CN115772567A - 用于辅助检测肺癌体细胞tp53基因突变的甲基化位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的甲基化位点及其应用，包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、chr20:34042058等在内的共110种DNA甲基化位点，并首次将其应用于肺癌体细胞突变辅助检测中，发现其能辅助检测肺癌体细胞样本中TP53基因突变，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。并且，基于对样本体细胞中这些DNA甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的甲基 化位点及其应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年 来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶 性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。目前肺癌特别是非小细胞肺癌已 证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关。
TP53基因是一种重要的抑癌基因。在人类50％的肿瘤中都发现TP53基因有缺失或突变， 其与肿瘤的发生发展密切相关。TP53基因突变是包括肺癌在内的，许多肿瘤发生的重要原因 之一。基因突变主要包括点突变和等位基因的缺失。椐报道，在大约200多种不同的肿瘤中， 有50％的肿瘤带有TP53基因突变。已发现TP53基因中有4个位于外显子5-8的突变热点， 虽然不同组织器官发生的肿瘤中，TP53基因突变谱显示有差异，但约有90％的突变是集中 在这部分区域。他们分别编码132-143、174-179、236-248和272-281号氨基酸[Rodin SN,and RodinASJPotNAoS.Human lung cancer andp53:the interplay betweenmutagenesis and selection. 2000；97(22):12244-9.]。
目前常规检测TP53基因突变的手段主要是WGS、WES、gene panel、RNA-seq等，通过寻找甲基化生物标记物来预测基因突变，并且通过多个DNA甲基化的甲基化状态可以克服单个DNA甲基化信号低的问题，可以提高检测的灵敏度和特异性。
其中，使用NGS检测癌症的体细胞突变通常涉及到对肿瘤DNA和来自同一患者的非恶 性(或正常)组织(通常是血液)的DNA进行测序。因此，以癌症为焦点的NGS实验在实验设计 上与孟德尔紊乱或正常人类变异的研究有很大不同。在癌症研究中需要从两个匹配样本中读 取的序列与一个参考人类基因组对齐，在测序过程中和对齐过程中很可能产生不可预知的错 误，同时一些基因中的突变也并不是影响某一癌症的决定性因素。Samtools，SOAPsnp，VarScan， SNVMix，GATK，VipR等这些工具在肿瘤和正常数据中进行比较，找出那些出现在肿瘤中 的变异，哪些不是正常的样本将被认为是体细胞突变，并为研究者提供一个候选名单，以跟 踪功能影响和临床相关性。但是，这些简单的比对方法的准确度不高。因此从肿瘤基因数据 中识别该种疾病的体细胞突变仍然是一个亟待解决的技术难题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提出一种用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的甲基 化位点或其组合。
具体技术方案如下:
用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的甲基化位点或其组合，包括chr5:5066252、 chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、chr20:34042058中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、chr20:34042058。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、 chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、、chr21:36421468、 chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、 chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、 chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、 chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、 chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、 chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、 chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、 chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、 chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、 chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、 chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、 chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、 chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、 chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344 中的任意至少5种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、 chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、 chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、 chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、 chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、 chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、 chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、 chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、 chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、 chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、 chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、 chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、 chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、 chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、 chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、 chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344 中的任意至少15种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、 chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、 chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、 chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、 chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、 chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、 chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、 chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、 chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、 chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、 chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、 chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、 chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、 chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、 chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344 中的任意至少45种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、 chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、 chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、 chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、 chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、 chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、 chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、 chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、 chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、 chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、 chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、 chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、 chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、 chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、 chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、 chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344 中的任意至少95种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、 chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、、chr21:36421468、 chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、 chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、 chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、 chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、 chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、 chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、 chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、 chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、 chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、 chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、 chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、 chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、 chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、 chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121和chr5:2132344。
本发明的目的之一还在于提供一种上述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、 分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞TP53基因突变的试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种肺癌体细胞TP53基因突变检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下:
一种肺癌体细胞TP53基因突变检测试剂盒，其包括检测上述甲基化位点或其组合的甲 基化差异程度的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突 变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组 合制备而成。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化 特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
本发明的目的之一还在于提供上述检测试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或 其它评价肺癌体细胞TP53基因突变中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的方法。
实现上述目的的技术方案如下:
一种辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的方法，其包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
在其中一些实施例中，上述方法包括但不限于以下技术:甲基化特异性PCR，亚硫酸盐 PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全 基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测 平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、 骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明的发明人发现包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、 chr20:34042058等在内的共110种DNA甲基化位点，并首次将其应用于肺癌体细胞突变辅助 检测中，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立预测模型， 发现其能辅助检测肺癌体细胞样本中TP53基因是否发生有害突变，同时还能克服单个DNA 甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。并且，基于对样本体细胞中这些DNA 甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化， 从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。
附图说明
图1为实施例1中110个marker在40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的heatmap图。
图2为实施例1中117个marker在40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图。
图3为实施例2中不同marker数量下的40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图；其中，A为marker数量为5的40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图、B 为marker数量为1的40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图、C为marker数量 为20的40个TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图、D为marker数量为50的40个 TP53_mut与38个TP53_wt样本中的ROC图、E为marker数量为100的40个TP53_mut与 38个TP53_wt样本中的ROC图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分 子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按 照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目 的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意 的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形 式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公 开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明所涉及的甲基化位点详细信息具体如下表1所示：
表1
其中intronic为内含子、intergenic为基因间序列、exonic为外显子、upstream为上游片 段、downstream为下游片段。
实施例1
本实施例公开了本发明中110种甲基化位点用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的检 测方法，具体包括如下步骤:
一、样本信息
1、肺癌患者组织FFPE取自广州广州医科大学附属第一医院。该项目获得了广州医科大 学附属第一医院大学医学伦理学委员会的批准。在每一个病例中都征求患者知情同意。术后 从每位患者采集2-5个FFPE载玻片样本，相关病人个人病理信息来自医院的官方病理报告。
2、78例肺癌样本包含35例女性，43例男性；年龄介于33-81之间，平均年龄53.3；57例IA(浸润性腺癌)，2例LC(大细胞癌)，19例MIA(微浸润性腺癌)；按照病理分期分别为60例Ia，15例Ib，1例IIa，2例IIIa(其中Ia、Ib指癌症I期：局域性癌症，癌组织局限于最 初形成的地方，没有任何扩散现象；IIa期指癌症II期：区域性癌症：癌细胞已扩散到附近的 淋巴结、组织或器官；IIIa期指癌症III期：远位癌症：癌症已经扩散到身体的各个部分。) 60例Ia，15例Ib，1例IIa，2例IIIa；78例FFPE组织样品由均进行了全外显子和RNA-seq 测序，并进行了变异分析，得到了SNVs，Indels等信息，按照TP53基因突变型样本与TP53 野生型样本分组，分别为40个TP53_mut与38个TP53_wt样本。
二、建库流程和方法
1、组织DNA提取及甲基化建库
1.1、组织DNA的提取。
上述组织样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说 明进行；
1.2、转化
将提取的组织DNA(50ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨 基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操 作按照Zymo Research的EZ DNAMethylation-Lightning Kit说明书进行。
1.3、末端修复
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 热盖 | 105℃ |
当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
1.4连接I
配制如下反应液：
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 20 |
| H<sub>2</sub>O | 4 |
| MLB1缓冲液 | 8 |
| MLR1试剂 | 2 |
| MLR5试剂 | 2 |
| MLE1酶 | 2 |
| MLE5酶 | 2 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 10℃ | hold |
| 热盖 | 105℃ |
1.5扩增I
配制如下反应液
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 40 |
| H2O | 35 |
| MAB2缓冲液 | 20 |
| MAR1试剂 | 2 |
| MAR2试剂 | 2 |
| MAE3酶 | 1 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6纯化I：
加入166ul 1:6倍稀释的AgencourtAMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对扩增 I反应后的产物进行纯化，用21μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加 入200μl 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新 的PCR管中。
1.7连接II
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 20 |
| H2O | 4 |
| MSB1缓冲液 | 8 |
| MSR1试剂 | 2 |
| MSR5试剂 | 2 |
| MSE1酶 | 2 |
| MSE5酶 | 2 |
| 总体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8Indexing PCR(扩增产物文库构建):
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 40 |
| H2O | 6 |
| 2XKAPAHiFiHotStartReadyMix | 8 |
| I5接头引物 | 2 |
| I7接头引物 | 2 |
| 总体积 | 100 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9纯化II
加入AgencourtAM Pure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产 物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的AgencourtAM PureBeads， 用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩 余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打 混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNAHS Assay Kit对文库进行定量。
2、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂 交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
3、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4、下机数据的分析:
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC 低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T， 得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后， 根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bam file)，对 bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5、对原始测序数据进行了相关清理及处理分析[Liang,W.,et al.,Non-invasivediagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNAmethylation sequencing ofcirculating tumor DNA(ctDNA).2019.9(7):p.2056.]，并基于对reads读数来确定每一个位点甲基化胞嘧 啶的百分比(β值)。
6、针对这38个TP53_wt和40个TP53_mut样本(40个样本共包含5个frameshiftdeletion， 1个frameshift insertion，28个nonsynonymous SNV，6个stopgain，1个stoploss)的甲基化 检测信息，用表1中的110个marker进行分析，heatmap图如图1，将这78个样本按照7:3 的比例切分50次，利用随机森林(Random Forest)建模，每一次切分里利用随机森林(Random Forest)在train集合里面建模，用该模型在test集合里面计算每个样本的风险得分，风险得 分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC、NPV以及PPV等， 50次建模AUC图如图2所示，平均auc为0.858，90％特异度下的灵敏度为61.8％。说明采 用110个marker的模式组合对于肺癌体细胞TP53基因突变样本诊断的整体灵敏度高，ROC 曲线稳定性较好。计算50次建模每个marker的平均probablity，按照probablity从大到小排 序，取top 5marker，每个marker的预测性能AUC如下表2所示。从每个marker的AUC 以及每一次切分的AUC可以看出，在38个TP53_wt和40个TP53_mut中，这些marker或 者marker组合在这两类样本中均存在差异，可以作为辅助诊断的标记物。
表2
| Marker | AUC |
| chr5:8686178 | 0.869 |
| chr20:34042058 | 0.833 |
| chr8:143626019 | 0.884 |
| chr5:5066252 | 0.889 |
| chr14:22917809 | 0.798 |
实施例2
针对实施例1中相同的样本，分别用5marker，10marker，20marker，50marker，100marker 的组合，用实施例1相同的50次切分，利用随机森林(Random Forest)建模，其中5marker 为chr5:8686178、chr20:34042058、chr8:143626019、chr5:5066252、chr14:22917809。
10marker为在chr5:8686178、chr20:34042058、chr8:143626019、chr5:5066252、chr14:22917809的基础上随机增加5个marker，例如具体为：chr5:8686178、chr20:34042058、 chr5:5066252、chr8:143626019、chr1:1267611、chr14:22917809、chr5:8586367、chr1:176998907、 chr1:1267629、chr5:8686081。
20marker为在chr5:8686178、chr20:34042058、chr8:143626019、chr5:5066252、chr14:22917809的基础上随机增加15个marker，例如具体为：chr5:8686178、chr20:34042058、 chr5:5066252、chr8:143626019、chr1:1267611、chr14:22917809、chr5:8586367、chr1:176998907、 chr1:1267629、chr5:8686081、chr1:7029193、chr14:22917797、chr7:41869835、chr1:176998778、 chr5:40053226、chr2:19674070、chr5:2132344、chr3:27064121、chr6:6588693、chr8:104196991。
50marker为在chr5:8686178、chr20:34042058、chr8:143626019、chr5:5066252、chr14:22917809的基础上随机增加45个marker，例如具体为：chr5:8686178、chr20:34042058、chr5:5066252、chr8:143626019、chr1:1267611、chr14:22917809、chr5:8586367、chr1:176998907、 chr1:1267629、chr5:8686081、chr1:7029193、chr14:22917797、chr7:41869835、chr1:176998778、 chr5:40053226、chr2:19674070、chr5:2132344、chr3:27064121、chr6:6588693、chr8:104196991、 chr5:2295952、chr21:36421964、chr5:172128838、chr5:2132336、chr5:15966372、chr8:143645016、 chr8:142549037、chr3:9821914、chr2:19674209、chr1:30122870、chr1:158564817、chr1:1267604、 chr1:1267643、chr5:43873015、chr7:62504155、chr12:55378423、chr21:36421503、chr1:1267651、 chr5:169760270、chr5:2176146、chr1:1267656、chr1:175332855、chr5:2101032、chr21:36421468、 chr1:1267664、chr16:1738303、chr1:247614605、chr1:30122871、chr5:8586401、chr2:19674105。
100marker为在chr5:8686178、chr20:34042058、chr8:143626019、chr5:5066252、chr14:22917809的基础上随机增加95个marker，例如具体为：chr5:8686178、chr20:34042058、 chr5:5066252、chr8:143626019、chr1:1267611、chr14:22917809、chr5:8586367、chr1:176998907、 chr1:1267629、chr5:8686081、chr1:7029193、chr14:22917797、chr7:41869835、chr1:176998778、 chr5:40053226、chr2:19674070、chr5:2132344、chr3:27064121、chr6:6588693、chr8:104196991、 chr5:2295952、chr21:36421964、chr5:172128838、chr5:2132336、chr5:15966372、chr8:143645016、 chr8:142549037、chr3:9821914、chr2:19674209、chr1:30122870、chr1:158564817、chr1:1267604、 chr1:1267643、chr5:43873015、chr7:62504155、chr12:55378423、chr21:36421503、chr1:1267651、 chr5:169760270、chr5:2176146、chr1:1267656、chr1:175332855、chr5:2101032、chr21:36421468、 chr1:1267664、chr16:1738303、chr1:247614605、chr1:30122871、chr5:8586401、chr2:19674105、 chr17:72755638、chr1:1267625、chr16:1738319、chr21:36421434、chr12:109028385、 chr17:79495621、chr21:36421473、chr1:1267554、chr11:1874291、chr5:2176143、chr1:1267560、 chr17:72755647、chr5:169760343、chr21:36421436、chr5:1003962、chr5:41263090、 chr21:36421504、chr7:37392950、chr1:175332867、chr2:27637379、chr5:1003951、chr21:36421437、 chr1:1267666、chr12:109028343、chr16:1738288、chr16:1738335、chr8:143626028、 chr21:36421472、chr3:61951918、chr21:36421467、chr1:1268893、chr5:491828、chr8:143645073、 chr8:143625873、chr5:2176137、chr1:1267623、chr8:33432378、chr1:1267609、chr8:124195251、 chr8:143625866、chr5:1003939、chr1:1268042、chr8:143626001、chr1:247690121、 chr15:102193535、chr8:124195291、chr1:1267602、chr8:143645076、chr15:40600679、 chr17:38445172。
在上述这些marker数目下面，建模的平均auc和敏感性，特异性如下表3所示，不同marker组合下的ROC图如下图3所示。从每种组合的AUC可以看出，在38个TP53_wt和 40个TP53_mut中，这些marker组合在这两类样本中均存在差异，再次说明这些marker的 随机组合可以作为辅助诊断的标记物；
表3
| Marker数目 | Meanauc | Meanse | Meansp | Meanacc | meanppv | Meannpv |
| 5 | 0.834 | 0.46 | 0.85 | 0.83 | 0.84 | 0.85 |
| 10 | 0.846 | 0.44 | 0.86 | 0.83 | 0.85 | 0.86 |
| 20 | 0.852 | 0.44 | 0.89 | 0.83 | 0.86 | 0.86 |
| 50 | 0.853 | 0.46 | 0.88 | 0.83 | 0.86 | 0.86 |
| 100 | 0.858 | 0.45 | 0.90 | 0.83 | 0.86 | 0.86 |
其中auc为ROC曲线下面积、se为敏感性、sp为特异性、acc为准确率、ppv为阳性预测值、npv为阴性预测值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (15)
1.用于辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的甲基化位点或其组合，其特征在于，所述甲基化位点或其组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、chr20:34042058中的任意至少一种。
2.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809、chr20:34042058。
3.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、、chr21:36421468、chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344中的任意至少5种。
4.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344中的任意至少15种。
5.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344中的任意至少45种。
6.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、chr21:36421468、chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121、chr5:2132344中的任意至少95种。
7.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr5:5066252、chr8:143626019、chr5:8686178、chr14:22917809和chr20:34042058，以及选自chr5:491828、chr5:2176137、chr21:36421434、chr15:102193535、chr5:1003939、chr5:2176143、chr21:36421436、chr8:104196991、chr5:1003951、chr5:2176146、chr21:36421437、chr12:109028343、chr5:1003962、chr5:2295952、chr21:36421467、chr12:109028385、chr1:1267554、、chr21:36421468、chr8:124195251、chr1:1267560、chr7:6525094、chr21:36421472、chr8:124195271、chr1:1267602、chr7:6525095、chr21:36421473、chr8:124195291、chr1:1267604、chr7:6525101、chr21:36421503、chr8:142549037、chr1:1267609、chr7:6525116、chr21:36421504、chr8:143625866、chr1:1267611、chr6:6588693、chr21:36421964、chr8:143625873、chr1:1267623、chr1:7029193、chr7:37392950、chr8:143626001、chr1:1267625、chr5:8586367、chr17:38445172、chr1:1267629、chr5:8586401、chr5:40053226、chr8:143626028、chr1:1267643、chr5:8686081、chr15:40600679、chr8:143645016、chr1:1267651、chr5:41263090、chr8:143645073、chr1:1267656、chr3:9821914、chr7:41869835、chr8:143645076、chr1:1267664、chr5:15966372、chr5:43873015、chr1:158564817、chr1:1267666、chr2:19674070、chr12:55378423、chr5:169760270、chr1:1268042、chr2:19674105、chr3:61951918、chr5:169760343、chr1:1268893、chr2:19674209、chr7:62504155、chr5:172128838、chr16:1738288、chr14:22917797、chr17:72755638、chr2:174397754、chr16:1738303、chr17:72755647、chr1:175332855、chr16:1738319、chr3:27064121、chr12:76713690、chr1:175332867、chr16:1738335、chr2:27637379、chr12:76713699、chr1:176998778、chr11:1874291、chr1:30122870、chr12:76713707、chr1:176998907、chr5:2101032、chr1:30122871、chr12:76713726、chr1:247614605、chr5:2132336、chr8:33432378、chr17:79495621、chr1:247690121和chr5:2132344。
8.检测权利要求1-7任一项所述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞TP53基因突变的试剂盒中的应用。
9.一种肺癌体细胞TP53基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1-7任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
10.根据权利要求9所述肺癌体细胞TP53基因突变检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
11.根据权利要求10所述肺癌体细胞TP53基因突变检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
12.权利要求9-11任一项所述检测试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞TP53基因突变中的应用。
13.一种辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对权利要求1-7任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
14.根据权利要求13所述辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括但不限于以下技术:甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
15.根据权利要求13-14任一项所述辅助检测肺癌体细胞TP53基因突变的方法，其特征在于，所述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
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| US20210108255A1 (en) * | 2015-07-16 | 2021-04-15 | Dimo Dietrich | Method for determining a mutation in genomic DNA, use of the method and kit for carrying out said method |
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2021
- 2021-09-08 CN CN202111051865.7A patent/CN115772567B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210108255A1 (en) * | 2015-07-16 | 2021-04-15 | Dimo Dietrich | Method for determining a mutation in genomic DNA, use of the method and kit for carrying out said method |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MICHAEL J DUFFY等: "Mutant p53 as a target for cancer treatment", 《EUR J CANCER》, vol. 83, pages 258 - 265, XP002791504, DOI: 10.1016/j.ejca.2017.06.023 * |
| 屈芳: "基于大数据挖掘的肺癌基因突变与病理分型的关系研究", 《万方》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115772567B (zh) | 2023-08-08 |
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