CN109385465B

CN109385465B - 一种dna甲基化定量系统

Info

Publication number: CN109385465B
Application number: CN201810845927.3A
Authority: CN
Inventors: 禹汇川; 骆衍新; 白亮亮; 唐冠楠; 王小琳; 李英杰; 黄增鸿; 黄美近; 汪建平
Original assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN109385465A; WO2020019701A1

Abstract

本发明涉及一种DNA甲基化定量系统。该系统包括获取待测DNA样品中，甲基化和非甲基化待测CpG的量的采集构件，以及通过甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数PMR的处理构件。该系统不仅适用于CpG岛内的共甲基化CpG位点的甲基化定量，还尤其适用于针对侧翼序列没有CpG位点的DNA甲基化定量。该方法不需要对照反应和完全甲基化的DNA标准品作为参照，从而可以克服它们带来的缺陷，具有更高的重复性和准确性。

Description

一种DNA甲基化定量系统

技术领域

本发明属于分析方法技术领域，涉及一种DNA甲基化定量系统。

背景技术

癌症组织中存在的胞嘧啶-5DNA甲基化(m5C)被认为是具有潜在临床价值的DNA表观修饰[1]。在脊椎动物中，m5C主要出现在CpG二核苷酸。在多种肿瘤中已经证实，抑癌基因启动子的CpG岛(CGI)异常甲基化导致了转录失活[2]。启动子内的CGI仅代表甲基化的一小部分，而主要位于基因体中的CpG open sea则代表了真核生物中最保守的DNA甲基化靶标，但该区域甲基化的功能尚不清楚。最近的研究揭示了非启动子区域(如基因体和UTR)甲基化对基因表达的协同效应，基因体甲基化可能是癌症中潜在的治疗靶点[3]。此外，基因体甲基化可能是RNA选择性剪接调控的潜在机制[4]，并且可限制转录起始，从而阻止异常转录[5]。我们在以往研究中通过EPIC甲基化芯片发现，复发和非复发结直肠癌患者的差异甲基化位点(differential methylation positions,DMPs)在CGIs和启动子中很少，但在open sea和基因体中很多。我们还在基因体中发现了与基因过表达相关的一组高甲基化CpG位点。

由于分析基因组中的甲基化有很大的价值，许多检测甲基化的方法和技术得以开发。

目前，常用于队列验证的甲基化定量方法有三种。1、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)是一种终点分析技术[6,7]，使用甲基化特异性引物扩增DNA样品后，通过观测DNA凝胶电泳的条带强弱，可以对待测位点的甲基化水平进行判断，但这只能实现半定量的甲基化检测；2、之后，第二代基于PCR的技术——MethyLight(定量MSP)被用来进行定量检测[8-10]，样品的待测位点甲基化反应荧光信号值通过与AluC4反应相比进行输入控制，再与完全甲基化样品相比，得到甲基化比例[11,12]，这一定量体系的缺陷显而易见，尤其是在基因组不稳定的肿瘤标本中，全基因组拷贝数变异和突变对待测位点和AluC4内参照稳定性的影响无法完全避免，而且两个独立反应中随机误差的累积会造成检测的重复性和准确性降低。此种方法，由于甲基化水平的绝对定量依赖甲基化标准品，如果要获取某位点甲基化水平的绝对值，需同时设置100％甲基化标准品，通过样品和标准品的比值计算甲基化百分比参数(percentage of methylation ratio,PMR)。若甲基化标准品生产批次不同或存在不可避免的质量缺陷，如CG位点未100％甲基化、m5C自发脱氨基转化为T、DNA降解等，将造成甲基化水平绝对值定量的严重误差。3、在亚硫酸氢盐焦磷酸测序中，通过测序反应中在待测位点消耗的C和T碱基，或G和A碱基的数量，间接计算待测位点的甲基化比例，计算方法当测序引物在正义链时为：C峰高度/(C峰高度+T峰高度)×100；测序引物在反义链时为：G峰高度/(G峰高度+A峰高度)×100。焦磷酸测序是目前被广泛认为最为准确的一种甲基化定量技术，但该检测需要专门的焦磷酸测序仪，目前仅有少数的国内科研和商业机构提供该测序仪的开放使用或服务，并且测序成本、检测工作量和检测周期远高于基于PCR的MSP和定量MSP。

此外，现有的DNA甲基化检测技术都要求待测位点位于具有成簇CpG二核苷酸的区域，例如CpG岛，以允许设计的引物和探针覆盖足够多的CpG位点，检测的也并非是这一位点，而是被引物和探针覆盖的全部CpG位点共甲基化的状况，然而，现有技术存在以下问题：

(1)无法准确检测基因组中存在的杂合甲基化。如果相邻CG位点未表现为共甲基化现象，在此区域无法成功设计qMSP技术所需的引物和探针。

(2)无法检测CpG岛以外区域的甲基化水平。基因组中CpG岛以外区域包括opensea、CpG shore等区域，主要位于gene body和基因间区，此区域CG位点较少，很少存在相邻的CG位点，在此区域无法设计qMSP技术所需的引物和探针。

除非采用测序(亚硫酸氢盐焦磷酸测序)，可以不需要甲基化标准品，以及检测非CpG到的CpG位点，但是它在大样本的队列验证中不具有成本-效益优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基化定量系统。

本发明的另一个目的在于提供一种针对侧翼序列别有CpG位点的DNA甲基化定量系统。

本发明的另一个目的在于提供一种准确性高、便宜、便捷、迅速的DNA甲基化定量系统。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

本发明提供了一种DNA甲基化定量系统，所述的系统包括以下构件：

a)采集构件：所述的采集构件用于采集待测DNA样品的甲基化DNA的量和非甲基化DNA的量；

b)处理构件：所述处理构件采用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数(percent of methylated referenc，PMR)；

作为优选的实施方式，所述的系统还含有：

c)输出构件：所述的输出构件用于输出处理构件得到甲基化百分比参数(percentof methylated referenc，PMR)。

本系统中，PMR由甲基化/(甲基化+非甲基化)的比率决定，不需要完全甲基化的DNA作为参照计算。避免了参照样品DNA未完全甲基化，而带来的PMR计算偏差。经实验证实，本发明的系统与焦磷酸测序的结果几乎完全一致。而传统MethyLight即使与焦磷酸测序的结果线性相关，但PMR存在一定的偏差。

本发明的DNA甲基化定量系统，所检测的CpG位点可以是启动子区域中的CpG岛中相邻CpG位点。现有的技术，DNA甲基化主要是针对CpG岛中的甲基化，如MethyLight(甲基化特异性定量PCR)技术检测CpG岛(CpG Island,CGI)的甲基化，主要是基于启动子区域中的CpG岛中相邻CpG位点普遍存在共甲基化的现象。

此外，本发明的DNA甲基化定量系统，所检测的CpG位点，也可以是杂合甲基化的CpG位点，或者是侧翼没有CpG的孤立的CpG位点。因为启动子内的CGI仅代表甲基化的一小部分，现在逐渐发现主要位于基因体中的CpG open sea在疾病发生发展和异常的细胞内分子事件中发挥重要作用。

本发明的DNA甲基化定量系统，对于检测的区域无特别限制，可以适用所有DNA区域的甲基化检测，如CpG岛(CpG Island,CGI)以及侧翼没有CpG的孤立的CpG位点，一般是位于CpG岛外的CpG位点，如位于基因体或基因间区的CpG open sea、CpG shore、CpG shelf仅需获得该检测区域的DNA甲基化和非甲基化的量即可。

传统基于PCR的甲基化检测技术依据的假设为：CpG岛内的全部CG位点同时发生甲基化或者同时未发生甲基化，称为共甲基化区域。设计的引物和探针覆盖该区域内的多个CG位点，检测的是这些CG位点同时发生甲基化的比例，并非单个CG位点的高分辨率检测技术。

虽然，全基因组甲基化测序技术揭示，CpG岛的共甲基化现象普遍存在，但仍然存在许多不是共甲基化的区域，其中相邻的CG位点有的甲基化，有的无甲基化，称为杂合甲基化区域。杂合甲基化区域主要存在于CpG open sea、shore、shelf以及部分CpG岛内。由于本发明为单个CG位点的高分辨率检测技术，远远高于传统技术3～10个CG位点的低分辨率，本发明可有效地检测甲基化组中存在的杂合甲基化区域的CG位点甲基化水平。然而，现有的基于PCR的技术无法检验这种杂合甲基化的CpG位点或者是侧翼序列没有CpG的孤立CpG位点。即现有技术中，无法检测侧翼序列没有CpG的孤立CpG位点的甲基化和非甲基化的量。

因此，本发明的采集构件，尤其针对提供侧翼序列没有CpG的孤立CpG位点，采集这些位点的甲基化DNA的量和非甲基化DNA的量。

本发明的采集构件不含有完全甲基化标准品；

作为优选的实施方式，所述的采集构件包括：

1)转化模块：所述的转化模块用于将DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变；

2)扩增模块：所述的扩增模块用于扩增转化后的DNA样品。

其中，所述的转化模块中，含有转化剂，用于将DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。作为一种示范性的实施方式，所述的转化剂选自亚硫酸氢盐。

甲基化的发生是胞嘧啶上多了一个甲基，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐等转化剂处理后，非甲基化胞嘧啶会变成脲嘧啶，因为在进行扩增时尿嘧啶与胸腺嘧啶相似而会被识别为胸腺嘧啶，体现在扩增序列上就是没有发生甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶(C变成T)，甲基化的胞嘧啶(C)则不会发生变化。因此，采用转化剂转化DNA样品后，甲基化的CpG保持为CpG(CG)，而未甲基化的CpG转化后脱氨成TpG(TG)，然后使用的CG/TG特异性探针结合CpG位点。

其中，所述的扩增模块中，含有至少一对引物和至少一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针，用于扩增转化后的DNA样品；其中，所述的寡核苷酸探针结合小沟结合剂(minorgroove binder,MGB)。

进一步地，所述的引物扩增的长度为50～200bp。

设计扩增长度为50～200bp的引物，不仅在体外培养的细胞或新鲜冰冻组织中提取的高质量DNA中，而且在福尔马林固定-石蜡包埋组织(FFPE)中提取的片段化DNA中，都能有效地实现荧光定量PCR，从而灵敏地检测样品的甲基化水平。扩增长度太长，不仅PCR本身扩增效率迅速降低，而且探针5’端荧光基团在PCR过程中被DNA聚合酶切割释放的效率也会降低，影响检测的准确性；另外，长扩增子的引物对DNA的完整性等质控标准要求较高，在FFPE等临床常用标本中，DNA常高度片段化。

作为优选的实施方式，扩增模块中的引物应避开CG位点：本系统尤其适用针对基因体和基因间区，open sea等区域的CG位点，相邻CG位点较少，探针覆盖待测CG位点，引物应避开其它CG位点，以避免杂合甲基化对检测结果的影响。

其中，扩增模块中的一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针，其中一条特异性结合CG序列，另一条特异性结合TG序列，即所述的一对探针中，一条用于结合甲基化的CpG位点，一条用于结合非甲基化的CpG位点。

作为一种优选的实施方式，本发明中，所述的一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针为一对Taqman探针。每条Taqman探针的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭剂和MGB基团。且两条Taqman探针5’末端连接的荧光基团具有不同发射光波长。最终与CpG位点完全匹配时探针结构被破坏，从而发出不同的荧光而被检测。更具体地，其中一条探针为针对非甲基化CpG位点的TG-Taqman-MGB探针，另一条为针对甲基化CpG位点CG-Taqman-MGB探针。

作为优选的实施方式，所述的荧光基团无特别限制，可以选自现有技术中的探针常用的荧光基团，如对于每一条探针，可以选自如FAM、VIC、ROX、TAMRA、SYTO9、JOE/TET/HEX、Texas Red和NED/BODIPY/TMR-X等等中的一种即可，但是需要保持一对探针中，每条探针所连接的荧光基团具有不同的发射光波长，以使他们在荧光检测时能分辨出来。需要说明的是，FAM和SYTO9具有相同的发射光波长，VIC和JOE/TET/HEX)具有相同的发射光波长，ROX和Texas Red具有相同的发射光波长，TAMRA和NED/BODIPY/TMR-X具有相同的发射光波长，应避免选择上述两条发射光波长相同的荧光基团。

作为优选的实施方式，所述的淬灭剂也无特别限制，现有技术中的荧光基团的淬灭剂即可，如NFQ、BHQ1和BHQ2等等中的一种。

本发明使用的Taqman探针，在3’端连接的MGB基团可增加探针的退火温度

MGB目前主要的应用为DNA多态性的基因分型检测。本发明在甲基化检测中将MGB引入探针中，巧妙地通过简单地方式，充分利用靠近MGB的单碱基错配造成退火温度高达10℃以上如17℃骤降的特性，将待测位点的甲基化和非甲基化CG位点设计在探针靠近MGB的区域，即超出预期地攻克了现有技术中存在多年的非CpG岛甲基化位点检测问题。

如果不连接MGB，探针退火温度要达到70℃，则探针必然会非常长，尤其是在非CpG岛的区域，CG含量低，可能会长到40bp。在这么长的探针中，仅有的一个CG/TG错配差异，几乎对退火温度没有影响，所以无法鉴别CG/TG。

作为优选的实施方式，探针碱基数量应尽可能减少：探针退火温度应高于引物退火温度10度，以确保探针与DNA模板的结合发生在引物退火延伸之前。探针越短，探针鉴别甲基化和非甲基化CG位点的特异性越强。探针长度应控制在10～20bp，作为更优选的实施方式，所述的探针长度应控制在12～18bp。

作为优选的实施方式，待测CpG位点应可能位于探针中间靠3’端的区域。作为更优选的实施方式，CpG位点位于探针3'端的三分之一区域。

与完全配对相比，探针3'半区域(MGB区域)中的单碱基错配具有可高达17℃的退火温度差异，而位于5’端区域的单碱基错配，只能产生2～10℃的退火温度差异。因此，待测CG位点位于3’端的探针具有更高的特异性。

作为优选的实施方式，探针5’端应靠近正向引物的3’端，但不可与正向引物重叠，可与正向引物的3’端间隔1个碱基以上。探针可与反向引物重叠。

由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性在DNA合成链延伸的初期最大，探针5’端尽可能地靠近正向引物，可最大程度保证探针5’端偶联的荧光基团能在延伸时被DNA聚合酶切割游离，释放荧光，确保检测的准确性。此外，也能在DNA聚合酶的聚合性和外切活性最大时，高效切割结合在模板链上的探针，避免其引起的DNA延伸提前终止和检测的不准确性。

其中，本发明的系统中，所述的b)处理构件中，采用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数(percent of methylated referenc，PMR)，作为本发明中一种示范性的实施方式，因甲基化的量和非甲基化的量是采用荧光扩增后计算得到的，所以PMR＝甲基化荧光值/(甲基化荧光值+非甲基化荧光值)×100。

更具体地，PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT_{甲基化荧光}-CT_{非甲基化荧光}

ΔCT＝CT_甲基化-CT_非甲基化

如上所示，为本发明PMR计算公式推导过程。甲基化百分比参数PMR等于甲基化DNA与总DNA(甲基化与非甲基化DNA总和)的比值，通过变换可得PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)。其中，甲基化探针和非甲基化探针需标记不同发射波长的荧光基团，每条探针可以为FAM、VIC、ROX、TAMRA、SYTO9、JOE/TET/HEX、Texas Red和NED/BODIPY/TMR-X等等中任意一种。

现有技术中，甲基化百分比参数PMR的计算方法为：(甲基化荧光值/内参照荧光值)_待测样品/(甲基化荧光值/内参照荧光值)_完全甲基化标准品。

从以上对比可以看出，本发明的处理构件，相比传统技术使用的计算方法，更为直接地表达了待测样品的甲基化比例，并且无需使用内参照反应和完全甲基化标准品，更为简便的同时，也避免了使用内参照反应和完全甲基化标准品带来的误差。

本发明通过提供一种新的甲基化定量系统，采用通过采集构件采集待测DNA样品的甲基化的量和非甲基化的量，然后再采用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数(percent of methylated referenc，PMR)，可以避免现有技术中甲基化定量对于甲基化标准品的依赖，具有更好的重复性和准确性。

此外，本发明系统中的采集构件，含有巧妙的设计引物和探针，并采用结合MGB的探针，基因组DNA经转化剂处理后，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶(UpG)，而甲基化的胞嘧啶残基不受影响(mCpG)，这使得在基因组DNA中产生甲基化依赖性的序列差异。在PCR扩增过程中使用了不同的发射光波长的荧光标记的TaqMan MGB探针来区分转化剂处理产生的单碱基差异。在同一反应体系中，使用相同的一对引物，扩增甲基化和未甲基化的等位基因，序列区分仅发生在荧光探针杂交的过程，这一区分是基于序列完全配对与错配的退火温度差异(图1)。

本发明使用一种发射光波长的荧光标记的MGB探针特异性结合甲基化等位基因序列，使用另外一种发射光波长的荧光标记的MGB探针特异性结合非甲基化等位基因序列。与完全配对相比，探针3'半区域(MGB区域)中的单碱基错配具有高达17℃的退火温度差异。这使得我们能够设计探针仅覆盖单个CpG二核苷酸，从而可以测量孤立CpG的甲基化水平。

除了采集单个孤立的CpG位点甲基化，本发明的系统还可以同时采集多个孤立的CpG位点的甲基化。此时，需要针对，每个CpG位点设计与之相应的一对引物和一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针。

一对引物包括正向引物和反向引物，一对探针包括结合CG的探针和结合TG的探针，这对探针需位于这对引物的扩增子区域内，并在设计时充分考虑，使探针尽可能靠近正向引物，但不能与其重叠。本技术可适用于多重PCR体系，使用两对或更多对引物，和与其分别对应的两对或者更多对探针，在一个反应体系里同时检测两个或者更多个待测位点的甲基化水平。

除此之外，每个待测的CpG位点的引物扩增区域不重叠，以避免多重PCR过程中的竞争，且每个探针5’末端连接的荧光基团具有不同发射光波长。此外，还需分析多重qMSP引物、探针组合的兼容性：引物探针设计完成后，首先应在理论上排除多重qMSP体系中全部引物探针之间可能存在的二级结构(http://www.cstl.nist.gov/strbase/AutoDimerHomepage/AutoDimerProgramHomepage.htm)，确定多重qMSP的引物探针组合。

本发明的有益效果：

1.更好的可重复性和准确性：

首先，因为系统中的PMR由甲基化/(甲基化+非甲基化)的比率决定，不需要完全甲基化的DNA作为参照计算。如果参照DNA未完全甲基化，由待测样品与参考DNA的比率确定的PMR显然是不正确的。本系统的甲基化定量结果与焦磷酸测序的结果几乎完全一致，而传统MethyLight即使与焦磷酸测序的结果线性相关，但PMR存在一定的偏差。

其次，本系统的检测设计更为简便，无需独立的输入参照反应，因此来自输入内部参照反应的不可避免的偏差和误差不会累积，也不会并影响最终结果。如图2E所示，两次独立测量的标准差明显小于使用内参基因Alu-C4反应作为输入参照的标准差。

最后，本系统的单CpG分辨率使得结果不受侧翼序列中CpGs的甲基化变异的影响。因此，由本系统测得的PMR几乎与焦磷酸测序确定的甲基化百分比相同。

2.可以单独针对单个CpG位点的甲基化水平进行检测：

本发明首次提出了一种改进的甲基化采集构件，使用了与小沟结合剂(minorgroove binder,MGB)结合的探针，利用基于荧光探针的实时定量PCR对单个CpG的甲基化水平进行准确定量，解决了传统qMSP无法对CpG岛外的CG位点进行甲基化定量的问题。

3.更便宜、便捷、迅速：

值得注意的是，通过与被广泛认为是最可靠的甲基化测定方法的亚硫酸氢盐焦磷酸测序相比，本发明的准确性的与其与焦磷酸测序一致，可实现非常精确的甲基化定量。这种高分辨率的甲基化信息在以往只能用亚硫酸氢盐基因组测序或亚硫酸氢盐焦磷酸测序才能获得，但这对于在福尔马林固定石蜡包埋组织中的DMPs大样本队列验证来说，不具有成本效益优势或可行性。而本发明的系统在准确性的与其与焦磷酸测序一致的情况下，比焦磷酸测序更便宜、便捷、迅速。焦磷酸测序是检测DNA甲基化水平的金标准技术，也可用于本系统针对的孤立CG位点甲基化水平的检测。但焦磷酸测序需专门的焦磷酸测序仪，较难获取(暂未发现广州有此设备)，测序费用昂贵(约300/样本)，测序周期长(约1月)；而本技术只需一台常规荧光定量PCR仪，检测费用便宜，可即时获取数据。

4.适用范围广，对CGI和非CGI的单个CpG位点均能实现甲基化检测：

传统的MethyLight技术是基于CGI的全部CpG同时存在甲基化或非甲基化的假设，测定的是引物探针覆盖的全部CpG位点为共甲基化的百分比。然而，如果待测位点和侧翼序列中引物和探针覆盖的CpGs不呈现为共甲基化，原有技术将无法精确检查待测区域的甲基化状态。由于本技术显示出对单个CpG测量的高度敏感性，特异性和准确性。本发明的系统用于测定单个CpG二核苷酸的甲基化水平，但不限于侧翼序列缺少CpG的open sea，如在CGI中能设计出引物探针使探针仅覆盖待测CpG，本发明的系统可更精确地检测CGI待测区域的甲基化水平。

附图说明

图1为本发明的检测原理。

图2为本发明的特异性、灵敏度、重复性和定量准确性；

A.使用本技术检测完全甲基化和未甲基化的DNA中FAT3，FHIT和KIAA1026三个位点的甲基化水平；

B.使用DNA去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza)处理HCT116细胞后；使用本技术检测的FAT3，FHIT和KIAA1026的甲基化水平如预期降低；

C.本技术在肿瘤异质样品上的重复性；

C1.FAT3在肿瘤异质样品上的重复性；

C2.FHIT在肿瘤异质样品上的重复性；

C3.KIAA1026在肿瘤异质样品上的重复性；

D.通过标准曲线检验本技术的检测范围和定量准确性；

E.与使用Alu-C4反应校正的技术比较可重复性。

图3为与亚硫酸氢盐焦磷酸测序比较评估FAT3，FHIT和KIAA1026三个位点的甲基化定量准确性；

A.为与亚硫酸氢盐焦磷酸测序比较评估FAT3位点的甲基化定量准确性；

B.为与亚硫酸氢盐焦磷酸测序比较评估FHIT位点的甲基化定量准确性；

C.为与亚硫酸氢盐焦磷酸测序比较评估KIAA1026位点的甲基化定量准确性。

图4为使用本技术来验证45个肿瘤样品中的EPIC microarray的筛选结果。

图5本发明PMR计算方法(A)与传统PMR计算方法(B)准确性比较。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

基因体：基因是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列，基因体即基因的主体部分，通常是指一个基因除去其启动子区域(通常是指转录起始位点上游和下游的2000bp区域)的全部核苷酸序列。

本发明中，“杂合甲基化区域的CpG位点”和“非共甲基化区域的CpG位点”是一个意思。比如在一个100bp的DNA区域内有10个CpG，甲基化学界通常会假设这10个CpG是同时发生甲基化或者同时非甲基化的，称为“共甲基化区域”，基因组很多区域是这样的“共甲基化区域”，传统技术就是基于这样的大概率“共甲基化”，设计引物和探针，覆盖100bp区域内的多个CpG位点，检测的其实是这个区域内多个CpG位点同时发生甲基化的细胞占所有细胞的比例。

基因间区：基因间区指基因与基因之间的间隔序列，是基因组中不具有遗传效应的片段，不属于基因结构。

CpG岛：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常频率。CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp。通常被定义为GC含量超过55％，并且实际与预期CpG双核苷酸的数量比值大于65％，预期CpG双核苷酸数量的计算方法为(C数量*G数量)/序列长度。

CpG shore：在紧靠CpG岛的两侧区域里，长度约100～3000bp，CpG双核苷酸的出现频率达不到CpG岛定义的要求，但又高于基因组的其它区域，相对于CpG岛，这些紧邻的侧翼区域称为CpG岛的“海滨”(shore)CpG open sea：在远离CpG岛的基因组区域，CpG双核苷酸的出现频率远低于CpG岛，相对于CpG岛，这些基因组最广泛的区域被称为“公海”(opensea)。

CpG shelf：在CpG shore的两侧区域里，CpG双核苷酸的出现频率低于shore，但又高于open sea，相对于CpG岛、“海滨”以及广泛的“公海”，这些离CpG岛和“海滨”较近的侧翼区域称为CpG“暗礁”(shelf)。

侧翼序列没有CpG的孤立CpG位点：在CpG open sea和shore区域里，CpG双核苷酸的出现频率低，CG位点常常孤立，在其两侧100～200bp的PCR扩增序列里，常常缺乏其它CpG位点。

组织的DNA甲基化水平具有潜在的临床应用价值。目前已有多种检测DNA甲基化的方法，例如使用MethyLight(甲基化特异性定量PCR)来检查CpG岛(CpG Island,CGI)的甲基化。然而，启动子内的CGI仅代表甲基化组一小部分，现在逐渐发现主要位于基因体中的CpGopen sea在疾病发生发展和异常的细胞内分子事件中发挥重要作用。不幸的是，现有的基于PCR的技术无法检验这种两侧序列没有CpG的孤立CpG位点。因此，本发明提供了一种DNA甲基化定量系统，采集待测DNA样品的甲基化DNA的量和非甲基化DNA的量，然后再采用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数(percent of methylated referenc，PMR)。

此外，本发明的系统使用了与小沟结合剂(minor groove binder,MGB)结合的Taqman探针。具体地，基因组DNA经转化剂处理后，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶(UpG)，而甲基化的胞嘧啶残基不受影响(mCpG)，这使得在基因组DNA中产生甲基化依赖性的序列差异。我们在PCR扩增过程中使用了两种不同的荧光标记的MGB探针来区分亚硫酸氢盐处理产生的单碱基差异。在同一反应体系中，使用相同的一对引物，扩增甲基化和未甲基化的等位基因，序列区分仅发生在荧光探针杂交的过程，这一区分是基于序列完全配对与错配的退火温度差异(图1)。

本发明利用DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性切割双重标记探针，与转化剂处理过的DNA的CG/TG序列杂交。5'核酸外切酶的切割将5'-荧光团与3'-淬灭剂分开，使荧光团释放并产生可检测的荧光信号。小沟结合集团(minor groove binding,MGB)与3'-淬灭剂结合使得可以使用序列较短的探针，并且对单碱基错配具有高敏感性和特异性。甲基化的CpGs在转化剂处理时保持为CpG，而未甲基化的CpG在转化剂转化后脱氨成TpG，因此使用携带两个不同荧光团的CG/TG特异性探针，可以进行一步式甲基化检测，与完全配对相比，探针3'半区域(MGB区域)中的单碱基错配具有可高达17℃的退火温度差异。这使得我们能够设计探针仅覆盖单个CpG二核苷酸，从而可以测量孤立CpG的甲基化水平。PMR由扩增循环内两种荧光探针的CT阈值比率确定，来自甲基化探针和未甲基化探针的信号之间的比率可实现待测位点甲基化水平的精确定量，并且不需要扩增对照基因，如Alu-C4和ACTB，以反映和校正起始DNA模板的量和完整性；另外，也不再需要使用CpGenome完全甲基化的DNA样品作为参照计算每个样品的PMR样品。

本发明DNA甲基化定量系统与传统的MethyLight不同之处在于，它检测基因组中的甲基化状况有很高的分辨率，可以检测单个CpG的甲基化水平。这种基于甲基化探针和非甲基化探针比值的检测可以改进基于PCR的检测技术中的样品标准化方法，由于它无需使用阳性对照计算PMR(完全甲基化的DNA)，也不需输入对照校正DNA模板总量(Alu-C4PCR反应)，因此，不易受由癌症相关的拷贝数变异的影响，这一优势在大样本的复杂临床组织中更为明显。

我们设计并应用这种系统来检测位于FAT3、FHIT和KIAA1026基因体CpG open sea的三个孤立CpG位点的甲基化水平。我们通过与“金标准”亚硫酸氢盐焦磷酸测序进行比较，评估了本发明的系统在肿瘤DNA样本中的检测结果。此外，我们利用甲基化/非甲基化比率来计算PMR，从而避免了增加另一个独立的PCR反应来校正不同样本DNA模板的总量。我们还开发了一种计算方法，使得研究者无需使用完全甲基化的DNA样品作为对照，就可以测定PCR反应体系中甲基化等位基因的百分比。我们还描述了这项技术中的PCR条件以及如何设计引物和成对的探针，以更快、更准确地测定孤立CpG的甲基化水平。

该技术不仅非常特异且灵敏，而且操作简便，不需要对照反应和完全甲基化的DNA标准品作为参照，从而可以克服它们带来的缺陷。此外，它具有比现有的MethyLight技术更高的重复性和准确性。我们在45个结肠直肠癌样本中使用这种技术测定了位于CpG opensea的三个孤立CpG位点，发现此方法可用于临床复杂样本的甲基化定量检测。

本发明的系统在技术上足以可靠地检测孤立CpG位点的甲基化水平。如设计合适的引物和探针，其还可以用于更准确地检测CGI的甲基化水平。

实施例1一种DNA甲基化定量系统

一种DNA甲基化定量系统，其含有：

a)采集构件：用于采集待测DNA样品的甲基化的量和非甲基化的量；

具体地，采集构件还包括：

2)扩增模块：所述的扩增模块用于扩增转化后的DNA样品。

b)处理构件：甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数percentof methylated referenc，PMR。

作为可选的方式，其还含有

c)输出构件：所述的输出构件用于输出处理构件得到甲基化百分比参数percentof methylated referenc，PMR。

实施例2 DNA甲基化定量系统工作流程

1.DNA样品的甲基化的量和非甲基化的量采集

材料

从45例原发性结直肠腺癌患者中获得新鲜冰冻肿瘤组织样本。患者包括32名男性和13名女性。这些患者中，17例为I期肿瘤，28例为II期肿瘤；18例随访结局为复发，27例随访结局没有复发。详见表1。

表1肿瘤样本

2.转化模块转化待测DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基

使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，51306)和EZ DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch，D5002)，按照说明书提取上述样品中的基因组DNA并进行亚硫酸氢盐修饰[7,14]。

3.扩增模块扩增转化后的DNA样品

亚硫酸氢盐转化后，进行实时荧光定量PCR扩增基因组DNA。简而言之，使用位于引物和一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针扩增亚硫酸氢盐转化后的基因组DNA，每个寡核苷酸探针5'端连接荧光报告染料6FAM或VIC(分别特异性结合CG序列和TG序列)，3'端偶联淬灭-MGB基团(MGB-NFQ)(图1)。Taq DNA聚合酶在DNA延伸时，5'至3'核酸外切酶活性将切割探针并释放报告基因，其荧光可通过Applied Biosystems QuantStudio 7Flex实时PCR系统检测。初始DNA模板浓度可以通过荧光信号的CT(循环阈值)值获得[15]。将完全甲基化和完全非甲基化标准样品，按照一定比例混合后进行检测，以描绘标准曲线。我们使用20uL的反应体系，体系包括500nM引物，150nM探针，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200nM，2.25mMMgCl2，0.75U HotStar Taq酶，1X PCR缓冲液。反应条件为：亚硫酸氢盐转化后的DNA，95℃15分钟，然后是94℃30秒、56～60℃1分钟和72℃1分钟的50个循环。

引物和探针序列

针对FAT3(基因ID：120114)，FHIT(基因ID：2272)和KIAA1026(基因ID：23254)基因中的三个待测位点，我们设计了三组专门用于本发明的引物和探针(表2)。三个待测孤立CpG位点的200bp侧翼序列见表3。

表2用于本发明的引物和探针序列

表3三个孤立的CpGs的侧翼序列

4.处理构件计算甲基化百分比计算

在系统中的方法中，每个样本的PMR等于甲基化/(甲基化+非甲基化)×100，具体计算时，我们使用如下公式：PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT_FAM-CT_VIC

甲基化检测结果：如下表4-6，分别为10例临床结直肠癌组织中FAT3、FHIT和KIAA1026三个位点的检测结果。

表4 FAT3的甲基化检测结果

表5 FHIT的甲基化检测结果

表6 KIAA1026的甲基化检测结果

本系统的技术验证

发明人通过EPIC microarray筛选出了复发和非复发结直肠癌样本之间的差异甲基化启动子(Differentially Methylated Positions，DMPs)。DMPs在CGIs和启动子中较少，但在open sea和基因体中很多。然而，传统的MethyLight分析无法在CpG open sea中检测没有侧翼CpG簇的CpG甲基化水平。我们选择位于FAT3，FHIT和KIAA1026基因体的opensea中的3个孤立CpG位点，在人结肠直肠细胞系HCT116和CpGenome甲基化和非甲基化DNA(Millipore S7821&S7822)中检验本技术的各项特性。

首先检测引物与甲基化和非甲基化探针的特异性(表1)。甲基化DNA标准品的PMR接近100％，与其完全甲基化状态一致。相反，非甲基化DNA标准品的PMR接近于零(图2A)。此外，用DNA去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza)处理HCT116细胞后，用本系统检测的FAT3，FHIT和KIAA1026甲基化水平如预期有所下降(P<0.05，图2B)。这表明本系统可以特异性地区分甲基化和未甲基化的基因位点。

进一步分析了本系统在10个结直肠癌DNA样品(表1)中检测甲基化水平的可重复性。通过对每个待测位点进行两个独立的qPCR反应来检测可重复性。如图2C所示，三个待测位点的结果均为两次测量中得到的CT_FAM-CT_VIC值，两次独立测量的标准偏差较低，并且第一次和第二次测量的delta CT值线性相关，R²>0.999。总之，这些结果表明本技术在复杂的临床异质样品中多次测量能产生可重现的结果。

最后，我们通过标准曲线检验本系统的检测范围和定量准确性。CpGenome通用甲基化DNA与通用非甲基化DNA按照不同比例混合，使用本技术追踪FAT3，FHIT和KIAA1026三个待测位点的甲基化水平在不同混合比例的标准品中的改变。结果显示，即使在10,000倍未甲基化DNA稀释后，依然能可靠地检测三个位点的甲基化水平。我们计算了每次稀释得到的PMR，以确定本技术的定量准确度，结果表明该技术在四个数量级上的甲基化定量呈现为线性(图2D)。这些结果表明本系统具有很高的灵敏度和定量准确性。

实施例3亚硫酸氢盐焦磷酸测序比较评估定量准确性

使用焦磷酸测序作为参照，进一步检验了本发明甲基化定量系统的准确性。我们在10个结直肠癌组织(表1)中，同时使用焦磷酸测序和本技术检测上述3个CpG位点的甲基化水平。焦磷酸测序的引物见表2。通过本发明测得的PMR与通过焦磷酸测序得到的甲基化百分比线性相关(图3；FAT3为0.9690，FHIT为0.9954，KIAA1026为0.8755，均P<0.001)。不仅如此，PMR与焦磷酸测序的甲基化百分比有惊人的一致性。这比以前报道的传统MethyLight更精确[11,12]。因此，本系统有与亚硫酸氢盐焦磷酸测序法相同的定量精确性，并且操作更简便、更容易获取、更便宜。

实施例4与使用Alu-C4反应校正的技术比较可重复性

过去，所有基于qPCR的检测技术，均需要内参照基因进行定量。传统MethyLight广泛使用的是AluC4作为对照反应，评估和校正起始DNA模板的总量[8,11,12]。与其他单拷贝对照基因相比，这种高拷贝对照扩增子更不易受癌症相关基因改变的影响。不幸的是，全基因组拷贝数变异和突变对AluC4稳定性的影响仍然无法完全避免。本发明的优势是，不需要这种内参照反应，每个独立样本就能得到与起始DNA模板总量无关的准确PMR。此外，我们比较了10个临床肿瘤样本中这两种检测方法的可重复性。我们发现使用Alu-C4反应作为输入对照的传统MethyLight中，两次独立测量的PMR标准差比本技术中使用甲基化/非甲基化信号比以校正输入差异的PMR标准差更高(图2E)。传统MethyLight中观察到的较高标准差可能来自低模板浓度下的随机PCR[16]，以及两个独立反应中偏差的累积。然而，本系统受这些因素影响的可能性较低，因为来自甲基化和非甲基化探针的信号是在相同的反应体系中使用相同的引物扩增产生的。

实施例5 EPIC microarray比较评估定量的可靠性

使用此系统来验证在Illumina MethylationEPIC(EPIC)BeadChip microarray中筛选出的DMPs的甲基化状态。EPIC阵列是Illumina HM450microarray的第二代产品，其检测探针在CpG open sea中的覆盖率显着增加，为筛选出具有生物学和临床意义的分离CpGs提供了一种有价值的工具[17]。45个人结肠直肠腺癌组织被用于本实验(表1)。我们使用本系统检测与比较在EPIC microarray中cg00561674(FAT3)，cg05704547(FHIT)和cg06887407(KIAA1026)的甲基化百分比，以确定EPIC microarray的可靠性。通过EPICmicroarray检测得到的相对甲基化水平(β值)与通过本系统得到的PMR有很好的线性相关性(cg21101720R＝0.9208；cg21101720R＝0.29790；cg14215472 0.8920.所有P均<0.001)(见图4)。

实施例5本发明PMR计算方法与传统PMR计算方法准确性比较

我们在10个临床肿瘤样本中，比较本技术计算系统和传统技术计算方法得到的KIAA1026位点的PMR值，并与焦磷酸测序结果进行比较。本技术组的实验和计算方法已如上所述；传统技术组中，需增加一个完全甲基化标准品作为外参照，每个样品需设置两个独立的qPCR反应体系，分别检测待测甲基化位点和AluC4内参照基因的总量，采用如下方法计算PMR：(甲基化荧光值/内参照荧光值)_待测样品/(甲基化荧光值/内参照荧光值)_{完全甲基化标准品}。

与焦磷酸测序的结果比较表明，虽然本技术和传统技术的计算系统得到的PMR均与焦磷酸测序得到的甲基化比例相关性良好，但本技术的线性相关度强于传统技术(图5Avs.B，R＝0.8412VS.0.7698)。此外，使用AluC4和完全甲基化标准品分别作为内外参照的传统MethyLight技术中，计算得到的PMR值与焦磷酸测序得到的甲基化比例吻合度远不如本技术计算得到的PMR值(图5A vs.B)。

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序列表

<110> 中山大学附属第六医院

<120> 一种DNA甲基化定量系统

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttgggattgt agaattgtag ataaaga 27

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cctcttaaat cccttcaaac cttttcttat 30

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atccttgatc gttttagaag tatatgtatg taatctcaag caagtgatat tctaattaca 60

gatcagtctt acttattcat tagagcaaat ctcccgagga ctttaccagg aaatacttaa 120

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tggctacatt ttaaaaggta gattaccaaa aatataggtg attggacctt ttaaatatca 300

gaaaaattgc tgaaatagag aaaagtgaaa aagaaggtct atgttctcaa ataatactaa 360

gctaagaaag aataagactg aaacacttgc cttataatta tactcaaagt gagtcatgga 420

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gctctttcta ctctttattt ctctcattta gtgtgaatat ccatatgttt cactgcagaa 840

acactggtat ttttgattat gggatactac ggccagcacc aatttctgtg agggggagga 900

gtattttaca taatgtgaaa gatatgtgct gcatgtcctt gctaaaactg cacaatttta 960

aattctgaga tgcatctgct cccgcggatt tggagtccag taccttttca atagcatctg 1020

ttattctttc tctttctcct cctctcctct cccacctcag tctcttcctt tcccccaacc 1080

caggtaggaa aggaagacct gggagagatt gggttgggag gaacacctta aggcaaggtg 1140

atgacttggg gaccacagtg gccacagaaa tgcctaaatt aactccccct cccccccccc 1200

accaaccatc tttgtcctgc ttcatctgta ccctttaggt gcatcgtttt cttttaaaga 1260

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Claims

1.一种DNA甲基化定量系统，其特征在于，包括以下构件：

b)处理构件：所述处理构件采用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数percent of methylated referenc，PMR；

所述的采集构件包括：

2)扩增模块：所述的扩增模块用于扩增转化后的DNA样品；

所述扩增模块含有至少一对引物和至少一对覆盖待测单个CpG位点的寡核苷探针扩增转化后的DNA样品；

其中，所述的寡核苷酸探针结合MGB；

其中，所述的一对覆盖待测单个CpG位点的寡核苷酸探针，其中一条特异性结合CG序列，另一条特异性结合TG序列；

其中，所述的待测CpG位点位于探针中间靠3’端的区域；

其中，所述的探针5’端靠近正向引物的3’端。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统还含有：

c)输出构件：所述的输出构件用于输出处理构件得到甲基化百分比参数percent ofmethylated referenc，PMR。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统所检测的CpG位点为杂合甲基化区域的CpG位点，或者是侧翼没有CpG的孤立的CpG位点，或者共甲基化区域的CpG位点；或者是非共甲基化区域的CpG位点。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统所检测的CpG位点为CpG岛外的CpG位点，或者是CpG岛内的CpG位点。

5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统所检测的CpG位点位于基因体、基因间区或启动子。

6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的系统所检测的CpG位点为位于基因体或基因间区的CpG open sea、CpG shore、CpG shelf。

7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的采集构件不含有完全甲基化标准品。

8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的转化模块含有转化剂。

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述的转化剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种。

10.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述的转化剂为亚硫酸氢盐。

11.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的扩增模块扩增的DNA长度为50～200bp。

12.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针为一对Taqman探针，每条Taqman探针的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭剂和MGB基团，且两条Taqman探针5’末端连接的荧光基团具有不同发射光波长。

13.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，探针的长度在10～20bp之间。

14.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，探针的长度在12～18bp之间。

15.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，对于每一条Taqman探针，所述的荧光基团选自FAM、VIC、ROX、TAMRA、SYTO9、JOE/TET/HEX、Texas Red和NED/BODIPY/TMR-X中的一种。

16.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述的淬灭剂选自NFQ、BHQ1和BHQ2中的一种。

17.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的待测CpG位点位于探针靠3'端的三分之一区域。

18.根据权利要求1所述的系统，当同时检测的多个孤立的CpG位点时，每个CpG位点含有与之相应的一对引物和一对覆盖待测单个CpG位点的寡核苷酸探针，且每个待测的单个CpG位点的引物扩增区域不重叠。

19.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，处理构件中：

甲基化百分比参数PMR＝甲基化荧光值/(甲基化荧光值+非甲基化荧光值)×100；

更优选地，甲基化百分比参数PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT _{甲基化荧光}–CT_{非甲基化荧光}。