sanner上63℃运行60min，激发光强度为40，验证LAMP反应的特异性，利用扩增曲线观察反应结果。
1.4.5LAMP灵敏度实验
将300ng/μL肺炎链球菌DNA逐次稀释到30ng/μL，3ng/μL，0.3ng/μL0.03ng/μL，3pg/μL，0.3pg/μL 6个梯度，取后稀释后的5个浓度(3ng/μL，0.3ng/μL0.03ng/μL，3pg/μL,0.3pg/μL)做灵敏度实验；每个稀释度分别取2μl进行LAMP实验，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以本发明所述LAMP引物组(加环引物)作为引物，进行LAMP扩增；激发光强度为40，63℃运行60min以确定LAMP反应的灵敏度；同时根据最低灵敏度出峰时间，确定反应时间。
1.4.6LAMP精密度实验(最低检出度10倍浓度样品，10个重复)
将3ng/μL肺炎链球菌DNA作为模板，肺炎链球菌30ng/μL DNA作为阳性对照，ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以本发明所述LAMP引物组作为引物进行LAMP扩增，激发光强度为40，63℃运行，10个平行样品观察3ng/μL精密度LAMP反应的稳定性。
2、结果与分析
2.1LAMP引物筛选及反应体系的建立
应用1.4.1.3中设计的LAMP引物，采用1.4.3中的反应体系，进行LAMP引物筛选与反应体系的建立。
用30ng/μL肺炎链球菌DNA作为阳性模板，ddH2O作为阴性对照，分别用各套引物进行LAMP反应，63℃运行60min，激发光强度为40。结果如图2所示。
由图2可知，设计的LAMP引物组出峰时间约35min；考虑加入环引物再次验证，初步将反应时间控制在60min。
加环引物后实验，结果如图3所示。
由图3可知，加入环引物后，设计的引物组出峰时间均明显缩短，约9-10min，可用LAMP引物组进行特异性和灵敏度等实验。
2.2LAMP引物特异性的鉴定
根据1.4.4的实验方案，验证本发明所述LAMP引物组的特异性。结果如图4、图5和图6所示。
由图4、图5和图6可知：本发明所述LAMP引物组只对肺炎链球菌特异性检出，阳性对照的15种均无检出，特异性良好，可以用该引物组进行肺炎链球菌灵敏度和精密度实验。
2.3LAMP灵敏度实验
根据1.4.5中的LAMP灵敏度实验方案，进行LAMP扩增，结果如图7所示。
从图7中可以看出，采用肺炎链球菌DNA稀释至不同浓度梯度，本发明所述LAMP引物组作为引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化；检测灵敏度可达300pg/μL，约14min出峰；未出现假阳性，可以将反应时间确定为30min。
2.4LAMP精密度实验(最低检出度10倍浓度样品，10个重复)
按1.4.6的实验方案，进行LAMP精密度实验，结果如图8、图9所示。
由图8及图9可知，最低检出度10倍浓度(3ng/μl)的10个平行样品都能稳定地检出，说明LAMP稳定性较好。
3、结论
(1)本发明针对肺炎链球菌溶血素A基因(ply A)序列，采用Primer Explorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)和LAMP Designer软件设计了引物Strep-1，用ESEQuant Tube Sanner平台在63℃、60min、激发光强度为40条件下进行检测，成功建立了肺炎链球菌的LAMP检测方法；
(2)以铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念球菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、鸟分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌共15种菌做阴性对照，进行特异性验证，结果显示该引物与上述15种菌均无扩增，特异性良好；
(3)进行了本发明所述LAMP引物组的灵敏度实验，结果显示该引物检测限可达300pg/μL，14min反应出峰，临床检测时间定为30min；
(4)进行了本发明所述LAMP引物组的精密度实验，结果显示最低检出度10倍浓度的样品(3ng/μl)的稳定性良好。
综上所述，应用本发明建立的环介导等温扩增技术检测肺炎链球菌，在特异性、灵敏度和精密性方面均可以获得较理想的检测结果。
实施例2
本发明所述检测肺炎链球菌的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括LAMP引物组，反应液，显色剂，Bst大片断DNA聚合酶，阳性对照品，阴性对照品和超纯水；
所述引物组：
外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ ID:NO.1)；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ ID:NO.2)；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQID:NO.4)；
所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM。
所述反应液包括20mMTris-HCl(PH8.8)，10mM KCl，8mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，1M甜菜碱，1.6mM dNTP。
所述显色剂为SYBR Green I。
所述Bst大片段DNA聚合酶浓度为8U/μL。
所述阳性对照品为30ng/μL的肺炎链球菌DNA。
所述阴性对照品为ddH2O。
本试剂盒的使用方法的一种实施例如下：
(1)配制25μL的LAMP反应体系：12.5μL反应液，8.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，0.5μL显色剂，1μLBst酶以及2μL模板。
(2)将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23μL，加入20μL密封液后再分别加入2μL模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心。
(3)参照LAMP ESEQuant TubeSanner使用说明书，将混合物置于ESEQuantTubeSanner反应孔中，于63℃恒温反应60min，激发光强度为40。
实施例3
本发明所述检测肺炎链球菌的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括LAMP引物组，反应液，显色剂，Bst大片断DNA聚合酶，阳性对照品，阴性对照品和超纯水；
所述引物组：
外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ ID:NO.1)；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ ID:NO.2)；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQID:NO.4)；
环引物FLP:ACAGGCTGGTACTACCTCA(SEQ ID:NO.5)；
环引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC(SEQ ID:NO.6)；
所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述环引物FLP和BLP各0.8μM。
所述反应液包括20mMTris-HCl(PH8.8)，10mM KCl，8mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，1M甜菜碱，1.6mM dNTP。
所述显色剂为SYBR Green I。
所述Bst大片段DNA聚合酶浓度为8U/μL。
所述阳性对照品为30ng/μL的肺炎链球菌DNA。
所述阴性对照品为ddH2O。
本试剂盒的使用方法的一种实施例如下：
(1)配制25μL的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，1μL环引物，0.5μL显色剂，1μLBst酶以及2μL模板。
(2)将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23μL，加入20μL密封液后再分别加入2μL模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心。所述封闭液成分为矿物油。
(3)参照LAMP ESEQuant TubeSanner使用说明书，将混合物置于ESEQuantTubeSanner反应孔中，于63℃恒温反应60min，激发光强度为40。
实施例4
本发明所述检测肺炎链球菌的方法的一种实施例，所述方法包括：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mMKCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mMdNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应60min。
其中，外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ ID:NO.1)；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ ID:NO.2)；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQID:NO.4)；
所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM。
所述显色剂为SYBR Green I。
实施例5
本发明所述检测肺炎链球菌的方法的一种实施例，所述方法包括：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，1μL环引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应30min。
其中，外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ ID:NO.1)；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ ID:NO.2)；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQID:NO.4)；
环引物FLP:ACAGGCTGGTACTACCTCA(SEQ ID:NO.5)；
环引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC(SEQ ID:NO.6)；
所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述环引物FLP和BLP各0.8μM。
所述显色剂为SYBR Green I。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，其特征在于，包括以下引物：
外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG；
外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC；
内引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC；
内引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG。
2.根据权利要求1所述的检测肺炎链球菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组还包括：
环引物FLP:ACAGGCTGGTACTACCTCA；
环引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC。
3.一种检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的LAMP引物组。
4.根据权利要求3所述的检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液、显色剂、Bst大片断DNA聚合酶、阳性对照品、阴性对照品和超纯水；所述反应液包括Tris-HCl(PH8.8)、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱以及dNTP。
5.根据权利要求4所述的检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；
或者所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述环引物FLP和BLP各0.8μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL。
6.根据权利要求4所述的检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述荧光显色剂为SYBR Green I，所述阳性对照品为30ng/μL的肺炎链球菌DNA，所述阴性对照品为ddH2O。
7.一种检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述方法为采用如权利要求1或2所述的LAMP引物组检测肺炎链球菌。
8.根据权利要求7所述的检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1a)提取待检样品的DNA；
(2a)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应60min；
或者所述方法包括以下步骤：
(1b)提取待检样品的DNA；
(2b)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：12.5μL反应液，7.0μL超纯水，1μL引物内、外引物，1μL环引物，0.5μL显色剂，1μLBst大片断DNA聚合酶以及2μL模板；所述试剂盒中所述内引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述试剂盒中所述反应液包括20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、1M甜菜碱以及1.6mM dNTP，所述试剂盒中所述Bst大片断DNA聚合酶浓度为8U/μL；LAMP反应条件为在63℃恒温反应30min。
9.根据权利要求8所述的检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述步骤(1b)或(2b)中显色剂为SYBR Green I。
10.一种如权利要求1或2所述的LAMP引物组在检测肺炎链球菌中的用途。
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