KR101644661B1 - 암의 검출에 사용하기 위한 약 12317-16254 잔기의 미토콘드리아 dna 결손 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암을 예측, 진단 및 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계, 상기 샘플에서 미토콘드리아 DNA 돌연변이를 정량하는 단계 및 상기 샘플에 존재하는 mtDNA 돌연변이의 수준을 기준 값과 비교하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명의 방법은 새로운 치료제 및 처치 섭생에 대한 스크리닝에 효과적일 수 있다, 또한, 상기 방법은 예방적 또는 치료적 처치에 대한 대상의 반응을 모니터링하는데 또한 유용할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 이의 전체 내용이 본원에 원용에 의해 포함된, 2007년 11월 9일자로 출원된 미국출원 제61/002,637호에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 미토콘드리아 유전체학의 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 인간 미토콘드리아 게놈 돌연변이의 검출 및 암의 지표로서 이의 유용성에 관한 것이다.
진단 도구로서
미토콘드리아
DNA
미토콘드리아 DNA (mtDNA) 서열 역학은 중요한 진단 도구이다. mtDNA에서 돌연변이는 종종 질환 발생의 예비 지표이며, 종종 핵 돌연변이와 연관되어 있으며, 특히 하기와 관련된 바이오마커로서 작용한다: 흡연 및 간접 흡연에 대한 노출 유래의 조직 손상 및 암과 같은 (그러나 이에 제한되지는 않는) 질환 (Lee et al., 1998; Wei, 1998); 약 20세에 시작하여 그 후에 증가하는 미토콘드리아 게놈 돌연변이의 축적에 기초한, 장수 (von Wurmb, 1998); 돌연변이 또는 발암물질, 돌연변이 유발 요인, 자외선 복사에 대한 노출에 의해 야기된 전이성 질환 (Birch-Machin, 2000); 골관절염; 심혈관계 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병 (Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997; Zhang et al, 1998); 청력 상실과 연관된 연령 (Seidman et al., 1997); 시신경 퇴행 및 심부정맥 (Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988); 만성 진행성 외안근마비 (Taniike et al., 1992); 죽상동맥경화 (Bogliolo et al., 1999); 유두 갑상선암 및 갑상선 종양 (Yeh et al., 2000); 및 그 외 다른 것 (e.g. Naviaux, 1997; Chinnery and Turnbull, 1999).
미토콘드리아 게놈의 특정 부위에서 돌연변이는 특정 질환과 연관될 수 있다. 예를 들면, 4216, 4217 및 4917 위치에서의 돌연변이는 레버 유전성 시신경병증(LHON) (Mitochondrial Research Society; Huoponen (2001); MitoMap)과 연관이 있다. 15452에서의 돌연변이는 유비퀴놀 사이토크롬 c 환원효소(복합체 III) 결핍과 연관된 5/5 환자에서 발견되었다 (Valnot et al.1999).
특히, 상기 돌연변이 또는 변경은 점돌연변이(전이, 염기전환), 결손(1개의 염기에서 수천 개의 염기까지), 역위, 복제(1개의 염기에서 수천 개의 염기까지), 재조합 및 삽입(1개의 염기에서 수천 개의 염기까지)을 포함한다. 게다가, 특정 염기 쌍의 변경, 결손, 또는 이의 조합은 노화(예를 들면, Polyak et al., 1998), 미성숙 노화, 발암물질에 대한 노출(Lee et al., 1998) 등뿐만 아니라 전립선암, 피부암 및 폐암의 초기 시작과 연관된 것이 발견되었다.
전립선암
전립선암은 전립선 상피에서 대부분 유래하는 것으로 생각되는 자주 진단되는 고형 종양이다(Huang et al. 1999). 1997년에, 거의 천만 명의 미국 남성이 전립선 특이적 항원(PSA)에 대해 스크리닝 되었고, 이의 존재는 전립선암을 암시한다(Woodwell, 1999). 사실, 상기 사실은 초기 직장수지검사(DRE)에 의해 스크리닝된 훨씬 더 많은 수의 남성을 나타낸다. 동일한 해에, 삼천 백만명의 남성이 직장수지검사를 받았다(Woodwell, 1999). 게다가, 미국에서 새로이 진단된 전립선암의 연간 사례수는 179,000 건으로 추산된다(Landis et al., 1999). 상기 전립선암은 캐나다 남성에게서 두 번째로 가장 많이 진단된 암이며, 암 사망률의 두 번째 주요 원인이다. 1997년에 캐나다 남성에게서 새로이 진단된 암 중 19,800 건(28%)이 전립선암이었다(National Cancer Institute of Canada). 49세 이상의 남성 중 30% 내지 40%가 약간의 전립선 암세포를 가지는 것으로 추정되지만, 상기 남성 중 단지 20% 내지 25%만이 임상적으로 현저한 전립선암의 형태를 가진다 (SpringNet - CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm). 전립선암은 내인성 및 외인성 인자 즉, 사회경제적인 상황, 다이어트, 지형, 호르몬 불균형, 가족력 및 유전적 구성을 포함하는 다양한 조직학적 행동을 보여준다(Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998). 비록 특정 mtDNA 변화가 전립선암과 이미 연관되어있다 할지라도, 전립선암의 검출을 위한 추가의 마커에 대한 필요성이 존재한다.
유방암
유방암은 유선 조직의 암이며 암으로 인한 사망 중 다섯 번째로 가장 많은 원인이다. 2005년에, 유방암은 세계적으로 502,000명의 사망의 원인이었다 (암 사망의 7%; 모든 사망의 거의 1%) (World Health Organization Cancer Fact Sheet No. 297). 세계적으로 여성에게서, 유방암은 가장 흔한 암이며 암으로 인한 사망의 가장 흔한 원인이다 (World Health Organization Cancer Fact Sheet No. 297). 예를 들면 Parrella 등(Cancer Research: 61, 2001)에서, 비록 임의의 mtDNA 변화가 유방암과 이미 연관되어있다 할지라도, 유방암의 검출을 위한 추가의 마커에 대한 필요성이 존재한다.
상기 배경 정보는 본 발명에 대해 관련된 출원인에 의해 신뢰하는 공지된 정보를 만들 목적으로 제공되었다. 임의의 선행 정보가 본 발명에 대해 선행 기술을 구성한다는 어떤 인정도 반드시 의도되지 않으며, 해석되어서도 안 된다.
발명의 요약
본 발명은 암의 검출에 사용하기 위한 미토콘드리아 DNA 돌연변이에 관한 것이다. 본 발명의 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 개인에게서 암을 검출하는 방법이 제공된다:
a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계;
c) 인간 mtDNA 게놈의 약 12317 잔기 및 약 16254 잔기 사이의 mtDNA 서열에 결손을 가지는 상기 샘플에서 mtDNA의 양을 정량하는 단계; 및
d) 상기 결손을 갖는 샘플에서 mtDNA의 양을 적어도 하나의 공지된 기준(reference) 값과 비교하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 암의 발생에 대해 개인을 모니터링하는 방법이 제공된다:
a) 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계;
c) 인간 mtDNA 게놈의 약 12317 잔기 및 약 16254 잔기 사이의 mtDNA 서열에 결손을 가지는 상기 샘플에서 mtDNA의 양을 정량하는 단계; 및
d) 지속시간 동안 a) 내지 c) 단계를 반복하는 단계;
여기에서, 지속시간 동안 상기 결손 수준의 증가는 암을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 개인에게서 암을 검출하는 방법이 제공된다:
a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계;
c) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 서열에 해당하는 결손을 가지는 샘플에서 mtDNA의 양을 정량하는 단계; 및
d) 서열번호 1 또는 서열번호 2에 해당하는 상기 샘플에서 mtDNA의 양을 적어도 하나의 공지된 기준 값과 비교하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기를 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 진단 키트가 제공된다:
(a) 하나 이상의 생물학적 샘플을 수집하기 위한 재료; 및
(b) mtDNA 결손을 검출하기 위한 적절한 프라이머 및 시약.
도 1은 실시예 1과 관련된 주기 역치(cycle threshold)를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
도 3은 실시예 2와 관련된 주기 역치를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
도 5는 4 kb 결손의 검출에 유용한 프라이머의 고안 및 서열을 보여주는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
도 3은 실시예 2와 관련된 주기 역치를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
도 5는 4 kb 결손의 검출에 유용한 프라이머의 고안 및 서열을 보여주는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 구현예의 특이도 및 민감도를 나타내는 ROC 곡선을 보여준다.
본 발명은 암을 예측, 진단 및 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 생물학적 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계, 상기 샘플에서 미토콘드리아 돌연변이의 양을 정량하는 단계 및 샘플에서 상기 돌연변이의 양을 기준 값과 비교하는 단계를 포함한다. 이점에 있어서, 상기 방법은 질환의 시작을 결정하고 암에 대한 개인의 소인을 평가하기 위한 포괄적인 수단을 제공한다. 또한 상기 방법은 일정 시간 동안 개인의 위험 인자의 모니터링 및/또는 치료제 및 처치 섭생에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 허용한다.
정의
다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명이 속한 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본원에 사용된, 용어 "약"은 상기 언급된 값으로부터의 이해되는 변이를 말한다. 상기 변이는 특별히 언급되든 되지 않든, 본원에 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함된다는 것을 이해해야 한다.
본원에 정의된, "생물학적 샘플"은 mtDNA가 얻어질 수 있는 세포를 포함하는 조직액 또는 체액을 말한다. 예를 들면, 상기 생물학적 샘플은 유방 또는 전립선 조직과 같은 조직, 또는 혈액, 타액, 뇌척수액, 가래, 소변, 점액, 활액, 복막액, 양수 등으로부터 유래할 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 외과적 표본 또는 생검 표본일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 상기 원천으로부터 얻어진 그대로 직접 사용되거나 또는 상기 샘플의 특성을 변형하기 위한 전처리 후에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 생물학적 샘플은 예를 들면, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청의 제조, 세포의 파괴, 고형 재료로부터 체액의 제조, 점액의 희석, 체액의 여과, 체액의 증류, 체액의 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 사용 전에 전처리될 수 있다.
본원에 사용된, "주기 역치"(CT)는 형광 신호와 같은 신호에 의해 보여지는 바와 같이, 실시간 PCR을 사용한 타겟 증폭이 백그라운드 위로 상승하는 지점이다. 상기 주기 역치는 조사되는 상기 서열의 양과 역관계에 있다.
본원에 사용된, "진단의" 또는 "진단"은 질환 진단 또는 관리에서의 인자로서 돌연변이 또는 돌연변이 조합의 존재 또는 부재를 사용하는 것을 의미한다. 상기 돌연변이(들)의 검출은 질환의 진단에서 하나의 단계일 수 있다.
본원에 사용된, "결손"은 mtDNA의 인접 서열로부터 mtDNA 영역의 제거를 의미한다. 결손은 하나의 염기에서부터 수천 개의 염기 또는 그 이상까지의 크기에 이를 수 있다.
본원에 사용된, "미토콘드리아 DNA" 또는 "mtDNA"는 미토콘드리아에 존재하는 DNA이다.
본원에 사용된, "돌연변이"는 점돌연변이, 전이, 삽입, 염기전환, 전위, 결손, 역위, 복제, 재조합 또는 이의 조합을 제한 없이 포함하는, 야생형 서열 유래의 미토콘드리아 DNA 에서 임의의 변이 또는 변화를 포함한다. 상기 서열의 변이 또는 변화는 단 하나의 염기 변화에서부터 전체 DNA 절편의 부가 또는 제거까지 포함할 수 있다.
본원에 정의된, "민감도"는 본 발명의 방법을 사용하여 얻어진 진양성 결과의 일부(진양성률)를 말한다.
본원에 정의된, "특이도"는 본 발명의 방법을 사용하여 얻어진 위양성 결과의 일부(위양성률)를 말한다.
본원에 상호교환하여 사용된 용어 "치료" 및 "처치(treatment)"는 대상의 상태를 향상시킬 의도로 수행된 중재를 말한다. 상기 향상은 주관적 또는 객관적일 수 있으며 질환의 발생 예방 또는 병리 변화와 연관된 증상의 개선과 관련이 있다. 따라서, 상기 용어 치료 및 처치는 가장 넓은 의미로 사용되며, 다양한 단계에서 질환의 예방(질병예방), 조절, 감소, 및 치유를 포함한다. 대상의 상태 악화를 막는 것은 상기 용어에 또한 포함된다. 따라서 치료/처치를 필요로 하는 대상은 상기 질환을 가지기 쉬운 사람 또는 상기 질환이 발생할 위험이 있는 사람 및 상기 질환이 예방되어야 하는 사람뿐만 아니라 상기 질환을 이미 갖고 있는 사람도 포함한다.
암을 예측, 진단 및
모니터링하기
위한 분석법
미토콘드리아 돌연변이의 검출을 위한 분석법
미토콘드리아 DNA (mtDNA) 역학은 중요한 진단 도구이다. mtDNA에서의 돌연변이는 종종 질환 발생의 예비 지표이며 질환 시작과 연관된 위험 인자를 나타내는 바이오마커로서 작용할 수 있다. 본원에 논의된, 생물학적 샘플에서 미토콘드리아 DNA 이상의 수준을 측정하는 것은 하나 이상의 암의 존재를 결정할 수 있으며 하나 이상의 암에 대해 환자의 잠재적 위험 또는 소인을 동정할 수 있다. 게다가, 규칙적인 간격으로 mtDNA의 측정은 일정 시간 동안 환자의 경과를 측정하기 위한 및/또는 암을 예방 또는 치료하는데 있어서 상기 방법 유효성을 결정하기 위한 처치 권고에 대한 평가로서 실시간, 정량적 모니터링 수단을 건강 관리 전문가에게 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 생물학적 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 추출하는 단계, 및 상기 샘플에서 mtDNA 이상의 양을 정량하고, 상기 이상의 수준을 기준 값과 비교함으로써 미토콘드리아 돌연변이에 대해 상기 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 암을 예측, 진단 또는 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 기준 값은 상기 방법이 암을 예측, 진단 또는 모니터링 하려고 하는지에 기초한다. 따라서, 상기 기준 값은 하나 이상의 공지된 비-암성(non-cancerous) 생물학적 샘플, 하나 이상의 공지된 암성 생물학적 샘플, 및/또는 일정 시간 동안 얻어진 하나 이상의 생물학적 샘플로부터 수집된 mtDNA 데이타와 관련될 수 있다. 상기 기준 값은, 예를 들면 기준 샘플과 비교하여 생물학적 샘플에서 결손의 유사하거나 증가된 양이 암에 대한 소인 또는 암의 시작을 나타내거나, 또는 시간에 따라 결손의 수준 증가가 암의 시작을 나타내는 하나 이상의 생물학적 샘플로부터 수집된 mtDNA 데이타와 비교를 위해 사용된다.
본 발명의 양태에 따라, 암을 예측, 모니터링 및 진단하기 위한 상기 방법은 하나 이상의 미토콘드리아 돌연변이를 검출 및 정량하기 위한 분석법을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 mtDNA 결손이다. 또 다른 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 mtDNA 중 3926bp (본원에 "4 kb 결손" 또는 "4 kb 서열"로 언급됨)의 mtDNA 결손이다. 또 다른 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 서열을 가지는 mtDNA 결손이며, 원형일 때 서열번호 1 및 서열번호 2 사이에 차이는 없다.
상기 4 kb 결손은 인간 mtDNA 게놈의 대략 12317 및 16254 뉴클레오티드에 걸쳐 있다. 상기 인간 mtDNA 게놈은 본원에 서열번호 3으로 열거되었다 (Genbank accession no. AC_000021). 상기 4 kb 결손은 12317 내지 12328 및 16243 내지 16254 위치에 반복을 가지며, 12 bp 크기의 직접적인 플랭킹 반복의 특징이 있다. 상기 반복 서열은 5'-TGCAACTCCAAA-3' 이다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 상기 인간 mtDNA 게놈의 약 12317 잔기 및 약 16254 잔기 사이의 mtDNA 결손이다.
본 발명자는, 하기 실시예를 통해 제공된 바와 같이, 상기 결손이 암, 특히 전립선암 및 유방암과 연관이 있다는 것을 결정하였다. 따라서, 상기 결손은 정확한 바이오마커를 제공하며, 따라서, 적어도 상기 조직에서 암의 검출, 진단, 또는 모니터링을 하기 위한 귀중한 수단을 제공한다.
상기 결손은 두 개의 결손 단량체인, 4 kb 크기 (작은 sublimon) 및 대략 12.5 kb 크기 (큰 sublimon)의 생성을 야기한다. 상기 결손의 발생은, 각각 4 kb 또는 12.5 kb 서열인 작은 sublimon 또는 큰 sublimon의 존재를 동정함으로써 검출될 수 있다.
상기 미토콘드리아 돌연변이를 분석하기 위한 전형적 방법은 실시예 섹션에 제공된다. 샘플로부터 mtDNA의 추출은 임의의 적절한 공지의 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 당업계에 공지 및 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007)에 기재된 바와 같이, mtDNA 추출에 이어서 미토콘드리아 게놈의 전체 또는 일부 영역이 증폭되며, 상기 미토콘드리아 게놈의 시퀀싱을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상기 mtDNA에서 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 방법은 당업자에게 공지된 적절한 기술로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, mtDNA를 분석하는 것은 mtDNA 시퀀싱, PCR에 의한 mtDNA 증폭, 서던, 노던, 웨스턴 사우스-웨스턴 블롯 혼성화, 변성(denaturing) HPLC, 마이크로어레이에 대한 혼성화, 바이오칩 또는 유전자 칩, 분자 마커 분석, 바이오센서, 융점 프로파일링 또는 상기 기술의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
미토콘드리아 DNA를 시퀀싱하기 위한 임의의 적절한 수단이 사용될 수 있다. 바람직하게는, mtDNA는 시퀀싱에 앞서 PCR에 의해 증폭된다. 상기 PCR 방법은 당업계에 주지되어 있으며, [Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335] 에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. PCR 산물은 직접적으로 시퀀싱되거나 또는 이어서 세균 숙주 내로 위치되는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. DNA 시퀀싱 방법의 예는 [Brumley, R. L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126] 및 [Luckey, J.A., et al, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172]에 기재된다. PCR 및 mtDNA 시퀀싱의 조합된 사용은 [Hopgood, R., et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13:82-92] 및 [Tanaka, M. et al, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421]에 기재된다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 비록 실시간 정량적 PCR 방법이 상기 4 kb 결손의 존재 또는 부재를 검출 및 정량하기 위한 바람직한 수단을 나타낸다 할지라도, 다른 방법이 당업자에게 주지될 수 있으며 상기 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 게다가, 상기 결손의 정량은 Bio-Rad's Bioplex™ System 및 Suspension Array technology을 이용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 임의의 공지된 방법을 이용한 서열의 증폭 및 정량을 필요로 한다.
하기의 프라이머 서열은 상기 4 kb 결손의 검출을 위해 사용될 수 있는 프라이머의 예이다:
4 정방향 (인간 mtDNA 게놈의 12313 내지 12328/16255 내지 16267 염기에 결합) 5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3' (서열번호 4);
4 역방향 (인간 mtDNA 게놈의 16391 내지 16409 염기에 결합) 5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3' (서열번호 5).
본 발명의 일 구현예에서, 증폭 프라이머의 쌍은 상기 4 kb 결손의 존재를 나타내는 타겟 영역을 증폭하는데 사용된다. 상기 구현예에서, 증폭 프라이머 쌍 중 하나는 상기 4 kb 서열의 결손이 발생하고 상기 mtDNA가 원형의 mtDNA 분자로 재형성된 후(예를 들면, 상기 mtDNA 게놈의 12328 및 16255 사이의 위치에서 스플라이스), mtDNA의 스플라이싱된 영역과 겹친다. 따라서, 상기 겹쳐진 프라이머의 신장은 상기 4 kb 부분이 결손 되면 발생할 수 있다. 도 5는 상기 프라이머의 고안 및 서열(즉, 서열번호 4)을 보여주는 모식도이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 증폭 프라이머의 쌍은 상기 결손된 4 kb 서열과 연관된 타겟 영역을 증폭하는데 사용된다. 상기 결손된 4 kb 서열은, 결손시 원형의 mtDNA 분자로 재형성될 수 있다. 상기 구현예에서, 증폭 프라이머의 쌍 중 하나는 상기 4 kb 서열의 말단의 재연결 부위와 겹친다. 따라서, 샘플에서 검출된 상기 4 kb 분자의 양의 증가는 암을 나타낸다.
본 발명의 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 결손의 구분점(breakpoint)은 알려지지 않아 프라이머 위치에 대한 두 가지 가능성을 초래한다. 상기 구현예에서, 2개의 분리된 정방향 프라이머는 상기 결손된 4 kb 서열과 연관된 타겟 영역을 증폭하기 위해 고안될 수 있다. 하기의 프라이머 서열은 상기 시나리오에서 4 kb 결손의 검출을 위해 사용될 수 있는 프라이머의 예이다:
정방향 프라이머:
프라이머 A (인간 mtDNA 게놈의 12313 내지 12328/16255 내지 16267 염기에 결합) 5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3' (서열번호 4);
프라이머 B (인간 mtDNA 게놈의 12302 내지 12316 염기에 결합) 5'- CCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAAGCCAC-3' (서열번호 6).
역방향 프라이머:
프라이머 C (인간 mtDNA 게놈의 16391 내지 16409 염기에 결합) 5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3' (서열번호 5).
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머 A 또는 B는 qPCR 분석법에 유용한 PCR 산물을 생성하기 위해 역방향 프라이머 C와 함께 사용될 수 있다.
생물학적 샘플
본 발명은 하나 이상의 생물학적 샘플을 얻거나 수집하는 것을 포함하는 진단 시험을 제공한다. 본 발명의 내용에서, "생물학적 샘플"은 mtDNA가 얻어질 수 있는 세포를 포함하는 조직 또는 체액을 말한다. 예를 들면, 상기 생물학적 샘플은 유방, 전립선, 신경, 근육, 심장, 위, 결장 조직 등을 포함하는 조직; 또는 혈액, 타액, 뇌척수액, 가래, 소변, 점액, 활액, 복막액, 양수 등으로부터 유래할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 생물학적 샘플은 암성 또는 비-암성 조직으로부터 얻어질 수 있으며 외과적 표본 또는 생검 표본일 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 공급원으로부터 얻어진 그대로 직접 사용되거나 또는 상기 샘플의 특성을 변형시키기 위한 전처리 후에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 생물학적 샘플은 사용 전에, 예를 들면, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청의 제조, 세포의 파괴, 고형 재료로부터 체액의 제조, 점액의 희석, 체액의 여과, 체액의 증류, 체액의 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 전처리될 수 있다.
당업자는 하나 이상의 샘플 유형이 한 번에 분석될 수 있다는 것을 이해할 것이다(즉, 하나 이상의 암의 검출을 위해). 게다가, 수집 과정이 요구되는 곳, 예를 들면, 일정 시간 동안 위험 인자 또는 암을 모니터링하기 위한 곳에서, 주어진 샘플은 단독 또는 시험기간에 걸쳐서 획득된 다른 샘플과 함께 진단될 수 있다. 이점에 있어서, 생물학적 샘플은 단 한 번, 또는 격주, 매월, 반년 또는 매년과 같은 규칙적인 간격으로 획득될 수 있다.
또한 당업자는 미토콘드리아 DNA 타겟이 핵산 타겟보다 훨씬 더 많은 양(대략 1000배 더 많은)이 존재하며, 극히 낮은 생산량의 핵산을 포함하는 상기 샘플 크기는 본 발명에 사용하는데 적당할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
암을 예측, 진단 및
모니터링하기
위한 적용
암의 진단 및
모니터링
대부분의 조직 유형 및 연령 그룹에서 암의 유행은 암의 존재의 검출뿐만 아니라 상기 질환의 시작, 진행 및 확산을 예방하기 위해 권고 되는 예방적 조치 및 치료의 성공 및 적절성을 모니터링하기 위한 수단의 유용성을 필요로 한다. 개인의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 미토콘드리아 DNA 결손의 수준을 측정하는 것은 위험 인자, 암 및/또는 상기 질환의 단계의 조기 진단을 제공할 수 있다.
본 발명의 시스템 및 방법은, 예를 들면, 초기 단계 및 임의의 조직학적 기형 전에 암을 검출하는데 사용될 수 있다. 게다가, 격주, 매월, 반년 또는 매년(또는 임의의 다른 적절한 간격)과 같은 규칙적인 간격에서 샘플 시험은 상기 질환을 예방 또는 치료하는데 상기 방법의 유효성을 결정하기 위해 처치 권고에 대해 비교하기 위한 실시간, 정량적 모니터링 수단을 건강 관리 전문가에게 제공할 수 있다.
실시예로 돌아가면, 일 구현예에서 본 발명은 전-종양, 종양 그리고 전립선암 및 유방암의 잠재적 악성으로의 진행의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 암의 검출, 진단, 및/또는 모니터링을 위한 상기 4 kb mtDNA 결손의 검출 및 정량을 포함한다. 상기 방법에서, mtDNA는 생물학적 샘플(예를 들면 신체 조직, 또는 소변, 전립선 마사지액과 같은 체액)으로부터 추출될 수 있다. 그 후 상기 추출된 mtDNA는 상기 샘플에서 4 kb 결손의 수준(즉, 양)을 결정하기 위해서 시험 되었다. 본 발명자에 의해 실시된 시험에서, 상기 결손의 수준은 암을 가지지 않은 대상으로부터 얻어진 샘플에 비해 암을 가진 대상으로부터 얻어진 샘플에서 증가한 것이 발견되었다. 하기에 기재된 정보 및 데이타에 기초하여, 본 발명자는 인간 mtDNA에서 상기 4 kb 결손의 증가 수준이 암을 나타낸다는 것을 결정하였다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어 전립선 조직, 전립선 마사지액, 소변 또는 유방 조직의 샘플은 개인으로부터 얻어지며 암의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해 일정 시간 동안(예를 들면, 1년) 시험 되었다. 일정 시간 동안 상기 4 kb 결손의 증가 수준은 암의 시작 또는 진행을 나타낼 수 있다.
당업자는 미토콘드리아 DNA 타겟의 정량을 위해 개인으로부터 하나 이상의 생물학적 샘플을 분석하는 것은 처치 섭생의 유효성을 모니터링하는 건강 관리 연구자를 위한 수단을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 또한 당업자는 좋지않은 다이어트 및 운동과 같은 생활습관, 또는 공지의 발암물질(예를 들면 담배, 오염물질)에 대한 개인의 노출을 야기하는 활동을 확인하는데 있어서(및 이에 대한 권고를 제공하는데 있어서) 건강 관리 제공자에 의한 사용에 대한 mtDNA 분석의 효용을 인식할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생검 샘플로부터 비-암성 조직을 얻는 단계; 및 상기 비-질환 조직에서 4 kb mtDNA 결손의 양을 검출 및 정량하는 단계를 포함하는, 생검 샘플(예를 들면, 전립선 또는 유방암)로부터 암 생검 시험의 결과를 확정 또는 반박하기 위한 방법을 제공한다.
암에 대한 유전적 소인의 결정
하나 이상의 암에 대한 개인의 위험을 완전히 평가하기 위해서, 건강 관리 제공자는 환자의 위험 인자를 이해하고 소통하는데 가능한 많은 정보를 제공받아야 한다. mtDNA 이상의 수준을 결정하기 위한 본 발명의 활용은 하나 이상의 암에 대한 개인의 감수성을 평가하는데 유용하다는 것이 입증될 뿐만 아니라, 더 적극적인 모니터링 및 처치 조치를 잠재적으로 필요로 하는 더 많은 위험을 가진 환자를 확인하기 위한 귀중한 수단을 제공한다.
이점에 있어서, 하기에 제공된 다양한 실시예는 암을 가진 대상 및 암을 가지지 않은 대상으로부터 얻어진 샘플 사이에 상기 4 kb 결손을 가지는 mtDNA의 양에서 차이를 보여준다. 상기 4 kb 결손의 양은 암을 가진 대상으로부터 얻어진 샘플에서 더 높은 것이 발견되었다. 상기 결정은 공지의 암 세포 및/또는 공지의 비-암 세포 유래의 샘플에서 상기 4 kb 결손의 양을 비교함으로써 수행되었다.
상기와 같이, 본 발명자는 생물학적 샘플의 스크리닝이 하나 이상의 암에 대한 개인의 소인을 동정하는데 유용한 것으로 입증되었다고 결정하였다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 생물학적 샘플 유래의 암에 대해 개인을 스크리닝하기 위한 방법이 제공된다: 하나 이상의 샘플을 얻는 단계, 및 상기 샘플에서 4 kb mtDNA 결손의 수준을 검출 및 정량하는 단계. 본 발명의 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 체액 또는 조직 샘플 유래의 전립선암 또는 유방암에 대해 개인을 스크리닝하기 위한 방법이 제공된다; 체액 또는 조직 샘플을 얻는 단계, 및 상기 체액 또는 조직 샘플에서 4 kb mtDNA 결손의 수준을 검출 및 정량하는 단계.
또한, 상기 4 kb mtDNA 결손의 연령 관련된 축적은 개인에게 예를 들면, 중년 및 노년의 남성, 그리고 중년 및 노년의 여성에게서 각각 만연한 전립선암 또는 유방암에 걸리기 쉽게 할 수 있다. 마찬가지로, 상기 4 kb mtDNA 결손의 축적은 개인의 식사, 운동 습관, 및 공지의 발암물질에 대한 노출에 기초한 특정한 생활방식과 연관될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 따라, 규칙적인 암 스크리닝은 하나 이상의 생물학적 샘플에서 상기 4 kb 결손의 양을 일정 시간 동안 모니터링함으로써 이루어질 수 있으며, 상기 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 유방 및 전립선 조직, 또는 전립선 마사지액과 같은 체액, 또는 소변을 포함하는 방법이 제공된다.
치료제의 평가
또한, 본 발명의 방법은 암 치료에 사용하기 위한 잠재적 치료제를 스크리닝하거나 또는 이의 치료 효과를 모니터링하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 본원에 확인된 암과 연관된 다양한 바이오마커를 측정하는데 사용될 수 있다. 임의의 시점에 임의의 생물학적 샘플에서 DNA 손상의 수준을 평가하는 능력은 개인의 건강에 대해 유일하고 유익한 스크리닝 시험에 대한 토대를 제공하며, 기존 및 새로운 치료제 및 처치 섭생의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 토대를 제공한다. 게다가, 대상의 건강 상태를 기초로 하는 특이적인 유전적 변화를 동정함으로써, 환자가 특정한 치료제 또는 섭생에 반응할지 및 어느 정도까지 반응할지를 쉽게 결정할 수 있다.
키트
본 발명은 임상적 환경에서 사용하기 위한 진단/스크리닝 키트를 제공한다. 상기 키트는 하나 이상의 샘플링 수단뿐만 아니라, mtDNA 돌연변이의 동정을 위해 필요한 다른 재료도 포함할 수 있다.
상기 키트는 완충액, 염, 검출 시약 등과 같은 진단 분석법을 실시하기 위해 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 분리 및/또는 처치를 위한 완충액 및 용액과 같은 다른 구성성분이 또한 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트의 하나 이상의 구성성분은 동결건조될 수 있고, 상기 키트는 상기 동결건조된 구성성분의 재구성에 적절한 시약을 더 포함할 수도 있다.
또한 상기 키트는, 적절한 곳에, 시험 샘플의 제조를 용이하게 하는 반응 용기, 혼합 용기 및 다른 구성성분을 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 종이 형태 또는 디스크, CD, DVD 등과 같은 컴퓨터로 판독가능한 형태로 제공될 수 있는 사용 설명서를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, mtDNA의 추출을 위한 수단, 프라이머, 시약 및 설명서를 포함하는 암을 진단하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, mtDNA의 추출을 위한 수단, 서열번호 4 및 5로 표시되는 핵산 서열을 가지는 프라이머, 시약 및 설명서를 포함하는 암, 예를 들면 전립선암 또는 유방암을 진단하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, mtDNA의 추출을 위한 수단, 서열번호 6 및 5로 표시되는 핵산 서열을 가지는 프라이머, 시약 및 설명서를 포함하는 암, 예를 들면 전립선암 또는 유방암을 진단하기 위한 키트가 제공된다.
본원에 기재된 본 발명의 더 좋은 이해를 얻기 위해, 하기 실시예가 기재된다. 하기 실시예는 본 발명의 예시적인 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하기 위한 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.
실시예
1: 인간
mtDNA
에서의 4
kb
결손과 전립선암의 연관성
소변 샘플이 전립선암으로 진단된 5명의 환자 및 주사 바늘 생검 절차에서 전립선 악성 종양이 검출되지 않은 5명의 사람으로부터 수집되었다. 상기 샘플은 전립선 세포의 수집을 용이하게 하기 위한 직장수지검사(DRE) 후 수집되었다.
상기 샘플을 받는 즉시 5 ml 분취액이 제거되었고, 그 후 2 ml 은 펠렛을 형성하기 위해 14,000 × g 에서 원심분리되었다. 상등액은 제거되어 버려졌다.
펠렛은 200ul 인산염 완충액에 재현탁 되었다. 상기 재현탁된 펠렛 및 온전한 소변 샘플은 QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 DNA 추출 절차가 실시되었다. 그 후 생성된 DNA 추출물은 NanoDrop ND-1000 분광광도계를 사용하여 정량되었으며 0.1 ng/ul 의 농도로 표준화되었다.
샘플은 하기에 따라 4kb 결손 특이적 프라이머를 이용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 분석되었다:
1× iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad product no. 170-8880)
100 nmol 정방향 프라이머 (5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3') (서열번호 4)
100 nmol 역방향 프라이머 (5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3') (서열번호 5)
25ul 반응에 1 ng 주형 DNA
반응은 하기 프로토콜에 따라 Opticon 2 DNA Engine (Bio-Rad Canada)에서 실시되었다:
1. 95℃에서 3분
2. 95℃에서 30초
3. 69℃에서 30초
4. 72℃에서 30초
5. 플레이트 판독
6. 2 내지 5 단계를 44번 반복
7. 72℃에서 10분
8. 50℃에서 105℃까지의 융해 곡선을 1℃ 마다 판독, 3초 동안 중지
9. 10℃에서 중지
결과
소변 펠렛의 결과는 관찰된 평균 주기 역치 또는 유용한 컷오프 지점에서 현저한 차이를 보여주지 않았다. 그러나, 온전한 소변 샘플의 결과는 하기에 제공된 바와 같이 현저한 차이를 보여주었다.
표 1 및 2, 그리고 도 1은 전립선 악성 종양 조직 및 양성 종양 조직을 가지는 대상 유래의 소변 샘플에 대한 평균 주기 역치 점수에서 0.04 유의 수준에서 차이를 보여준다.
사례수 | 평균 | 표준편차 | 표준오차 평균 | |
양성 | 7 | 38.0357 | 3.40974 | 1.288876 |
악성 | 7 | 31.9300 | 6.12583 | 2.31534 |
CTt40 체액 |
분산의 동등성에 대한 레벤 검정 | 평균의 동등성에 대한 검정 | |||||||
F 비 | 유의도 | t 값 |
자유도 |
유의도(양측 검정) | 평균의 차이 | 표준오차의 차이 | 차이의 95% 신뢰구간 | ||
아래값 | 위값 | ||||||||
등분산 가정 | 1.707 | .216 | 2304 | 12 | .040 | 610571 | 264985 | .33218 | 11.87925 |
등분산 비가정 | 2304 | 9392 | .046 | 610571 | 264985 | .14927 | 12.06215 |
표 3 및 4, 그리고 도 2는 36.255의 컷오프 주기 역치를 사용하였을 때 전립선암에 대한 상기 분석법의 민감도는 86%이고 특이도는 86%라는 것을 보여준다.
도 2는 소변을 시험하였을 때, 전립선암에 대한 마커로서 상기 4 kb mtDNA 결손의 특이도 및 민감도를 보여주는 수신자 조작특성(ROC) 곡선이다. 상기 결과는 36.255의 컷오프 주기 역치를 사용하여 얻어졌다. 상기 주기 역치에서 마커의 민감도는 86%인 반면, 특이도는 86%이다.
36.255의 컷오프 주기 역치의 결정은 표 3에 나타내었다. 표 3에 기재된 결과는 36.255의 컷오프 주기 역치가 가장 높은 민감도 및 특이도를 제공하였다는 것을 보여준다.
시험의 정확도는 상기 시험이 시험하고 있는 그룹을 전립선암을 가진 사람 및 가지지 않은 사람으로 얼마나 잘 구분하는가에 달려있다. 정확도는 상기 ROC 곡선 아래 면적에 의해 측정되었다. 표 4는 본 발명의 실시예에 대한 상기 곡선 아래 면적의 계산을 보여준다.
Positive if ≤ a | 민감도 | 1 - 특이도 |
19.86 | .000 | .000 |
24.87 | .143 | .000 |
29.48 | .286 | .000 |
30.54 | .429 | .000 |
32.235 | .429 | .143 |
33.77 | .571 | .143 |
35.11 | .714 | .143 |
36.255 | .857 | .143 |
37.415 | .857 | .286 |
39.23 | .857 | .429 |
39.995 | 1.000 | .429 |
40.21 | 1.000 | .857 |
41.42 | 1.000 | 1.000 |
a - 최소 컷오프 값은 최소의 관찰된 시험 값 - 1이며, 최대 컷오프 값은 최대의 관찰된 시험 값 + 1이다. 모든 다른 컷오프 값은 2개의 연이은 순서로 관찰된 시험 값의 평균이다.
점근 95% 신뢰구간 | ||||
면적 | 표준오차 a | 점근 유의도 b | 하한 | 상한 |
.878 | .096 | .018 | .689 | 1.066 |
주: a - 비-모수적 가정 하에
b - 귀무가설: 진 면적 = 0.5
실시예
2: 인간
mtDNA
에서 4
kb
결손과 유방암의 연관성
20개의 유방 조직 샘플이 수집되었고, 그 중 10개는 악성 종양이고 나머지 10개는 양성 종양 유방 질환을 가졌거나 기형이 없었다. 상기 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매되었고, 각각의 20 마이크론 섹션이 QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 추출을 위해 개인 샘플 튜브내로 절단되었다. 그 후 DNA는 Nanodrop ND-1000을 이용하여 정량되었고 2 ng/ul의 농도로 표준화되었다.
그 후 샘플은 하기의 프로토콜을 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 상기 4kb 결손의 수준에 대해 분석되었다:
1× iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad product no. 170-8880)
175 nmol 정방향 프라이머 (5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3') (서열번호 4)
175 nmol 역방향 프라이머 (5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3') (서열번호 5)
25ul 반응에 20 ng 주형 DNA
반응은 하기의 프로토콜에 따라 Opticon 2 DNA Engine (Bio-Rad Canada)에서 수행되었다:
1. 95℃에서 3분
2. 95℃에서 30초
3. 70℃에서 30초
4. 72℃에서 30초
5. 플레이트 판독
6. 2 내지 5 단계를 44번 반복
7. 72℃에서 10분
8. 50℃에서 105℃까지의 융해 곡선을 1℃ 마다 판독, 3초 동안 중지
9. 10℃에서 중지
표 5 및 6, 그리고 도 3은 악성 종양 유방 조직 및 양성 종양 유방 조직을 가지는 대상 유래의 유방 조직 샘플에 대한 평균 주기 역치 점수에서 0.065 수준에서 차이를 보여준다.
그룹 | 사례수 | 평균 | 표준편차 | 표준오차 평균 |
정상 | 9 | 21.5278 | 2.71939 | .90646 |
악성 | 9 | 18.9089 | 2.89126 | .96375 |
CTt40 체액 |
분산의 동등성에 대한 레벤 검정 | 평균의 동등성에 대한 검정 | |||||||
F 비 | 유의도 | t 값 | 자유도 | 유의도(양측 검정) | 평균의 차이 | 표준오차의 차이 | 차이의 95% 신뢰구간 | ||
아래값 | 위값 | ||||||||
등분산 가정 | .007 | .934 | 1.979 | 16 | .065 | 2.61889 | 1.32306 | -.18588 | 5.42366 |
등분산 비가정 | 1.979 | 15.94 | .065 | 2.61889 | 1.32306 | -.18674 | 5.42452 |
표 7 및 8, 그리고 도 4는 19.845의 컷오프 주기 역치를 사용하였을 때 유방암에 대한 상기 분석법의 민감도는 78%이고 특이도는 78%라는 것을 보여준다.
도 4는 유방 조직을 시험하였을 때, 유방암에 대한 마커로서 상기 4 kb mtDNA 결손의 특이도 및 민감도를 보여주는 ROC 곡선이다. 상기 결과는 19.845의 컷오프 주기 역치를 사용하여 얻어졌다. 상기 주기 역치에서 마커의 민감도는 78%인 반면, 특이도는 78%이다.
19.845의 컷오프 주기 역치의 결정은 표 7에 나타내었다. 표 7에 기재된 결과는 19.845의 컷오프 주기 역치가 가장 높은 민감도 및 특이도를 제공하였다는 것을 보여준다.
시험의 정확도는 상기 시험이 시험하고 있는 그룹을 유방암을 가진 사람 및 가지지 않은 사람으로 얼마나 잘 구분하는가에 달려있다. 정확도는 상기 ROC 곡선 아래 면적에 의해 측정되었다. 표 8은 본 발명의 실시예에 대한 상기 곡선 아래 면적의 계산을 보여준다.
Positive if ≤ a | 민감도 | 1 - 특이도 |
15.28 | .000 | .000 |
16.305 | .111 | .000 |
16.69 | .222 | .000 |
17.075 | .333 | .000 |
17.4 | .444 | .000 |
17.71 | .556 | .000 |
18.0 | .556 | .111 |
18.835 | .556 | .222 |
19.415 | .667 | .222 |
19.845 | .778 | .222 |
20.475 | .778 | .333 |
10.79 | .778 | .444 |
21.38 | .778 | .556 |
22.005 | .778 | .667 |
23.145 | .889 | .667 |
24.19 | .889 | .778 |
24.49 | .889 | .889 |
25.21 | 1.00 | .889 |
26.66 | 1.00 | 1.00 |
a - 최소 컷오프 값은 최소의 관찰된 시험 값 - 1이며, 최대 컷오프 값은 최대의 관찰된 시험 값 + 1이다. 모든 다른 컷오프 값은 2개의 연이은 순서로 관찰된 시험 값의 평균이다.
점근 95% 신뢰구간 | ||||
면적 | 표준오차 a | 점근 유의도 b | 하한 | 상한 |
.778 | .117 | .047 | .548 | 1.008 |
실시예
3: 주사 바늘
생검
샘플을 이용하여 인간
mtDNA
에서 4
kb
결손과 전립선암의 연관성 조사
전립선 주사 바늘 생검 표본은 전립선암을 가지지 않은 9명 및 전립선암을 가진 10명으로 이루어진, 19명의 개인으로부터 얻어졌다. 주사 바늘 생검 조직은 임상적 진단 세팅에서 표준인 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE)되었다. 각 생검의 10 마이크론 섹션은 원심분리 튜브 내에 즉시 넣어 두었고, DNA는 QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen, p/n 51306)를 사용하여 추출되었다. DNA 추출물은 NanoDrop ND-1000 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도에 의해 정량되었다. 수율은 347ng에서 750ng 까지의 범위에 있었다. 상기 샘플은 2ng/ul 으로 희석되었고, 증폭 반응은 표 9 및 하기에 따라 설정되었다:
시약 | 최종 농도 |
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, p/n 170-8882) |
1× |
정방향 프라이머 12303-12316/16243-16259F 5'-CCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAAGCCAC- 3' (서열번호 6) |
175 nmol |
역방향 프라이머 16410R 5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3' (서열번호 5) |
175 nmol |
DNA 추출물 | 0.8 ng/ul |
뉴클레아제가 없는 증류수가 25ul의 최종 반응 부피로 첨가되었다. 증폭은 하기의 사이클링 조건에 따라 DNA Engine Chromo4 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad Laboratories)에서 실시되었다:
1) 95℃에서 3분
2) 연이은 3) 내지 5) 단계의 45 사이클
3) 95℃에서 30초
4) 69℃에서 30초
5) 72℃에서 30초
6) 플레이트 판독
그 후
7) 72℃에서 10분
8) 50℃에서 105℃까지의 융해 곡선을 1℃ 마다 판독, 3초 동안 중지
9) 4℃에서 중지
표 10에 나타낸 결과는, 전립선암을 가진 개인이 전립선암을 가지지 않은 개인보다 더 낮은 주기 역치 값을 가지며, 따라서 전립선 조직에서 상기 4 kb 결손의 더 높은 수준을 가진다는 것을 나타낸다. 전립선암을 가진 환자는 30.7의 평균 주기 역치 값을 가지는 반면, 전립선암을 가지지 않은 환자는 36.4의 평균 주기 역치 값을 갖는다. 상기 5.7 주기 역치의 차이는 전립선 악성 종양을 가진 그룹에서 그렇지 않은 그룹보다 거의 100배 더 많은 4 kb 결손 수준에 해당한다.
환자수 및 진단 | C(t) |
CUG 1301 악성 | 25.7 |
CUG 1268 악성 | 27.7 |
CUG RN 345 정상 | 28.3 |
CUG 1272 악성 | 28.8 |
CUG 1375 악성 | 29.1 |
CUG 1259 악성 | 29.1 |
CUG 1381 악성 | 30.2 |
CUG RN 82 정상 | 30.5 |
CUG 1372 악성 | 30.9 |
CUG 1085 C T1 정상 | 31.5 |
CUG 1317 악성 | 31.7 |
CUG 1377 mF 정상 | 33.6 |
CUG 1365 B 정상 | 34.6 |
CUG 1370 악성 | 35.9 |
CUG RN 405 정상 | 37.5 |
CUG 1366 악성 | 37.9 |
CUG RN 701 정상 | 41.7 |
CUG RN 420 정상 | 45 |
CUG RN 373 정상 | 45 |
표 11 및 12는 정상 및 악성 종양 전립선 조직을 가지는 대상 유래의 전립선 조직 샘플에 대한 평균 주기 역치 점수에서 차이를 보여준다.
그룹 | 사례수 | 평균 | 표준편차 | 표준오차 평균 |
정상 | 9 | 36.4111 | 6.25229 | 2.08410 |
악성 | 10 | 30.7 | 3.69534 | 1.16857 |
CTt40 체액 |
분산의 동등성에 대한 레벤 검정 | 평균의 동등성에 대한 검정 | |||||||
F 비 | 유의도 | t 값 | 자유도 | 유의도(양측 검정) | 평균의 차이 | 표준오차의 차이 | 차이의 95% 신뢰구간 | ||
아래값 | 위값 | ||||||||
등분산 가정 | 4.426 | .051 | 2.455 | 17 | .025 | 5.71111 | 2.32589 | .80391 | 10.61831 |
등분산 비가정 | 2.390 | 12.705 | .033 | 5.71111 | 2.38935 | .53701 | 10.88522 |
표 13 및 도 6은 주기 역치 32.65의 컷오프를 사용했을 때 상기 환자에 대한 올바른 진단의 민감도 및 특이도는 각각 80% 및 67%라는 것을 보여준다.
Positive if ≤ a | 민감도 | 1 - 특이도 |
24.7 | .000 | .000 |
26.7 | .100 | .000 |
28.0 | .200 | .000 |
28.55 | .200 | .111 |
28.95 | .300 | .111 |
29.65 | .500 | .111 |
30.35 | .600 | .111 |
30.7 | .600 | .222 |
31.2 | .700 | .222 |
31.6 | .700 | .333 |
32.65 | .800 | .333 |
34.1 | .800 | .444 |
32.25 | .800 | .556 |
36.7 | .900 | .556 |
37.7 | .900 | .667 |
39.8 | 1.000 | .667 |
43.35 | 1.000 | .778 |
46.0 | 1.000 | 1.000 |
비록 본 발명이 특정 구현예와 관련하여 기재되었다 할지라도, 이의 다양한 변형은 하기에 첨부된 청구 범위에 요약된 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남 없이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백할 것 같은 모든 변형은 하기의 청구 범위 내에 포함될 의도이다. 본 출원에 인용된 모든 공개문헌은 본원에 원용에 의해 포함된다.
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<210> 1
<211> 3926
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
taaaagtaat aaccatgcac actactataa ccaccctaac cctgacttcc ctaattcccc 60
ccatccttac caccctcgtt aaccctaaca aaaaaaactc atacccccat tatgtaaaat 120
ccattgtcgc atccaccttt attatcagtc tcttccccac aacaatattc atgtgcctag 180
accaagaagt tattatctcg aactgacact gagccacaac ccaaacaacc cagctctccc 240
taagcttcaa actagactac ttctccataa tattcatccc tgtagcattg ttcgttacat 300
ggtccatcat agaattctca ctgtgatata taaactcaga cccaaacatt aatcagttct 360
tcaaatatct actcatcttc ctaattacca tactaatctt agttaccgct aacaacctat 420
tccaactgtt catcggctga gagggcgtag gaattatatc cttcttgctc atcagttgat 480
gatacgcccg agcagatgcc aacacagcag ccattcaagc aatcctatac aaccgtatcg 540
gcgatatcgg tttcatcctc gccttagcat gatttatcct acactccaac tcatgagacc 600
cacaacaaat agcccttcta aacgctaatc caagcctcac cccactacta ggcctcctcc 660
tagcagcagc aggcaaatca gcccaattag gtctccaccc ctgactcccc tcagccatag 720
aaggccccac cccagtctca gccctactcc actcaagcac tatagttgta gcaggaatct 780
tcttactcat ccgcttccac cccctagcag aaaatagccc actaatccaa actctaacac 840
tatgcttagg cgctatcacc actctgttcg cagcagtctg cgcccttaca caaaatgaca 900
tcaaaaaaat cgtagccttc tccacttcaa gtcaactagg actcataata gttacaatcg 960
gcatcaacca accacaccta gcattcctgc acatctgtac ccacgccttc ttcaaagcca 1020
tactatttat gtgctccggg tccatcatcc acaaccttaa caatgaacaa gatattcgaa 1080
aaataggagg actactcaaa accatacctc tcacttcaac ctccctcacc attggcagcc 1140
tagcattagc aggaatacct ttcctcacag gtttctactc caaagaccac atcatcgaaa 1200
ccgcaaacat atcatacaca aacgcctgag ccctatctat tactctcatc gctacctccc 1260
tgacaagcgc ctatagcact cgaataattc ttctcaccct aacaggtcaa cctcgcttcc 1320
ccacccttac taacattaac gaaaataacc ccaccctact aaaccccatt aaacgcctgg 1380
cagccggaag cctattcgca ggatttctca ttactaacaa catttccccc gcatccccct 1440
tccaaacaac aatccccctc tacctaaaac tcacagccct cgctgtcact ttcctaggac 1500
ttctaacagc cctagacctc aactacctaa ccaacaaact taaaataaaa tccccactat 1560
gcacatttta tttctccaac atactcggat tctaccctag catcacacac cgcacaatcc 1620
cctatctagg ccttcttacg agccaaaacc tgcccctact cctcctagac ctaacctgac 1680
tagaaaagct attacctaaa acaatttcac agcaccaaat ctccacctcc atcatcacct 1740
caacccaaaa aggcataatt aaactttact tcctctcttt cttcttccca ctcatcctaa 1800
ccctactcct aatcacataa cctattcccc cgagcaatct caattacaat atatacacca 1860
acaaacaatg ttcaaccagt aactactact aatcaacgcc cataatcata caaagccccc 1920
gcaccaatag gatcctcccg aatcaaccct gacccctctc cttcataaat tattcagctt 1980
cctacactat taaagtttac cacaaccacc accccatcat actctttcac ccacagcacc 2040
aatcctacct ccatcgctaa ccccactaaa acactcacca agacctcaac ccctgacccc 2100
catgcctcag gatactcctc aatagccatc gctgtagtat atccaaagac aaccatcatt 2160
ccccctaaat aaattaaaaa aactattaaa cccatataac ctcccccaaa attcagaata 2220
ataacacacc cgaccacacc gctaacaatc aatactaaac ccccataaat aggagaaggc 2280
ttagaagaaa accccacaaa ccccattact aaacccacac tcaacagaaa caaagcatac 2340
atcattattc tcgcacggac tacaaccacg accaatgata tgaaaaacca tcgttgtatt 2400
tcaactacaa gaacaccaat gaccccaata cgcaaaacta accccctaat aaaattaatt 2460
aaccactcat tcatcgacct ccccacccca tccaacatct ccgcatgatg aaacttcggc 2520
tcactccttg gcgcctgcct gatcctccaa atcaccacag gactattcct agccatgcac 2580
tactcaccag acgcctcaac cgccttttca tcaatcgccc acatcactcg agacgtaaat 2640
tatggctgaa tcatccgcta ccttcacgcc aatggcgcct caatattctt tatctgcctc 2700
ttcctacaca tcgggcgagg cctatattac ggatcatttc tctactcaga aacctgaaac 2760
atcggcatta tcctcctgct tgcaactata gcaacagcct tcataggcta tgtcctcccg 2820
tgaggccaaa tatcattctg aggggccaca gtaattacaa acttactatc cgccatccca 2880
tacattggga cagacctagt tcaatgaatc tgaggaggct actcagtaga cagtcccacc 2940
ctcacacgat tctttacctt tcacttcatc ttgcccttca ttattgcagc cctagcaaca 3000
ctccacctcc tattcttgca cgaaacggga tcaaacaacc ccctaggaat cacctcccat 3060
tccgataaaa tcaccttcca cccttactac acaatcaaag acgccctcgg cttacttctc 3120
ttccttctct ccttaatgac attaacacta ttctcaccag acctcctagg cgacccagac 3180
aattataccc tagccaaccc cttaaacacc cctccccaca tcaagcccga atgatatttc 3240
ctattcgcct acacaattct ccgatccgtc cctaacaaac taggaggcgt ccttgcccta 3300
ttactatcca tcctcatcct agcaataatc cccatcctcc atatatccaa acaacaaagc 3360
ataatatttc gcccactaag ccaatcactt tattgactcc tagccgcaga cctcctcatt 3420
ctaacctgaa tcggaggaca accagtaagc taccctttta ccatcattgg acaagtagca 3480
tccgtactat acttcacaac aatcctaatc ctaataccaa ctatctccct aattgaaaac 3540
aaaatactca aatgggcctg tccttgtagt ataaactaat acaccagtct tgtaaaccgg 3600
agatgaaaac ctttttccaa ggacaaatca gagaaaaagt ctttaactcc accattagca 3660
cccaaagcta agattctaat ttaaactatt ctctgttctt tcatggggaa gcagatttgg 3720
gtaccaccca agtattgact cacccatcaa caaccgctat gtatttcgta cattactgcc 3780
agccaccatg aatattgtac ggtaccataa atacttgacc acctgtagta cataaaaacc 3840
caatccacat caaaaccccc tccccatgct tacaagcaag tacagcaatc aaccctcaac 3900
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<210> 2
<211> 3926
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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ctaacaacct attccaactg ttcatcggct gagagggcgt aggaattata tccttcttgc 480
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cctcagccat agaaggcccc accccagtct cagccctact ccactcaagc actatagttg 780
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tacattactg ccagccacca tgaatattgt acggtaccat aaatacttga ccacctgtag 3840
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (3107)..(3107)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
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aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa 360
acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac 420
ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat 480
ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata 540
ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa 600
gcaatacact gaaaatgttt agacgggctc acatcacccc ataaacaaat aggtttggtc 660
ctagcctttc tattagctct tagtaagatt acacatgcaa gcatccccgt tccagtgagt 720
tcaccctcta aatcaccacg atcaaaagga acaagcatca agcacgcagc aatgcagctc 780
aaaacgctta gcctagccac acccccacgg gaaacagcag tgattaacct ttagcaataa 840
acgaaagttt aactaagcta tactaacccc agggttggtc aatttcgtgc cagccaccgc 900
ggtcacacga ttaacccaag tcaatagaag ccggcgtaaa gagtgtttta gatcaccccc 960
tccccaataa agctaaaact cacctgagtt gtaaaaaact ccagttgaca caaaatagac 1020
tacgaaagtg gctttaacat atctgaacac acaatagcta agacccaaac tgggattaga 1080
taccccacta tgcttagccc taaacctcaa cagttaaatc aacaaaactg ctcgccagaa 1140
cactacgagc cacagcttaa aactcaaagg acctggcggt gcttcatatc cctctagagg 1200
agcctgttct gtaatcgata aaccccgatc aacctcacca cctcttgctc agcctatata 1260
ccgccatctt cagcaaaccc tgatgaaggc tacaaagtaa gcgcaagtac ccacgtaaag 1320
acgttaggtc aaggtgtagc ccatgaggtg gcaagaaatg ggctacattt tctaccccag 1380
aaaactacga tagcccttat gaaacttaag ggtcgaaggt ggatttagca gtaaactaag 1440
agtagagtgc ttagttgaac agggccctga agcgcgtaca caccgcccgt caccctcctc 1500
aagtatactt caaaggacat ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggagacaagt 1560
cgtaacatgg taagtgtact ggaaagtgca cttggacgaa ccagagtgta gcttaacaca 1620
aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta 1680
gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa 1740
agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg 1800
aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa 1860
ttaactagaa ataactttgc aaggagagcc aaagctaaga cccccgaaac cagacgagct 1920
acctaagaac agctaaaaga gcacacccgt ctatgtagca aaatagtggg aagatttata 1980
ggtagaggcg acaaacctac cgagcctggt gatagctggt tgtccaagat agaatcttag 2040
ttcaacttta aatttgccca cagaaccctc taaatcccct tgtaaattta actgttagtc 2100
caaagaggaa cagctctttg gacactagga aaaaaccttg tagagagagt aaaaaattta 2160
acacccatag taggcctaaa agcagccacc aattaagaaa gcgttcaagc tcaacaccca 2220
ctacctaaaa aatcccaaac atataactga actcctcaca cccaattgga ccaatctatc 2280
accctataga agaactaatg ttagtataag taacatgaaa acattctcct ccgcataagc 2340
ctgcgtcaga ttaaaacact gaactgacaa ttaacagccc aatatctaca atcaaccaac 2400
aagtcattat taccctcact gtcaacccaa cacaggcatg ctcataagga aaggttaaaa 2460
aaagtaaaag gaactcggca aatcttaccc cgcctgttta ccaaaaacat cacctctagc 2520
atcaccagta ttagaggcac cgcctgccca gtgacacatg tttaacggcc gcggtaccct 2580
aaccgtgcaa aggtagcata atcacttgtt ccttaaatag ggacctgtat gaatggctcc 2640
acgagggttc agctgtctct tacttttaac cagtgaaatt gacctgcccg tgaagaggcg 2700
ggcataacac agcaagacga gaagacccta tggagcttta atttattaat gcaaacagta 2760
cctaacaaac ccacaggtcc taaactacca aacctgcatt aaaaatttcg gttggggcga 2820
cctcggagca gaacccaacc tccgagcagt acatgctaag acttcaccag tcaaagcgaa 2880
ctactatact caattgatcc aataacttga ccaacggaac aagttaccct agggataaca 2940
gcgcaatcct attctagagt ccatatcaac aatagggttt acgacctcga tgttggatca 3000
ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 3060
gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctacnttc aaattcctcc 3120
ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga 3180
tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc 3240
agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt 3300
aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca 3360
ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac 3420
gttgtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa 3480
gagcccctaa aacccgccac atctaccatc accctctaca tcaccgcccc gaccttagct 3540
ctcaccatcg ctcttctact atgaaccccc ctccccatac ccaaccccct ggtcaacctc 3600
aacctaggcc tcctatttat tctagccacc tctagcctag ccgtttactc aatcctctga 3660
tcagggtgag catcaaactc aaactacgcc ctgatcggcg cactgcgagc agtagcccaa 3720
acaatctcat atgaagtcac cctagccatc attctactat caacattact aataagtggc 3780
tcctttaacc tctccaccct tatcacaaca caagaacacc tctgattact cctgccatca 3840
tgacccttgg ccataatatg atttatctcc acactagcag agaccaaccg aacccccttc 3900
gaccttgccg aaggggagtc cgaactagtc tcaggcttca acatcgaata cgccgcaggc 3960
cccttcgccc tattcttcat agccgaatac acaaacatta ttataataaa caccctcacc 4020
actacaatct tcctaggaac aacatatgac gcactctccc ctgaactcta cacaacatat 4080
tttgtcacca agaccctact tctaacctcc ctgttcttat gaattcgaac agcatacccc 4140
cgattccgct acgaccaact catacacctc ctatgaaaaa acttcctacc actcacccta 4200
gcattactta tatgatatgt ctccataccc attacaatct ccagcattcc ccctcaaacc 4260
taagaaatat gtctgataaa agagttactt tgatagagta aataatagga gcttaaaccc 4320
ccttatttct aggactatga gaatcgaacc catccctgag aatccaaaat tctccgtgcc 4380
acctatcaca ccccatccta aagtaaggtc agctaaataa gctatcgggc ccataccccg 4440
aaaatgttgg ttataccctt cccgtactaa ttaatcccct ggcccaaccc gtcatctact 4500
ctaccatctt tgcaggcaca ctcatcacag cgctaagctc gcactgattt tttacctgag 4560
taggcctaga aataaacatg ctagctttta ttccagttct aaccaaaaaa ataaaccctc 4620
gttccacaga agctgccatc aagtatttcc tcacgcaagc aaccgcatcc ataatccttc 4680
taatagctat cctcttcaac aatatactct ccggacaatg aaccataacc aatactacca 4740
atcaatactc atcattaata atcataatag ctatagcaat aaaactagga atagccccct 4800
ttcacttctg agtcccagag gttacccaag gcacccctct gacatccggc ctgcttcttc 4860
tcacatgaca aaaactagcc cccatctcaa tcatatacca aatctctccc tcactaaacg 4920
taagccttct cctcactctc tcaatcttat ccatcatagc aggcagttga ggtggattaa 4980
accaaaccca gctacgcaaa atcttagcat actcctcaat tacccacata ggatgaataa 5040
tagcagttct accgtacaac cctaacataa ccattcttaa tttaactatt tatattatcc 5100
taactactac cgcattccta ctactcaact taaactccag caccacgacc ctactactat 5160
ctcgcacctg aaacaagcta acatgactaa cacccttaat tccatccacc ctcctctccc 5220
taggaggcct gcccccgcta accggctttt tgcccaaatg ggccattatc gaagaattca 5280
caaaaaacaa tagcctcatc atccccacca tcatagccac catcaccctc cttaacctct 5340
acttctacct acgcctaatc tactccacct caatcacact actccccata tctaacaacg 5400
taaaaataaa atgacagttt gaacatacaa aacccacccc attcctcccc acactcatcg 5460
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ggttaaatac agaccaagag ccttcaaagc cctcagtaag ttgcaatact taatttctgt 5580
aacagctaag gactgcaaaa ccccactctg catcaactga acgcaaatca gccactttaa 5640
ttaagctaag cccttactag accaatggga cttaaaccca caaacactta gttaacagct 5700
aagcacccta atcaactggc ttcaatctac ttctcccgcc gccgggaaaa aaggcgggag 5760
aagccccggc aggtttgaag ctgcttcttc gaatttgcaa ttcaatatga aaatcacctc 5820
ggagctggta aaaagaggcc taacccctgt ctttagattt acagtccaat gcttcactca 5880
gccattttac ctcaccccca ctgatgttcg ccgaccgttg actattctct acaaaccaca 5940
aagacattgg aacactatac ctattattcg gcgcatgagc tggagtccta ggcacagctc 6000
taagcctcct tattcgagcc gagctgggcc agccaggcaa ccttctaggt aacgaccaca 6060
tctacaacgt tatcgtcaca gcccatgcat ttgtaataat cttcttcata gtaataccca 6120
tcataatcgg aggctttggc aactgactag ttcccctaat aatcggtgcc cccgatatgg 6180
cgtttccccg cataaacaac ataagcttct gactcttacc tccctctctc ctactcctgc 6240
tcgcatctgc tatagtggag gccggagcag gaacaggttg aacagtctac cctcccttag 6300
cagggaacta ctcccaccct ggagcctccg tagacctaac catcttctcc ttacacctag 6360
caggtgtctc ctctatctta ggggccatca atttcatcac aacaattatc aatataaaac 6420
cccctgccat aacccaatac caaacgcccc tcttcgtctg atccgtccta atcacagcag 6480
tcctacttct cctatctctc ccagtcctag ctgctggcat cactatacta ctaacagacc 6540
gcaacctcaa caccaccttc ttcgaccccg ccggaggagg agaccccatt ctataccaac 6600
acctattctg atttttcggt caccctgaag tttatattct tatcctacca ggcttcggaa 6660
taatctccca tattgtaact tactactccg gaaaaaaaga accatttgga tacataggta 6720
tggtctgagc tatgatatca attggcttcc tagggtttat cgtgtgagca caccatatat 6780
ttacagtagg aatagacgta gacacacgag catatttcac ctccgctacc ataatcatcg 6840
ctatccccac cggcgtcaaa gtatttagct gactcgccac actccacgga agcaatatga 6900
aatgatctgc tgcagtgctc tgagccctag gattcatctt tcttttcacc gtaggtggcc 6960
tgactggcat tgtattagca aactcatcac tagacatcgt actacacgac acgtactacg 7020
ttgtagccca cttccactat gtcctatcaa taggagctgt atttgccatc ataggaggct 7080
tcattcactg atttccccta ttctcaggct acaccctaga ccaaacctac gccaaaatcc 7140
atttcactat catattcatc ggcgtaaatc taactttctt cccacaacac tttctcggcc 7200
tatccggaat gccccgacgt tactcggact accccgatgc atacaccaca tgaaacatcc 7260
tatcatctgt aggctcattc atttctctaa cagcagtaat attaataatt ttcatgattt 7320
gagaagcctt cgcttcgaag cgaaaagtcc taatagtaga agaaccctcc ataaacctgg 7380
agtgactata tggatgcccc ccaccctacc acacattcga agaacccgta tacataaaat 7440
ctagacaaaa aaggaaggaa tcgaaccccc caaagctggt ttcaagccaa ccccatggcc 7500
tccatgactt tttcaaaaag gtattagaaa aaccatttca taactttgtc aaagttaaat 7560
tataggctaa atcctatata tcttaatggc acatgcagcg caagtaggtc tacaagacgc 7620
tacttcccct atcatagaag agcttatcac ctttcatgat cacgccctca taatcatttt 7680
ccttatctgc ttcctagtcc tgtatgccct tttcctaaca ctcacaacaa aactaactaa 7740
tactaacatc tcagacgctc aggaaataga aaccgtctga actatcctgc ccgccatcat 7800
cctagtcctc atcgccctcc catccctacg catcctttac ataacagacg aggtcaacga 7860
tccctccctt accatcaaat caattggcca ccaatggtac tgaacctacg agtacaccga 7920
ctacggcgga ctaatcttca actcctacat acttccccca ttattcctag aaccaggcga 7980
cctgcgactc cttgacgttg acaatcgagt agtactcccg attgaagccc ccattcgtat 8040
aataattaca tcacaagacg tcttgcactc atgagctgtc cccacattag gcttaaaaac 8100
agatgcaatt cccggacgtc taaaccaaac cactttcacc gctacacgac cgggggtata 8160
ctacggtcaa tgctctgaaa tctgtggagc aaaccacagt ttcatgccca tcgtcctaga 8220
attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta 8280
ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag 8340
agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat 8400
aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa 8460
ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga 8520
accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc 8580
gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 8640
aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga ctaatcaaac taacctcaaa acaaatgata 8700
accatacaca acactaaagg acgaacctga tctcttatac tagtatcctt aatcattttt 8760
attgccacaa ctaacctcct cggactcctg cctcactcat ttacaccaac cacccaacta 8820
tctataaacc tagccatggc catcccctta tgagcgggca cagtgattat aggctttcgc 8880
tctaagatta aaaatgccct agcccacttc ttaccacaag gcacacctac accccttatc 8940
cccatactag ttattatcga aaccatcagc ctactcattc aaccaatagc cctggccgta 9000
cgcctaaccg ctaacattac tgcaggccac ctactcatgc acctaattgg aagcgccacc 9060
ctagcaatat caaccattaa ccttccctct acacttatca tcttcacaat tctaattcta 9120
ctgactatcc tagaaatcgc tgtcgcctta atccaagcct acgttttcac acttctagta 9180
agcctctacc tgcacgacaa cacataatga cccaccaatc acatgcctat catatagtaa 9240
aacccagccc atgaccccta acaggggccc tctcagccct cctaatgacc tccggcctag 9300
ccatgtgatt tcacttccac tccataacgc tcctcatact aggcctacta accaacacac 9360
taaccatata ccaatgatgg cgcgatgtaa cacgagaaag cacataccaa ggccaccaca 9420
caccacctgt ccaaaaaggc cttcgatacg ggataatcct atttattacc tcagaagttt 9480
ttttcttcgc aggatttttc tgagcctttt accactccag cctagcccct accccccaat 9540
taggagggca ctggccccca acaggcatca ccccgctaaa tcccctagaa gtcccactcc 9600
taaacacatc cgtattactc gcatcaggag tatcaatcac ctgagctcac catagtctaa 9660
tagaaaacaa ccgaaaccaa ataattcaag cactgcttat tacaatttta ctgggtctct 9720
attttaccct cctacaagcc tcagagtact tcgagtctcc cttcaccatt tccgacggca 9780
tctacggctc aacatttttt gtagccacag gcttccacgg acttcacgtc attattggct 9840
caactttcct cactatctgc ttcatccgcc aactaatatt tcactttaca tccaaacatc 9900
actttggctt cgaagccgcc gcctgatact ggcattttgt agatgtggtt tgactatttc 9960
tgtatgtctc catctattga tgagggtctt actcttttag tataaatagt accgttaact 10020
tccaattaac tagttttgac aacattcaaa aaagagtaat aaacttcgcc ttaattttaa 10080
taatcaacac cctcctagcc ttactactaa taattattac attttgacta ccacaactca 10140
acggctacat agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc 10200
gcgtcccttt ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag 10260
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cattaaatta tgataatcat atttaccaaa tgcccctcat ttacataaat attatactag 10500
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tatgcctaga aggaataata ctatcgctgt tcattatagc tactctcata accctcaaca 10620
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cagcggtggg cctagcccta ctagtctcaa tctccaacac atatggccta gactacgtac 10740
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tagcatcatc cctctactat tttttaacca aatcaacaac aacctattta gctgttcccc 10920
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ctacctctct atactaatct ccctacaaat ctccttaatt ataacattca cagccacaga 11100
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acaatggggc tcactcaccc accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa 12060
caccctcatg ttcatacacc tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat 12120
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cagaggctta cgacccctta tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc 12240
catgtctaac aacatggctt tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag 12300
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gcagtctgcg cccttacaca aaatgacatc aaaaaaatcg tagccttctc cacttcaagt 13260
caactaggac tcataatagt tacaatcggc atcaaccaac cacacctagc attcctgcac 13320
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ctatctatta ctctcatcgc tacctccctg acaagcgcct atagcactcg aataattctt 13620
ctcaccctaa caggtcaacc tcgcttcccc acccttacta acattaacga aaataacccc 13680
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tgtagtatat ccaaagacaa ccatcattcc ccctaaataa attaaaaaaa ctattaaacc 14520
catataacct cccccaaaat tcagaataat aacacacccg accacaccgc taacaatcaa 14580
tactaaaccc ccataaatag gagaaggctt agaagaaaac cccacaaacc ccattactaa 14640
acccacactc aacagaaaca aagcatacat cattattctc gcacggacta caaccacgac 14700
caatgatatg aaaaaccatc gttgtatttc aactacaaga acaccaatga ccccaatacg 14760
caaaactaac cccctaataa aattaattaa ccactcattc atcgacctcc ccaccccatc 14820
caacatctcc gcatgatgaa acttcggctc actccttggc gcctgcctga tcctccaaat 14880
caccacagga ctattcctag ccatgcacta ctcaccagac gcctcaaccg ccttttcatc 14940
aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa 15000
tggcgcctca atattcttta tctgcctctt cctacacatc gggcgaggcc tatattacgg 15060
atcatttctc tactcagaaa cctgaaacat cggcattatc ctcctgcttg caactatagc 15120
aacagccttc ataggctatg tcctcccgtg aggccaaata tcattctgag gggccacagt 15180
aattacaaac ttactatccg ccatcccata cattgggaca gacctagttc aatgaatctg 15240
aggaggctac tcagtagaca gtcccaccct cacacgattc tttacctttc acttcatctt 15300
gcccttcatt attgcagccc tagcaacact ccacctccta ttcttgcacg aaacgggatc 15360
aaacaacccc ctaggaatca cctcccattc cgataaaatc accttccacc cttactacac 15420
aatcaaagac gccctcggct tacttctctt ccttctctcc ttaatgacat taacactatt 15480
ctcaccagac ctcctaggcg acccagacaa ttatacccta gccaacccct taaacacccc 15540
tccccacatc aagcccgaat gatatttcct attcgcctac acaattctcc gatccgtccc 15600
taacaaacta ggaggcgtcc ttgccctatt actatccatc ctcatcctag caataatccc 15660
catcctccat atatccaaac aacaaagcat aatatttcgc ccactaagcc aatcacttta 15720
ttgactccta gccgcagacc tcctcattct aacctgaatc ggaggacaac cagtaagcta 15780
cccttttacc atcattggac aagtagcatc cgtactatac ttcacaacaa tcctaatcct 15840
aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat 15900
aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15960
gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16020
ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16080
accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat 16140
acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16200
caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16260
cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16320
catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16380
tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16440
actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16500
ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac 16560
atcacgatg 16569
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward deletion detection primer
<400> 4
ttggtgcaac tccaaagcca cccctcacc 29
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Reverse deletion detection primer.
<400> 5
aggatggtgg tcaagggac 19
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward deletion detection primer
<400> 6
cccaaaaatt ttggtgcaac tccaaagcca c 31
Claims (39)
- 인간 개인으로부터 얻은 생물학적 샘플에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 타겟 영역을 증폭시키기 위한 프라이머쌍을 포함하며, 상기 타겟 영역이 인간 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 12317과 16254에 걸쳐 있는 결손을 가진 mtDNA 영역인 것인, 개인에서 전립선암 또는 유방암을 검출하기 위한 키트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 결손의 맞은 편 말단들 상의 스플라이스 연결 영역(splice joining region)과 겹치는 서열에 해당하는 핵산 서열을 갖는 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 서열번호 4에 해당하는 핵산 서열을 갖는 것인 키트.
- 인간 개인으로부터 얻은 생물학적 샘플에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 타겟 서열을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머쌍을 포함하며, 상기 타겟 서열이 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 12317과 16254에 걸쳐 있는 결손된 영역인 것인, 개인에서 전립선암 또는 유방암을 검출하기 위한 키트.
- 제4항에 있어서, 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 결손된 영역의 맞은 편 말단들 상의 스플라이스 연결 영역과 겹치는 서열에 해당하는 핵산 서열을 가지며, 스플라이스 연결 영역은 결손된 영역이 재원형화된 후 형성되는 것인 키트.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 시약 또는 설명서를 추가로 포함하는 키트.
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 개인으로부터 생물학적 샘플을 추출하는 수단을 추가로 포함하는 키트.
- a) 생물학적 샘플 내의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 PCR 프라이머쌍으로 증폭시키는 단계;
b) 샘플 내의 결손을 가진 mtDNA 양을 정량하는 단계를 포함하는, mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 12317과 16254에 걸쳐 있는 결손을 가진, mtDNA의 양을 생물학적 샘플에서 정량하는 방법. - 제9항에 있어서, 증폭은 증폭 프라이머 쌍을 이용하여 실시되며, 증폭 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 결손의 맞은편 말단들 상의 스플라이스 연결 영역과 겹치도록 적응된 핵산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 서열번호 4에 해당하는 핵산 서열을 갖는 것인 방법.
- a) 타겟 서열에 해당하는 핵산 서열을 갖는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 생물학적 샘플에서 PCR 프라이머쌍을 이용하여 증폭시키는 단계; 및
b) 타겟 서열의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 미토콘드리아 DNA의 타겟 서열의 양을 정량하는 방법으로서, 상기 타켓 서열이 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 12317과 16254에 걸쳐 있는 결손된 영역인 것인, 방법. - 제12항에 있어서, 타겟 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 해당하는 핵산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 결손된 영역의 맞은편 말단들 상의 스플라이스 연결 영역과 겹치는 서열에 해당하는 핵산 서열을 가지며, 스플라이스 연결 영역은 결손된 영역이 재원형화된 후 형성되는 것인 방법.
- 제9항 또는 제12항에 있어서, 정량된 양을 적어도 하나의 공지의 기준값에 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제9항 또는 제12항에 있어서, 정량 단계는 실시간 PCR을 이용하여 실시되는 것인 방법.
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