JP5595612B1 - 肌分析用プライマーセット及び肌の検査方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否か分析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法の提供。
【解決手段】特定の配列からなるプライマーから選択される2種のプライマーセットを含む肌診断用のプライマーセット。そのプライマーセットを用いて,対象物に含まれるDNA断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と,増幅産物を検出する工程と,を含む肌の診断方法。
【選択図】図1

Description

本発明は,肌分析用プライマーセット及び肌分析方法に関する。より詳しく説明すると,本発明は,肌に悪影響を及ぼす特定の菌叢を効果的に検出するための肌分析用プライマーセット,肌分析キット及び肌分析方法に関する。
特開2009−65939号公報には,動物識別用プライマーセット及びプライマーキットが開示されている。このプライマーセットは,PCRを用いて,食品中の異物に由来する動物種のDNAを増幅し,これを測定することで,特定の動物種が混合しているか否かを検出するためのものである。このようにPCRに用いられるプライマーを見出すことができれば特定の生物が存在するか否かを判別できる。
特開2009−65939号公報
ヒトの肌には,肌の状態を悪化させる菌が存在する場合がある。このため,特定の菌が肌に存在することがわかれば,肌の状態を分析できる。このため,肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否かを解析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法が望まれる。
本発明は,所定の菌叢が肌に悪影響を及ぼすことを突き止め,そしてその菌叢を特異的に検出するための特定のプライマーセットを見出したことに基づくものである。
本発明は,肌診断用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは,配列番号2〜11のプライマーから選択される2種のプライマーセットを含む。2種のプライマーセットのうち一方は,配列番号2,4,6,8又は10で示される塩基配列を有するプライマーであり,残りは,配列番号3,5,7,9又は11で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。
本発明の好ましい態様は,
前記2種のプライマーセットが,
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセット,
配列番号4及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーセット,
配列番号6及び配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーセット,
配列番号8及び配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーセット,及び
配列番号10及び配列番号11で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。
本発明は,肌の診断方法をも提供する。この方法は,上記したいずれかの肌診断用のプライマーセットを用いて,対象物に含まれるDNA断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と,増幅産物を検出する工程とを含む。
本発明のプライマーセットは,PCRにより,肌を悪化させる菌由来のDNAを特異的に増幅させることができる。このため,本発明は,肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否か分析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法を提供できる。
図1は,図1は,肌を悪化させる菌が生息していると考えられる肌由来のサンプルについて配列番号2及び配列番号3からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示す図面に替わるゲル電気泳動写真である。
以下,図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は,以下に説明する形態に限定されるものではなく,以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
本発明は,肌診断用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは,PCRにより以下の表1に示される塩基配列を有するDNA(配列番号1で示される塩基配列を有するDNA)を増幅できる。
Figure 0005595612
本発明のプライマーセットは,配列番号2〜11のプライマーから選択される2種のプライマーセットを含む。2種のプライマーセットのうち一方は,配列番号2,4,6,8又は10で示される塩基配列を有するプライマーであり,残りは,配列番号3,5,7,9又は11で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。
本発明の好ましい態様は,
2種のプライマーセットが,
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセット(配列番号2で示される塩基配列を有するプライマーと,配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーのセット,以下同様),
配列番号4及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーセット,
配列番号6及び配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーセット,
配列番号8及び配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーセット,及び
配列番号10及び配列番号11で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。これらプライマーの塩基配列は,以下の表2に示されるとおりである。
Figure 0005595612
プライマーを用いて特定のDNA(DNA断片)を増幅し,対象となる生物が検体に含まれるか否かまた対象となる生物の存在量を評価することは,公知である。本発明においても,公知の方法を適宜採用できる。
上記のプライマーは,DNA自動合成器を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し,適宜脱保護や支持体からの切断を行い,カラムクロマトグラフィー等公知の方法を用いて分離生成することで得ることができる。
次に,上記したいずれかの肌診断用のプライマーセットを用いた肌の診断方法について説明する。
まず,検査対象者の皮膚に存在する菌を採取する。本発明の対象は,哺乳動物(例えばヒト)の肌である。肌の例は,顔の肌である。そして,例えば,湿らせた綿棒で対象部位である顔の皮膚をこすり,その綿棒で寒天培地をこする。そして,寒天培地を1時間〜1週間常温で保存する。
次に寒天培地に含まれる菌のゲノムに含まれるDNA断片を公知のキットを用いて取得する。この方法は,公知のキットを用いて,公知のキットの説明書に基づいて行えばよい。
PCRは,公知のPCR装置を用いてPCR装置の解説書に基づいて行えばよい。PCRを行う際に,プライマーセットは,例えば,最終濃度が0.1μM以上1μMとなるように設定すればよく,0.2μM以上0.5μM以下でもよい。PCRにより,対象物に含まれるDNA断片が特異的に増幅する。PCR反応の条件の例は,以下のとおりである。
二本鎖DNAの一本鎖への熱変性(ステップ1)
二本鎖DNAの一本鎖への熱変性は,例えば,摂氏90度以上摂氏100度以下(又は摂氏94度以上摂氏98度以下)で3秒以上10秒以下(又は4秒以上7秒以下)により行う。
アニーリング(ステップ2)
アニーリングは,例えば,摂氏50度以上摂氏70度以下(又は摂氏55度以上摂氏65度以下)で3秒以上10秒以下(又は4秒以上7秒以下)により行う。
DNA伸長反応(ステップ3)
DNA伸長反応は,通常,通常アニーリング工程より高温にて行う。DNA伸長反応は,例えば,摂氏60度以上摂氏80度以下(又は摂氏63度以上摂氏73度以下)で5秒以上20秒以下(又は6秒以上12秒以下)により行う。
PCRは,上記のステップ1〜ステップ3を複数サイクル行う。サイクル数の例は,10回以上100回以下である。サイクル数は,対象となる菌由来の増幅物が検出できる程度に増幅するまで行えばよい。
次に,DNA断片の増幅産物を検出する。PCRで増幅されたDNA断片の検出方法は公知である。本発明においても公知の検出方法を適宜採用できる。DNA断片の増幅産物を検出する方法の例は,増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し,核酸染色を行って可視化するものである。後述の実施例により示されたとおり,プライマーセットにより増幅される対象の菌に含まれるDNA断片の長さが実施例により見出された。よって,検出対象に,所定の長さのDNA断片が含まれるか(所定の長さ領域の部位にバンドが見えるか)を判断することで,対象となる菌が被検者の皮膚に存在するか否かを判断することができる。
肌に悪影響を与える菌叢の調査
ヒトの肌の状態が悪化する原因となる菌叢についての知見を得るため,被験者の協力のもと肌に悪影響を及ぼす菌叢及びその菌叢のDNAを調査した。
具体的には,被験者は,その顔の皮膚を綿棒でこすり,その綿棒で寒天培地をこすり,皮膚に存在する常在菌を増幅させた。さらに,各被験者について,肌の状況と肌の変化とを記録した。各サンプルについて,大規模配列解析を行った。配列解析には,イルミナ社のHiSeq2000を用いた。
その結果,肌の状態が良かったものの短い期間で肌の状態が悪化したサンプルは,他のサンプルに比べて配列番号1で示される塩基配列を有するDNAが多く含まれることがわかった。このため,配列番号1で示される塩基配列を有するDNAを有する菌叢の有無や量を測定することで,肌の状態を診断できることがわかった。
[実施例1]
配列番号2,3の塩基配列を基に,フリーのヌクレオチドをFmoc固相法によって結合し,次いでOPCカラムにより精製することによって,2種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは,使用直前まで−80℃にて保管し,融解後直ちに使用するようにし,凍結融解を3回以上繰り返さないようにした。
上記2種類のプライマーを,使用前に蒸留水にて溶解し,被験DNA液を含む反応液に対し,それぞれの最終濃度が0.25μMとなるようにした。
被験者の肌を湿らせた綿棒で擦ったものから,動物組織からのトータルDNAを精製するキットであるDNeasy
Blood&Tissue kit(QIAGEN社製)を用いてサンプルのDNAを精製した。上記精製したサンプルのDNAの濃度を測定し,滅菌水を加えて希釈し,被験DNA液(1ng/μl)に希釈した。それぞれの被験DNA液1μlに滅菌水及びPCR酵素バッファー混合液およびプライマーを,QIAGEN
Fast Cycling PCR
Kit(QIAGEN社製)のプロトコルに従って加え,総液量を20μlに調整してPCR反応を行った。
PCR反応は,反応液が入った状態のチューブを95℃で5分保持した後,熱変性反応を96℃で5秒,アニーリング反応を60℃で5秒,DNA伸長反応を68℃で9秒行い,以上の反応を45サイクル繰り返し,最後に72℃で1分DNA伸長反応を行った。
PCR反応終了後,得られたPCR産物を,4.0%アガロースゲル(インビトロジェン社製)を用いMupid−2(アドバンス社製)により,100V45分間電気泳動し,エチジウムブロマイド(1.0μg/ml)で5分間染色後,UVランプ下でバンドを撮影した。その結果を図1に示す。図1は,肌を悪化させる菌が生息していると考えられる肌由来のサンプルについて配列番号2及び配列番号3からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示すゲル電気泳動写真である。図1に示されるように,肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで,150bpのバンドが確認できた。
このことから,配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたPCR法に基づいて肌の状態を指弾する場合,150bp前後(例えば145bp以上155bp以下,又は148bp以上152bp以下)のバンドの有無を用いればよいことがわかる。すなわち,150bp前後のバンドが観測される対象は,肌に悪影響を及ぼす菌叢が生息しているといえるし,150bp前後のバンドが強く観測される対象は,そのような菌叢が多く生息しているため,肌の状況が極めて悪化しやすいと判断される。
[実施例2]
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて,配列番号4及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例1と同様にしてPCRに基づく肌の状況解析を行った。その結果,肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで,110bpのバンドが確認できた。
このことから,配列番号4及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたPCR法に基づいて肌の状態を指弾する場合,110bp前後(例えば105bp以上115bp以下,又は108bp以上112bp以下)のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
[実施例3]
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて,配列番号6及び配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例1と同様にしてPCRに基づく肌の状況解析を行った。その結果,肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで,109bpのバンドが確認できた。
このことから,配列番号6及び配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたPCR法に基づいて肌の状態を指弾する場合,109bp前後(例えば104bp以上114bp以下,又は107bp以上111bp以下)のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
[実施例4]
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて,配列番号8及び配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例1と同様にしてPCRに基づく肌の状況解析を行った。その結果,肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで,109bpのバンドが確認できた。
このことから,配列番号8及び配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたPCR法に基づいて肌の状態を指弾する場合,109bp前後(例えば104bp以上114bp以下,又は107bp以上111bp以下)のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
[実施例5]
配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて,配列番号10及び配列番号11で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例1と同様にしてPCRに基づく肌の状況解析を行った。その結果,肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで,109bpのバンドが確認できた。
このことから,配列番号10及び配列番号11で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたPCR法に基づいて肌の状態を指弾する場合,109bp前後(例えば104bp以上114bp以下,又は107bp以上111bp以下)のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
本発明は,美容業や美容業のための機器を製造販売する製造業の分野で利用されうる。
配列番号1:合成DNA
配列番号2:プライマー
配列番号3:プライマー
配列番号4:プライマー
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号8:プライマー
配列番号9:プライマー
配列番号10:プライマー
配列番号11:プライマー

Claims (2)

  1. 配列番号2〜11のプライマーから選択される2種のプライマーセットを含む肌診断用のプライマーセットであって,
    前記2種のプライマーセットは,
    配列番号2及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーセット,
    配列番号4及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーセット,
    配列番号6及び配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーセット,
    配列番号8及び配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーセット,及び
    配列番号10及び配列番号11で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットである
    肌診断用のプライマーセット。
  2. 請求項1に記載の肌診断用のプライマーセットを用いて,対象物に含まれるDNA断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と,
    前記増幅産物を検出する工程と,
    を含む,
    肌の検査方法。
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