CN115772566B - 用于辅助检测肺癌体细胞erbb2基因突变的甲基化生物标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的甲基化位点及其应用，包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925等在内的共150种DNA甲基化位点，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立预测模型，发现其能有效地辅助检测肺癌体细胞样本中ERBB2基因的indel、SNVs等情况，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的甲基化位点及其应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。目前肺癌特别是非小细胞肺癌已证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关。
ERBB2(HER2)基因属于人类表皮生长因子受体家族(HER)，HER2基因突变广泛存在于许多实体肿瘤中，包括乳腺癌、胃癌、肺癌等。ERBB2突变是肺癌的常见驱动突变基因之一，在2-4％的肺癌中可以检测出，以20号外显子/插入突变(INDEL)最为常见，该突变可以激活激酶活性和下游信号通路，促进细胞存活和肿瘤发生[Wang SE,et al.HER2 kinasedomain mutation results in constitutive phosphorylation and activation ofHER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors.2006；10(1):25-38.]。
目前常规检测ERBB2基因突变的手段主要是WGS、WES、gene panel、RNA-seq等，通过寻找甲基化生物标记物来预测基因突变，并且通过多个DNA甲基化的甲基化状态可以克服单个DNA甲基化信号低的问题，可以提高检测的灵敏度和特异性。
其中，使用NGS检测癌症的体细胞突变通常涉及到对肿瘤DNA和来自同一患者的非恶性(或正常)组织(通常是血液)的DNA进行测序。因此，以癌症为焦点的NGS实验在实验设计上与孟德尔紊乱或正常人类变异的研究有很大不同。在癌症研究中需要从两个匹配样本中读取的序列与一个参考人类基因组对齐，在测序过程中和对齐过程中很可能产生不可预知的错误，同时一些基因中的突变也并不是影响某一癌症的决定性因素。Samtools，SOAPsnp，VarScan，SNVMix，GATK，VipR等这些工具在肿瘤和正常数据中进行比较，找出那些出现在肿瘤中的变异，哪些不是正常的样本将被认为是体细胞突变，并为研究者提供一个候选名单，以跟踪功能影响和临床相关性。但是，这些简单的比对方法的准确度不高。因此从肿瘤基因数据中识别该种疾病的体细胞突变仍然是一个亟待解决的技术难题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的甲基化位点或其组合。
具体技术方案如下：
用于辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的甲基化位点或其组合，其特征在于，所述甲基化位点或其组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点或其组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少5种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少15种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少45种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少95种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681和chr1:247803002。
本发明的目的之一还在于提供上述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种肺癌体细胞ERBB2基因突变检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种肺癌体细胞ERBB2基因突变检测试剂盒，其包括检测上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
本发明的目的之一还在于提供上述检测试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ERBB2基因突变中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法，其包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
在其中一些实施例中，上述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现包括chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925等在内的共150种DNA甲基化位点，并首次将其应用于肺癌体细胞突变辅助检测中，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立预测模型，发现其能辅助检测肺癌体细胞样本中ERBB2基因是否存在有害突变。，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。从而可有效应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
附图说明
图1为实施例1中150个marker在7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的heatmap图。
图2为实施例1中150个marker在7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图。
图3为实施例2中不同marker数量下的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图；其中，A为marker数量为5的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图、B为marker数量为10的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图、C为marker数量为20的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图、D为marker数量为50的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图、E为marker数量为100的7个ERBB2_mut与71个ERBB2_wt样本中的ROC图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明所涉及的甲基化位点详细信息具体如下表1所示：
表1
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其中intronic为内含子、intergenic为基因间序列、exonic为外显子、upstream为上游片段、downstream为下游片段。
实施例1
本实施例公开了本发明中150种甲基化位点用于辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的检测方法，具体包括如下步骤：
一、样本信息
1、肺癌患者组织FFPE取自广州广州医科大学附属第一医院。该项目获得了广州医科大学附属第一医院大学医学伦理学委员会的批准。在每一个病例中都征求患者知情同意。术后从每位患者采集2-5个FFPE载玻片样本，相关病人个人病理信息来自医院的官方病理报告。
2、78例肺癌样本包含35例女性，43例男性；年龄介于33-81之间，平均年龄53.3；57例IA(浸润性腺癌)，2例LC(大细胞癌)，19例MIA(微浸润性腺癌)；按照病理分期分别为60例Ia，15例Ib，1例IIa，2例IIIa(其中Ia、Ib指癌症I期：局域性癌症，癌组织局限于最初形成的地方，没有任何扩散现象；IIa期指癌症II期：区域性癌症：癌细胞已扩散到附近的淋巴结、组织或器官；IIIa期指癌症III期：远位癌症：癌症已经扩散到身体的各个部分。)；78例FFPE组织样品由均进行了全外显子和RNA-seq测序，并进行了变异分析，得到了SNVs，Indels等信息，按照ERBB2突变型样本与ERBB2野生型样本分组，分别为7例ERBB2_mut与71例ERBB2_wt样本。
二、建库流程和方法
1、组织DNA提取及甲基化建库
1.1、组织DNA的提取。
上述肺癌组织样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行；
1.2、转化
将提取的组织DNA(50ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNA Methylation-Lightning Kit说明书进行。
1.3、末端修复
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 热盖 | 105℃ |
当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
1.4连接I
配制如下反应液：
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 20 |
| H2O | 4 |
| MLB1缓冲液 | 8 |
| MLR1试剂 | 2 |
| MLR5试剂 | 2 |
| MLE1酶 | 2 |
| MLE5酶 | 2 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 10℃ | hold |
| 热盖 | 105℃ |
1.5扩增I
配制如下反应液
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 40 |
| H2O | 35 |
| MAB2缓冲液 | 20 |
| MAR1试剂 | 2 |
| MAR2试剂 | 2 |
| MAE3酶 | 1 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6纯化I：
加入166ul 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对扩增I反应后的产物进行纯化，用21μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。
1.7连接II
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8 Indexing PCR(扩增产物文库构建):
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 40 |
| H2O | 6 |
| 2X KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | 8 |
| I5接头引物 | 2 |
| I7接头引物 | 2 |
| 总体积 | 100 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9纯化II
加入Agencourt AM Pure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的Agencourt AM PureBeads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行定量。
2、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
3、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4、下机数据的分析：
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bamfile)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5、对原始测序数据进行了相关清理及处理分析[Liang,W.,et al.,Non-invasivediagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNAmethylation sequencing of circulating tumor DNA(ctDNA).2019.9(7):p.2056.]，并基于对reads读数来确定每一个位点甲基化胞嘧啶的百分比(β值)。
6、将71个ERBB2_wt和7个ERBB2_mut样本(7个样本共包含3个nonframeshiftinsertion和4个nonsynonymous SNV)的甲基化测序信息，用表1中的150个marker进行分析，heatmap图如图1，将这78个样本按照5:5的比例切分50次，利用随机森林(RandomForest)建模，每一次切分里利用随机森林(Random Forest)在train集合里面建模，用该模型在test集合里面计算每个样本的风险得分，风险得分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC、NPV以及PPV等，50次建模AUC图如图2所示，平均auc为0.850，90％特异度下的灵敏度为40.7％。说明采用150个marker的模式组合对于肺癌体细胞ERBB2基因突变样本诊断的整体灵敏度高，ROC曲线稳定性较好。计算50次建模每个marker的平均probablity，按照probablity从大到小排序，取top 5marker，每个marker的预测性能AUC如下表2所示。从下表2和50次建模的AUC可以看出，在71个ERBB2_wt和7个ERBB2_mut样本中，甲基化标记物在两个类别中具有显著的区分性能，这些marker或者marker组合可以作为ERBB2_wt和ERBB2_mut的区分的标记物；
表2
| Marker | AUC |
| chr1:247802998 | 0.924 |
| chr7:155255386 | 0.863 |
| chr7:27170161 | 0.865 |
| chr1:91185502 | 0.948 |
| chr17:48858925 | 0.887 |
实施例2
针对实施例1中相同的样本，分别用5marker，10marker，20marker，50marker，100marker的组合，用实施例1相同的50次切分，利用随机森林(Random Forest)建模，其中5marker为chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925。
10marker为在chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925的基础上随机增加5个marker，例如具体为：chr1:247802998、chr7:27170161、chr7:155255386、chr1:247802992、chr11:94771103、chr1:91185502、chr1:247802739、chr17:48858925、chr8:145107319、chr17:1492285。
20marker为在chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925的基础上随机增加5个marker，例如具体为：chr1:247802998、chr7:27170161、chr7:155255386、chr1:247802992、chr11:94771103、chr1:91185502、chr1:247802739、chr17:48858925、chr8:145107319、chr17:1492285、chr1:247803002、chr6:27550791、chr7:27170809、chr5:1295761、chr5:42944378、chr11:614926、chr5:1010960、chr7:27169737、chr5:3607008、chr11:614892)。
50marker为在chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925的基础上随机增加5个marker，例如具体为：chr1:247802998、chr7:27170161、chr7:155255386、chr1:247802992、chr11:94771103、chr1:91185502、chr1:247802739、chr17:48858925、chr8:145107319、chr17:1492285、chr1:247803002、chr6:27550791、chr7:27170809、chr5:1295761、chr5:42944378、chr11:614926、chr5:1010960、chr7:27169737、chr5:3607008、chr11:614892、chr7:27170263、chr2:63284472、chr7:27170828、chr22:20001087、chr11:614899、chr1:247802833、chr17:38675158、chr7:27170805、chr1:119522489、chr11:85645776、chr15:102193535、chr17:79694700、chr1:157164999、chr7:27170850、chr7:27170811、chr4:675751、chr5:1295753、chr7:4901481、chr16:3345488、chr6:136810946、chr1:247803000、chr5:42757010、chr8:124219528、chr8:124173386、chr5:9631216、chr4:675741、chr5:3603114、chr12:64215561、chr1:247802740、chr7:27170260。
100marker为在chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925的基础上随机增加5个marker，例如具体为：chr1:247802998、chr7:27170161、chr7:155255386、chr1:247802992、chr11:94771103、chr1:91185502、chr1:247802739、chr17:48858925、chr8:145107319、chr17:1492285、chr1:247803002、chr6:27550791、chr7:27170809、chr5:1295761、chr5:42944378、chr11:614926、chr5:1010960、chr7:27169737、chr5:3607008、chr11:614892、chr7:27170263、chr2:63284472、chr7:27170828、chr22:20001087、chr11:614899、chr1:247802833、chr17:38675158、chr7:27170805、chr1:119522489、chr11:85645776、chr15:102193535、chr17:79694700、chr1:157164999、chr7:27170850、chr7:27170811、chr4:675751、chr5:1295753、chr7:4901481、chr16:3345488、chr6:136810946、chr1:247803000、chr5:42757010、chr8:124219528、chr8:124173386、chr5:9631216、chr4:675741、chr5:3603114、chr12:64215561、chr1:247802740、chr7:27170260、chr1:247802952、chr7:27170819、chr4:675720、chr5:3600391、chr7:27170282、chr1:243264950、chr7:50514882、chr1:247802834、chr5:92909371、chr5:1225510、chr7:4901584、chr5:1295799、chr8:120219928、chr8:124173395、chr8:124195291、chr5:1295771、chr5:1225398、chr5:40681884、chr1:247802956、chr8:124219530、chr11:614883、chr7:676004、chr8:144650754、chr7:579031、chr5:3600389、chr1:247681769、chr7:4832443、chr1:247802936、chr8:144650803、chr7:101005911、chr11:134526983、chr8:124173439、chr18:9321218、chr7:32801602、chr14:50233591、chr7:39649279、chr1:247802828、chr8:144650765、chr8:124173405、chr1:247802896、chr1:91185500、chr8:144650770、chr7:24324401、chr1:247802643、chr10:133951900、chr7:27169732、chr5:3600353、chr5:1295797、chr1:247802880、chr1:247802958。
在上述这些marker数目下面，建模的平均auc和敏感性，特异性如下表3所示，不同marker组合下的ROC图如下图3所示。从不同组合的AUC可以看出，在71个ERBB2_wt和7个ERBB2_mut样本中，甲基化标记物在两个类别中具有显著的区分性能，再次说明这些marker的不同组合均可以作为ERBB2_wt和ERBB2_mut的区分的标记物；
表3
| Marker数目 | Mean auc | Mean se | Mean sp | Mean acc | mean ppv | Mean npv |
| 5 | 0.841 | 0.40 | 0.99 | 0.76 | 0.83 | 0.68 |
| 10 | 0.83 | 0.40 | 1 | 0.75 | 0.83 | 0.67 |
| 20 | 0.841 | 0.41 | 0.99 | 0.77 | 0.84 | 0.67 |
| 50 | 0.846 | 0.41 | 0.99 | 0.78 | 0.84 | 0.69 |
| 100 | 0.844 | 0.43 | 0.97 | 0.80 | 0.85 | 0.71 |
其中auc为ROC曲线下面积、se为敏感性、sp为特异性、acc为准确率、ppv为阳性预测值、npv为阴性预测值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502、chr17:48858925组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
2.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及选自chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少5种组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
3.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及选自chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少15种组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
4.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及选自chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少45种组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
5.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及选自chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681、chr1:247803002中的任意至少95种组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
6.检测甲基化位点组合的试剂在制备预测、检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化位点组合由chr1:247802998、chr7:155255386、chr7:27170161、chr1:91185502和chr17:48858925，以及选自chr7:579031、chr5:3600353、chr1:38412696、chr8:96085707、chr1:156863604、chr11:614883、chr5:3600389、chr1:38412711、chr8:96085713、chr1:157164999、chr11:614892、chr5:3600391、chr17:38675158、chr8:96085722、chr1:226924871、chr11:614899、chr5:3603114、chr7:39649279、chr8:96085724、chr1:228559083、chr11:614926、chr5:3607008、chr5:40681884、chr8:96085730、chr1:243264950、chr4:675720、chr7:4832443、chr5:40681893、chr7:101005911、chr1:247681769、chr4:675741、chr7:4901481、chr5:40681959、chr8:101822133、chr1:247802643、chr4:675751、chr7:4901584、chr21:41160204、chr15:102193535、chr1:247802658、chr7:676004、chr18:9321218、chr5:42756905、chr1:119522489、chr1:247802681、chr5:1010960、chr5:9631216、chr5:42757010、chr8:120219928、chr1:247802739、chr1:1109470、chr1:10092192、chr5:42944378、chr8:124173386、chr1:247802740、chr5:1225329、chr22:20001087、chr8:124173395、chr1:247802828、chr5:1225398、chr7:24324401、chr14:50233591、chr8:124173405、chr1:247802833、chr5:1225510、chr7:26657578、chr7:50514882、chr8:124173439、chr1:247802834、chr1:1268781、chr7:26657610、chr7:50514899、chr8:124195217、chr1:247802880、chr1:1268793、chr7:27169732、chr7:50514904、chr8:124195271、chr1:247802889、chr1:1268865、chr7:27169737、chr2:63284472、chr8:124195291、chr1:247802890、chr1:1268887、chr12:64215561、chr8:124219528、chr1:247802896、chr5:1295753、chr7:27170260、chr17:79694700、chr8:124219530、chr1:247802897、chr5:1295759、chr7:27170263、chr11:85645776、chr10:133951718、chr1:247802900、chr5:1295761、chr7:27170282、chr16:88883432、chr10:133951900、chr1:247802936、chr5:1295771、chr7:27170805、chr1:91185500、chr11:134526983、chr1:247802940、chr5:1295797、chr7:27170809、chr6:136810946、chr1:247802949、chr5:1295799、chr7:27170811、chr5:92909371、chr8:144650754、chr1:247802952、chr17:1492285、chr7:27170819、chr11:94771103、chr8:144650765、chr1:247802956、chr16:3345488、chr7:27170828、chr12:95840379、chr8:144650770、chr1:247802958、chr5:3600297、chr7:27170850、chr12:95840388、chr8:144650803、chr1:247802992、chr5:3600306、chr6:27550791、chr8:96085527、chr8:145107319、chr5:3600310、chr7:32801602、chr8:96085658、chr8:145593549、chr1:247803000、chr5:3600348、chr1:38412684、chr8:96085681和chr1:247803002组成，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
7.一种非诊断目的辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对权利要求1-6任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
8.根据权利要求7所述非诊断目的辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法，其特征在于，所述方法选自以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR。
9.根据权利要求7-8任一项所述非诊断目的辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法，其特征在于，所述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞。
10.根据权利要求9所述非诊断目的辅助检测肺癌体细胞ERBB2基因突变的方法，其特征在于，所述生物样品为组织切片。
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