CN110106267A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组 - Google Patents

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组 Download PDF

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常庆
沈丽娟
王飞
梁冬雨
饶玉良
胡筱媛
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Shanghai Jiading District Central Hospital
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Shanghai University of Medicine and Health Sciences
Shanghai Jiading District Central Hospital
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Abstract

一种重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组；还涉及利用上述引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法；还涉及利用上述引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速定量检测试剂盒。本发明确立了针对mecA基因甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌测定最佳引物序列及最佳检测方法，建立实验室快速便捷的LAMP高通量检测方法。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体地涉及一种重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因快速定量检测用引物组。
本发明还涉及利用上述的引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。
本发明还涉及利用上述的引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速定量检测试剂盒。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种重要的人类病原体，可产生多种毒素并引起多种感染，包括皮肤脓肿、坏死性肺炎、关节感染和心内膜炎。
最近，MRSA已成为公共卫生中的重要病原体，导致显着的发病率并且经常表现出多药耐药。
mecA基因是一种特异性耐药MRSA基因，在耐药性中发挥决定性作用。尽管PCR广泛用于核苷酸扩增，但该方法需要特殊且昂贵的设备用于扩增和检测，不能够在临床快速检测中使用。
LAMP技术(环介导等温扩增技术)具有较强的特异性，并且具有较高的灵敏度，不需要昂贵仪器，能够在现场病原体及基层检测中使用。因此，建立实验室快速便捷的LAMP高通量检测方法很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因快速定量检测用引物组。
本发明的又一目的是提供一种利用上述的引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。
本发明再一目的是提供一种利用上述的引物组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速定量检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组，每个引物组由两个外引物对F3/B3和两个内引物对FIP/BIP组成；F3、B3、FIP、BIP具体如下：
本发明提供的利用上述的引物组检测重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：F3、B3、FIP、BIP；
3)将提取的DNA模版进行LAMP扩增反应，63℃扩增1小时，将反应管置于80℃水浴5分钟终止反应，观察绿色荧光强度或通过实时浊度仪定量DNA浓度。
所述的方法，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8,20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，MRSA mecA基因2μl。
所述的方法，其中，F3、B3、FIP、BIP的浓度均为0.2μM。
本发明提供的利用上述的引物组检测重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的快速定量检测试剂盒，所述试剂盒至少包括含有上述的引物组或上述的LAMP检测反应体系。
所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8,20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，MRSA mecA基因2μl。
本发明对LAMP检测进行优化，通过大量前期实验及临床反复验证确立了针对mecA基因甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌测定最佳引物序列及最佳检测方法，建立实验室快速便捷的LAMP高通量检测方法。
具体实施方式
以下对本发明作进一步的描述。
本发明的操作步骤是：
1、提取RNA；
使用GeneJET DNA/RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)，按说明从样本中提取DNA。
2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：F3、B3、FIP、BIP；
3、将提取的DNA模版进行LAMP扩增反应，LAMP检测反应体系总反应体积为25μl。63℃扩增1小时，将反应管置于80℃水浴5分钟终止反应，观察绿色荧光强度或通过实时浊度仪定量DNA浓度。
4、LAMP检测反应体系组成：
dNTPs(1.4mM)，Tris-HCl(pH＝8.8,20mM)，(NH4)2SO4(10mM)，KCl(10mM)，MgSO4(8mM)，甜菜碱(0.8M)，0.1％Tween20，Bst DNA聚合酶(8U)，AMV逆转录酶(0.5U)，荧光染料(SYBR green I 1μl)，MRSA mecA基因(2μl)。
本发明的优越之处在于建立实验室快速便捷的LAMP高通量检测方法。

Claims (6)

1.一种重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测用引物组，每个引物组由两个外引物对F3/B3和两个内引物对FIP/BIP组成；F3、B3、FIP、BIP具体如下：
。
2.利用权利要求1所述的引物组检测重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的方法，包括以下步骤：
1)提取DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：F3、B3、FIP、BIP；
3)将提取的DNA模版进行LAMP扩增反应，63℃扩增1小时，将反应管置于80℃水浴5分钟终止反应，观察绿色荧光强度或通过实时浊度仪定量DNA浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8,20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，MRSA mecA基因2μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，F3、B3、FIP、BIP的浓度均为0.2μM。
5.利用权利要求1所述的引物组检测重症感染患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的快速定量检测试剂盒，所述试剂盒至少包括含有权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的LAMP检测反应体系。
6.根据权利要求5所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8,20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I1μl，MRSA mecA基因2μl。
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