CN117660641A - 用于辅助检测隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用 - Google Patents
用于辅助检测隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于辅助检测隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286‑39957635等。本发明的甲基化生物标记物能有效地辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性，从而为肺癌患者制定合理诊疗方案等方面提供更为有效地辅助检测服务。并且，基于对样本中这些DNA甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于辅助识别检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用。
背景技术
TNM分类系统是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)分期和治疗策略的一个重要基础。淋巴结转(Lymph node metasis，LNM)作为预后的重要影响因素，其病患的五年综合生存率仅为26-53％[Goldstraw P,Chansky K,Crowley J,et al.TheIASLC Lung Cancer Staging Project:Proposals for Revision of the TNM StageGroupings in the Forthcoming(Eighth)Edition of the TNM Classification forLung Cancer.J Thorac Oncol.2016；11(1):39-51.doi:10.1016/j.jtho.2015.09.009]。在可切除的非小细胞肺癌中，隐匿性淋巴结转移占总隐匿性转移的22.4％，且淋巴结转移与明显较差的无病生存期和总生存期相关[Tang W,Lei Y,Su J,et al.TNM stagesinversely correlate with the age at diagnosis in ALK-positive lungcancer.Transl Lung Cancer Res.2019；8(2):144-154.doi:10.21037/tlcr.2019.03.07]。
医学影像和侵入性活检是目前两种主要的确定淋巴结转移的手段，但它们各自都存在不容忽视的缺陷。一方面，当前的医学影像技术还不能够在手术前准确地诊断出淋巴结转移。另一方面，侵入性活检的应用也并不广泛，这是因为其在技术上的复杂性，以及检测结果上的高假阴性。在这样的背景下，更精确和非侵入性的方法便有研发的必要性，以便更好地在术前确定淋巴结的状态同时改善治疗策略。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，它参与了生物统中分化、发育、衰老和肿瘤发生等过程。异常的DNA甲基化被认为是癌症发展的标志，借助基因转录的抑制或失活引起染色质的不稳定[Cheng Y,He C,Wang M,et al.Targeting epigenetic regulatorsfor cancer therapy:mechanisms and advances in clinical trials.SignalTransduct Target Ther.2019；4:62.Published 2019 Dec 17.doi:10.1038/s41392-019-0095-0]。启动子区域的高甲基化和整体DNA的低甲基化在癌症中相当普遍，且早期癌症中也存在不少甲基化变化，因此和甲基化相关的信号通常会被当作早期癌症追踪的首选。不少过往研究展示了早期非小细胞肺癌以及早期复发的I期非小细胞肺癌的特定甲基化信号[Ma Y,Bai Y,Mao H,et al.A panel of promoter methylation markers for invasiveand noninvasive early detection of NSCLC using a quantum dots-based FRETapproach.Biosens Bioelectron.2016；85:641-648.doi:10.1016/j.bios.2016.05.067；Chen HF,Lei L,Wu LX,et al.Effect of icotinib on advanced lung adenocarcinomapatients with sensitive EGFR mutation detected in ctDNA by ddPCR.TranslCancer Res.2019；8(8):2858-2863.doi:10.21037/tcr.2019.10.48；Liang W,Zhao Y,Huang W,et al.Non-invasive diagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNA methylation sequencing of circulating tumor DNA(ctDNA).Theranostics.2019；9(7):2056-2070.Published 2019 Apr 6.doi:10.7150/thno.28119；Sun K.Clonal hematopoiesis:background player in plasma cell-freeDNA variants.Ann Transl Med.2019；7(Suppl 8):S384.doi:10.21037/atm.2019.12.97]。
基于上述原因，以及在非小细胞肺癌中将DNA甲基化和隐匿性淋巴结转移相关联的报道的稀缺性，筛选相关甲基化生物标记物用于隐匿性淋巴结转移诊断非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物、试剂盒及方法。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286-39957635、chr14:21493920-21494121、chr15:69452361-69452562、chr16:30103427-30103628、chr19:19281074-19281297、chr2:20551133-20551334、chr22:21399958-21400284、chr3:169482920-169483121、chr5:125930900-125931101中的任意至少一种。
本发明的第二方面，提供了一种检测上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度的试剂。
本发明的第三方面，提供了检测上述甲基化生物标记物的甲基化差异化程度的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移辅助检测试剂盒，包括检测上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度的试剂。
本发明的第五方面，提供了一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的方法。其包括以下步骤，提取待测的生物样品外周血或组织DNA；对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；对上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度进行检测。
本发明的发明人发现包括chr1:39957286-39957635等在内的共150种DNA甲基化区域(如表3所示)，通过针对这些区域的不同组合检测，采用随机森林等方式在性别、年龄、吸烟史及肿瘤组织学配对的血浆样本中建立预测模型，发现其能有效地辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性，从而为肺癌患者制定合理诊疗方案等方面提供更为有效地辅助检测服务。并且，基于对样本中这些DNA甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
附图说明
图1为实施例1中pN0/pN+恶性血浆样本使用未筛选的全部7299个甲基化生物标记物绘制的热图，每一列代表一个样本，每一行代表一个甲基化生物标记物。
图2为实施例1中pN0/pN+恶性组织样本使用未筛选的全部7299个甲基化生物标记物绘制的热图，每一列代表一个样本，每一行代表一个甲基化生物标记物。
图3为实施例1中，同时存在于pN0/pN+恶性血浆样本前1000个差异甲基化标记物和pN0/pN+恶性组织样本前1000个差异甲基化标记物中，其交集得到的150-marker甲基化生物标记物绘制的热图，每一列代表一个样本，每一行代表一个甲基化生物标记物。
图4为实施例1中，同时存在于pN0/pN+恶性血浆样本前500个差异甲基标记物和pN0/pN+恶性组织样本前500个差异甲基标记物中，其交集得到的35-marker甲基化生物标记物绘制的热图，每一列代表一个样本，每一行代表一个甲基化生物标记物。
图5为实施例1中，同时存在于pN0/pN+恶性血浆样本前200个差异甲基化标记物和pN0/pN+恶性组织样本前200个差异甲基化标记物中，其交集得到的9-marker甲基化生物标记物绘制的热图，每一列代表一个样本，每一行代表一个甲基化生物标记物。
图6为实施例1中筛选得到的150-marker甲基化生物标记物建立随机森林模型输出对应的ROC图。
图7为实施例1中筛选得到的35-marker甲基化生物标记物建立随机森林模型输出对应的ROC图。
图8为实施例1中筛选得到的9-marker甲基化生物标记物建立随机森林模型输出对应的ROC图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明的其中一些实施例中，提供了一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286-39957635、chr14:21493920-21494121、chr15:69452361-69452562、chr16:30103427-30103628、chr19:19281074-19281297、chr2:20551133-20551334、chr22:21399958-21400284、chr3:169482920-169483121、chr5:125930900-125931101中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286-39957635、chr14:21493920-21494121、chr15:69452361-69452562、chr16:30103427-30103628、chr19:19281074-19281297、chr2:20551133-20551334、chr22:21399958-21400284、chr3:169482920-169483121和chr5:125930900-125931101。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物还包括chr1:228645381-228645810、chr1:33592937-33593254、chr1:36771963-36772164、chr1:38510832-38511033、chr10:101290598-101290799、chr10:45374278-45374479、chr11:105892754-105893382、chr11:17036236-17036437、chr12:114847063-114847264、chr13:107188155-107188356、chr14:89884172-89884373、chr16:47177502-47177703、chr17:16256836-16257110、chr17:73127196-73127397、chr19:17858351-17858552、chr19:58281349-58281550、chr2:223164534-223164735、chr20:62184973-62185174、chr4:122686501-122686702、chr6:26272232-26272616、chr6:27100949-27101150、chr6:27101019-27101220、chr6:27470513-27470714、chr6:72892800-72893001、chr7:107302378-107302579、chr8:42010041-42010242中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物还包括chr1:228645381-228645810、chr1:33592937-33593254、chr1:36771963-36772164、chr1:38510832-38511033、chr10:101290598-101290799、chr10:45374278-45374479、chr11:105892754-105893382、chr11:17036236-17036437、chr12:114847063-114847264、chr13:107188155-107188356、chr14:89884172-89884373、chr16:47177502-47177703、chr17:16256836-16257110、chr17:73127196-73127397、chr19:17858351-17858552、chr19:58281349-58281550、chr2:223164534-223164735、chr20:62184973-62185174、chr4:122686501-122686702、chr6:26272232-26272616、chr6:27100949-27101150、chr6:27101019-27101220、chr6:27470513-27470714、chr6:72892800-72893001、chr7:107302378-107302579和chr8:42010041-42010242。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物还包括chr1:109203509-109203710、chr1:161993815-161994087、chr1:206643740-206643941、chr1:228645587-228645788、chr1:46632595-46632796、chr1:6464744-6464945、chr1:64936555-64936756、chr1:85086350-85086551、chr1:860824-861025、chr1:91176442-91176787、chr10:101292482-101292683、chr10:101292534-101292782、chr10:101294542-101294743、chr10:106399412-106399613、chr10:23216742-23216943、chr10:30723791-30723992、chr10:31608087-31608312、chr10:93647199-93647400、chr11:125757528-125757729、chr11:128556673-128556965、chr11:20691328-20691529、chr11:46354464-46354730、chr11:88070679-88070880、chr12:104852338-104852546、chr12:113013114-113013315、chr12:117319092-117319346、chr12:119419534-119419735、chr12:121078557-121078758、chr12:16759630-16759831、chr12:25538193-25538394、chr12:28122985-28123186、chr12:63025847-63026048、chr13:101241024-101241225、chr13:30995562-30995763、chr14:105994515-105994716、chr14:29229354-29229555、chr14:31343793-31343994、chr14:56585385-56585586、chr14:74058385-74058586、chr15:28341879-28342080、chr15:52820459-52820660、chr15:60297942-60298143、chr15:88800903-88801104、chr16:12897377-12897578、chr16:4986146-4986347、chr16:77823515-77823716、chr17:1957597-1957932、chr17:37764149-37764393、chr17:41791129-41791330、chr17:7982705-7982906、chr18:32557781-32558152、chr18:5542778-5542979、chr19:12943492-12943693、chr19:2461941-2462165、chr19:35168137-35168338、chr19:38182849-38183050、chr19:38210736-38210937、chr19:50828804-50829005、chr19:56879832-56880033、chr19:57901644-57901845、chr19:58258545-58258746、chr2:119613025-119613226、chr2:167232119-167232320、chr2:178013706-178013907、chr2:179278231-179278658,chr2:190445095-190445296、chr2:223183831-223184032、chr2:25439274-25439475、chr2:54682657-54682858、chr2:60809116-60809317、chr20:62103440-62103641、chr21:44495911-44496112、chr21:46351983-46352184、chr3:126075793-126075994、chr3:127347877-127348078、chr3:40428537-40428738、chr3:42814692-42814893、chr4:103266596-103266855、chr4:121993991-121994192、chr4:144480441-144480840、chr4:154605161-154605362、chr4:175139139-175139340、chr4:54957879-54958080、chr4:54966917-54967118、chr4:76862254-76862455、chr4:76862324-76862525、chr5:101632070-101632386、chr5:137774783-137774984、chr5:14581428-14581629、chr5:159200575-159200776、chr5:36690501-36690757、chr6:100909020-100909338、chr6:148881125-148881326、chr6:27792401-27792602、chr6:78173126-78173327、chr6:91005199-91005400、chr7:107302154-107302371、chr7:127291557-127291758、chr7:148982183-148982384、chr7:155249297-155249498、chr7:15726247-15726749、chr7:23508633-23508834、chr7:32110138-32110339、chr7:32110535-32110736、chr7:37488061-37488262、chr7:86272990-86273280、chr8:120220030-120220231、chr8:21924411-21924612、chr8:22722716-22722917、chr8:38614414-38614615、chr9:129987033-129987234、chr9:131842978-131843179、chr9:132934574-132934775、chr9:89561780-89561981、chr9:93955574-93955775中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物还包括chr1:109203509-109203710、chr1:161993815-161994087、chr1:206643740-206643941、chr1:228645587-228645788、chr1:46632595-46632796、chr1:6464744-6464945、chr1:64936555-64936756、chr1:85086350-85086551、chr1:860824-861025、chr1:91176442-91176787、chr10:101292482-101292683、chr10:101292534-101292782、chr10:101294542-101294743、chr10:106399412-106399613、chr10:23216742-23216943、chr10:30723791-30723992、chr10:31608087-31608312、chr10:93647199-93647400、chr11:125757528-125757729、chr11:128556673-128556965、chr11:20691328-20691529、chr11:46354464-46354730、chr11:88070679-88070880、chr12:104852338-104852546、chr12:113013114-113013315、chr12:117319092-117319346、chr12:119419534-119419735、chr12:121078557-121078758、chr12:16759630-16759831、chr12:25538193-25538394、chr12:28122985-28123186、chr12:63025847-63026048、chr13:101241024-101241225、chr13:30995562-30995763、chr14:105994515-105994716、chr14:29229354-29229555、chr14:31343793-31343994、chr14:56585385-56585586、chr14:74058385-74058586、chr15:28341879-28342080、chr15:52820459-52820660、chr15:60297942-60298143、chr15:88800903-88801104、chr16:12897377-12897578、chr16:4986146-4986347、chr16:77823515-77823716、chr17:1957597-1957932、chr17:37764149-37764393、chr17:41791129-41791330、chr17:7982705-7982906、chr18:32557781-32558152、chr18:5542778-5542979、chr19:12943492-12943693、chr19:2461941-2462165、chr19:35168137-35168338、chr19:38182849-38183050、chr19:38210736-38210937、chr19:50828804-50829005、chr19:56879832-56880033、chr19:57901644-57901845、chr19:58258545-58258746、chr2:119613025-119613226、chr2:167232119-167232320、chr2:178013706-178013907、chr2:179278231-179278658,chr2:190445095-190445296、chr2:223183831-223184032、chr2:25439274-25439475、chr2:54682657-54682858、chr2:60809116-60809317、chr20:62103440-62103641、chr21:44495911-44496112、chr21:46351983-46352184、chr3:126075793-126075994、chr3:127347877-127348078、chr3:40428537-40428738、chr3:42814692-42814893、chr4:103266596-103266855、chr4:121993991-121994192、chr4:144480441-144480840、chr4:154605161-154605362、chr4:175139139-175139340、chr4:54957879-54958080、chr4:54966917-54967118、chr4:76862254-76862455、chr4:76862324-76862525、chr5:101632070-101632386、chr5:137774783-137774984、chr5:14581428-14581629、chr5:159200575-159200776、chr5:36690501-36690757、chr6:100909020-100909338、chr6:148881125-148881326、chr6:27792401-27792602、chr6:78173126-78173327、chr6:91005199-91005400、chr7:107302154-107302371、chr7:127291557-127291758、chr7:148982183-148982384、chr7:155249297-155249498、chr7:15726247-15726749、chr7:23508633-23508834、chr7:32110138-32110339、chr7:32110535-32110736、chr7:37488061-37488262、chr7:86272990-86273280、chr8:120220030-120220231、chr8:21924411-21924612、chr8:22722716-22722917、chr8:38614414-38614615、chr9:129987033-129987234、chr9:131842978-131843179、chr9:132934574-132934775、chr9:89561780-89561981和chr9:93955574-93955775。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度的试剂。
在本发明的另一些实施例中，公开了上述试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的试剂盒中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移辅助检测试剂盒，包括检测上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测技术中聚合酶链式反应技术包括但不限于RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等；高通量检测技术包括但不限于简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序；基于质谱的GC-MS、LC-MS、MALDI-TOFMS、FT-MS、ICP-MS、SIMS的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的方法。其包括以下步骤，提取待测的生物样品外周血或组织DNA；对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；对上述甲基化生物标记物的甲基化差异程度进行检测。
在其中一些实施例中，上述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1用于辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化标记物的筛选
本实施例提供了用于辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化标记物的筛选方法，具体包括如下步骤：
一、样本信息
1、本实施例使用119例恶性肺结节原发病灶直径小于3.0cm的组织样本队列用于筛选和鉴定淋巴结转移的特异性甲基化标记物。上述样本包含62例女性，57例男性；年龄小于70岁的102例，大于或等于70岁的17例；主要诊断信息为101例腺癌，13例鳞癌，5例其它，其中腺癌病例的亚型分布为7例AIS，20例MIA，74例IA。按照pN分期，则包含26例pN+和93例pN0。
2、本实施例使用39例恶性肺结节原发病灶直径小于3.0cm的血浆样本队列用于筛选和鉴定淋巴结转移的特异性甲基化标记物。上述样本包含9例女性，30例男性；年龄小于70岁的32例，大于或等于70岁的7例；主要诊断信息为30例腺癌，6例鳞癌，3例其它，其中腺癌病例的亚型分布为4例MIA，25例IA，1例其它。按照pN分期，则包含17例pN+和22例pN0。
3、将上述有恶性肺结节的病人的血浆和组织样本进行常规的高通量靶向甲基化测序，包括分离组织基因组DNA或血浆游离DNA(cfDNA)，亚硫酸氢盐转化，以及AnchorIRISTM靶向甲基化测序等步骤。
二、建库流程和方法
1、样本DNA提取及甲基化建库
1.1、样本DNA的提取
对于肺癌外周血样本，DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&TissueKit操作说明进行。对于肺癌组织样本，DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行。
1.2、转化
将提取的样本DNA(50ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZDNA Methylation-Lightning Kit说明书进行。
1.3、末端修复
以下步骤1.3至步骤1.9使用AnchorDx IRIS甲基化建库试剂盒(广州市基准医疗有限责任公司)。
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
| 组分 | 体积(μl) |
| 转化后样本 | 17 |
| MEB1缓冲液 | 2 |
| MEE2酶 | 1 |
| 总体积 | 20 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 热盖 | 105℃ |
当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
1.4、连接I
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 10℃ | hold |
| 热盖 | 105℃ |
1.5、扩增I
配制如下反应液
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 40 |
| H2O | 35 |
| MAB2缓冲液 | 20 |
| MAR1试剂 | 2 |
| MAR2试剂 | 2 |
| MAE3酶 | 1 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6、纯化I：
加入166ul1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)对扩增I反应后的产物进行纯化，用21μlEB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μlEB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。
1.7、连接II
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 20 |
| H2O | 4 |
| MSB1缓冲液 | 8 |
| MSR1试剂 | 2 |
| MSR5试剂 | 2 |
| MSE1酶 | 2 |
| MSE5酶 | 2 |
| 总体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8、Indexing PCR(扩增产物文库构建)
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 40 |
| H2O | 6 |
| 2X KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | 8 |
| I5接头引物 | 2 |
| I7接头引物 | 2 |
| 总体积 | 100 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9、纯化II
加入Agencourt AM Pure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的Agencourt AM PureBeads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μlEB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行定量。
2、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
3、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4、下机数据的分析
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bamfile)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5、对原始测序数据进行了相关清理及处理分析[Liang,W.,et al.,Non-invasivediagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNAmethylation sequencing of circulating tumor DNA(ctDNA).2019.9(7):p.2056.]，并基于对reads读数来确定每一个区域甲基化胞嘧啶的百分比(β值)。
6、统计分析方法
R统计软件(v3.5.1，贝尔实验室，美国新泽西州默里山)用于所有相关统计检验分析。威尔科克森秩和统计检验(Wilcoxon rank-sum test)被用于检测差异甲基化的生物标记物。在Random Forest R模块中部署实现了随机森林预测模型，并借助pROC模块绘制了ROC曲线。
7、针对这119例恶性肺结节原发病灶直径小于3.0cm的样本队列的甲基化检测信息，通过威尔科克森秩和统计检验方法寻找26例pN+(作为实验组)和93例pN0(作为对照组)组织样本的两个分组之间的差异甲基化生物标记物，以及17例pN+(作为实验组)和22例pN0(作为对照组)血浆样本的两个分组之间的差异甲基化生物标记物，并将两种样本各自经过统计检验得到的FDR值从小到大排序。
pN0/pN+恶性血浆样本使用未筛选的全部7299个甲基化生物标记物绘制的热图如图1所示，pN0/pN+恶性组织样本使用未筛选的全部7299个甲基化生物标记物绘制的热图如图2所示，分别存在于pN0/pN+恶性血浆样本的前1000个、500个和200个差异甲基化标记物和pN0/pN+恶性组织样本前1000个、500个和200个差异甲基化标记物中，其交集分别得到的150-marker、35-marker和9-marker甲基化生物标记物绘制的热图，分别如图3～图5所示。从各热图对比可知，以未筛选的全部7299个甲基化生物标记物绘制的热图，血浆样本的pN0/pN+组之间几乎没有区分度，但是借助pN0/pN+恶性组织样本筛选特征后，血浆样本的pN0/pN+组各自的聚类程度有较为明显的上升。
表1显示了取上述组织和血浆两种样本各自统计检验排序的前200、前500、前1000、前2000特征的交集情况
| 特征分组 | 特征数目 |
| 前200交集 | 9 |
| 前500交集 | 35 |
| 前1000交集 | 150 |
| 前2000交集 | 556 |
采用随机森林(Random Forest，RF)方法，分别基于上述特征选集在17例pN+(作为实验组)和22例pN0(作为对照组)血浆样本中建立多个预测模型，统计重复33次的3折交叉验证的结果并绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operator Characteristic Curve，ROC)，并计算曲线下面积(Area Under Curve，AUC)，以此来评估这些模型的性能。结果如表2所示。其中，上述筛选得到的150-marker甲基化生物标记物、35-marker甲基化生物标记物、9-marker甲基化生物标记物建立随机森林模型输出对应的ROC图分别如图6～8所示。
表2
| 测试集AUC平均±AUC标准差 | 特征分组 | 组合命名 |
| 0.860±0.110 | 前200交集 | 9-marker组合 |
| 0.858±0.107 | 前500交集 | 35-marker组合 |
| 0.871±0.098 | 前1000交集 | 150-marker组合 |
| 0.806±0.107 | 前2000交集 | 556-marker组合 |
| 0.469±0.153 | 特征全集 | 7299-marker组合 |
通常情况下组织中的甲基化信号远高于血浆且更为可靠，鉴于以上交集表示来源于组织和血浆存在一致性信号的甲基化生物标记物，上述结果说明，相较于使用特征全集在血浆样本上完全没有区分能力(AUC～0.5)，使用组织协助血浆筛选得到的特征能够有效提升随机森林方法建模性能，从而得到更为可靠的检测差异甲基化的生物标记物。在上述梯度分析中，各自选取统计学排名前1000并取交集得到的特征(数目为150个)分类能力最佳。表3提供了这些差异甲基化的生物标记物所属位置信息等信息。
表3
其中intronic为内含子、intergenic为基因间序列、exonic为外显子、upstream为上游片段、downstream为下游片段。按照序号，序号1-9的备选特征为前200交集的9-marker组合，序号1-35的备选特征为前500交集的35-marker组合，序号1-150的备选特征为前1000交集的150-marker组合。这些组合在淋巴结转移血浆样本和组织样本中具有有效的区分能力，可用于辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286-39957635、chr14:21493920-21494121、chr15:69452361-69452562、chr16:30103427-30103628、chr19:19281074-19281297、chr2:20551133-20551334、chr22:21399958-21400284、chr3:169482920-169483121、chr5:125930900-125931101中的任意至少一种。
2.根据权利要求1所述的辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物包括chr1:39957286-39957635、chr14:21493920-21494121、chr15:69452361-69452562、chr16:30103427-30103628、chr19:19281074-19281297、chr2:20551133-20551334、chr22:21399958-21400284、chr3:169482920-169483121和chr5:125930900-125931101。
3.根据权利要求1所述的辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物还包括chr1:228645381-228645810、chr1:33592937-33593254、chr1:36771963-36772164、chr1:38510832-38511033、chr10:101290598-101290799、chr10:45374278-45374479、chr11:105892754-105893382、chr11:17036236-17036437、chr12:114847063-114847264、chr13:107188155-107188356、chr14:89884172-89884373、chr16:47177502-47177703、chr17:16256836-16257110、chr17:73127196-73127397、chr19:17858351-17858552、chr19:58281349-58281550、chr2:223164534-223164735、chr20:62184973-62185174、chr4:122686501-122686702、chr6:26272232-26272616、chr6:27100949-27101150、chr6:27101019-27101220、chr6:27470513-27470714、chr6:72892800-72893001、chr7:107302378-107302579、chr8:42010041-42010242中的任意至少一种。
4.根据权利要求2所述的辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物还包括chr1:228645381-228645810、chr1:33592937-33593254、chr1:36771963-36772164、chr1:38510832-38511033、chr10:101290598-101290799、chr10:45374278-45374479、chr11:105892754-105893382、chr11:17036236-17036437、chr12:114847063-114847264、chr13:107188155-107188356、chr14:89884172-89884373、chr16:47177502-47177703、chr17:16256836-16257110、chr17:73127196-73127397、chr19:17858351-17858552、chr19:58281349-58281550、chr2:223164534-223164735、chr20:62184973-62185174、chr4:122686501-122686702、chr6:26272232-26272616、chr6:27100949-27101150、chr6:27101019-27101220、chr6:27470513-27470714、chr6:72892800-72893001、chr7:107302378-107302579和chr8:42010041-42010242。
5.根据权利要求4所述的辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物还包括chr1:109203509-109203710、chr1:161993815-161994087、chr1:206643740-206643941、chr1:228645587-228645788、chr1:46632595-46632796、chr1:6464744-6464945、chr1:64936555-64936756、chr1:85086350-85086551、chr1:860824-861025、chr1:91176442-91176787、chr10:101292482-101292683、chr10:101292534-101292782、chr10:101294542-101294743、chr10:106399412-106399613、chr10:23216742-23216943、chr10:30723791-30723992、chr10:31608087-31608312、chr10:93647199-93647400、chr11:125757528-125757729、chr11:128556673-128556965、chr11:20691328-20691529、chr11:46354464-46354730、chr11:88070679-88070880、chr12:104852338-104852546、chr12:113013114-113013315、chr12:117319092-117319346、chr12:119419534-119419735、chr12:121078557-121078758、chr12:16759630-16759831、chr12:25538193-25538394、chr12:28122985-28123186、chr12:63025847-63026048、chr13:101241024-101241225、chr13:30995562-30995763、chr14:105994515-105994716、chr14:29229354-29229555、chr14:31343793-31343994、chr14:56585385-56585586、chr14:74058385-74058586、chr15:28341879-28342080、chr15:52820459-52820660、chr15:60297942-60298143、chr15:88800903-88801104、chr16:12897377-12897578、chr16:4986146-4986347、chr16:77823515-77823716、chr17:1957597-1957932、
chr17:37764149-37764393、chr17:41791129-41791330、chr17:7982705-7982906、chr18:32557781-32558152、chr18:5542778-5542979、chr19:12943492-12943693、chr19:2461941-2462165、chr19:35168137-35168338、chr19:38182849-38183050、chr19:38210736-38210937、chr19:50828804-50829005、chr19:56879832-56880033、chr19:57901644-57901845、chr19:58258545-58258746、chr2:119613025-119613226、chr2:167232119-167232320、chr2:178013706-178013907、chr2:179278231-179278658,chr2:190445095-190445296、chr2:223183831-223184032、chr2:25439274-25439475、chr2:54682657-54682858、chr2:60809116-60809317、chr20:62103440-62103641、chr21:44495911-44496112、chr21:46351983-46352184、chr3:126075793-126075994、chr3:127347877-127348078、chr3:40428537-40428738、chr3:42814692-42814893、chr4:103266596-103266855、chr4:121993991-121994192、chr4:144480441-144480840、chr4:154605161-154605362、chr4:175139139-175139340、chr4:54957879-54958080、chr4:54966917-54967118、chr4:76862254-76862455、chr4:76862324-76862525、chr5:101632070-101632386、chr5:137774783-137774984、chr5:14581428-14581629、chr5:159200575-159200776、chr5:36690501-36690757、chr6:100909020-100909338、chr6:148881125-148881326、chr6:27792401-27792602、chr6:78173126-78173327、chr6:91005199-91005400、chr7:107302154-107302371、chr7:127291557-127291758、chr7:148982183-148982384、chr7:155249297-155249498、chr7:15726247-15726749、chr7:23508633-23508834、chr7:32110138-32110339、chr7:32110535-32110736、chr7:37488061-37488262、chr7:86272990-86273280、chr8:120220030-120220231、chr8:21924411-21924612、chr8:22722716-22722917、chr8:38614414-38614615、chr9:129987033-129987234、chr9:131842978-131843179、chr9:132934574-132934775、chr9:89561780-89561981、chr9:93955574-93955775中的任意至少一种。
6.根据权利要求4所述的辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的甲基化生物标记物，其特征在于，所述甲基化生物标记物还包括chr1:109203509-109203710、chr1:161993815-161994087、chr1:206643740-206643941、chr1:228645587-228645788、chr1:46632595-46632796、chr1:6464744-6464945、chr1:64936555-64936756、chr1:85086350-85086551、chr1:860824-861025、chr1:91176442-91176787、chr10:101292482-101292683、chr10:101292534-101292782、chr10:101294542-101294743、chr10:106399412-106399613、chr10:23216742-23216943、chr10:30723791-30723992、chr10:31608087-31608312、chr10:93647199-93647400、chr11:125757528-125757729、chr11:128556673-128556965、chr11:20691328-20691529、chr11:46354464-46354730、chr11:88070679-88070880、chr12:104852338-104852546、chr12:113013114-113013315、chr12:117319092-117319346、chr12:119419534-119419735、chr12:121078557-121078758、chr12:16759630-16759831、chr12:25538193-25538394、chr12:28122985-28123186、chr12:63025847-63026048、chr13:101241024-101241225、chr13:30995562-30995763、chr14:105994515-105994716、chr14:29229354-29229555、chr14:31343793-31343994、chr14:56585385-56585586、chr14:74058385-74058586、chr15:28341879-28342080、chr15:52820459-52820660、chr15:60297942-60298143、chr15:88800903-88801104、chr16:12897377-12897578、chr16:4986146-4986347、chr16:77823515-77823716、chr17:1957597-1957932、
chr17:37764149-37764393、chr17:41791129-41791330、chr17:7982705-7982906、chr18:32557781-32558152、chr18:5542778-5542979、chr19:12943492-12943693、chr19:2461941-2462165、chr19:35168137-35168338、chr19:38182849-38183050、chr19:38210736-38210937、chr19:50828804-50829005、chr19:56879832-56880033、chr19:57901644-57901845、chr19:58258545-58258746、chr2:119613025-119613226、chr2:167232119-167232320、chr2:178013706-178013907、chr2:179278231-179278658,chr2:190445095-190445296、chr2:223183831-223184032、chr2:25439274-25439475、chr2:54682657-54682858、chr2:60809116-60809317、chr20:62103440-62103641、chr21:44495911-44496112、chr21:46351983-46352184、chr3:126075793-126075994、chr3:127347877-127348078、chr3:40428537-40428738、chr3:42814692-42814893、chr4:103266596-103266855、chr4:121993991-121994192、chr4:144480441-144480840、chr4:154605161-154605362、chr4:175139139-175139340、chr4:54957879-54958080、chr4:54966917-54967118、chr4:76862254-76862455、chr4:76862324-76862525、
chr5:101632070-101632386、chr5:137774783-137774984、chr5:14581428-14581629、chr5:159200575-159200776、chr5:36690501-36690757、chr6:100909020-100909338、chr6:148881125-148881326、chr6:27792401-27792602、chr6:78173126-78173327、chr6:91005199-91005400、chr7:107302154-107302371、chr7:127291557-127291758、chr7:148982183-148982384、chr7:155249297-155249498、chr7:15726247-15726749、chr7:23508633-23508834、chr7:32110138-32110339、chr7:32110535-32110736、
chr7:37488061-37488262、chr7:86272990-86273280、chr8:120220030-120220231、chr8:21924411-21924612、chr8:22722716-22722917、chr8:38614414-38614615、
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7.一种检测权利要求1～6任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化差异程度的试剂。
8.权利要求7所述的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的试剂盒中的应用。
9.一种非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移辅助检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的试剂。
10.一种辅助检测非小细胞肺癌早期隐匿性淋巴结转移的方法，其特征在于，包括以下步骤，提取待测的生物样品外周血或组织DNA；对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；对权利要求1～6任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化差异程度进行检测。
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