CN112375822B - 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 - Google Patents
用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112375822B CN112375822B CN202010485435.5A CN202010485435A CN112375822B CN 112375822 B CN112375822 B CN 112375822B CN 202010485435 A CN202010485435 A CN 202010485435A CN 112375822 B CN112375822 B CN 112375822B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chr1
- methylation
- breast cancer
- sites
- biomarker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 183
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 113
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 104
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 104
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 58
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 54
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 claims description 38
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 49
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 101100153581 Bacillus anthracis topX gene Proteins 0.000 description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- 101150041570 TOP1 gene Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 3
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 2
- 101100261006 Salmonella typhi topB gene Proteins 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 101150032437 top-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 101150042997 21 gene Proteins 0.000 description 1
- KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[2-[4-(3,4-dicarboxyphenoxy)phenyl]propan-2-yl]phenoxy]phthalic acid Chemical compound C=1C=C(OC=2C=C(C(C(O)=O)=CC=2)C(O)=O)C=CC=1C(C)(C)C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=C(C(O)=O)C(C(O)=O)=C1 KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094765 70 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000033640 Hereditary breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101001134216 Homo sapiens Macrophage scavenger receptor types I and II Proteins 0.000 description 1
- 101000630267 Homo sapiens Probable glutamate-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102100034184 Macrophage scavenger receptor types I and II Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 102100026125 Probable glutamate-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101100024330 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MSB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150104012 TOP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000025581 hereditary breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000007388 punch biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012950 reanalysis Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了可用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物cg23035715片段。本发明还公开乳腺癌患者的血液cfDNA中cg23035715片段的15个甲基化位点中至少存在3个CpG位点以上的组合的低甲基化表达。上述生物标记物可用于乳腺癌的检测。本发明还公开了检测上述甲基化生物标记物的用于检测乳腺癌的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物 及其应用。
背景技术
cfDNA(cell-freeDNA)是外周血中游离的核酸小片段DNA，源自正常细胞 或肿瘤细胞代谢与凋亡，包含体细胞突变和DNA甲基化等遗传信息。通过检测 特异性cfDNA片段，可掌握疾病的发生、发展的技术，称为液体活检(Liquid Biopsy)。液体活检与传统的组织活检相比，有着迅速、便捷、损伤性小等众多 优点。2014年，来自Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler团队的一份640例各类 肿瘤的研究发现，超过75％的晚期胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃食 管癌、黑色素癌、肝细胞癌以及头颈癌症的患者，都能检测到ctDNA的存在。
甲基化是DNA的一种重要修饰，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以s- 腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定 碱基上的过程。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在CpG双核苷酸的C上，生 成5-甲基胞嘧啶(5mC)。人基因组中60％～90％的(CpG)都被甲基化，未甲基 化的CpG成簇地组成CpG岛，主要位于基因的启动子和外显子区域，长度为 300～3 000bp。靠近或位于启动子区域的异常甲基化一般会抑制转录，沉默相关 基因的表达。在肿瘤中，抑癌基因和DNA修复基因启动子区域的异常高甲基化使得抑癌基因沉默和修复基因失活，从而丧失对肿瘤发生的抑制作用，也是目 前肿瘤甲基化研究的主要方向。与其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作为最 早发现的表观修饰途径之一，其异常甲基化模式在不同肿瘤组织中具有高度特 异性。特征性的甲基化"指纹"图谱可用于癌症早期诊断与分期、疗效评估、复发 监测和预后判断等。
根据国家癌症中心2019年中国最新癌症报告显示，女性发病首位为乳腺癌， 每年发病约为30.4万。女性乳腺癌发病率在0～24岁年龄段处较低水平，25岁 后逐渐上升，50～54岁年龄段达到高峰，55岁以后逐渐下降。针对乳腺癌的易 感基因，欧、美国家做了大量研究，现已知的有BRCA-1、BRCA-2，还有p53、 PTEN等，与这些基因突变相关的乳腺癌称为遗传性乳腺癌，占全部乳腺癌的 5％～10％。乳腺癌21基因检测不仅提供1-5年及5年后复发风险预测，还能作 为唯一多基因检测来预测雌激素受体阳性浸润性乳腺癌患者的化疗及内分泌治 疗的获益程度。乳腺癌70基因检测也在早期乳腺癌诊断中发挥了重要作用。目 前乳腺癌基因检测手段属于一种非侵入性检测，但需要基于原来的手术(乳房 肿瘤切除手术、乳房切除手术或核心穿刺活组织检查)过程中取出的组织检测 基础上。乳腺癌患者在肿瘤发生的早期即发生DNA甲基化变化，其中一些研究 表明，甲基化的频率或密度从正常乳腺到良性病变，再到原位癌或浸润性癌呈 现逐渐增加。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种乳腺癌的甲基化生物标记物。
实现上述目的的技术方案如下。
一种用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，该生物标记物为低甲基化的cg23035715片段，序列如SEQ ID NO.1所示。
在其中一些实施例中，所述cg23035715片段包括以下15个甲基化位点中 的任意至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合，所述15个甲基 化位点为：chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662，chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762， chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802， chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825。
在其中一些实施例中，所述至少3个甲基化修饰CpG位点以上共甲基化模 式组合包括来自于chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和 chr1:223302662位置处的甲基化修饰CpG位点中至少一个。
在其中一些实施例中，所述至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化 模式组合包括来自于chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和 chr1:223302662位置处甲基化修饰的CpG位点至少两个。
在其中一些实施例中，所述至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化 模式组合包括来自于chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和 chr1:223302662位置处甲基化修饰的CpG位点至少三个。
在其中一些实施例中，所述至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化 模式组合包括来自chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和 chr1:223302662甲基化修饰的CpG位点至少一个；以及包括以下甲基化修饰CpG 位点的至少两个：chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753， chr1:223302762和chr1:223302764。
在其中一些实施例中，所述至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化 模式组合包括来自chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和 chr1:223302662位置处甲基化修饰的CpG位点至少两个；以及包括以下位置处 甲基化修饰的CpG位点的至少一个：chr1:223302700，chr1:223302710， chr1:223302753，chr1:223302762和chr1:223302764。
在其中一些优选的实施例中，15个甲基化位点中的4个甲基化修饰CpG位 点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651 和223302700。
在其中一些优选的实施例中，15个甲基化位点中的5个甲基化修饰CpG位 点以上的共甲基化模式组合：223302630，chr1:223302635，chr1:223302651、 chr1:223302662和chr1:223302700。
本发明还提供了上述甲基化生物标记物在制备乳腺癌检测试剂盒中的应 用。
本发明的另一目的是提供上述甲基化生物标记物在制备乳腺癌早期诊断试 剂盒中的应用。
本发明的另一目的是提供早期诊断乳腺癌的试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种早期诊断乳腺癌的试剂盒，包括检测样品中的如上所述甲基化生物标记 物的共甲基化模式为低甲基化的试剂
在其中一些实施例中，所述样品为外周血，例如全血或血浆或者血清。
在其中一些实施例中，所述试剂是根据采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化 测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、 全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC 法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
在其中一些实施例中，所述乳腺癌如早期乳腺癌。
本发明的发明人发现，对应cg23035715片段的低共甲基化率与乳腺癌(特 别是早期乳腺癌)非常相关，可作为乳腺癌诊断的甲基化生物标记物。进一步 地，还发现乳腺癌患者的血液cfDNA中cg23035715片段的15个甲基化位点， 包括第chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662，chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762， chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802， chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825位置中至少存在3个CpG位 点以上的共甲基化修饰组合的低甲基化状态。所述生物标记物可用于乳腺癌， 特别是早期乳腺癌的检测。
附图说明
图1是实施例2中74例健康人和155例乳腺癌患者血浆cfDNA中cg23035715 片段共甲基化率的比较结果示意图。
图2是实施例2中74例健康人与155例乳腺癌患者血浆cfDNA中在表1随机 八种模式的共甲基化率比较结果示意图。
图3是实施例3中独立验证集中top1的共甲基化模式的ROC曲线(a)以及在不 同乳腺癌分期中的灵敏度和特异性(b)。
图4是实施例3中独立验证集中top3的共甲基化模式的ROC曲线(a)以及在不 同乳腺癌分期中的灵敏度和特异性(b)。
图5是实施例3中独立验证集中top1/2/3的共甲基化模式组合的ROC曲线(a)以 及在不同乳腺癌分期中的灵敏度和特异性(b)。
图6是实施例3中独立验证集中top1/2/3的共甲基化模式与随机四种共甲基化模式组合的ROC曲线(a)以及在不同乳腺癌分期中的灵敏度和特异性(b)。
图7是实施例3中独立验证集中69种共甲基化模式组合的ROC曲线(a)以及在 不同乳腺癌分期中的灵敏度和特异性(b)。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的 各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技 术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是 为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本申请实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排 他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定 于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括 对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本文中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关 联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A， 同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一 种“或”的关系。
本申请涉及公开了用于乳腺癌(Breast Cancer,BC)患者血浆细胞游离 DNA(cell-free DNA,cfDNA)低甲基化CpG岛(CpG island)的发现。具体地， 研究获得了在乳腺癌血浆中明显异常甲基化修饰的基因组片段，即 cg23035715，其包括了15个甲基化的＝修饰的CpG位点及其至少包含3个甲基 化修饰的CpG位点上所有组合的形式。通过研究血浆甲基化修饰的基因组片段 在各期乳腺癌患者及健康人群中的甲基化修饰差异，发现该血浆基因组片段确 实存在低甲基化率的组合模式。进一步的研究发现至少3个以上甲基化修饰的 CpG位点组成的共甲基化模式，与正常健康人血浆cfDNA该片段的共甲基化模 式比较，乳腺癌癌者血浆cfDNA中存在非常显著的低甲基化率。
癌症和肿瘤基因组图谱在线(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库严 格比较分析了乳腺癌与癌旁组织的甲基化修饰CpG位点信息，筛选出乳腺癌特 异性的甲基化位点。
针对血浆cfDNA中低量的肿瘤DNA(circling tumor DNA,ctDNA)样本和 亚硫氢盐处理DNA损伤的问题，采用建库和杂交捕获技术：AnchorDx EpiVisioTM MethylationLibrary Prep Kit(AnchorDx,Cat#A0UX00019)， AnchorDx EpiVisioTM Indexing PCRKit(AnchorDx,Cat#A2DX00025)和 AnchorDx EpiVisioTM Target Enrichment Kit(AnchorDx,Cat#A0UX00031)。
基于靶向循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)的甲基化测序， 筛选乳腺癌与正常对照样本差异化甲基化位点(different methylation loci,DML) 和差异化甲基化区域(different methylation region,DMR)，包括如下步骤：
步骤一、根据TGCA乳腺癌与癌旁甲基化芯片数据筛选出来的乳腺癌特异 性的甲基化标记物；
步骤二、健康人和乳腺癌患者血浆cfDNA提取、甲基化建库；
步骤三、乳腺癌特异性panel靶向杂交捕获甲基化预文库；
步骤四、靶向捕获的文库定量，上机进行二代测序；
步骤五、数据预处理，获得探针捕获得到的真实reads数据(bam file)；
步骤六、甲基化数据分析，筛选乳腺癌与正常对照血浆cfDNA的DML和 DMR。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许 多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施 例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
本实施例公开了上述用于预测结乳腺癌ctDNA差异性甲基化标记物 (marker)的筛选方法，详细方案流程见图1，具体包括以下步骤：
一、标记物的筛选方法
1.根据TGCA数据筛选出来乳腺癌特异性的甲基化标记物
1.1从TCGA下载乳腺癌组织及癌旁组织的甲基化450k芯片(IlluminaHumanMethylation450 BeadChip)的数据；
1.2对数据进行预处理：过滤缺失值，可补全缺失值，去除批次效应，去除不 稳定的CpG位点，选择乳腺癌特异性的3288个甲基化位点作为最终的标记 物集。
二、建库流程和方法
1.血浆cfDNA提取及甲基化建库
1.1血cfDN的提取。
血浆DNA提取具体操作步骤按照Life公司的MagMAX TM Cell-Free DNAIsolation Kit操作说明书进行。
1.2转化
将提取的cfDNA(10ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的 DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNAMethylation-Lightning Kit说 明书进行。
1.3末端修复
1.3.1将转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
1.3.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
37℃30min
95℃5min
热盖105℃
1.3.3当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直 接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作
1.4连接I
1.4.1配制如下反应液
1.4.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.5扩增I
1.5.1配制如下反应液
1.5.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6纯化I：加入166ul 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对Amplification I反应后的产物进行纯化，用21ul EB进行洗脱， 纯化具体步骤如下：
1.6.1取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166ul 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。
1.6.2室温孵育5min。
1.6.3离心，置于磁力架上静置5min。
1.6.4吸去上清。
1.6.5加入200ul 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇。
1.6.6重复步骤5)一次。
1.6.7离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。
1.6.8开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。
1.6.9加入21ul EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。
1.6.10离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。
1.6.11吸取20ul上清于新的PCR管中。
1.7连接II
1.7.1配制如下反应液：
| 组分 | 体积(ul) |
| 上一步反应体积 | 20 |
| H2O | 4 |
| MSB1 Buffer | 8 |
| MSR1 Reagent | 2 |
| MSR5 Reagent | 2 |
| MSE1 Enzyme | 2 |
| MSE5 Enzyme | 2 |
| 总体积 | 40 |
1.7.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8Indexing PCR:
1.8.1配制如下反应液：
1.8.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9纯化II
加入Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR 反应后的产物进行纯化，用41ul EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
1.9.1取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71ul未稀释的AgencourtAMPure Beads，用移液器吹打混匀.
1.9.2室温孵育5min。
1.9.3离心，置于磁力架上静置5min。
1.9.4吸去上清。
1.9.5加入200ul 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇。
1.9.6重复步骤5)一次。
1.9.7离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。
1.9.8开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。
1.9.9加入41ul EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。
1.9.10离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。
1.9.11吸取20ul上清于新的PCR管中。
1.10Qubit定量：取1ul用Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行定量。
2.通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说 明书进行操作。
3.采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4.下机数据的处理：
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp 过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端 的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用 bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得 到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bam file)，对bam文件进行统计和 分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5.共甲基率差异化分析筛选验证共甲基化片段标记物
利用TCGA筛选的3288个甲基本化标记物，进一步通过40对配对的组织和血 浆来验证甲基化水平的一致性，并进一步筛选与乳腺癌诊断相关的1996个基因 甲基化生物标记物。对TGCA来源筛选3288和过滤后的1996个甲基化标记物 在位点数据在正常与乳腺癌样本中进行聚类分析，筛选后1996个甲基化标记物 在正常血浆与乳腺癌样本存在最显著异常甲基化的位点。该1996个甲基化生物 标记物，以下简称位点或者marker。再从以上1996个甲基化生物标记物经过在 52例健康和108例乳腺癌患者血浆cfDNA中进行模型训练和测试，进一步筛选, 分别利用两种算法LASSO和RandomForest筛选到42和50种甲基化标记物， 最后在22例健康和47例乳腺癌患者血浆cfDNA的独立验证集中，进行26个 甲基化物的筛选和验证，发明人从26个甲基化标记物中创造性筛选出甲基化标 记物为cg23035715片段，进一步研究发现其存在15个CpG位点，根据以往大 量的研究和独创的分析，cg23035715片段中的甲基化位点进行验证分析。
6.共甲基化模式组合的片段定义以及共甲基化率计算方法
我们先重点分析了差异化的甲基化修饰CpG位点，同时对其相邻的CpG位 点信息一并进行分析，并进一步寻找和计算不同的差异化CpG点组合的规律和 特征，最终发现在乳腺癌患者血浆cfDNA中对于某些特定的CpG岛，存在由 至少3个以上甲基化修饰的CpG位点形成的共甲基化片段，与正常健康人相比， 共甲基化率有明显差异，能够很好的区分乳腺癌患者与健康人群。当该片段存 在至少3个以上的甲基化修饰CpG位点，我们定义为一个共甲基化的组合片段 (co-methylated read)，每一种共甲基化组合都可以计算出一个共甲基化率，共 甲基化率＝所有共甲基化reads/(非共甲基化reads+共甲基化reads),也即该片段 区域的所有共甲基化组合的片段数目去除以该片段二代测序所测到所有数目。 P-vlaue所得为wilcoxn test，p<0.001为有显著性统计学意义；diff定义为乳腺癌 患者血浆cfDNA中某种组合在所有样本的平均甲基化率(mea_Malignant)减去 健康人血浆cfDNA该种组在所有健康人样本的平均甲基化率(mean-Normal), 如果diff<0,我们却认为该种组合在乳腺癌患者血浆cfDNA中为低甲基化率。另 加，我们还计算了几种共甲基化片段组合和所有69种共甲基化片段组合的AUC 值，AUC(area under the curve)是ROC(ReceiverOperating Characteristic)曲线下 的面积，用于判断该组合诊断乳腺癌的能力，AUC越接近1，表示越优。
实施例2
本实施例公开了乳腺癌患者血浆cfDNA中以DNA片段单元参考序列 cg23035715为基准，如SEQ ID NO.1所示，其中，包括了15个甲基化修饰CpG 位点，包括第chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662， chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762， chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802， chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825，具体依次如SEQ ID NO.1 序列中标记所示。进一步地，上述至少3个甲基化修饰位点的共甲基化组合， 形成了低甲基化状态。
利用52例钼靶和彩超无异常的正常人的血浆样本以及108确诊例乳腺癌病 人的血浆样本进行模型训练和测试后，在22例健康和47例乳腺癌患者血浆cfDNA组成的独立验证中进行cg23035715的甲基化位点检测。
其中一种所述检测方法，包括以下步骤：
(1)对所述待测样本外周血中的游离DNA进行转化处理，即将提取的 cfDNA(10ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转 变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转 化具体操作按照Zymo Research的EZDNA Methylation-Lightning Kit说明书进行
(2)基于所述转化处理的样本，构建测序文库，测序获得测序数据；
(3)将所述测序数据与参考序列进行比对，基于比对结果确定所述测序数据中目标位点的甲基化结果；所述参考序列为人血浆中cfDNA片段单元参考序列 cg23035715为基准；
其中所述测序是通过第二代测序方法或第三代测序方法进行的。
SEQ ID NO.1： 
ATA
CCATGTGGTCAGCA
ACTTCTCCA
TCTCCTCTTTCTCTTCTTCCTGCAGAGTGAGCCCAC
GTTCACCA
TTGCTCTTGCCCCTAGCCC ACCAGGCCCTGGCCCTCAGCAG
GACCT GC
GTTTCTGGACTAGG AAGGCCCTGCTCC
AC
ACC
GAG
CTGCTGCCCTCTAC
cg23035715片段长195bp，
代表15个CpG位点。
检测结果可发现，与正常对照血浆cfDNA比较，乳腺癌患者血浆cfDNA中 该片段的至少3以上甲基化修饰位点的共甲基化组合计算甲基化率低，(健康vs 乳腺癌＝0.1417vs0.0865，p-value<2.22e-16)；所述共低甲基化位点包括 chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662， chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762， chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802，chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825位置中至少3个CpG位点以上的组合，共有69种共甲基化组合模式的共甲基化片段见表1)，其共甲基化率 详细见图1(图1是表1中69种组合的共甲基化片段的共甲基化率在所有健康 和乳腺癌患者血浆中的比较结果)单个样本该cg23035715片段的甲基化率＝共 甲基化reads/非共甲基化reads+共甲基化reads，图1展示与74健康人血浆 cfDNA比较，155例乳腺癌患者血浆cfDNA中69种组合方式的共甲基化片段存 低甲基化率，且具有非常显著性的统计学意义。
请参见图2，图2为表1中挑选了8种组合的，每一个共甲基化片段在74 例健康人群与155例乳腺癌患者人群的血浆cfDNA共甲基化率的比较，从图2 中可以得知，每一个共甲基化片段乳腺癌患者人群的血浆cfDNA中是存在低 甲基化修饰模式的。
这些位点在74例健康人群和155例乳腺癌患者人群的血浆cfDNA中的69 种共甲基化组合模式以及共甲基化片段的共甲基化率计算结果请见表1。
实施例3
利用其中15个甲基化修饰CpG位点形成的共甲基化修饰的各种组合，对 74例钼靶和彩超无异常的正常人以及155例确诊的乳腺癌病人血浆样本进行检 测，进一步筛选69种共甲基化组合模式有显著统计学差异，如表1所述，具体 的实验以及下机数据处理与实施例1一致，通过计算血浆cfDNA中69种共甲 基化组合模式的共甲基化片段的甲基化率，在乳腺癌患者血浆cfDNA中共甲基 化率显著低于正常健康人群(diff<0，p-value<0.001)，以人血浆cfDNA片段单 元参考序列cg23035715为基准，参见表1。
为便于描述，将血浆cfDNA中一种cg23035715基因内含子DNA片段单元 参考序列共197bp个碱基的15个位点描述为一种简体形式，chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662，chr1:223302700， chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762，chr1:223302764， chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802，chr1:223302807， chr1:223302809和chr1:223302825的15个CpG位点的组合中，用C和T来代 表上述15个位点，C代表上述15个位点中甲基化的CpG位点的C,T代表未甲 基化的CpG位点的C，中间的碱基序列省略未展示。其中，15个位点依次为 CCCTCTTTTTTTTTT,CCCCCTTTTTTTTTT，CCTCCTTTTTTTTTT， CCCCTTCTTTTTTTT，CCTTTTCTTTTTTTT，CTCCTTTTTTTTTTT, CCTTCTTTTTTTTTT,CCTCTTCTTTTTTTT和CCTTTTTCTTTTTTT等69种甲 基化C与非甲基化T组合。
其中，乳腺癌血浆cfDNA片段单元参考序列基准，共甲基化模式的69种 组合的甲基化率均比正常健康人血浆cfDNA中组合共甲基化率显著低，见图1， 而且AUC>0.8以上的表1中1-3的3种共甲基化模式组合均包含了15个CpG 位点中前4个CpG位点位点组合而成，包括chr1:223302630，chr1:223302635， chr1:223302651和chr1:223302662，参与形成的组合：CCTCTTTTTTTTTTT， CCCCTTTTTTTTTTT和CCCTTTTTTTTTTTT。该形式表示为血浆cfDNA片段 单元参考序列共197bp个碱基一种简体形式，其中，C代表甲基化的CpG位点 的C，T代表未甲基化的CpG位点的C，中间的碱基序列省略未展示，序列见 实施例2中的序列表1。
22例钼靶和彩超无异常的正常人的组织样本以及47例乳腺癌病人的血浆样 本组成的独立验证集中，进一步验证由前4个CpG位点形成的 CCTCTTTTTTTTTTT共甲基化模式片段的单一组合，在95％特异性下，验证 集的0期的检测灵敏度均为55％(2/3)，I期的检测灵敏度均为36.67％(4/12)，II期的检测灵敏度均为47.5％(10/22)，III期的检测灵敏度均为22.91％(2/8)， IV期检测灵敏度均为27.5％(1/2)，整体检测的整体灵敏度均为40.18％(19/47),AUC分别为0.8680，见图3a-3b。
进一步验证由前4个CpG位点形成的CCCTTTTTTTTTTTT共甲基化模 式片段的单一组合，在95％特异性下，验证集的0期的检测灵敏度均为100％ (3/3)，I期的检测灵敏度均为100％(12/12)，II期的检测灵敏度均为68.18％ (15/22)，III期的检测灵敏度均为50％(4/8)，IV期检测灵敏度均为100％(2/2)， 整体检测的整体灵敏度均为76.59％(36/47),AUC分别为0.9163，见图4a-4b,从 结果来看CCCTTTTTTTTTTTT模式组合对于早期乳腺癌诊断的灵敏度高。
进一步验证由前4个CpG位点形成的CCTCTTTTTTTTTTT、 CCCCTTTTTTTTTTT和CCCTTTTTTTTTTTT三种共甲基化模式片段进行组合 (top1、top2、top3)，在95％特异性下，验证集的0期的检测灵敏度均为100％ (3/3)，I期的检测灵敏度均为91.67％(11/12)，II期的检测灵敏度均为81.82％ (18/22)，III期的检测灵敏度均为75％(6/8)，IV期检测灵敏度均为100％(2/2)， 整体检测的整体灵敏度均为85.11％(36/47),AUC分别为0.9671，见图5,从结 果来看三种模式组合对于乳腺癌诊断的整体灵敏度有所提高，且仍然对早期诊 断较好，ROC曲线稳定性更好。
进一步验证由前4个CpG位点形成的CCTCTTTTTTTTTTT， CCCCTTTTTTTTTTT、CCCTTTTTTTTTTTT的三种共甲基化模式片段与随机 挑选的其它65种模式中的TTTTTCCCCTTTTTT、TTTCCCTTTTTTTTT、 TTCCTTTCTTTTTTT、CCTTTTCTCTTTTTT四种共甲基化模式片段形成的组 合，在95％特异性下，验证集的0期的检测灵敏度均为100％(3/3)，I期的检 测灵敏度均为91.67％(11/12)，II期的检测灵敏度均为95.45％(21/22)，III期的 检测灵敏度均为87.5％(7/8)，IV期检测灵敏度均为100％(2/2)，整体检测的 整体灵敏度均为93.62％(44/47),AUC分别为0.9671，见图6a-6b,从结果来看 三种模式组合与其它随机四种模式的组合对于乳腺癌诊断的整体灵敏度有所提 高，且仍然对早期诊断较好，ROC曲线稳定性更好。
进一步验证69种共甲基化模式片段的整体组合，在95％特异性下，验证集 的0期的检测灵敏度均为100％(3/3)，I期的检测灵敏度均为100％(12/12)，II 期的检测灵敏度均为95.45％(21/22)，III期的检测灵敏度均为87.5％(7/8)，IV 期检测灵敏度均为100％(2/2)，整体检测的整体灵敏度均为95.74％(41/47),AUC 分别为0.9691，见图7a-7b,从结果来看69种组合对于早期乳腺癌诊断的灵敏度 高，整体灵敏度最高，ROC曲线稳定性最好。
通过表1的结果，可以看出：以血浆cfDNA片段单元参考序列cg23035715 为基准，所述15个甲基化位点包括以下至少3个以上甲基化修饰CpG位点的组 合：包括第chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662， chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762， chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802，， chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825位置中至少3个以上甲基化 修饰CpG位点形成的共甲基化模式组合，在乳腺癌患者血浆cfDNA存在低甲基 化。
其中，血浆cfDNA片段单元参考序列cg23035715为基准，包括了15个CpG 位点，按照表1中69种低甲基化率的共甲基化模式组合进行统计，发现前面4 个CpG位点chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662 中的至少一个参与乳腺癌患者血浆cfDNA代甲基化率的共甲基化模式组合的概 率较大，比较常见或更相关的是其中2个CpG位点或者3个甲基化修饰CpG位 点参与共甲基化模式组合，该4个甲基化位点与后面第5-99个甲基化位点结合 一起，至少有3个甲基化修饰的CpG位点参与共甲基化模式组合的概率也较大。
表1 69种共甲基化组全片段的甲基化率在健康人群和乳腺癌患者血浆cfDNA 的比较
1.第一列为该cg23035715片段长197bp，共有15个CpG位点，定义其中至少 3个甲基化修饰位点的共甲基化模式组合为一个共甲基化的read，包括69种 共甲基化模式组合。
2.第二和第三列分别代表了乳腺癌患者和健康人群血浆cfDNA中单种共甲基 化模式片段的平均共甲基化率。
3.Diff为负数是表示该组合的共甲基化率在乳腺癌患者中低于正常健康人群。
4.P-value为wilcoxn test(符号秩检验)。
5.AUC衡量单个共甲基化模式区分乳腺癌患者与健康人的能力。
6.CCCTCTTTTTTTTTT,CCCCCTTTTTTTTTT……表述为组合形式，并非实际 碱基，血浆cfDNA片段单元参考序列共197bp个碱基，C代表甲基化的CpG 位点的C,T代表未甲基化的pG位点的C，中间的碱基序列省略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatacgcca tgtggtcagc acgacttctc cacgtctcct ctttctcttc ttcctgcaga 60
gtgagcccac cggttcacca cgttgctctt gcccctagcc caccaggccc tggccctcag 120
cagcggacct gccgcggttt ctggactagg aaggccctgc tcccgaccga cccggagcgc 180
gctgctgccc tctaccg 197
Claims (10)
1.一种用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，该生物标记物为低甲基化的cg23035715片段，序列如SEQ ID NO.1所示；
所述cg23035715片段包括以下15个甲基化位点中的至少3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合，所述15个甲基化位点为：chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，chr1:223302662，chr1:223302700，chr1:223302710，chr1:223302753，chr1:223302762，chr1:223302764，chr1:223302793，chr1:223302797，chr1:223302802，chr1:223302807，chr1:223302809和chr1:223302825；
且15 个甲基化位点中的包括选自以下至少3 个甲基化修饰位CpG点以上的共甲基化模式组合：chr 1:223302630, chr 1:223302635 , chr 1: 223302651 和chr1:223302662。
2.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下4个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651和chr1:223302700。
3.根据权利要求2所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下5个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1223302630，chr1:223302635，chr1:223302651、chr1:223302662和chr1:223302700。
4.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302635，和chr1:223302662。
5.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302635，和chr1:223302651。
6.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302651，和chr1:223302662。
7.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下3个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合： chr1:223302635，chr1:223302651，和chr1:223302662。
8.根据权利要求1所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，15个甲基化位点中的包括以下4个甲基化修饰CpG位点以上的共甲基化模式组合：chr1:223302630，chr1:223302635，chr1:223302651，和chr1:223302662。
9.根据权利要求1-8任一项所述的用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物，其特征是，所述乳腺癌为早期乳腺癌。
10.检测权利要求1-8任一项所述甲基化生物标记物的试剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010485435.5A CN112375822B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 |
| PCT/CN2021/096741 WO2021244423A1 (zh) | 2020-06-01 | 2021-05-28 | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010485435.5A CN112375822B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112375822A CN112375822A (zh) | 2021-02-19 |
| CN112375822B true CN112375822B (zh) | 2021-11-02 |
Family
ID=74586356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010485435.5A Active CN112375822B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112375822B (zh) |
| WO (1) | WO2021244423A1 (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112391466A (zh) * | 2020-05-19 | 2021-02-23 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物或其组合和应用 |
| WO2022253288A1 (zh) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 广州燃石医学检验所有限公司 | 一种甲基化测序方法和装置 |
| CN114317736B (zh) * | 2021-08-19 | 2022-09-13 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用 |
| CN115772564B (zh) * | 2021-09-08 | 2023-08-18 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于辅助检测肺癌体细胞atm基因融合突变的甲基化生物标记物及其应用 |
| CN113930516B (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-19 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 宫颈癌相关基因甲基化的引物、试剂盒、模型及构建方法 |
| CN113943817B (zh) * | 2021-12-20 | 2022-04-19 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 宫颈癌癌化水平评估模型及构建方法 |
| CN113948150B (zh) * | 2021-12-21 | 2022-04-19 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | Jmml相关基因甲基化水平评估方法、模型及构建方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017129716A1 (en) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | Epigenomics Ag | Methods for detecting cpg methylation of tumor-derived dna in blood samples |
| KR102031345B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2019-10-11 | 서울대학교산학협력단 | ＬＩＮＥ１ 조절 영역에서 ＣｐＧ 부위의 메틸화 수준을 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 |
| CN108676879A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-10-19 | 中国科学院北京基因组研究所 | 特异甲基化位点作为乳腺癌分子分型诊断标志物的应用 |
| CN109385464A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-02-26 | 中山大学附属第六医院 | 一种dna甲基化检测试剂盒及方法 |
| CN109385465B (zh) * | 2018-07-27 | 2019-12-24 | 中山大学附属第六医院 | 一种dna甲基化定量系统 |
| CN109456968B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-10-04 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 基于甲基化修饰的肿瘤标记物 |
| CN110195107B (zh) * | 2019-05-27 | 2023-04-14 | 清华大学 | 外周血中癌症检测的核糖体dna甲基化标记物及其应用 |
-
2020
- 2020-06-01 CN CN202010485435.5A patent/CN112375822B/zh active Active
-
2021
- 2021-05-28 WO PCT/CN2021/096741 patent/WO2021244423A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112375822A (zh) | 2021-02-19 |
| WO2021244423A1 (zh) | 2021-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112375822B (zh) | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN110872631B (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
| KR102587176B1 (ko) | 혈장으로부터 태아 또는 종양 메틸롬의 비침습적 결정 | |
| CN102311953B (zh) | 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒 | |
| CN114317738B (zh) | 用于检测胃癌淋巴结节转移相关的甲基化生物标记物或其组合及应用 | |
| CN112176057B (zh) | 利用CpG位点甲基化水平检测胰腺导管腺癌的标志物及其应用 | |
| JP7391082B2 (ja) | 腫瘍を診断するためのｄｎａメチル化に関連するマーカー及びその使用 | |
| CN112899359A (zh) | 用于肺结节良恶性检测的甲基化标记物或其组合及应用 | |
| WO2022143396A1 (zh) | 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒 | |
| WO2021180105A1 (zh) | 一种检测常见两性癌症的探针组合物 | |
| WO2021185274A1 (zh) | 一种检测6种中国高发癌症的探针组合物 | |
| WO2024060775A1 (zh) | 新型的肿瘤检测标志物TAGMe及其应用 | |
| WO2021233329A1 (zh) | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物或其组合和应用 | |
| JP2023550141A (ja) | 制限酵素及びハイスループット配列決定を用いたｄｎａ試料におけるメチル化変化の検出 | |
| WO2021169874A1 (zh) | 一种检测3种管腔性器官肿瘤的探针组合物 | |
| CN102776270A (zh) | 检测dna甲基化的方法和装置 | |
| JP7462035B2 (ja) | １１種類の癌を検出するプローブ組成物 | |
| CN115851923A (zh) | 用于检测结直肠癌淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN117441027A (zh) | Heatrich-BS：用于亚硫酸氢盐测序的富含CpG的区域的热富集 | |
| JP7383727B2 (ja) | メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーｓｔａｍｐ－ｅｐ７及びその応用 | |
| CN115772566B (zh) | 用于辅助检测肺癌体细胞erbb2基因突变的甲基化生物标记物及其应用 | |
| WO2022188776A1 (zh) | 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用 | |
| WO2023078283A1 (zh) | 用于乳腺癌诊断的甲基化生物标记物及其应用 | |
| WO2024192928A1 (zh) | 一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用 | |
| CN114250298B (zh) | 胰腺导管腺癌的dna甲基化标志物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Methylation biomarkers for detection of breast cancer and their applications Effective date of registration: 20220314 Granted publication date: 20211102 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000042 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230420 Granted publication date: 20211102 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000042 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |