JP2008005701A - 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 - Google Patents
上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008005701A JP2008005701A JP2004296559A JP2004296559A JP2008005701A JP 2008005701 A JP2008005701 A JP 2008005701A JP 2004296559 A JP2004296559 A JP 2004296559A JP 2004296559 A JP2004296559 A JP 2004296559A JP 2008005701 A JP2008005701 A JP 2008005701A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer set
- lung cancer
- mutation
- growth factor
- epidermal growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】微量検体から迅速且つ正確にEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の変異を検出することによってゲフィチニブ等のEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する技術を提供すること。
【解決手段】特定の配列のプライマーセットを使用して、PCR−SSCP法によるEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の変異の検出を行うことにより、100%又はそれに近い精度で、該遺伝子の変異の有無を検出し、その遺伝子変異の検出の有無に基づいてゲフィチニブの抗腫瘍効果を予測する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の配列のプライマーセットを使用して、PCR−SSCP法によるEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の変異の検出を行うことにより、100%又はそれに近い精度で、該遺伝子の変異の有無を検出し、その遺伝子変異の検出の有無に基づいてゲフィチニブの抗腫瘍効果を予測する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ゲフィチニブ等の上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する方法に関する。また、本発明は、該予測診断方法を実施するために使用されるキットに関する。
上皮増殖因子受容体(以下、EGFRと表記する)のチロシンキナーゼを阻害する薬剤は、非小細胞肺癌に対して抗腫瘍作用を効果的に発揮できることが分かっている。EGFRを標的とした抗腫瘍剤であるゲフィチニブは、従来の化学療法が無効である非小細胞肺癌に対して、高い抗腫瘍効果が期待される薬剤として、2002年から日本国内で市販されている。ゲフィチニブの投与は、非小細胞肺癌の10〜30%の患者に対しては有効であるものの、他の患者には抗腫瘍効果を示さないだけでなく、7%程度の患者には急性肺障害等の致死的副作用が引き起こされることが分かっている。そのため、ゲフィチニブ等のEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の投与に先立って、該薬剤の抗腫瘍効果を正確に予測することにより、抗腫瘍効果が期待される患者を正確に選択することが重要とされている。
これまでに、EGFR遺伝子のエクソン18、19又は21に変異が認められる場合には、ゲフィチニブがその非小細胞肺癌に対して有効な抗腫瘍作用を発揮できることが明らかにされている。しかしながら、EGFRの遺伝子変異の確認には、従来、その遺伝子配列の同定が必要とされており、この方法では(1)変異同定に時間がかかる、(2)微量検体からの検出が困難、(3)凍結標本が必要であり、遺伝子が断片化されているホルマリン固定検体を使用できない、(4)高い純度の検体が必要である等の問題点があった。このような従来技術を背景として、微量検体から迅速且つ正確にEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の遺伝子変異を検出する技術の確立が望まれていた。
従来、微量の検体から迅速に遺伝子上の配列異常を検出する方法として、PCR−SSCP(single-strand conformation polymorphism)法が知られている。このPCR−SSCP法では、一般に遺伝子変異の検出率は80〜90%程度であることが知られている(例えば、非特許文献1参照)。しかしながら、ゲフィチニブの抗腫瘍効果が期待される患者を正確に選択するためには、100%又はそれに近い検出率でEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の遺伝子変異を検出することが求められており、従来のPCR−SSCP法の精度では、臨床的応用の観点から満足できるものではなかった。
須貝幸子、「がんの遺伝子診断」、都臨技会誌、Vol.31、No.1、p.12-16
須貝幸子、「がんの遺伝子診断」、都臨技会誌、Vol.31、No.1、p.12-16
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、微量検体から迅速且つ正確にEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の変異を検出することによってゲフィチニブ等のEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する技術を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、PCR−SSCP法によるEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の変異の検出に特に適したプライマーを見出した。そして、該プライマーを用いてPCR−SSCP法を行うことにより、検体としてホルマリン固定検体を使用しても、100%又はそれに近い検出率でEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の遺伝子変異を検出でき、その遺伝子変異の検出の有無に基づいてゲフィチニブの抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測できることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる発明である:
項1. 下記工程を含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法:
(1)非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを用いてPCR法により増幅させる工程、
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット
(2)増幅産物をSSCP法により分析し、上記部分配列中の変異の有無を確認する工程、及び
(3)変異の有無に基づいて、上記患者に対する上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測する工程。
項2. 工程(1)において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、項1に記載の予測診断方法。
項3. 工程(1)において、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、項1又は2に記載の予測診断方法。
項4. 肺癌患者から採取した肺癌組織片が、ホルマリン固定されたものである、項1乃至3のいずれかに記載の予測診断方法。
項5. 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブである、項1乃至4のいずれかに記載の予測診断方法。
項6. 下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキット:
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット、
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット、及び
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット。
項1. 下記工程を含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法:
(1)非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを用いてPCR法により増幅させる工程、
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット
(2)増幅産物をSSCP法により分析し、上記部分配列中の変異の有無を確認する工程、及び
(3)変異の有無に基づいて、上記患者に対する上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測する工程。
項2. 工程(1)において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、項1に記載の予測診断方法。
項3. 工程(1)において、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、項1又は2に記載の予測診断方法。
項4. 肺癌患者から採取した肺癌組織片が、ホルマリン固定されたものである、項1乃至3のいずれかに記載の予測診断方法。
項5. 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブである、項1乃至4のいずれかに記載の予測診断方法。
項6. 下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキット:
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット、
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット、及び
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット。
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法
本発明は、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測診断する方法である。EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤とは、EGFRのチロシンキナーゼの活性を阻害する分子標的抗癌剤のことである。該チロシンキナーゼ阻害剤としては、特に制限されないが、例えばゲフィチニブやエロチニブ等が例示される。特に、ゲフィチニブは、他の治療法で効果がなかった進行性非小細胞肺癌の治療に使用されている分子標的抗癌剤であり、本発明の方法は、ゲフィチニブの非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測に好適に使用される。ゲフィチニブは、アストラゼネカ社により商品名「イレッサ」として市販されている。
(1)抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法
本発明は、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測診断する方法である。EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤とは、EGFRのチロシンキナーゼの活性を阻害する分子標的抗癌剤のことである。該チロシンキナーゼ阻害剤としては、特に制限されないが、例えばゲフィチニブやエロチニブ等が例示される。特に、ゲフィチニブは、他の治療法で効果がなかった進行性非小細胞肺癌の治療に使用されている分子標的抗癌剤であり、本発明の方法は、ゲフィチニブの非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測に好適に使用される。ゲフィチニブは、アストラゼネカ社により商品名「イレッサ」として市販されている。
本発明において、抗腫瘍効果の有効性が判断される癌は非小細胞肺癌であるが、好ましくは進行性の非小細胞肺癌である。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。
工程(1)
本発明の方法では、まず、非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を、特定のプライマーセットを用いてPCR法により増幅させる(工程(1))。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。
工程(1)
本発明の方法では、まず、非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を、特定のプライマーセットを用いてPCR法により増幅させる(工程(1))。
非小細胞肺癌患者から肺癌組織片を採取する方法としては、特に制限されないが、例えば、気管支鏡下生検や経皮生検等の臨床学的に通常実施されている方法が例示される。なお、該肺癌組織片は、癌細胞と正常細胞が混在するものであってもよい。採取された肺癌組織片は、そのまま本工程(1)において使用してもよいが、ホルマリン固定したものや凍結保存したものを使用してもよい。特に、ホルマリン固定した肺癌組織片は、過去に採取したものを使用できるという点で利点がある。
本工程では、まず、肺癌組織片に対してDNA抽出処理を行い、肺癌組織片由来のゲノムDNAを調製する。DNAの抽出処理は、本発明の技術分野において周知の方法で実施できる。簡便には、Fast DNA kit(Qbiogene Inc.製)等の市販のDNA抽出キットを利用することもできる。
本工程では、極めて微量のDNAであっても、目的の部分配列を増幅できる。例えば、100万個の正常遺伝子に1個の異常遺伝子が混入していても、該異常遺伝子を増幅し、これを検出することが可能である。
得られたゲノムDNAを鋳型として、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを用いて、PCR法によりEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を増幅させる。
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'(配列番号1)及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'(配列番号2)のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'(配列番号3)及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'(配列番号2)のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'(配列番号4)及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'(配列番号5)のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'(配列番号6)及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'(配列番号7)のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'(配列番号6)及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'(配列番号8)のプライマーセット
上記(a)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン18の部分配列(219bp)を増幅することができる。また、(b)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン18の部分配列(169bp)を増幅することができる。(c)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン19の部分配列(239bp)を増幅することができる。(d)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン21の部分配列(222bp)を増幅することができる。また、(e)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン21の部分配列(154bp)を増幅することができる。
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'(配列番号1)及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'(配列番号2)のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'(配列番号3)及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'(配列番号2)のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'(配列番号4)及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'(配列番号5)のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'(配列番号6)及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'(配列番号7)のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'(配列番号6)及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'(配列番号8)のプライマーセット
上記(a)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン18の部分配列(219bp)を増幅することができる。また、(b)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン18の部分配列(169bp)を増幅することができる。(c)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン19の部分配列(239bp)を増幅することができる。(d)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン21の部分配列(222bp)を増幅することができる。また、(e)のプライマーセットにより正常EGFR遺伝子のエクソン21の部分配列(154bp)を増幅することができる。
即ち、エクソン18の変異の検出には(a)又は(b)のプライマーセットが使用され、エクソン19の変異の検出には(c)のプライマーセットが使用され、エクソン21の変異の検出には(d)又は(エ)のプライマーセットが使用される。
本発明の方法において、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を高い精度で判定するためには、EGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の全てにおいて変異の有無を確認しておくことが望ましい。故に、本工程において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセッ、ト及び(d)又は(e)のプライマーセットをそれぞれ用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させることが望ましい。特に、より一層高い精度で変異の有無を確認するためには、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット及び(e)のプライマーセットをそれぞれ用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させることが望ましい。
PCR条件についても特に限定されず、使用する装置等に応じて適宜設定することができる。PCRにおいては、DNA鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好ましくは20〜40回繰り返して行われる。
工程(2)
次いで、上記工程(1)で得られた増幅産物をSSCP法(一本鎖DNA高次構造多型解析法)により分析し、上記部分配列中の変異の有無の確認を行う(工程(2))。
次いで、上記工程(1)で得られた増幅産物をSSCP法(一本鎖DNA高次構造多型解析法)により分析し、上記部分配列中の変異の有無の確認を行う(工程(2))。
変異の有無については、肺癌組織片由来のEGFR遺伝子から得られる増幅産物における電気泳動の移動度を、正常EGFR遺伝子を鋳型として得られる増幅産物における電気泳動の移動度と対比することにより確認される。なお、電気泳動された増幅産物のバンドの可視化は、当業界で公知の方法に従って行うことができる。
工程(2)におけるSSCPの条件としては、上記工程(1)で得られた増幅産物中の変異の有無の識別が可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、SSCP条件として、下記条件が例示される。
温度条件:通常4〜25℃、好ましくは10〜20℃
ゲル濃度:通常10〜15重量%
電気泳動条件:通常10〜20W
電気泳動時間:通常60〜180分間、好ましくは60〜90分間
このようなSSCP条件下で実施することにより、増幅産物中の変異の有無を一層明確に識別することが可能になる。
温度条件:通常4〜25℃、好ましくは10〜20℃
ゲル濃度:通常10〜15重量%
電気泳動条件:通常10〜20W
電気泳動時間:通常60〜180分間、好ましくは60〜90分間
このようなSSCP条件下で実施することにより、増幅産物中の変異の有無を一層明確に識別することが可能になる。
工程(3)
次いで、上記工程(2)で確認された変異の有無に基づいて、該肺癌患者に対するゲフィチニブの抗腫瘍効果の有効性を予測する(工程(3))。
次いで、上記工程(2)で確認された変異の有無に基づいて、該肺癌患者に対するゲフィチニブの抗腫瘍効果の有効性を予測する(工程(3))。
EGFR遺伝子のエクソン18、19又は21において遺伝子変異が存在している場合、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤は、非小細胞肺癌に対して有効に抗腫瘍作用を発揮することが分かっている。
(a)又は(b)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、EGFR遺伝子のエクソン18上の変異に相当している。また、(C)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、EGFR遺伝子のエクソン19上の変異に相当している。更に、(d)又は(e)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、EGFR遺伝子のエクソン21上の変異に相当している。
故に、(a)〜(e)のプライマーセットのいずれかを使用し、変異が認められた場合、その肺癌患者に対しては、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の投与が有効であると予測される。一方、(a)又は(b)のプライマーセット、(C)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットをそれぞれ使用し、いずれにおいても変異が認められなかった場合、その肺癌患者に対しては、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤を投与しても抗腫瘍効果が得られない可能性が高いと予測される。
2.キット及びプライマーセット
前述するように、(a)〜(e)のプライマーセットは、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測する方法に使用されるものである。従って、本発明は、更に、(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキットを提供する。該キットには、PCRに必要な試薬やSSCP法に必要な試薬が含まれていてもよい。
前述するように、(a)〜(e)のプライマーセットは、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測する方法に使用されるものである。従って、本発明は、更に、(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキットを提供する。該キットには、PCRに必要な試薬やSSCP法に必要な試薬が含まれていてもよい。
また、前述するように、(a)及び(b)のプライマーセットは、EGFR遺伝子のエキソン18の変異をPCR−SSCP法により検出するのに特に適している。また、(c)のプライマーセットは、EGFR遺伝子のエキソン19の変異をPCR−SSCP法により検出するのに特に適している。更に、(d)及び(e)のプライマーセットは、EGFR遺伝子のエキソン21の変異をPCR−SSCP法により検出するのに特に適している。従って、本発明は、更に下記(1)〜(3)の発明を提供する:
(1) (a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'、又は(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン18の変異を検出するためのプライマーセット。
(2) (c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン19の変異を検出するためのプライマーセット。
(3) (d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'、又は(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン21の変異を検出するためのプライマーセット。
(1) (a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'、又は(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン18の変異を検出するためのプライマーセット。
(2) (c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン19の変異を検出するためのプライマーセット。
(3) (d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'、又は(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'からなる、PCR−SSCP法によりEGFR遺伝子のエキソン21の変異を検出するためのプライマーセット。
本発明では、PCR−SSCP法において使用するプライマーが、通常のPCR−SSCP法では不可能とれている100%又はそれに近い精度で、EGFR遺伝子変異を検出できるように設計されているため、極めて高い精度で、非小細胞肺癌患者に対するEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能である。
また、本発明によれば、生検検体、気管支洗浄液や喀痰等の微量検体から正確にEGFR遺伝子変異を検出できるという利点に加えて、ホルマリン固定標本を検体として使用することもできるので、過去に採取した検体を用いてEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能となり、患者の肉体的負担が軽減されるという利点も得られる。即ち、EGFRのチロシンキナーゼ阻害剤投与の対象となる患者の多くは末期癌状態であり、EGFRの遺伝子変異を検索するために新たに検体を採取することが困難なことが多く、このような場合に過去に採取した検体を用いてEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の効果を予測しうる本診断法は多くの癌患者にとって福音となる。
更に、本発明によれば、僅か数時間でEGFR遺伝子変異を検出することが可能であり、極めて迅速にEGFRのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能になる。
例えば、本発明によれば、ゲフィチニブの抗腫瘍効果を投与前に予測することが可能になり、ゲフィチニブの有効性が期待される患者には早期からゲフィチニブを投与することにより臨床的メリットが得られる。また、ゲフィチニブの有効性が期待できない患者には、無駄なゲフィチニブ投与による経済的負担を軽減できると共に致死的副作用である急性肺疾患のリスクから回避することが可能になる。
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例1
1.ゲノムDNAの調製
本試験は、EGFRのエクソン18、19及び21における遺伝子変異の有無が確認されている非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片の凍結標本112例を使用して行った。なお、凍結標本112例の内、2例はエクソン18に変異があり、25例はエクソン19に変異があり、16例はエクソン21に変異があり、79例は変異が無いことが確認されている。上記凍結標本から、Fast DNA kit(Qbiogene Inc.製)を用いてゲノムDNAを調製した。
実施例1
1.ゲノムDNAの調製
本試験は、EGFRのエクソン18、19及び21における遺伝子変異の有無が確認されている非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片の凍結標本112例を使用して行った。なお、凍結標本112例の内、2例はエクソン18に変異があり、25例はエクソン19に変異があり、16例はエクソン21に変異があり、79例は変異が無いことが確認されている。上記凍結標本から、Fast DNA kit(Qbiogene Inc.製)を用いてゲノムDNAを調製した。
2.PCR
得られた大腸癌組織片由来のゲノムDNA、及び表1に示す5つのプライマーセットを用いて、PCRによりEGFRのエクソン18、19及び21の部分配列を増幅した。PCR条件は、表1に示す通りである。
得られた大腸癌組織片由来のゲノムDNA、及び表1に示す5つのプライマーセットを用いて、PCRによりEGFRのエクソン18、19及び21の部分配列を増幅した。PCR条件は、表1に示す通りである。
3.SSCP解析
GenePhor System(Amersham Bioscience製)を用いてSSCPによる分析を行った。上記で得られたPCR増幅産物のそれぞれを、12.5%アクリルアミドからなるゲル(高さ123mm×幅110mm×厚さ0.5mm)にアプライした。電気泳動はゲルと同一の緩衝液系で表1に示す条件で実施した。電気泳動後、DNA Sliver Staining Kit(Amersham Bioscience製)を用いてゲルを染色した。健常肺組織片(Wildタイプ)から得られる泳動パターンと比較することにより、肺癌組織片由来のEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21における変異の有無を確認した。
GenePhor System(Amersham Bioscience製)を用いてSSCPによる分析を行った。上記で得られたPCR増幅産物のそれぞれを、12.5%アクリルアミドからなるゲル(高さ123mm×幅110mm×厚さ0.5mm)にアプライした。電気泳動はゲルと同一の緩衝液系で表1に示す条件で実施した。電気泳動後、DNA Sliver Staining Kit(Amersham Bioscience製)を用いてゲルを染色した。健常肺組織片(Wildタイプ)から得られる泳動パターンと比較することにより、肺癌組織片由来のEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21における変異の有無を確認した。
この結果、112例の全てにおいて、SSCP解析により確認されたEGFR遺伝子の変異の有無の判定結果は、従来法の遺伝子配列を同定する方法により得られている結果と同一であった。
本実施例において(a)又は(b)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果(電気泳動図)の一例を図1に示す。図1の電気泳動写真において、レーン1、2、4及び5は変異がないEGFR遺伝子を有する肺癌組織片;及びレーン3はEGFR遺伝子の第2155位のGがAに置換されている肺癌組織片について試験した結果である。
本実施例において(c)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果(電気泳動図)の一例を図2に示す。図2の電気泳動写真において、レーン1はEGFR遺伝子の第2240位から第2257位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片;レーン2−4及び6は変異がないEGFR遺伝子を有する肺癌組織片;レーン5は第2235位から第2249位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片、;レーン7はEGFR遺伝子の第2236位から第2250位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片について試験した結果である。
本実施例において(d)又は(e)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果(電気泳動図)の一例を図3に示す。図3の電気泳動写真において、レーン1、2、4及び5は変異がないEGFR遺伝子を有する肺癌組織片;及びレーン3はEGFR遺伝子の第2573位のTがGに置換されている肺癌組織片について試験した結果である。
比較試験例1
EGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の増幅に使用されるプライマーセットの候補として、表2に示す(i)〜(xi)のプライマーセットが挙げられる。そこで、これらのプライマーセット(i)〜(xi)を使用すること以外は、上記実施例1と同様にして、大腸癌組織片由来のEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21における変異の有無を確認した。
EGFR遺伝子のエクソン18、19及び21の増幅に使用されるプライマーセットの候補として、表2に示す(i)〜(xi)のプライマーセットが挙げられる。そこで、これらのプライマーセット(i)〜(xi)を使用すること以外は、上記実施例1と同様にして、大腸癌組織片由来のEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21における変異の有無を確認した。
その結果、(i)〜(xi)のプライマーセットのいずれにおいても、PCRによる増幅ができない、或いはSSCPにおける分離ができない等の問題があり、変異の有無を正確に把握することができなかった。また、SSCPの条件を種々変更しても変異を正確に検出することはできなかった。
実施例2
EGFR遺伝子のエクソン19において変異が認められる非小細胞肺癌患者から大腸癌組織片を採取した。これを2つに分けて、一方を凍結標本にし、もう一方をホルマリン固定標本にした。
EGFR遺伝子のエクソン19において変異が認められる非小細胞肺癌患者から大腸癌組織片を採取した。これを2つに分けて、一方を凍結標本にし、もう一方をホルマリン固定標本にした。
また、同様に、EGFR遺伝子に変異が無い非小細胞肺癌患者から大腸癌組織片を採取した。これを2つに分けて、一方を凍結標本にし、もう一方をホルマリン固定標本にした。
これらの4つの標本を使用して、上記実施例と同様の方法で、大腸癌組織片由来のEGFR遺伝子のエクソン18、19及び21における変異の有無を確認した。
この結果、ホルマリン固定標本を使用しても、凍結標本と同様に、EGFR遺伝子の変異を検出できることが確認された。本実施例において、(c)のプライマーセットを使用した場合に得られた(電気泳動図)を図4に示す。図4の電気泳動写真において、レーン1はEGFR遺伝子に変異が無い肺癌組織片の凍結標本;レーン2はEGFR遺伝子のエクソン19において変異が認められる肺癌組織片の凍結標本;レーン3はEGFR遺伝子に変異が無い肺癌組織片のホルマリン固定標本;及びレーン4はEGFR遺伝子のエクソン19において変異が認められる肺癌組織片のホルマリン固定標本について試験した結果である。
Claims (6)
- 下記工程を含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法:
(1)非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列の内の少なくとも1種の配列を、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを用いてPCR法により増幅させる工程、
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット
(2)増幅産物をSSCP法により分析し、上記部分配列中の変異の有無を確認する工程、及び
(3)変異の有無に基づいて、上記患者に対する上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測する工程。 - 工程(1)において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、請求項1に記載の予測診断方法。
- 工程(1)において、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン18、19及び21の部分配列をPCR法によりそれぞれ増幅させる、請求項1又は2に記載の予測診断方法。
- 肺癌患者から採取した肺癌組織片が、ホルマリン固定されたものである、請求項1乃至3のいずれかに記載の予測診断方法。
- 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブである、請求項1乃至4のいずれかに記載の予測診断方法。
- 下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも1種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキット:
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット、
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット、及び
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004296559A JP2008005701A (ja) | 2004-10-08 | 2004-10-08 | 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 |
PCT/JP2005/018651 WO2006041036A1 (ja) | 2004-10-08 | 2005-10-07 | 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測又は診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004296559A JP2008005701A (ja) | 2004-10-08 | 2004-10-08 | 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008005701A true JP2008005701A (ja) | 2008-01-17 |
Family
ID=36148329
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004296559A Withdrawn JP2008005701A (ja) | 2004-10-08 | 2004-10-08 | 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008005701A (ja) |
WO (1) | WO2006041036A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007099852A1 (ja) * | 2006-02-23 | 2007-09-07 | National University Corporation Kanazawa University | 固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法及び検査キット |
CN107653303A (zh) * | 2017-10-11 | 2018-02-02 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法 |
-
2004
- 2004-10-08 JP JP2004296559A patent/JP2008005701A/ja not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-10-07 WO PCT/JP2005/018651 patent/WO2006041036A1/ja active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006041036A1 (ja) | 2006-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sorber et al. | Circulating cell-free nucleic acids and platelets as a liquid biopsy in the provision of personalized therapy for lung cancer patients | |
US20140296081A1 (en) | Identification and use of circulating tumor markers | |
Alikian et al. | Next-generation sequencing-assisted DNA-based digital PCR for a personalized approach to the detection and quantification of residual disease in chronic myeloid leukemia patients | |
EP3757229A1 (en) | Method of preparing cell free nucleic acid molecules by in situ amplification | |
Herreros-Villanueva et al. | KRAS mutations: analytical considerations | |
US20230061928A1 (en) | Compositions and methods for detecting circulating tumor dna | |
WO2018186930A1 (en) | Method and kit for constructing nucleic acid library | |
WO2017112738A1 (en) | Methods for measuring microsatellite instability | |
JP2023109998A (ja) | マイクロサテライト不安定性の検出 | |
Yoon et al. | Peptide nucleic acid clamping versus direct sequencing for the detection of EGFR gene mutation in patients with non-small cell lung cancer | |
CN112921091B (zh) | Flt3基因突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 | |
JP2017070240A (ja) | 稀少突然変異の検出方法、検出装置及びコンピュータプログラム | |
WO2020021119A1 (en) | Method of monitoring effectiveness of immunotherapy of cancer patients | |
EP3954784A1 (en) | Composition for diagnosis or prognosis prediction of glioma, and method for providing information related thereto | |
JPWO2013129542A1 (ja) | Hla−a*31:01アレルの検出方法 | |
CN107151707B (zh) | 一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用 | |
WO2017084027A1 (zh) | 一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒及检测方法 | |
Ardakani et al. | Detection of epidermal growth factor receptor mutations in lung adenocarcinoma: comparing Cobas 4800 EGFR assay with Sanger bidirectional sequencing | |
US20180187267A1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
US20190352704A1 (en) | Benign thyroid nodule-specific gene | |
JP2008005701A (ja) | 上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法 | |
KR102236717B1 (ko) | 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 | |
WO2017106365A1 (en) | Methods for measuring mutation load | |
KR101644661B1 (ko) | 암의 검출에 사용하기 위한 약 12317-16254 잔기의 미토콘드리아 dna 결손 | |
CN113061656A (zh) | Tet1基因突变在预测结肠癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080108 |