KR101449562B1

KR101449562B1 - 암 검출에 사용하기 위한 3.4 케이비 미토콘드리아 디엔에이 결실

Info

Publication number: KR101449562B1
Application number: KR1020107007603A
Authority: KR
Inventors: 리안 파; 로버트 타이어; 가브리엘 다쿠보; 제니퍼 크리드; 케리 로빈슨; 안드레아 마그라; 브라이언 레글리
Original assignee: 미토믹스 인크.
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2007-09-26
Publication date: 2014-10-13
Also published as: JP2010539908A; CA2700941A1; AU2007359381A1; CN101874119A; EP2203570B1; JP5518715B2; HK1145343A1; ES2539001T3; EP2634267A1; EP2203570A4; ES2484044T3; EP2634267B1; CN101874119B; SG185254A1; NZ584815A; KR20100069670A; WO2009039601A1; AU2007359381B2; EP2203570A1

Abstract

전립선 또는 유방암을, 시험 샘플의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 중의 3 4-킬로염기 결실을 정량화함으로써 검출하는 방법을 개시한다. 상기 결실은 상기 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오타이드 10744 내지 14124 사이에 위치한다. 비-암성 전립선 및 유방 조직 중의 상기 결실의 양에 대한 상기 결실량의 증가는 각각 전립선 및 유방암을 가리킨다

Description

암 검출에 사용하기 위한 3.4 케이비 미토콘드리아 디엔에이 결실 {3.4 KB MITOCHONDRIAL DNA DELETION FOR USE IN THE DETECTION OF CANCER}

본 발명은 미토콘드리아 게놈 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 미토콘드리아 게놈에서 3.4 kb 결실 및 암 지표로서 그의 용도에 관한 것이다.

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2006년 4월 18일자로 출원된 PCT 출원 제 PCT/CA2006/000652 호의 일부 계속 출원이며, 상기 출원은 2005년 4월 18일자로 출원된 미국 가 출원 제 60/672,016 호, 2005년 9월 29일자로 출원된 제 60/721,522 호, 및 2006년 4월 7일자로 출원된 제 60/789,872 호로부터 우선권을 청구한다. 이들 출원의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.

종래 기술의 설명

진단 도구로서 미토콘드리아 DNA(MtDNA)

mtDNA 서열 동역학은 중요한 진단 도구이다. mtDNA의 돌연변이는 종종 질병 발생의 예비 지표이며, 종종 핵 돌연변이와 관련되고, 구체적으로 질병, 예를 들어 비 제한적으로 조직 손상, 및 흡연 및 간접적인 담배 연기에의 노출로 인한 암(Lee et al., 1998; Wei, 1998); 20 세 부근에서 시작하여 그 후에 증가하는 미토콘드리아 게놈 돌연변이의 축적에 근거한 장수(von Wurmb, 1998); 돌연변이 또는 발암물질, 돌연변이 유발 물질, 자외선에의 노출에 의해 야기된 전이성 질병(Birch-Machin, 2000); 골관절염; 심혈관, 알쯔하이머, 파킨슨 병(Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997; Zhang et al., 1998); 연령 관련된 청력 상실(Seidman et al., 1997); 시 신경 퇴행 및 심장 부정맥(Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988); 만성 진행성 외부 눈근육마비(Taniike et al., 1992); 죽상동맥경화증(Bogliolo et al., 1999); 갑상선 유두암 및 갑상선 종양(Yeh et al., 2000); 및 기타(예를 들어 Naviaux, 1997; Chinnery and Trunbull, 1999)와 관련된 바이오마커로서 작용한다.

상기 미토콘드리아 게놈의 특정 부위에서의 돌연변이는 특정 질병과 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 4216, 4217 및 4917 번에서의 돌연변이는 레버 시신경위축증(LHON)(미토콘드리아 연구 협회; Huoponen(2001); MitoMap.)과 관련이 있다. 15452 번의 돌연변이는 5/5 환자에게서 유비퀴놀 시토크롬 c 리덕타제(복합체 III) 결핍과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Valnot et al., 1999).

구체적으로, 이들 돌연변이 또는 변경은 점 돌연변이(전이, 역전), 결실(하나의 염기에서 수천 개의 염기), 역위, 중복(하나의 염기에서 수천 개의 염기), 재조합 및 삽입(하나의 염기에서 수천 개의 염기)을 포함한다. 또한, 특정 염기 쌍 변경, 결실 또는 이들의 조합이 전립선, 피부 및 폐암의 초기 발병뿐만 아니라 노화(예를 들어 Polyak et al., 1998), 조기 노화, 발암 물질에의 노출(Lee et al., 1998) 등과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.

전립선암

전립선암은 십중팔구 전립선 상피에서 기원하는 흔히 진단되는 고형 종양이다(Huang et al. 1999). 1997년에, 거의 1000만 명의 미국 남성이 전립선 특이 항원(PSA)에 대해 선별되었으며, 그의 존재는 전립선암을 암시한다(Woodwell, 1999). 실제로, 이는 초기 수지 직장 검사(DRE)에 의해 훨씬 더 많은 수의 남성이 선별되었음을 가리킨다. 같은 해에, 3100만 명의 남성이 DRE를 경험했다(Woodwell, 1999). 더욱이, 미국에서 연간 전립선암으로 새로 진단되는 사례의 수는 179,000 건으로 추산된다(Landis et al., 1999). 이는 캐나다 남성에게서 두 번째로 가장 흔하게 진단되는 암이며 암 사망률의 두 번째 주요 원인이다. 1997년에 전립선암은 캐나다 남성에게서 새로 진단된 암 중 19,800 건(28%)의 원인이었다(캐나다 국립 암 학회). 49세 연령에 걸친 모든 남성의 30 내지 40%가 어떤 암성 전립선 세포를 가지나, 이들 남성 중 단지 20 내지 25%만이 임상적으로 의미 있는 형태의 전립선암을 갖는 것으로 추정된다(SpringNet-CE Connection, internet, www.spingnet.com/ce/j803a.htm). 전립선암은 내인성 및 외인성 인자 모두를 수반하는 광범위하게 다양한 조직학적 양상, 즉 사회-경제적 위치, 식이요법, 지리학, 호르몬 불균형, 가족력 및 유전자 구성을 나타낸다(Konishi et al., 1997; Hayward et al. 1998). 몇몇 mtDNA 변경이 앞서 전립선암과 관련지어졌지만, 전립선암의 검출을 위한 추가적인 마커의 필요성이 존재한다.

3.4kb mtDNA 결실 및 전립선암의 검출

본 출원인의 계류중인 PCT 출원 제 WO/06/111029 호(이의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)에서, mtDNA의 3379 bp 단편의 결실이 전립선 조직의 전체 미토콘드리아 게놈 증폭을 통해 확인되었다. 상기 3379 bp 결실(3.4 kb 결실이라 칭함)은 상기 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오타이드 10744 내지 14124 사이에 위치하는 것으로 측정되었다. 상기 결실의 검출을 조직 샘플 시험 시 전립선암의 진단에 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

상기 3.4 kb 결실은 mtDNA 게놈으로부터 하기의 유전자들 중 일부 또는 전부를 제거한다: (i) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4L, (ii) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4, (iii) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 5, (iv) tRNA 히스티딘, (v) tRNA 세린 2, 및 (vi) tRNA 류신 2.

유방암

유방암은 유방선 조직의 암이며 다섯 번째로 가장 흔한 암 사망 원인이다. 2005년에, 유방암은 전 세계적으로 502,000 건의 사망(암 사망의 7%; 모든 사망의 거의 1%)을 야기하였다(세계 보건 기구 암 공식 보고서 297번). 전 세계 여성들 중에서 유방암은 가장 흔한 암이며, 가장 흔한 암 사망 원인이다(세계 보건 기구 암 공식 보고서 297번). 몇몇 mtDNA 변경이 앞서 유방암과 관련지어졌지만(예를 들어 문헌[Parrella et al., Cancer Research: 61, 2001]), 유방암의 검출을 위한 추가적인 마커의 필요성이 존재한다.

발명의 요약

하나의 실시태양에서, 본 발명은

a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 수득하고;

b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA, mtDNA를 추출하고;

c) 상기 mtDNA 게놈의 대략 잔기 10744에서 14124까지 걸쳐있는 핵산 서열 중 결실을 갖는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 정량화하고;

d) 상기 결실을 갖는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 하나 이상의 공지된 기준 값과 비교함

을 포함하는, 상기 개인에게서 암을 검출하는 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은

a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 수득하고;

b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA, mtDNA를 추출하고;

d) 상기 결실을 갖는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 공지된 비-암성 조직 또는 체액으로부터의 mtDNA의 기준 샘플 중의 상기 결실의 양과 비교함

을 포함하는, 상기 개인에게서 암을 검출하는 방법을 제공하며,

여기에서 상기 기준 샘플과 비교된 상기 생물학적 샘플 중의 상기 결실의 상승된 양은 암을 가리킨다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은

a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 수득하고;

b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA, mtDNA를 추출하고;

d) 상기 결실을 갖는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 공지된 암성 조직 또는 체액으로부터의 mtDNA의 기준 샘플 중의 상기 결실의 양과 비교함

여기에서 상기 기준 샘플과 비교된 상기 생물학적 샘플 중의 상기 결실의 유사한 수준은 암을 가리킨다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은

a) 생물학적 샘플을 수득하고;

b) 상기 샘플로부터 mtDNA를 추출하고;

d) 일정한 지속기간에 걸쳐 단계 a) 내지 c)를 반복함

을 포함하고,

e) 여기에서 상기 지속기간에 걸친 상기 결실 수준의 증가가 암을 가리키는,

개인을 암의 발생에 대해 모니터하는 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은

a) 개인으로부터 생물학적 샘플을 수득하고;

b) 상기 샘플로부터 미토콘드리아 DNA, mtDNA를 추출하고;

c) 서열식별번호: 1로 확인된 서열에 상응하는 서열을 갖는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 정량화하고;

d) 상기 서열식별번호: 1에 상응하는, 상기 샘플 중의 mtDNA의 양을 하나 이상의 공지된 기준 값과 비교함

본 발명은 미토콘드리아 게놈 분야에 관한 것으로 본 발명은 미토콘드리아 게놈에서 3.4 kb 결실 및 암 검출 지표로서 활용될 수 있다.

본 발명의 실시태양을 이제 오직 첨부된 도면들을 참고로 예로서 개시할 것이며, 도면에서:
도 1은 3.4 kb 결실의 검출에 유용한 프라이머의 디자인 및 서열을 나타내는 개략도이다.
도 2는 3.4 kb 연구에서 악성과 징후적 양성 참여자들 간의 주기 역치의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 1과 관련된 바와 같은 주기 역치를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 하나의 실시태양의 특이성 및 감도를 예시하는 ROC 곡선을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시태양의 특이성 및 감도를 예시하는 ROC 곡선을 나타낸다.
도 6은 유방암과 관련된 3.4 kb mtDNA 결실 수준에 관한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 또 다른 실시태양의 특이성 및 감도를 예시하는 ROC 곡선을 나타낸다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "주기 역치(cycle threshold)"(C_T)는 실시간 PCR을 사용하는 표적 증폭이, 형광 신호와 같은 신호가 가리키는 바와 같이, 배경 이상으로 상승하는 점이다. 상기 C_T는 상기 연구 중인 서열의 양과 역의 관계이다.

본 발명에 정의된 바와 같이, "감도"는 본 발명의 방법을 사용하여 획득한 참 양성 결과의 분수(참 양성 비율)를 지칭한다.

본 발명에 정의된 바와 같이, "특이성"은 본 발명의 방법을 사용하여 획득한 거짓 양성 결과의 분수(거짓 양성 비율)를 지칭한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 언급한 3.4 kb mtDNA 결실의 검출 및 정량화를 통해 암을 모니터하고 진단하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명을 전립선암 및 유방암의 전-종양, 종양 및 잠재적인 악성으로의 진행을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 발명은 암의 검출, 진단 및/또는 모니터를 위한 상기 3.4 kb mtDNA 결실(서열식별번호: 1)의 검출 및 정량화를 수반한다. 상기 방법에서, mtDNA를 생물학적 샘플(예를 들어 체 조직, 또는 체액, 예를 들어 소변, 전립선 마사지액)로부터 추출한다. 이어서 상기 추출된 mtDNA를, 상기 샘플 중의 상기 3.4 kb 결실의 수준(즉 양)을 측정하기 위해 시험한다. 본 발명자들에 의해 수행된 시험에서, 상기 결실의 수준은 암이 없는 환자로부터 획득한 샘플에 비해 암이 있는 환자로부터 획득한 샘플 중에서 상승하는 것으로 밝혀졌다. 하기에 공급된 정보 및 데이터를 근거로, 본 발명자들은 상기 mtDNA 중의 3.4 kb 결실의 상승된 수준이 암을 가리키는 것으로 결론지었다.

PCT WO/06/111029에 개시된 바와 같이, 상기 3.4 kb 결실은 mtDNA 게놈의 대략 10744 내지 14124 뉴클레오타이드에 걸쳐 있다. 상기 mtDNA 게놈은 서열식별번호: 8(Genbank 수탁 번호 AC_000021)로서 나열한다. 본 발명자들은 하기 실시예에 의해 제공되는 바와 같이, 상기 결실이 또한 암 및 특히 전립선 및 유방암과 관련이 있음을 결정하였다. 따라서, 상기와 같은 결실은 정확한 바이오마커를 제공하며 따라서 적어도 상기 조직 중의 암의 검출, 진단 또는 모니터에 귀중한 도구를 제공한다.

상기 결실은 2 개의 결실 단량체, 즉 크기가 3.4 kb인 것 하나(작은 서브리몬(sublimon))와 크기가 대략 12.6 kb인 것 하나(큰 서브리몬)를 생성시킨다. 상기 결실의 존재는 상기 작은 서브리몬의 존재를 확인하거나, 또는 상기 3.4 kb 서열이 상기 큰 서브리몬으로부터 결실되었음을 측정함으로써 검출될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 상기 결실은 대략적으로 3379 bp이며, NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4L, NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4, NADH 데하이드로게나제 서브유닛 5, tRNA 히스티딘, tRNA 세린 2, 및 tRNA 류신 2를 암호화하는 유전자를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 예를 들어 전립선 조직, 전립선 마사지액, 소변 또는 유방 조직의 샘플을 개인으로부터 획득하고 암의 발생 또는 진행을 모니터하기 위해서 일정 기간(예를 들어 수년)에 걸쳐 시험한다. 시간에 따라 증가하는 상기 3.4 kb 결실의 수준은 암의 시작 또는 진행을 가리킬 수 있다.

상기 3.4 kb mtDNA 결실의 연령 관련된 축적은 개인을 예를 들어, 각각 중년 및 노년의 남성과 중년 및 노년의 여성에게서 우세한 전립선암 또는 유방암에 걸리기 쉽게 만들 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 따라, 체 조직, 예를 들어 유방 조직 또는 체액, 예를 들어 전립선 마사지액, 또는 소변에서 상기 3.4 kb 결실의 양을 시간에 걸쳐 모니터함으로써 정기적인 암 선별을 수행할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 암을 조기, 및 임의의 조직학적 이상 전에 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 유방 조직에서 전-종양을 검출할 수 있다.

하기의 프라이머 서열이 3.4 kb 결실의 검출에 바람직하다:

3.4 순 방향(mtDNA 게놈의 염기 10729-10743/14125-14139에 결합한다) 5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3' (서열식별번호: 2);

3.4 역 방향(mtDNA 게놈의 염기 14361-14379에 결합한다) 5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3'(서열식별번호: 3)

본 발명의 하나의 실시태양에서, 한 쌍의 증폭 프라이머를 사용하여 상기 3.4 kb 결실의 존재를 가리키는 표적 부위를 증폭시킨다. 상기 실시태양에서, 상기 증폭 프라이머의 쌍 중 하나는 상기 3.4 kb 서열의 결실이 발생한 후의 mtDNA의 연접된 부위(즉 상기 mtDNA 게놈의 대략 잔기 10744에서 14124까지 걸쳐있는 연접부)와 겹쳐진다. 따라서 상기 겹쳐지는 프라이머의 연장은 상기 3.4 kb 부분이 결실되는 경우에만 발생할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 한 쌍의 증폭 프라이머를 사용하여 상기 결실된 3.4 kb 서열과 관련된 표적 부위를 증폭시킨다. 상기 결실된 3.4 kb 서열은 결실 시 환상 mtDNA 분자로서 재형성될 수 있다. 상기 실시태양에서, 상기 증폭 프라이머 쌍 중 하나는 상기 3.4 kb 서열 단부의 재결합 부위와 겹쳐진다. 따라서, 샘플 중에서 검출되는 상기 3.4 kb 분자의 양의 증가는 암을 가리킨다. 하기의 프라이머 상이 상기 결실된 3.4 kb 핵산의 검출에 바람직하다.

순 방향 14115/10755 5'-CCCACTCATCACCTAAACCTAC-3' (서열식별번호: 9)

역 방향 10980R 5'-GGTAGGAGTCAGGTAGTTAG-3' (서열식별번호: 10).

본 발명의 하나의 태양에서, mtDNA의 추출 수단, 서열식별번호: 2 및 3, 또는 서열식별번호: 9 및 10에 인용된 핵산 서열을 갖는 프라이며, 시약 및 설명서를 포함하는, 암, 예를 들어 전립선 또는 유방암의 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 생검 샘플로부터 비-암성 조직을 획득하고; 상기 비-질병 조직 중의 3.4 kb mtDNA 결실의 양을 검출 및 정량화함을 포함하는, 생검 샘플(예를 들어 전립선 또는 유방암)로부터 암 생검 시험의 존재를 승인 또는 반박하는 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서 본 발명은 체액 샘플을 수득하고, 상기 체액 중의 3.4 kb mtDNA 결실의 수준을 검출 및 정량화함을 포함하는, 체액 샘플로부터 전립선 또는 유방암에 대해 개인을 선별하는 방법을 제공한다.

하기 실시예에 개시된 바와 같이 실시간 정량적인 PCR 방법이 상기 3.4 kb 결실의 존재 또는 부재를 검출하고 정량화하는 바람직한 수단을 나타내지만, 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 다른 방법들도 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 결실의 정량화를 바이오-래드 바이오플렉스(Bio-Rad's Bioplex)^TM 시스템 및 현탁액 배열 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 임의의 공지된 방법을 사용하는 서열의 증폭 및 정량화를 필요로 한다.

하기 제공되는 실시예들은 상기 결실을 전립선 조직 중의 전립선암의 검출에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 생물학적 샘플, 예를 들어 전립선 마사지액, 소변, 및 유방 조직 중의 암의 존재를 검출하는데 사용할 수 있음을 예시한다. 이들 실시예에서의 발견을 근거로, 상기 3.4 kb mtDNA 결실을 암의 바이오마커로서 사용할 수 있다.

제공되는 다양한 실시예들은 암이 있는 환자, 및 암이 없는 환자로부터 획득한 샘플들 간의 상기 3.4 kb 결실을 갖는 mtDNA의 양의 차이를 예시한다. 상기 3.4 kb 결실의 양은 암이 있는 환자로부터 획득한 샘플에서 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 측정은 상기 시험 샘플 중의 3.4 kb 결실의 양과 공지된 암 세포 및/또는 공지된 비-암 세포로부터의 양을 비교함으로써 수행되었다.

실시예 1: 전립선 조직의 mtDNA 중의 3.4 kb 결실

새로 동결된 전립선 조직의 전체 미토콘드리아 게놈 증폭을 통해 대략 3.4 킬로염기(kb)의 결실을 확인하였다. 선형 회귀를 사용하여, 상기 결실의 크기는 3000 염기쌍(bp) 내지 3500 pb인 것으로 추정되었다. 2 개의 가능한 후보 결실, 즉 9574-12972에서 3397 bp 결실 및 10744-14124에서 3379 bp 결실을 미토맵(Mitomap)^TM(Brandon, M.C., Lott, M.T., Nguyen, K.C., Spolim, S., Navathe, S.B., Baldi, P.& Wallace, D.C., MITOMAP: 인간 미토콘드리아 게놈 데이터베이스 --2004 update. Nucleic Acids Research 33(Database Issue):D611-613, 2005; www.mitomap.org)을 사용하여 확인하였다. 상기 두 결실 중 어느 것이 전립선암과 관련이 있는지를 결정하기 위해서, 상기 결실 연접부를 중개하는 순 방향 프라이머를 상기 각각의 두 후보에 대해 개발하였으며, 이는 상기 프라이머가 상기 결실에 인접하는 반복 부위들보다 확실히 더 연장되게 한다. 도 1은 상기 프라이머의 디자인 및 서열(즉 서열식별번호: 2)을 나타내는 개략도이다. 10744-14124에서 3379 bp 결실(3.4 kb 결실이라 칭함)에 상응하는 증폭 절(amplicon)에 대한 양의 증폭 결과가 획득되었다.

상기 나타낸 바와 같이, 상기 3.4 kb 결실은 하기의 유전자들 중 일부 또는 전부를 제거한다: (i) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4L, (ii) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 4, (iii) NADH 데하이드로게나제 서브유닛 5, (iv) tRNA 히스티딘, (v) tRNA 세린 2, 및 (vi) tRNA 류신 2.

상기 3.4 kb 결실은 33 개의 새로 동결시킨 전립선 샘플의 91%에서 존재하는 것으로 측정되었다. 상기 특정한 결실 프라이머들을 사용하여, 포르말린 고정된 조직을 n 값이 증가하는 순서로 시험하였다.

본 연구자들은 조직학적으로 정상인 전립선으로부터 레이저 포착 미세절제에 의해 미세절제된 32 개 조직 샘플 및 12 침 생검으로부터 전체 미토콘드리아 게놈을 서열화하였다. 상기 각각의 샘플로부터 수집한 조직 단편들을 다음 연구를 위해 사용하였다. 각각의 샘플로부터 1 내지 2 개의 단편을 제거하였다. DNF를 각각의 샘플로부터 미세절제보다는 오히려 전체로서 추출하였다. 따라서, 각각의 샘플은 전립선 간질 조직뿐만 아니라 전립선 선 조직의 혼합물로 이루어졌다. 상기 추출을 퀴아겐(Qiagen)의 퀴아앰프(QIAamp)^TM DNA 미니 키트(Cat#51304)를 사용하여 수행하였다. 추출에 이어서 상기 샘플을 나노드롭(Nano-Drop)^TM 분광광도계를 사용하여 정량화하고 후속적으로 농도를 2 ng/ul로 표준화하였다. 각각의 샘플을 20 ng 투입 DNA 및 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Green Supermix)^TM 키트(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 사용하여 증폭시켰다. 반응들을 옵티콘(Opticon)(등록상표) 2 컬러 실시간 PCR 시스템(MJ Research) 상에서 실행시켰다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 악성 전립선 샘플과 징후적 양성 전립선 샘플 사이의 주기 역치, 및 연장에 의해, 결실 양에 있어서 독특한 차이가 관찰되었다. 악성 샘플은 상기 양성 샘플보다 일관 되게 더 이른 주기 역치를 나타내었다.

실시예 2: 3.4 kb 결실 맹검 연구 - 주기 역치의 비교

추가로 21 개의 전립선 조직 샘플을 선택하였으며, 이중 10 개는 양성이었고 11 개는 악성이었다. 병리학적 상태를 자격 있는 병리학자에 의해 수행된 침 생검에 의해 측정하였다. 본 연구자들이 상기 시험을 수행할 때 상기 샘플의 병리학적 상태를 알지 못하도록 상기 샘플을 가렸다. 본 연구자들은 상기 주기 역치를 조사함으로써 사례의 81%에서 병리학적 상태를 정확하게 예견할 수 있었다. 4 개의 부정확한 콜 중에서 2 개는 양성인 것으로 측정된 악성 샘플이었고 2 개는 악성인 것으로 측정된 양성 샘플이었다. 후자의 시나리오에서 상기 2 명의 개인이 상기 연구에 사용된 침 생검 결과에 따라 전립선암으로 진단되었음을 확정하기 위해서 이들에 대한 추적 임상 정보가 의사로부터 요청되었다. 원래 양성 샘플을 제출하였지만 본 연구에 의해 악성 종양을 갖는 것으로 예견된 개인 중 한 명은 후속적으로 악성 샘플을 제출하였다. 그 결과 상기 거짓 양성 중 하나는 참 양성으로 되었다. 따라서, 병리학적 상태는 본 연구에서 조사된 사례 중 86%에서 정확하게 예견되었다. 본 연구에 대한 최종적인 양성 예견 값(PPV, 여기에서 PPV는 참 양성/(참 양성 + 거짓 양성)이다)은 91%이고 음성 예견 값(NPV, 여기에서 NPV는 참 음성/(참 음성 + 거짓 음성)이다)은 80%이었다.

실시예 3: 3.4 kb 결실 연구 - 방법(n = 76)

76 개의 전립선 조직 샘플을 본 연구에서 3.4 kb 결실에 대해 조사하였다. 모든 조직 샘플들을 포르말린-고정하였으며, 조직학적으로 입증된 바와 같이 25 개는 악성이고, 12 개는 정상이며, 39 개는 양성 전립선 질병이 있었다. 후자의 그룹 중 절반이 넘게 이상증식이 있었다. 모든 시편은 상기 연구자들의 조직 수집자료로부터 취한 침 생검 시편이었다.

전립선 시편

프렙 스트립스(Prep-Strips)(카탈로그 번호 LCM0207, Arcturus Bioscience Inc로부터)를 사용하여 각각의 슬라이드 상에서 테이프 리프트를 수행하였다. 이는 DNA 추출 전에 상기 슬라이드로부터 임의의 미립 물질 또는 비-점착성 조직을 제거되게 하였다. 여전히 상기 슬라이드 상에 조직이 있는 경우, 상기 슬라이드를 PBS(포스페이트 완충 염수 용액)로 세정하여 정착액을 가능한 한 많이 제거하였다. 상기 슬라이드 상의 1 내지 2 개의 침 생검 단편을 개별적으로 포장된, 멸균된 수술용 면도날을 사용하여 멸균 원심분리 튜브에 긁어 모았다. 이어서 DNA를 단리하고 제조사의 명세에 따라 퀴아앰프(등록상표) DNA 미니 키트(Qiagen, Cat#51304)를 사용하여 정제하였다. 음성 추출물 대조군을 품질 대조 검사점으로서 상기 슬라이드 추출과 병행하여 처리하였다. 각 샘플의 전체 DNA 농도 및 순도 비를 분광광도측정(Nano-Drop^TM ND-1000)에 의해 측정하고 2 ng/㎕의 희석물을 정량적인 폴리머라제 쇄 반응(qPCR)을 위해 제조하였다.

프라이머(올리고뉴클레오타이드)

정제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 인비트로젠(Invitrogen)(California, USA)에 의해 화학적으로 합성하였다. 상기 프라이머의 서열 및 증폭된 PCR 산물의 예상된 크기를 표 1에 나타낸다. 또한, mtDNA 결실에 대한 PCR 분석은 양성 대조군(돌연변이 mtDNA를 수반하는 것으로 알려진 공급원으로부터의 DNA)을 포함하였다. TNF(종양 괴사 인자)를 제외한 각 프라이머 세트를 미토콘드리아가 없는 rho 0 세포주에 대해 검사하여 가유전자(pseudogene) 동시 증폭의 부재를 확인하였다.

증폭 프라이머

*프라이머* 쌍	*증폭된 위치 5'-3'*	*증폭산물의* *길이(염기쌍)*
*3.4 결실 실시간* *12s* *mtDNA* *TNF*	10729-14379 (10744-14124에서 3379 bp 미만) 708-945 3756-3886	273 238 131
*3.4* 순방향 (10729-10743 - 14125-14139) 5' TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA -3' 서열식별번호: 2 *3.4* 역방향 (14361-14379) 5'- GAGGTAGGATTGGTGCTGT -3'서열식별번호: 3 *12s* 순방향 (708-728 ) 5'- CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC -3' 서열식별번호: 4 *12s* 역방향 (923-945) 5'- CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT -3' 서열식별번호: 5 *TNF* 순방향 (3756-3775) 5'- CCTGCCCCAATCCCTTTATT -3' 서열식별번호: 6 *TNF* 역방향 (3866-3886) 5'- GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG -3' 서열식별번호: 7

실시간 폴리머라제 쇄 반응

3 개의 별도의 PCR을 각 샘플에 대해 수행하였다. 각각의 반응은 총 부피가 25 ㎕이고 주형 DNA, 한 쌍의 프라이머(12s 또는 3.4 결실 또는 TNF), iQ^TM CYBR 그린 수퍼믹스^TM 키트(카탈로그 번호 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) 및 증류된 탈이온수(ddH₂O)를 포함하였다. 상기 TNF(종양 괴사 인자)는 단일 사본 핵 유전자 프라이머를 포함하였고, 12s는 전체 미토콘드리아 게놈 프라이머를 포함하였다. 주형 DNA, 프라이머, 및 반응 완충제의 부피 및 농도를 하기에 나타낸다.

qPCR 요소
시약	반응 당 농도	반응 당 부피
반응 완충제	1X	12.5 ㎕
프라이머(순방향 및 역방향)	250 nM	각각 100 unole 모액 당 0.0625 ㎕
ddH₂O	N/A	2.375 ㎕
주형 DNA	20 ng	10.0 ㎕
합계		25 ㎕

각 증폭 절에 대한 주기 매개변수를 표 3에 나타낸다.

주기 매개변수
단계	온도(℃)	지속기간
1	95	3 분
2	95	30 초
3	66(3.4 결실 프라이머) 또는 61.5(12s 프라이머) 또는 61.5(TNF 프라이머)	30 초
4	72	30 초
5	플레이트 판독
6	72	10 분
7	용융 곡선 50 ℃-100 ℃ 매 1 ℃마다 판독	3 초
단계 2 내지 5 반복, 총 45 주기 동안 44 회

상기 반응의 열 주기, 실시간 검출 및 분석을 인튜이티브 옵티콘 모니터(Intuitive Opticon Monitor)^TM 소프트웨어(MJ Research Inc.)가 구비된 DNA 엔진 옵티콘(등록상표) 2 연속 형광 검출 시스템을 사용하여 수행하였다. 표준 곡선 방법을 DNA 정량화에 사용하였다. 3 개의 정제된 PCR 생성된 주형들, 즉 3.4 결실에 대한 하나, 12s 프라이머에 대한 하나, 및 TNF에 대한 하나의 산물의 일련의 희석 세트(10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹)를 수행하였다. 상기로부터, 3 개의 상이한 표준 곡선이 생성되었으며 이는 전체 mtDNA 사본의 수(12s 증폭 절-전체 미토콘드리아 게놈 프라이머), 3.4 kb 결실을 갖는 mtDNA의 양, 또는 전체 핵 DNA(TNF-단일 사본 핵 유전자 프라이머)를 나타낸다. 이어서 상기 샘플들의 C_T 값을, 샘플 C_T와 표준을 비교함으로써 DNA 사본 수로 전환시켰다. 상기 3.4 결실은 상기 결실이 37 주기 내에서 검출되지 않은 경우 존재하지 않거나 낮은 수준인 것으로 간주되었다.

악성의 결정은 상기 주기 역치의 위치에 의해 지시되는 바와 같이 표준화된 샘플 중에 존재하는 3.4 kb 결실의 양에 근거한다. 상기 위치는 25 초과 35 미만의 주기에서와 같이 절대적이거나, 또는 더욱 가능하게는 상기 12s 증폭 절에 의해 지시되는 바와 같이 존재하는 전체 미토콘드리아 DNA와 3.4 kb 결실 사이의 비일 수 있다. 상기를 전체 미토콘드리아 DNA의 퍼센트로서 나타낼 수 있다. 상기 TNF 증폭 절에 의해 나타내는 바와 같은 세포의 수를 양성 조직과 악성 조직 간의 구별을 개선하기 위해서 통합시킬 수도 있다.

이들 샘플의 분석을 자동화하기 위해서, 생물정보학 도구를 사용하였다. 이들 분석에 대해 고려된 3 가지 변수는 종양 괴사 인자(TNF)의 주기 역치 C_T, 상기 특정한 프라이머 부위를 함유하는 미토콘드리아의 전체 종, 및 관심 결실을 갖고 있는 미토콘드리아였다.

클러스터 분석

데이터의 유사하고 작은 범위로 인해 클러스터링(clustering)을 표준화하지도 못하고 대수 함수로 사용하지도 못했다.

도 3은 데이터의 실제 움직임 및 동향을 나타낸다. x-축은 환자 수이고 y-축은 실시간 PCR로부터 획득한 주기 역치이다.

상기 주기 역치가 클수록 더 낮은 양의 결실이 존재함을 아는 것이 중요하다.

도 3에 도시된 일반적인 동향은 결실, 전체, 및 TNF의 변수들 간의 차이/비에 근거한다. 상기 결실은 양성/정상 샘플(오른쪽)에 대해 낮거나 없으며 비정상적인 양성 및 악성 샘플에 따라 증가한다(왼쪽을 향해). 상기 비정상적인 양성 및 악성 샘플은 결실 대 TNF의 주기 역치 비를 근거로 서로 구별되기 시작한다.

지도 학습

지도 학습은 알고 있는 샘플에 대한 결과를 예견하고자 하는 시스템을 기본으로 한다. 상기 데이터의 절반을 훈련에 사용하고 다른 절반은 연산 시험에 사용하였다. 지도 학습은 그의 예견을 표적 답과 비교하고 그의 실수로부터 "학습한다". 그러나, 상기 예견된 출력이 데이터의 실제 결과보다 높거나 낮은 경우, 상기 오차는 상기 시스템을 통해 역 전파되고 가중치가 상응하게 조절된다.

데이터 세트:

5% 내지 35% - 양성

35% 내지 65% - 과형성

65% 내지 95% - 악성

인공 신경망(ANN) 연산(하기에 도식적으로 나타냄):

데이터 세트의 절반은 ANN의 훈련에 사용되고

다른 절반은 정확도를 비교하는데, 즉 예상된 데이터 세트와 획득된 데이터 세트를 비교하는데 사용되었다 → 86.6%

인공 신경망(ANN)을 사용하는 결실 데이터의 지도 학습

3 가지 분류:

양성

과형성

악성

각각의 분류에 대해 실시간 PCR 주기 역치 C_T를 근거로 3 개의 변수를 사용하였다:

종양 괴사 인자(TNF) - 핵 사본 대조군

전체 미토콘드리아 - 미토콘드리아 사본 대조군

결실 - 결실된 상태의 미토콘드리아

결과:

데이터 세트의 절반을 상기 ANN의 훈련에 사용하고, 나머지 절반은 정확성 비교에 사용한다.

3 가지 분류 정확도 = 86.6%

양의 예견치(PPV);

양성 대 악성 = 88.2%

음의 예견치(NPV)

양성 대 악성 = 76.5%

실시예 4: 유방암과 관련된 mtDNA 에서 3.4 kb 결실

18 개의 샘플을 상기 언급한 3.4 kb 결실의 존재에 대해 악성 및 양성 유방 조직으로부터 시험하였으며, 이때 9 개는 악성이고 9 개는 양성이었다. 샘플들을 통상적인 조직병리학적 분석을 사용하여 악성 또는 양성으로서 분류하였다.

DNA를 퀴아앰프(등록상표) DNA 미니 키트(Qiagen, Cat#51304)를 사용하여 제조사의 명세에 따라 상기 샘플들로부터 단리하고 정제하였다.

정제된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 인비트로젠(California, USA)에 의해 화학적으로 합성되었다. 상기 프라이머들의 서열 및 증폭된 PCR 산물의 예상 크기를 상기 표 1에 나타낸다.

실시간 폴리머라제 쇄 반응

3 개의 별도의 PCR을 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 각각의 반응은 전체 부피가 25 ㎕이었고, 주형 DNA, 한 쌍의 프라이머(12s 또는 3.4 결실 또는 TNF), iQ^TM SYBR 그린 수퍼믹스 키트(카탈로그 번호 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) 및 증류된 탈이온수(ddH₂O)를 포함하였다. 상기 TNF(종양 괴사 인자)는 단일 사본 핵 유전자 프라이머를 포함하고, 12s는 전체 미토콘드리아 게놈 프라이머를 포함하였다. 주형 DNA, 프라이머, 및 반응 완충제의 부피 및 농도를 하기에 나타낸다:

각 증폭 절에 대한 주기 매개변수를 표 5에 나타낸다.

상기 반응의 열 주기, 실시간 검출 및 분석을 인튜이티브 옵티콘 모니터^TM 소프트웨어(MJ Research Inc.)가 구비된 DNA 엔진 옵티콘(등록상표) 2 연속 형광 검출 시스템을 사용하여 수행하였다. 표준 곡선 방법을 DNA 정량화에 사용하였다. 3 개의 정제된 PCR 생성된 주형들, 즉 3.4 결실에 대한 하나, 12s 프라이머에 대한 하나, 및 TNF에 대한 하나의 산물의 일련의 희석 세트(10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹)를 수행하였다. 상기로부터, 3 개의 상이한 표준 곡선이 생성되었으며 이는 전체 mtDNA 사본의 수(12s 증폭 절-전체 미토콘드리아 게놈 프라이머), 3.4 결실, 또는 전체 핵 DNA(TNF-단일 사본 핵 유전자 프라이머)를 나타낸다. 이어서 상기 샘플들의 C_T 값을, 샘플 C_T와 표준을 비교함으로써 DNA 사본 수로 전환시켰다.

악성의 결정은 상기 주기 역치의 위치에 의해 지시되는 바와 같이 표준화된 샘플 중에 존재하는 3.4 kb 결실의 양에 근거하였다. 상기 위치는 25 주기 초과 30 주기 미만에서와 같이 절대적이거나, 또는 보다 있음직 하게는 12s 증폭 절에 의해 지시되는 바와 같이 존재하는 전체 미토콘드리아 DNA와 3.4 kb 결실 사이의 비일 수 있다. 이를 전체 미토콘드리아 DNA의 퍼센트로서 나타낼 수 있다.

상기 샘플의 분석을 자동화하기 위해서, 생물정보학 도구를 사용하였다. 상기 분석에 대해 고려된 3 가지 변수는 종양 괴사 인자(TNF)의 주기 역치 C_T, 상기 특정한 프라이머 부위를 함유하는 미토콘드리아의 전체 종, 및 관심 결실을 갖는 미토콘드리아였다.

표 6 및 도 7은 악성 조직 및 양성 조직으로부터의 샘플들에 대한 평균 C_T 점수의 차이를 나타낸다. 정상 조직에 대한 평균 C_T 값은 30.5889인 반면, 악성 조직에 대한 평균 C_T는 27.8533이었으며, 이는 정상 유방 조직에 대한 악성 유방 조직 중에 3.4 kb 결실을 갖는 mtDNA의 양의 차이를 예시한다.

C_T 점수에 대한 평균값

그룹 통계학
GRP	N	평균	표준 편차	표준 오차 평균
del 3.4 정상 악성	9 9	30.5889 27.8533	2.53897 2.52253	.84632 .84084

도 8은 유방 조직 시험 시 유방암에 대한 마커로서 3.4 kb mtDNA 결실의 특이성 및 감도를 예시하는 ROC 곡선이다. 상기 결과를 29.1900의 컷오프 C_T를 사용하여 획득하였다. 상기 C_T에서 상기 마커의 감도는 77.8%인 반면, 특이성은 77.8%이었다.

표 7은 상기 시험의 정확도의 척도로서 본 실시예에 대한 곡선 아래 면적의 계산을 나타낸다.

곡선 아래 면적을 나타내는 결과

곡선 아래 면적 시험 결과 변수(들): del 3.4
면적	표준 오차^a	점근선 신호^b	점근선 95% 신뢰도 구간
			하위 결합	상위 결합
.790	.112	.038	.570	1.010
a. 비모수적 가정 하에서 b. 귀무 가설: 참 면적 = 0.5

29.1900의 컷오프 C_T의 측정을 하기 표 8에 나타낸다. 표 8에 나타낸 결과들은 29.1900의 컷오프 C_T가 각각 78% 및 78%에서 최고의 감도 및 특이성을 제공하였음을 보인다.

C_T 컷오프의 측정

실시예 5: 전립선암의 조직학적 증거가 없는 환자의 유체와 비교된 전립선암 환자의 전립선 마사지액 중의 3.4 kb 결실

40 개의 전립선 마사지액 샘플이, 후속적으로 전립선암으로 진단되었거나 전립선 침 생검 과정에 이어서 전립선암의 조직학적 증거를 나타내지 않은 환자들로부터 비뇨기과 의사에 의해 수집되었다. 상기 샘플을 IsoCode Card^TM(Schleicher & Shuell) 상에 침착시키고, 건조시키고, 이어서 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 모든 DNA 추출물을 나노드롭^TM ND-1000 분광광도계를 사용하여 정량화하고 DNA 농도를 2 ng/ul로 표준화하였다. 이어서 각각의 샘플을 하기의 매개변수에 따라 증폭시켰다:

25 ul 반응에서

1X iQ CYBR 그린 수퍼믹스^TM(Bio-Rad P/N 170-8880)

150 nmol 순방향 프라이머

(5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3') (서열식별번호: 2).

150 nmol 역방향 프라이머

(5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3')(서열식별번호: 3)

20 ng 주형 DNA.

반응들을 하기의 프로토콜에 따라 옵티콘^TM 2 DNA 엔진(Bio-Rad Canada) 상에서 순환시켰다:

1. 3 분간 95 ℃

2. 30 초간 95 ℃

3. 30 초간 66 ℃

4. 30 초간 72 ℃

5. 플레이트 판독

6. 단계 2 내지 5 44 회 반복

7. 10 분간 72 ℃

8. 50 ℃ 내지 105 ℃의 용융 곡선, 매 1 ℃마다 판독, 3 초간 유지

9. 10 ℃ 유지

전립선 마사지액 시험에 대한 평균 C_T 값을 나타내는 결과

그룹 통계학
GRP	N	평균	표준 편차	표준 오차 평균
DEL 3.4 양성 악성	25 15	37.1869 33.7712	3.18495 3.98056	.63699 1.02778

표 9 및 10은 양성 샘플과 악성 샘플 그룹에 대해 획득된 평균 C_T 값들 간의 유의차를 나타낸다(p=0.005).

샘플들의 C_T 값에 대한 차이(p=0.005)를 나타내는 결과

도 5는 전립선 마사지액 시험 시 전립선암에 대한 마커로서 3.4 kb mtDNA 결실의 특이성 및 감도를 예시하는 수용자 반응 특성(ROC) 곡선이다. 상기 결과를 37.3683의 컷오프 C_T를 사용하여 획득하였다. 상기 C_T에서 상기 마커의 감도는 87%인 반면, 특이성은 64%이다.

상기 시험의 정확도는 상기 시험이 상기 시험 그룹을 전립선암이 있는 그룹과 없는 그룹으로 얼마나 잘 분리하느냐에 따른다. 정확성을 상기 ROC 곡선 아래 면적에 의해 측정한다. 표 11은 본 실시예에 대한 곡선 아래 면적의 계산을 나타낸다.

ROC 곡선 아래 면적을 나타내는 결과

곡선 아래 면적 시험 결과 변수(들): DEL 3.4
면적	표준 오차^a	점근선 신호^b	점근선 95% 신뢰도 구간
			하위 결합	상위 결합
.768	.074	.005	.622	.914
a. 비모수적 가정 하에서 b. 귀무 가설: 참 면적 = 0.5

특이성 및 감도의 측정

최소 컷오프 값은 최소 관측 시험 값 -1이고, 최고 컷오프 값은 최대 관측 시험 값 +1이다. 모든 다른 컷오프 값들은 2 개의 연속적으로 정렬된 관측 시험 값들의 평균이다)

37.3683의 컷오프 C_T의 측정을 상기 표 12에 나타낸다. 표 12에 나타낸 결과는 37.3683의 컷오프 C_T가 최고의 감도 및 특이성을 제공하였음을 예시한다.

실시예 6: 전립선암의 조직학적 증거가 없는 환자의 유체와 비교된 전립선암 환자의 소변 중의 3.4 kb 결실

소변 샘플을 전립선암으로 진단된 5 명의 환자 및 침 생검 과정을 받은 5 명(전립선 악성 종양을 검출할 수 없다)으로부터 수집하였다. 상기 샘플을 전립선 세포의 수집을 용이하게 하기 위해서 수지 직장 검사(DRE)에 따라 수집하였다.

상기 샘플을 받았을 때, 5 ㎖ 분액을 제거하고 이어서 2 ㎖을 14,000 x g에서 원심분리하여 펠릿을 형성시켰다. 상등액을 제거하고 버렸다. 펠릿을 200 ul 포스페이트 완충 염수 용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 펠릿과 전체 소변 샘플 모두에 대해, 제조사의 지시에 따라 퀴아앰프^TM DNA 미니 키트(Qiagen P/N 51304)를 사용하여 DNA 추출 과정을 수행하였다. 이어서 생성되는 DNA 추출물을 나노드롭^TM ND-1000 분광광도계를 사용하여 정량화하고 0.1 ng/ul의 농도로 표준화하였다.

샘플들을 하기에 따라 3.4 kb 결실 특이적 프라이머를 사용하여 정량적인 실시간 PCR에 의해 분석하였다:

25 ul 반응에서

1X iQ SYBR 그린 수퍼믹스^TM(Bio-Rad P/N 170-8880)

100 nmol 순방향 프라이머 (5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3')(서열식별번호: 2)

100 nmol 역방향 프라이머 (5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3')(서열식별번호: 3)

1 ng 주형 DNA

1. 3 분간 95 ℃

2. 30 초간 95 ℃

3. 30 초간 69 ℃

4. 30초간 72 ℃

5. 플레이트 판독

6. 단계 2 내지 5 44 회 반복

7. 10 분간 72 ℃

9. 10 ℃ 유지

C_T 점수에 대한 평균값

그룹 통계학
GRP 유체38	N	평균	표준 편차	표준 오차 평균
CTF 양성 악성	5 5	33.2780 30.6980	1.10900 2.55767	.49596 1.14382

표 13 및 14는 양성 샘플과 악성 샘플 그룹에 대해 획득된 평균 C_T 값들 간의 유의차를 나타낸다(p=0.005).

샘플들의 C_T 값에 대한 차이(p=0.005)를 나타내는 결과

도 6은 소변 시험 시 전립선암에 대한 마커로서 3.4 kb mtDNA 결실의 특이성 및 감도를 예시하는 수용자 반응 특성(ROC) 곡선이다. 상기 결과를 31.575의 컷오프 C_T를 사용하여 획득하였다. 상기 C_T에서 상기 마커의 감도는 80%인 반면, 특이성은 100%이다.

31.575의 컷오프 C_T의 측정을 표 15에 나타낸다. 표 15에 나타낸 결과는 31.575의 컷오프 C_T가 최고의 감도 및 특이성을 제공하였음을 예시한다.

C_T 컷오프의 측정

a. 최소 컷오프 값은 최소 관측 시험 값 -1이고, 최고 컷오프 값은 최대 관측 시험 값 +1이다. 모든 다른 컷오프 값들은 2 개의 연속적으로 정렬된 관측 시험 값들의 평균이다)

실시예 7: 전립선 악성 및 양성 조직에서 다시 원형으로 된 3.4 kb 결실된 서열의 검출

본 실시예에서, 샘플 중의 다시 원형으로 된 3.4 kb 결실된 mtDNA 분자의 양을 전립선암의 지표로서 시험하였다. 상기 언급한 바와 같이, 결실 시 상기 3.4 kb 서열은 원형 mtDNA 분자를 다시 형성할 수 있다. 상기 결실된 3.4 kb mtDNA 서브리몬으로부터 표적 부위의 증폭을 프라이머 쌍(서열식별번호: 9 및 10)을 사용하여 수행하였다. 순방향 프라이머(서열식별번호: 9)는 상기 3.4 kb 서열 단부들의 재결합 부위와 겹쳐진다.

전립선 조직은 포르말린-고정된 파라핀 매몰된 전립선 조직 침 생검물이었다.

본 실시예에 사용된 시약 구성은 하기와 같았다:

25 ul 반응 부피 중의

250 nmol의 각각의 프라이머

12.5 ul의 2X 반응 혼합물

20 ng(10 ul의 2ng/ul)의 주형

주기 매개변수는 하기와 같았다:

1. 3 분간 95 ℃

2. 30 초간 95 ℃

3. 30 초간 62 ℃

4. 30 초간 72 ℃

5. 플레이트 판독

6. 단계 2 내지 5 44 회 반복

7. 10 분간 72 ℃

9. 4 ℃ 유지

상기 결실된 3.4 kb mtDNA 서브리몬으로부터 표적 부위의 증폭을 프라이머 쌍(서열식별번호: 9 및 10)을 사용하여 수행하였다.

하기 표 16은 악성 및 양성 전립선 조직으로부터 획득한 mtDNA에서 실제 결실된 3.4 kb의 검출을 위해 수행된 시험의 요약을 제공한다. 30.0의 C_T 점수를 사용하여, 악성 및 양성 조직의 명백한 확인이 가능하였다. 그 자체로서, 샘플 중에 존재하는 3.4 kb 분자의 양의 증가는 암을 가리켰다.

전립선 조직에서 암 검출을 위한 C _T 점수
설명	C_T
양성 샘플 1	33.75
악성 샘플 1	28.79
양성 샘플 2	30.96
악성 샘플 2	28.4
양성 샘플 3	32.19
악성 샘플 3	27.38

본 발명을 몇몇 특정 실시태양을 참고로 개시하였지만, 본 발명의 다양한 변경들은 첨부된 특허청구범위에 개략된 바와 같은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.

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tggctttctc aacttttaaa ggataacagc tatccattgg tcttaggccc 1560 caaaaatttt ggtgcaactc caaataaaag taataaccat gcacactact ataaccaccc 1620 taaccctgac ttccctaatt ccccccatcc ttaccaccct cgttaaccct aacaaaaaaa 1680 actcataccc ccattatgta aaatccattg tcgcatccac ctttattatc agtctcttcc 1740 ccacaacaat attcatgtgc ctagaccaag aagttattat ctcgaactga cactgagcca 1800 caacccaaac aacccagctc tccctaagct tcaaactaga ctacttctcc ataatattca 1860 tccctgtagc attgttcgtt acatggtcca tcatagaatt ctcactgtga tatataaact 1920 cagacccaaa cattaatcag ttcttcaaat atctactcat cttcctaatt accatactaa 1980 tcttagttac cgctaacaac ctattccaac tgttcatcgg ctgagagggc gtaggaatta 2040 tatccttctt gctcatcagt tgatgatacg cccgagcaga tgccaacaca gcagccattc 2100 aagcaatcct atacaaccgt atcggcgata tcggtttcat cctcgcctta gcatgattta 2160 tcctacactc caactcatga gacccacaac aaatagccct tctaaacgct aatccaagcc 2220 tcaccccact actaggcctc ctcctagcag cagcaggcaa atcagcccaa ttaggtctcc 2280 acccctgact cccctcagcc atagaaggcc ccaccccagt ctcagcccta ctccactcaa 2340 gcactatagt 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1560 cgtaacatgg taagtgtact ggaaagtgca cttggacgaa ccagagtgta gcttaacaca 1620 aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta 1680 gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa 1740 agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg 1800 aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa 1860 ttaactagaa ataactttgc aaggagagcc aaagctaaga cccccgaaac cagacgagct 1920 acctaagaac agctaaaaga gcacacccgt ctatgtagca aaatagtggg aagatttata 1980 ggtagaggcg acaaacctac cgagcctggt gatagctggt tgtccaagat agaatcttag 2040 ttcaacttta aatttgccca cagaaccctc taaatcccct tgtaaattta actgttagtc 2100 caaagaggaa cagctctttg gacactagga aaaaaccttg tagagagagt aaaaaattta 2160 acacccatag taggcctaaa agcagccacc aattaagaaa gcgttcaagc tcaacaccca 2220 ctacctaaaa aatcccaaac atataactga actcctcaca cccaattgga ccaatctatc 2280 accctataga agaactaatg ttagtataag taacatgaaa acattctcct ccgcataagc 2340 ctgcgtcaga ttaaaacact gaactgacaa ttaacagccc aatatctaca atcaaccaac 2400 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ctagacaaaa aaggaaggaa tcgaaccccc caaagctggt ttcaagccaa ccccatggcc 7500 tccatgactt tttcaaaaag gtattagaaa aaccatttca taactttgtc aaagttaaat 7560 tataggctaa atcctatata tcttaatggc acatgcagcg caagtaggtc tacaagacgc 7620 tacttcccct atcatagaag agcttatcac ctttcatgat cacgccctca taatcatttt 7680 ccttatctgc ttcctagtcc tgtatgccct tttcctaaca ctcacaacaa aactaactaa 7740 tactaacatc tcagacgctc aggaaataga aaccgtctga actatcctgc ccgccatcat 7800 cctagtcctc atcgccctcc catccctacg catcctttac ataacagacg aggtcaacga 7860 tccctccctt accatcaaat caattggcca ccaatggtac tgaacctacg agtacaccga 7920 ctacggcgga ctaatcttca actcctacat acttccccca ttattcctag aaccaggcga 7980 cctgcgactc cttgacgttg acaatcgagt agtactcccg attgaagccc ccattcgtat 8040 aataattaca tcacaagacg tcttgcactc atgagctgtc cccacattag gcttaaaaac 8100 agatgcaatt cccggacgtc taaaccaaac cactttcacc gctacacgac cgggggtata 8160 ctacggtcaa tgctctgaaa tctgtggagc aaaccacagt ttcatgccca tcgtcctaga 8220 attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta 8280 ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag 8340 agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat 8400 aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa 8460 ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga 8520 accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc 8580 gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 8640 aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga ctaatcaaac taacctcaaa acaaatgata 8700 accatacaca acactaaagg acgaacctga tctcttatac tagtatcctt aatcattttt 8760 attgccacaa ctaacctcct cggactcctg cctcactcat ttacaccaac cacccaacta 8820 tctataaacc tagccatggc catcccctta tgagcgggca cagtgattat aggctttcgc 8880 tctaagatta aaaatgccct agcccacttc ttaccacaag gcacacctac accccttatc 8940 cccatactag ttattatcga aaccatcagc ctactcattc aaccaatagc cctggccgta 9000 cgcctaaccg ctaacattac tgcaggccac ctactcatgc acctaattgg aagcgccacc 9060 ctagcaatat caaccattaa ccttccctct acacttatca tcttcacaat tctaattcta 9120 ctgactatcc tagaaatcgc tgtcgcctta atccaagcct acgttttcac acttctagta 9180 agcctctacc tgcacgacaa cacataatga cccaccaatc acatgcctat catatagtaa 9240 aacccagccc atgaccccta acaggggccc tctcagccct cctaatgacc tccggcctag 9300 ccatgtgatt tcacttccac tccataacgc tcctcatact aggcctacta accaacacac 9360 taaccatata ccaatgatgg cgcgatgtaa cacgagaaag cacataccaa ggccaccaca 9420 caccacctgt ccaaaaaggc cttcgatacg ggataatcct atttattacc tcagaagttt 9480 ttttcttcgc aggatttttc tgagcctttt accactccag cctagcccct accccccaat 9540 taggagggca ctggccccca acaggcatca ccccgctaaa tcccctagaa gtcccactcc 9600 taaacacatc cgtattactc gcatcaggag tatcaatcac ctgagctcac catagtctaa 9660 tagaaaacaa ccgaaaccaa ataattcaag cactgcttat tacaatttta ctgggtctct 9720 attttaccct cctacaagcc tcagagtact tcgagtctcc cttcaccatt tccgacggca 9780 tctacggctc aacatttttt gtagccacag gcttccacgg acttcacgtc attattggct 9840 caactttcct cactatctgc ttcatccgcc aactaatatt tcactttaca tccaaacatc 9900 actttggctt cgaagccgcc gcctgatact ggcattttgt agatgtggtt tgactatttc 9960 tgtatgtctc catctattga tgagggtctt actcttttag tataaatagt accgttaact 10020 tccaattaac tagttttgac aacattcaaa aaagagtaat aaacttcgcc ttaattttaa 10080 taatcaacac cctcctagcc ttactactaa taattattac attttgacta ccacaactca 10140 acggctacat agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc 10200 gcgtcccttt ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag 10260 aaattgccct ccttttaccc ctaccatgag ccctacaaac aactaacctg ccactaatag 10320 ttatgtcatc cctcttatta atcatcatcc tagccctaag tctggcctat gagtgactac 10380 aaaaaggatt agactgaacc gaattggtat atagtttaaa caaaacgaat gatttcgact 10440 cattaaatta tgataatcat atttaccaaa tgcccctcat ttacataaat attatactag 10500 catttaccat ctcacttcta ggaatactag tatatcgctc acacctcata tcctccctac 10560 tatgcctaga aggaataata ctatcgctgt tcattatagc tactctcata accctcaaca 10620 cccactccct cttagccaat attgtgccta ttgccatact agtctttgcc gcctgcgaag 10680 cagcggtggg cctagcccta ctagtctcaa tctccaacac atatggccta gactacgtac 10740 ataacctaaa cctactccaa tgctaaaact aatcgtccca acaattatat tactaccact 10800 gacatgactt tccaaaaaac acataatttg aatcaacaca accacccaca gcctaattat 10860 tagcatcatc cctctactat tttttaacca aatcaacaac aacctattta gctgttcccc 10920 aaccttttcc tccgaccccc taacaacccc cctcctaata ctaactacct gactcctacc 10980 cctcacaatc atggcaagcc aacgccactt atccagtgaa ccactatcac gaaaaaaact 11040 ctacctctct atactaatct ccctacaaat ctccttaatt ataacattca cagccacaga 11100 actaatcata ttttatatct tcttcgaaac cacacttatc cccaccttgg ctatcatcac 11160 ccgatgaggc aaccagccag aacgcctgaa cgcaggcaca tacttcctat tctacaccct 11220 agtaggctcc cttcccctac tcatcgcact aatttacact cacaacaccc taggctcact 11280 aaacattcta ctactcactc tcactgccca agaactatca aactcctgag ccaacaactt 11340 aatatgacta gcttacacaa tagcttttat agtaaagata cctctttacg gactccactt 11400 atgactccct aaagcccatg tcgaagcccc catcgctggg tcaatagtac ttgccgcagt 11460 actcttaaaa ctaggcggct atggtataat acgcctcaca ctcattctca accccctgac 11520 aaaacacata gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc 11580 catctgccta cgacaaacag acctaaaatc gctcattgca tactcttcaa tcagccacat 11640 agccctcgta gtaacagcca ttctcatcca aaccccctga agcttcaccg gcgcagtcat 11700 tctcataatc gcccacgggc ttacatcctc attactattc tgcctagcaa actcaaacta 11760 cgaacgcact cacagtcgca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact 11820 aatagctttt tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa 11880 cctactggga gaactctctg tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct 11940 acttacagga ctcaacatac tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac 12000 acaatggggc tcactcaccc accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa 12060 caccctcatg ttcatacacc tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat 12120 taccgggttt tcctcttgta aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa 12180 cagaggctta cgacccctta tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc 12240 catgtctaac aacatggctt tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag 12300 gccccaaaaa ttttggtgca actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc 12360 accctaaccc tgacttccct aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa 12420 aaaaactcat acccccatta tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc 12480 ttccccacaa caatattcat gtgcctagac caagaagtta ttatctcgaa ctgacactga 12540 gccacaaccc aaacaaccca gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata 12600 ttcatccctg tagcattgtt cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata 12660 aactcagacc caaacattaa tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata 12720 ctaatcttag ttaccgctaa caacctattc caactgttca tcggctgaga gggcgtagga 12780 attatatcct tcttgctcat cagttgatga tacgcccgag cagatgccaa cacagcagcc 12840 attcaagcaa tcctatacaa ccgtatcggc gatatcggtt tcatcctcgc cttagcatga 12900 tttatcctac actccaactc atgagaccca caacaaatag cccttctaaa cgctaatcca 12960 agcctcaccc cactactagg cctcctccta gcagcagcag gcaaatcagc ccaattaggt 13020 ctccacccct gactcccctc agccatagaa ggccccaccc cagtctcagc cctactccac 13080 tcaagcacta tagttgtagc aggaatcttc ttactcatcc gcttccaccc cctagcagaa 13140 aatagcccac taatccaaac tctaacacta tgcttaggcg ctatcaccac tctgttcgca 13200 gcagtctgcg cccttacaca aaatgacatc aaaaaaatcg tagccttctc cacttcaagt 13260 caactaggac tcataatagt tacaatcggc atcaaccaac cacacctagc attcctgcac 13320 atctgtaccc acgccttctt caaagccata ctatttatgt gctccgggtc catcatccac 13380 aaccttaaca atgaacaaga tattcgaaaa ataggaggac tactcaaaac catacctctc 13440 acttcaacct ccctcaccat tggcagccta gcattagcag gaataccttt cctcacaggt 13500 ttctactcca aagaccacat catcgaaacc gcaaacatat catacacaaa cgcctgagcc 13560 ctatctatta ctctcatcgc tacctccctg acaagcgcct atagcactcg aataattctt 13620 ctcaccctaa caggtcaacc tcgcttcccc acccttacta acattaacga aaataacccc 13680 accctactaa accccattaa acgcctggca gccggaagcc tattcgcagg atttctcatt 13740 actaacaaca tttcccccgc atcccccttc caaacaacaa tccccctcta cctaaaactc 13800 acagccctcg ctgtcacttt cctaggactt ctaacagccc tagacctcaa ctacctaacc 13860 aacaaactta aaataaaatc cccactatgc acattttatt tctccaacat actcggattc 13920 taccctagca tcacacaccg cacaatcccc tatctaggcc ttcttacgag ccaaaacctg 13980 cccctactcc tcctagacct aacctgacta gaaaagctat tacctaaaac aatttcacag 14040 caccaaatct ccacctccat catcacctca acccaaaaag gcataattaa actttacttc 14100 ctctctttct tcttcccact catcctaacc ctactcctaa tcacataacc tattcccccg 14160 agcaatctca attacaatat atacaccaac aaacaatgtt caaccagtaa ctactactaa 14220 tcaacgccca taatcataca aagcccccgc accaatagga tcctcccgaa tcaaccctga 14280 cccctctcct tcataaatta ttcagcttcc tacactatta aagtttacca caaccaccac 14340 cccatcatac tctttcaccc acagcaccaa tcctacctcc atcgctaacc ccactaaaac 14400 actcaccaag acctcaaccc ctgaccccca tgcctcagga tactcctcaa tagccatcgc 14460 tgtagtatat ccaaagacaa ccatcattcc ccctaaataa attaaaaaaa ctattaaacc 14520 catataacct cccccaaaat tcagaataat aacacacccg accacaccgc taacaatcaa 14580 tactaaaccc ccataaatag gagaaggctt agaagaaaac cccacaaacc ccattactaa 14640 acccacactc aacagaaaca aagcatacat cattattctc gcacggacta caaccacgac 14700 caatgatatg aaaaaccatc gttgtatttc aactacaaga acaccaatga ccccaatacg 14760 caaaactaac cccctaataa aattaattaa ccactcattc atcgacctcc ccaccccatc 14820 caacatctcc gcatgatgaa acttcggctc actccttggc gcctgcctga tcctccaaat 14880 caccacagga ctattcctag ccatgcacta ctcaccagac gcctcaaccg ccttttcatc 14940 aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa 15000 tggcgcctca atattcttta tctgcctctt cctacacatc gggcgaggcc tatattacgg 15060 atcatttctc tactcagaaa cctgaaacat cggcattatc ctcctgcttg caactatagc 15120 aacagccttc ataggctatg tcctcccgtg aggccaaata tcattctgag gggccacagt 15180 aattacaaac ttactatccg ccatcccata cattgggaca gacctagttc aatgaatctg 15240 aggaggctac tcagtagaca gtcccaccct cacacgattc tttacctttc acttcatctt 15300 gcccttcatt attgcagccc tagcaacact ccacctccta ttcttgcacg aaacgggatc 15360 aaacaacccc ctaggaatca cctcccattc cgataaaatc accttccacc cttactacac 15420 aatcaaagac gccctcggct tacttctctt ccttctctcc ttaatgacat taacactatt 15480 ctcaccagac ctcctaggcg acccagacaa ttatacccta gccaacccct taaacacccc 15540 tccccacatc aagcccgaat gatatttcct attcgcctac acaattctcc gatccgtccc 15600 taacaaacta ggaggcgtcc ttgccctatt actatccatc ctcatcctag caataatccc 15660 catcctccat atatccaaac aacaaagcat aatatttcgc ccactaagcc aatcacttta 15720 ttgactccta gccgcagacc tcctcattct aacctgaatc ggaggacaac cagtaagcta 15780 cccttttacc atcattggac aagtagcatc cgtactatac ttcacaacaa tcctaatcct 15840 aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat 15900 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15960 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16020 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16080 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat 16140 acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16200 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16260 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16320 catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16380 tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16440 actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16500 ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac 16560 atcacgatg 16569 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Forward primer for detection of 3.4 kb mtDNA deleted sequence <400> 9 cccactcatc acctaaacct ac 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Reverse primer for 3.4 kb deleted sequence. <400> 10 ggtaggagtc aggtagttag 20

Claims

생물학적 샘플의 mtDNA(미토콘드리아 DNA)의 표적 부위 증폭용 프라이머 쌍을 포함하는 전립선암 또는 유방암 진단용 키트로서, 상기 mtDNA는 mtDNA 게놈의 잔기 10744 내지 14124 사이에 걸쳐 있는 서열 중 결실이 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 결실의 크기는 3379 bp인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 중 하나는 서열식별번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 중 하나는 서열식별번호 3의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 생물학적 샘플 수득 수단, mtDNA의 추출 수단, 시약 및 설명서로 구성된 군으로 부터 선택되는 1 종 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
생물학적 샘플의 mtDNA(미토콘드리아 DNA)의 결실 부위 증폭용 PCR 프라이머 쌍을 포함하는 전립선암 또는 유방암 진단용 키트로서, 상기 결실 부위는 mtDNA 게놈의 잔기 10744 내지 14124 사이에 걸쳐 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 결실 부위의 크기는 3379 bp인 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 결실 부위는 서열식별번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 중 하나는 서열식별번호 9의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 9 항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 중 하나는 서열식별번호 10의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 생물학적 샘플 수득 수단, mtDNA의 추출 수단, 시약 및 설명서로 구성된 군으로 부터 선택되는 1 종 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
하기의 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 키트를 이용하여 전립선암 또는 유방암의 존재 여부를 시험하는 방법:
a) 생물학적 샘플의 mtDNA 게놈의 잔기 10744 내지 14124 사이에 걸쳐 있는 서열 중 결실이 있는 mtDNA(미토콘드리아 DNA)의 양을 정량화하는 단계; 및
b) 상기 샘플 중 mtDNA 양을 하나 이상의 공지된 기준 값과 비교하는 단계.
제 12 항에 있어서, 상기 기준 값은 공지된 비-암성 조직 또는 체액으로부터의 기준 샘플에서의 결실양이고, 상기 기준 값과 비교하여 생물학적 샘플 중 결실의 상승된 양은 전립선암 또는 유방암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 기준 값은 공지된 전립선암성 또는 유방암성 조직 또는 체액으로부터의 기준 샘플에서의 결실양이고, 상기 기준 값과 비교하여 생물학적 샘플 중 결실의 동등한 양은 전립선암 또는 유방암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 결실은 서열식별번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 정량화는 상기 mtDNA의 표적 부위를 증폭시키고 상기 증폭된 표적 부위의 양을 정량화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 증폭은 한 쌍의 증폭 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 증폭 프라이머 쌍 중 하나가 상기 결실의 연접 부위와 겹쳐지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열식별번호 2의 서열을 포함하며, 표적 부위의 증폭을 위한 증폭 프라이머 쌍 중 하나로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열식별번호 3의 서열을 포함하며, 표적 부위의 증폭을 위한 증폭 프라이머 쌍 중 하나로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 체조직 또는 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 체조직은 전립선 또는 유방 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 정량화는 실시간 PCR을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기의 단계를 포함하는, 제 6 항에 따른 키트를 이용하여 전립선암 또는 유방암의 존재 여부를 시험하는 방법:
a) 생물학적 샘플의 mtDNA 게놈의 잔기 10744 내지 14124 사이에 걸쳐 있는 서열 중 결실이 있는 mtDNA(미토콘드리아 DNA)의 결실 부위의 양을 정량화하는 단계; 및
b) 상기 샘플 중 결실 부위의 양을 하나 이상의 공지된 기준 값과 비교하는 단계.
제 23 항에 있어서, 상기 결실 부위는 서열식별번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 정량화는 상기 결실 부위의 표적 서열을 증폭시키고 상기 증폭된 표적 서열의 양을 정량화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 증폭은 한 쌍의 증폭 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 증폭 프라이머 쌍 중 하나가 상기 결실 단부와 겹쳐지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열식별번호 9의 서열을 포함하며, 상기 결실 부위의 표적 서열의 증폭을 위한 증폭 프라이머 쌍 중 하나로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열식별번호 10의 서열을 포함하며, 상기 결실 부위의 표적 서열의 증폭을 위한 증폭 프라이머 쌍 중 하나로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 기준 값은 공지된 비-암성 조직 또는 체액으로부터의 기준 샘플에서의 표적 서열의 양이고, 상기 기준 값과 비교하여 생물학적 샘플 중 표적 서열의 상승된 양은 전립선암 또는 유방암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 기준 값은 공지된 전립선암성 또는 유방암성 조직 또는 체액으로부터의 기준 샘플에서의 표적 서열의 양이고, 상기 기준 값과 비교하여 생물학적 샘플 중 표적 서열의 동등한 양은 전립선암 또는 유방암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 체조직 또는 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 상기 체조직은 전립선 또는 유방 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 정량화는 실시간 PCR을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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