KR20100010644A

KR20100010644A - 유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법

Info

Publication number: KR20100010644A
Application number: KR1020080071618A
Authority: KR
Inventors: 장세진; 천성민; 최진; 이제환; 김청수; 황정진
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2010-02-02
Also published as: KR100986960B1

Abstract

본 발명은 유전자의 메틸화를 확인하기 위하여 유전자를 소듐 바이설파이트로 처리한 후 이를 주형으로 하여 PCR을 실시함에 있어서, 상기 유전자가 메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머(메틸화 특이적 프라이머), 이 프라이머가 결합하는 유전자의 부분과는 일정 간격 이격된 부분과 결합하는, 상기 유전자가 비메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머(비메틸화 특이적 프라이머) 및 메틸화에 영향을 받지 않는 프라이머(공통 프라이머)를 모두 이용하여 동시에 PCR을 실시함으로써, 상기 유전자의 메틸화 정도에 따라 유전자가 메틸화된 경우의 PCR 산물(메틸화 증폭산물)과 유전자가 비메틸화된 경우의 PCR 산물(비메틸화 증폭산물)이 서로 다른 크기로 증폭됨으로써 유전자의 메틸화 여부 및 비율을 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.

메틸화, CpG 서열

Description

유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법{Method for Analysis of Gene Methylation and Ratio Thereof}

본 발명은 유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 상기 유전자가 메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머, 이 프라이머가 결합하는 유전자의 부분과는 일정 간격 이격된 부분과 결합하는, 상기 유전자가 비메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머 및 메틸화에 영향을 받지 않는 프라이머를 모두 이용하여 동시에 PCR을 실시함으로써, 상기 유전자의 메틸화 정도에 따라 유전자가 메틸화된 경우의 PCR 산물과 유전자가 비메틸화된 경우의 PCR 산물이 서로 다른 크기로 증폭됨으로써 유전자의 메틸화 여부 및 비율을 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.

인간 DNA상에서의 메틸화 현상은 CpG 염기서열의 C에서 제한적으로 나타나고 있는데, 이는 진화상으로 유지되고 있는 현상이다. 일반적으로 생체 내에서 CpG 염기서열내의 사이토신은 비교적 쉽게 탈아민화에 의해 우라실로 전환되고 이는 다 시 DNA 수복현상에 의해 티민으로 바뀌게 되어, 원래의 염기서열이던 CG가 유지되지 못하고 종종 TG로 변환되어 유전정보를 전달하지 못하게 되어 많이 제한되어 진화하였다. 이러한 이유로 인하여 약 3*10⁹개 정도의 인간 염기서열 중 실제로 나타나는 CG 염기서열의 빈도는 산술적인 기대치의 약 15% 수준으로 보고되고 있다. 또한, 이렇게 보존되어 있는 CG의 사이토신은 메틸화가 되어 있어 탈아민화 되는 것을 방지해서 CG 염기서열을 유지하고 있다.

하지만 이러한 일반적인 상태와는 달리, 약 40~50% 정도로 높은 빈도를 가지고 CG가 반복해서 나타나고 있는 염기서열 부위가 있는데 이러한 부위를 CpG 섬이라고 명명해서 부르고 있다. 이 CpG 섬은 주로 유전자의 5' 쪽 프로모터 부위에서 나타나고 있으며 그 길이는 약 500~2000 bp 정도이다. 또한 특이하게도 이 부위에서의 CpG의 사이토신은 비메틸화된 상태로 유지되고 있으며, 이는 유전자의 발현을 책임지는 전사유도 단백질의 결합과 밀접한 연관성을 가지고 있다. RASSF1A나 p16INK4A등의 암억제 유전자에도 5'의 프로모터 부위에 CpG 섬이 존재하는데, 정상적인 경우에서는 비메틸화 되어있어 전사가 쉽게 일어나 발현이 잘 유지되고 있지만, 암환자에서는 높은 빈도로 메틸화되어 있음을 알 수 있고 또한 발현양도 상당히 많이 감소해 있음을 확인할 수 있다. 이러한 사실들도 미루어 보아, 암억제 유전자에서는 CpG섬에서의 사이토신 메틸화가 전사유도 단백질의 DNA로의 접근을 방해하여 발현량이 감소함으로써 제 기능을 발휘하지 못하여 암이 발생하게 된 것으로 여겨지고 있다. 반대로 k-ras 같은 프로토 온코진의 경우도 5' 프로모터 부위 에 CpG 섬을 가지고 있는데, 정상인에서는 메틸화되어 있고 그 발현도 억제되어 있다가 암환자에서는 높은 빈도로 비메틸화 되어 있고 단백질 발현양도 증가해 있음을 알 수 있다. 이처럼 CpG섬의 사이토신 메틸화는 암 발생과 상당히 밀접한 연관성을 가지고 있고, 또한 암 발생 초기에 나타나는 현상으로 알려져 있어 암의 조기진단 바이오 마커로 이용할 수 있는 특정 유전자의 개발이 많이 시도되고 있으며, 실제로 이에 관한 많은 논문들이 해외의 유수 잡지에서 발표되고 있다.

현재 연구자들이 DNA 메틸화 확인을 위해서 가장 일반적으로 이용하는 방법은 바이설파이트라는 화학물질을 처리한 후 엠에스피 (MSP: 메틸화 특이적 PCR)를 수행하는 것이다. 메틸화 여부를 확인하고자 하는 샘플시료에서 지노믹 DNA를 순수분리한 후 바이설파이트를 이용한 화학반응을 수행하면, 메틸화 사이토신은 그대로 유지되지만 나머지 모든 비메틸화 사이토신은 우라실로 변환된다. 이렇게 변환시킨 DNA를 주형으로 해서 PCR을 수행하고, 메틸화를 확인하고자 하는 특정 유전자의 염기서열 중 CpG 염기서열이 3~4개 포함된 위치에서 비메틸화 프라이머와 메틸화 프라이머 2 세트를 각각 제작해서 독립적으로 PCR을 한다. 이렇게 독립적으로 반응시킨 결과물을 각각 분석하여 어떤 프라이머 세트를 이용했을 때, 증폭산물이 얻어지는지를 확인하여 각 샘플시료의 메틸화 여부를 확인한다. 하지만 이 방법의 경우, 하나의 시료에서의 메틸화 여부를 확인하기 위해 비메틸화 특이적 프라이머를 이용한 증폭반응과 메틸화 특이적인 프라이머를 이용한 증폭반응이 서로 다른 시험튜브에서 이루어지므로 다음과 같은 몇 가지 단점들이 있다.

첫째, 샘플시료의 메틸화 DNA의 비율확인이 불가능하다. 엠에스피에서는 메 틸화 프라이머와 비메틸화 프라이머는 CpG 염기서열이 3~4개 포함되어 있는 부위에서 선정해서 제작하기 때문에, 이들 각각의 Tm값은 6~10 도 정도의 차이가 나게 된다. 이러한 Tm값의 차이에 증폭률의 차이를 보정해 주기 위해 보통 비메틸화 프라이머는 메틸화 프라이머보다 4~6개 정도 더 긴 올리고뉴클레오타이드로 이루어지거나, 비메틸화 프라이머를 이용할 경우 어닐링 온도를 더 낮게 해서 수행하는 등의 PCR 조건이 달라지게 된다. 이러한 결과로 인하여, 비록 어느 정도는 보정되었다 하더라도 결국 증폭산물의 양에는 차이가 날 수 밖에 없다. 또한, 사이클이 진행됨에 따라 증폭산물의 양은 기하급수적으로 증폭되다가 종래에는 한계점에 다다르게 되는 PCR의 특성으로 인해, 증폭 이전 샘플에서의 메틸화 DNA의 비율이 증폭반응 이후의 비메틸화 산물과 메틸화 산물의 분석 시에서는 유지되지 않는다. 때문에 일반적인 엠에스피의 방법으로는 샘플시료의 DNA에 메틸화가 존재하는지의 여부만 확인할 수 있을 뿐, 그 비율의 확인은 사실상 어렵게 된다.

둘째, 샘플시료의 과 사용에 관한 문제이다. 일반적으로 1 마이크로그램의 DNA를 이용하여 바이설파이트 화학반응을 수행하고 난 후 얻을 수 있는 변환된 DNA의 양은 대략 200~300 나노그램 정도가 되는데, 이는 PCR을 대략 5~6번 정도 수행할 수 있는 양이다. 때문에 비메틸화 프라이머와 메틸화 프라이머를 이용한 증폭반응을 독립적으로 수행할 경우 메틸화 여부를 확인할 수 있는 유전자의 개수는 대략 3~4개에 불과하게 된다. 메틸화를 확인하고자 하는 유전자의 개수가 많은 경우에는 이러한 일반적인 엠에스피 방법으로는 한계가 있을 수 있다.

셋째, 내재 대조 유전자의 부재로 인한 PCR의 성공여부를 확인할 수 없다는 어려움이 있다. 비메틸화 프라이머와 메틸화 프라이머를 이용한 증폭반응의 결과가 음성으로 나타났을 경우, 단순한 PCR의 에러에 의한 것이 아닌지에 대한 확인을 할 수 없다는 결정적인 문제가 있다.

이러한 문제점들을 해결하기 위해 바이설파이트 시퀀싱 (Bisulfite sequencing), COBRA (Combination of Bisulfite and Restriction enzyme assay), 파이로시퀸싱(Pyrosequencing), 메틸 라이트 (Methyl Light), 골든게이트 (Golden Gate)등 다양한 해결방안들이 연구되었다. 하지만 이러한 방법들에도 일반 실험실에서 많은 연구자들이 손쉽게 사용하기에는 많은 추가적인 어려움들이 따르고 있어 그 사용에 제약이 따르고 있다. 바이설파이트 시퀀싱의 경우 바이설파이트 처리를 통한 DNA의 변환 이후 공통적인 하나의 프라이머 세트만 이용하여 PCR로 증폭산물을 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 메틸화를 확인하고자 하는 부위가 CpG 염기서열이 높은 빈도로 존재하는 곳이기 때문에 비메틸화 메틸화 증폭산물을 동시에 증폭시킬 수 있는 부위를 프라이머로 설계하는데 있어 염기서열상의 제한이 있으며, 또한 증폭반응 이후 클로닝을 통한 시퀀싱을 여러 개의 클론에 대해 추가로 수행하여야만 하는 단점이 있다. 파이로시퀀싱이나 메틸라이트, 그리고 골든게이트 방법의 경우, 각각의 방법에만 사용이 가능한 고가의 전용분석 기기와 시약을 갖추어야만 실험분석이 가능하다는 어려움이 있고, COBRA 분석법의 경우에는 증폭 반응 후 다시 제한효소를 이용하여 증폭산물을 절단한 후 전기영동법으로 증폭산물의 절단 패턴을 확인하여야 하는 추가실험 등의 복잡한 문제점을 안고 있다. 따라서 별도로 고가의 장비나 추가적인 시약이 구입 없이도 쉽고 정확하게 샘플시료의 메틸화 여 부와 비율을 확인할 수 있는 기술에 대한 요구와 열망은 점차 커져가고 있는 상황이다.

본 발명자는 앞서 살펴본 종래 기술의 문제점을 극복하기 위하여 연구하던 중 메틸화를 확인하고자 하는 유전자를 소듐 바이설파이트로 처리한 후 이를 주형으로 하여 PCR을 실시함에 있어서, 상기 유전자가 메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머(메틸화 특이적 프라이머), 이 프라이머가 결합하는 유전자의 부분과는 일정 간격 이격된 부분과 결합하는, 상기 유전자가 비메틸화된 경우에 증폭 가능하게 하는 프라이머(비메틸화 특이적 프라이머) 및 메틸화에 영향을 받지 않는 프라이머(공통 프라이머)를 모두 이용하여 동시에 PCR을 실시함으로써, 상기 유전자의 메틸화 정도에 따라 유전자가 메틸화된 경우의 PCR 산물(메틸화 증폭산물)과 유전자가 비메틸화된 경우의 PCR 산물(비메틸화 증폭산물)이 서로 다른 크기로 증폭됨으로써 유전자의 메틸화 여부 및 비율을 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 한 관점으로서, (1) 시료 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하는 단계;

(2) 상기 소듐 바이설파이트로 처리된 시료 DNA를 주형으로 하여 프라이머로서,

(a) 특정 유전자의 염기서열 상에서 CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제1의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어진 제1의 올리고뉴클레오타이드,

(b) 상기 제1의 영역과 일정 염기서열 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제2의 영역에 상보적이되, 상기 CpG 염기서열을 UpG 염기서열로 간주하여 그에 상보적인 염기서열을 포함하도록 이루어지고, 제1의 올리고뉴클레오타이드와 동일한 방향성을 갖는 제2의 올리고뉴클레오타이드,

(c) 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(3) 상기 PCR 반응에 따른 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법을 제공한다.

다른 관점으로서, (1) 소듐 바이설파이트;

(2) 하기 프라이머:

(c) 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드;

(3) 특정 유전자를 증폭시킬 수 있는 dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 한 관점은 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법에 관한 것이다. 이 분석방법은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어진다.

제 1단계: 메틸화를 확인하고자 하는 유전자를 포함한 시료 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하는 단계

'시료 DNA'는 메틸화를 확인하고자 하는 대상, 예를 들면 메틸화 확인을 통해 암을 진단하고자 하는 환자의 암 세포로부터 분리한 DNA를 의미한다. 상기 DNA는 지노믹 (genomic) DNA 또는 그의 단편일 수도 있다. 세포로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면 상업적으로 입수 가능한 DNA 분리용 키트를 이용할 수도 있다.

메틸화를 확인하고자 하는 유전자 (또한, '특정 유전자'라고 함)는 시료 DNA 전체이거나, 바람직하게는 그의 단편일 수 있다. 본 발명에서 특정 유전자는 코딩 서열 뿐만 아니라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer), 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 포함한 조절서열일 수도 있다. 본 발명에서 특정 유전자는 프로모터가 바람직하다. 프로모터의 길이는 일반적으로 약 500 내지 2000bP 정도이다. 또한, 본 발명에서 특정 유전자는 2개 이상일 수도 있다.

시료 DNA를 '소듐 바이설파이트 (Sodium Bisulfate)'로 처리함으로써 시료 DNA의 염기서열 상에서 메틸화된 사이토신은 그대로 유지되고, 비메틸화된 사이토신은 우라실로 전환된다.

제 2단계: 소듐 바이설파이트로 처리된 시료 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하는 단계

(1) 본 발명의 프라이머

본 발명의 분석방법은 프라이머로서 다음 3개의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 것을 특징으로 한다.

즉, 특정 유전자의 염기서열 상에서 CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제1의 영역(염기서열)에 상보적인 염기서열로 이루어진 제1의 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. 제1의 올리고뉴클레오타이드가 결합하는 제1영역 내의 사이토신(C)은 메틸화되어 있어 소듐 바이설파이트에 의해 우라실(U)로 변환되지 않을 것으로 간주하여 제1의 올리고뉴클레오타이드의 해당 위치에 구아닌(G)이 오도록 설계한다. 본 발명에서 상기 제1의 올리고뉴클레오타이드를 "메틸화 특이적 프라이머"라고 약칭한다.

또한, 상기 제1의 영역과 일정 염기서열 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제2의 영역(염기서열)에 상보적이되, 상기 CpG 염기서열을 UpG 염기서열로 간주하여 그에 상보적인 염기서열을 포함하도록 이루어지고, 제1의 올리고 뉴클레오타이드와 동일한 방향성을 갖는 제2의 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. 제2의 올리고뉴클레오타이드가 결합하는 제2의 영역내에 있는 CpG 염기서열내의 사이토신은 비메틸화되어 있어 소듐 바이설파이트에 의해 모두 티민(T)과 유사한 우라실로 변화될 것으로 간주하여 제2의 올리고뉴클레오타이드의 해당 위치에 아데닌(A)이 오도록 설계한다. 본 발명에서는 상기 제2의올리고뉴클레오타이드를 "비메틸화 특이적 프라이머"라고 약칭한다.

아울러, 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. 제3의 올리고뉴클레오타이드가 결합하는 제3의 영역에 있는 사이토신은 소듐 바이설파이트에 의해 모두 티민(T)과 유사한 우라실로 변화될 것으로 간주하여 제3의 올리고뉴클레오타이드의 해당 위치에 아데닌(A)이 오도록 설계한다. 본 발명에서는 상기 올리고뉴클레오타이드를 "공통 프라이머"라고 명명한다.

본 발명의 프라이머에 있어서, 제1의 영역과 및 제2의 영역 간의 일정 간격은 임의의 크기일 수 있으며, 다음과 같은 3가지 사항을 감안하여 설정한다. 첫째, PCR 산물을 전기영동한 후 젤 상에서 비메틸화 산물과 메틸화 산물의 크기를 용이하게 구분할 수 있는 정도의 간격으로 설정한다.

둘째, 비메틸화 산물과 메틸화 산물의 크기 차이가 너무 크면, 비메틸화와 메틸화 비율 확인 시에 두 가지 문제가 발생할 수 있다. 즉, 비메틸화 산물과 메틸화 산물이 동시에 증폭되기 때문에 경쟁반응이 일어나게 되는데, 이 때 두 산물 간의 크기에 차이가 많이 일어나면 증폭률에서 큰 차이가 발생하게 되어, 메틸화와 비메틸화 정도에 따른 비율 차이 확인에 영향을 주게 된다. 또한, PCR 결과 비슷한 양의 산물이 증폭되었다 하더라도, 일반적으로 더 큰 사이즈의 증폭산물에 상대적으로 더 많은 양의 염색약(예, EtBr)에 의해 염색되어 산물의 비율이 다르게 계산되어질 수 있다. 셋째, CpG섬의 염기서열 중 CpG는 대부분 같은 패턴으로 메틸화나 비메틸화 상태로 존재하지만, 일부 유전자에서는 한 프로모터의 CpG섬 내부에서도 메틸화가 다르게 나타나는 글러스터(cluster)가 존재하는 경우가 있다. 그로 인해 비메틸화와 메틸화 특이적 프라이머 간의 간격이 너무 넓어져 버리면 다른 클러스터에 위치하게 될 수가 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 제1의 영역과 및 제2의 영역 간의 일정 간격은 특별히 제한적이지 않으나, 40 내지 50bp가 바람직하다.

또한, 본 발명의 프라이머에 있어서, 제1의 올리고뉴클레오타이드와 제2의 올리고뉴클레오타이드는 동일한 방향성(orientation)을 갖도록 설계하고, 제3의 올리고뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드들과는 반대의 방향성을 갖도록 설계한다. 예를 들면, 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드가 5'→ 3'방향성 (또는 센스)을 갖는다면 제3의 올리고뉴클레오타이드는 3'→ 5'방향성 (또는 안티센스)을 갖도록 설계한다. 본 발명에서는 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드는 안티센스, 제3의 올리고뉴클레오타이드는 센스 방향성을 갖도록 설계하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명의 프라이머는 50 내지 70℃, 바람직하게는 55 내지 65℃, 가장 바람직하게는 60℃ 정도의 용융온도(Tm); 35-55% 정도, 바람직하게는 40-50% 정도의 GC 비율이 포함되는, 10 내지 50bp, 바람직하게는 20 내지 25bp 크기의 올리고뉴클레오타이드가 되도록 설계하는 것이 적합하다.

본 발명의 프라이머 합성에 이용되는 프라이머의 형태는 일반적으로 이용되는 주형 염기서열과 상보적으로 결합하는 데옥시뉴클레오타이드의 폴리머 형태나, PNA(Peptide Nucleic Acid)의 폴리머 형태, 또는 이 둘을 모두 포함하는 중간에 미스매치(miss match) 형태가 들어가 있는 폴리머 등, PCR시 프라이머로 이용될 수 있는 모든 폴리머 형태가 이용될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 본 분야에서 올리고뉴클레오타이를 합성할 수 있는 것으로 공지된 임의의 방법, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템^TM 등으로 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수도 있다.

(2) 본 발명의 PCR

본 발명의 분석방법에서는 당업계에 공지된 PCR (Polymerase Chain Reaction)방법을 모두 이용할 수 있다. PCR은 예를 들면, 미국특허 제4,683,195호; 미국특허 제4,683,194호; Saiki et al. Science, 1985, vol.230, pp.1350-1354; Scharf et al. Science, 1986, vol.324, pp.163-166; Kogan et al. New Engl. J. Med., vol.317, pp.986-990 등에 개시되어 있다.

PCR은 통상적으로 (1) DNA의 변성 (denaturation); (2) 프라이머의 결합 (annealing); (3) DNA의 합성 (polymerization or elongation) 단계로 이루어져 있 다. 본 발명에서 DAN의 변성은 당업계에 공지된 바와 같이 약 80 내지 96℃에서 가열함으로써 달성될 수 있으며 높은 온도일수록 단일 가닥 DNA 로의 분리(변성)가 용이하지만, 온도가 지나치게 높으면 DNA 중합효소의 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 적합한 온도를 설정하여야 한다. 이렇게 분리된 단일가닥 DNA (즉, 주형)에 대한 프라이머의 결합은 통상적으로 37 내지 65℃에서 진행되지만, 상기 온도는 프라이머의 GC 함량 및 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. 주형에 프라이머가 결합하게 되면 상기 프라이머의 말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드가 순차적으로 결합하여 DNA 합성이 일어나게 되는데, 통상적으로 60 내지 75℃에서 실행한다. 본 발명에서 DNA의 변성, 어닐링, DNA의 합성 단계를 30 내지 40회, 바람직하게는 35회 수행하는 것이 적합하다.

본 발명에 있어서, PCR은 DNA의 합성에 적합한 조건에서 수행하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로 PCR은 약 pH 7 내지 9, 바람직하게는 약 pH 8의 완충용액에서 수행한다. 본 발명에서는 HEPES 또는 글리신-NaOH를 포함하는 완충용액 및 인산완충용액 등이 이용될 수 있으며, Tris-HCl을 10 내지 100mM의 농도로 함유하는 완충용액을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 상기 완충용액은 1가의 염(salt)을 약 10mM 내지 60mM의 농도로 함유할 수도 있다. 일반적으로 이용되는 1가의 염에는 KCl. NaCl 및 (NH₄)₂SO₄ 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PCR 반응물의 한 성분으로서 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP는 목적한 특정 유전자의 서열을 목적한 양까지 증폭하기에 충분한 양으로 PCR 반응물에 첨가되어야 한다. dNTPs는 바람직하게는 약 0.75 내지 4.0mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 2.0 내지 3.0mM의 농도로 PCR 반응물에 첨가할 수 있다.

상기 PCR 반응물에는 프라이머의 말단으로부터 주형 DNA의 염기서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 순차적으로 연결시키는 반응을 촉매하는 DNA 중합효소가 포함되어야 할 것이다. 본 발명에서는 당업계에 공지된 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, 그러한 예에는 E.coli DNA 중합효소, E.coli DNA 중합효소의 Klenow 단편, T4 DNA 중합효소 등이 포함된다. 그러나 통상적으로 PCR은 고온에서 실행되기 때문에 본 발명에서 이용되는 DNA 중합효소는 고온에서 안정한 성질을 보유한 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 PCR에서는 당업계에 공지된 열에 안정한 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, Taq 중합효소, 예를 들면 Amplitaq-gold 효소를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 PCR에 의하여 도 2에 나타낸 바와 같이 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율에 따라 여러 가지 증폭 산물이 생성될 수 있다. 특정 유전자가 완전히 비메틸화된 경우에는 특정 유전자에 비메틸화 특이적 프라이머가 결합하여 그에 따른 PCR 산물 (또한 '비메틸화 증폭산물'이라고 함)이 생성될 것이다. 특정 유전자가 완전히 메틸화된 경우에는 특정 유전자에 메틸화 특이적 프라이머가 결합하여 그에 따른 PCR 산물 (또한, '메틸화 증폭산물'이라고 함)이 생성될 것이다. 특정 유전자에 메틸화와 비메틸화가 혼재된 경우에는 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭 산물이 모두 생성될 것이다. 더 나아가, 상기 특정 유전자가 주로 메틸화된 경우에는 메틸화 특이적 프로모터가 비메틸화 특이적 프로모터 보다 높은 확률로 상기 특정 유전자에 결합하여 메틸화 증폭산물이 주로 생성될 것인데 반하여 상기 특정 유전자가 주로 비메틸화된 경우에는 비메틸화 특이적 프로모터가 메틸화 특이적 프로모터 보다 높은 확률로 상기 특정 특정 유전자에 결합하여 주로 비메틸화 증폭산물이 생성될 것이다.

본 발명에서는 앞서 설명된 바와 같이 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드가 일정 간격 이격되도록 설계되었기 때문에 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물은 그 간격만큼 상이한 크기를 갖게 된다. 예를 들어 일정 간격이 40-50bp라면 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물의 크기는 40-50bp 차이가 나게 된다. 따라서, 후술되는 증폭산물의 검출에 의하여 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물은 용이하게 식별할 수 있다.

제 3단계: 증폭산물의 검출

본 발명에서는 이전 단계의 PCR을 통해서 수득한 PCR 산물을 바람직하게는 전기영동을 이용하여 검출한다. '전기영동'은 전기장에서 특정 물질을 크기 및 전하에 따라 분리하는 방법을 의미하는 것으로, 통상적으로 특정 물질을 음극에 로딩하고 전기장을 적용시켜서 상기 물질이 양극으로 이동하면서 분리되도록 유도한다. 뉴클레오타이드로 이루어진 물질의 전기영동에는 일반적으로 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되는 것 은 아니다.

전술한 전기영동에 이용되는 겔의 제조 및 염색방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어서 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide)를 이용한 아가로스 겔의 염색방법은 Boerwinkle et al. PNAS, 1989, vol.86, pp.212-216에 개시되어 있다. 또한, 은을 이용한 폴리아크릴아미드 겔의 염색방법은 (1) Goldman et al. Electrophoresis, 1982, vol.3, pp.24-26; (2) Marshall, Electrophoresis, 1983, vol.4, pp.269-272; (3) Tegelstrom, Electrophoresis, vol.7, pp.226-229 및 (4) Allen et al. Bio Technique, 1989, vol.7, pp.736-744 등에 개시되어 있다.

본 발명에서는 증폭산물에 의해 전기영동의 젤 상에 나타나는 밴드의 진하기를 산술적으로 계산하면, 특정 유전자의 메틸화 존재 여부와 비율까지 확인 가능하다.

이상 설명된 본 발명의 분석방법은 간략하게 "이중 특이 바이설파이트 중합효소연쇄반응"(Dual Specific Bisulfite PCR; DSBP)이라고 약칭한다.

본 발명의 다른 관점은 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율을 분석할 수 있는 키트에 관한 것이다. 이 키트는 다음과 같은 구성성분을 포함하여 이루어진다.

즉, (1) 소듐 바이설파이트와; (2) 하기 프라이머:

(c) 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드; 및

(3) 특정 유전자를 증폭시킬 수 있는 dNTP 및 DNA 중합효소이다.

본 발명의 분석방법 및 키트는 한 양태로서 암 진단에 이용할 수 있다. 즉, 정상 세포에서 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율과 암 세포에서 상기 유전자의 메틸화 여부와 비율을 비교하여 암 여부를 진단한다. 일반적으로 암 억제 유전자 (예, RASSF1A, p161INK4A)의 프로모터의 경우에 정상 세포에서는 비메틸화되고 암 세포에서는 메틸화되는 것으로 알려져 있으므로 특정 유전자가 암 억제 유전자의 프로모터인 경우, 메틸화 비율이 높은 경우에는 암으로 진단할 수 있다. 또한, 일반적으로 발암 유전자 (예, k-ras)의 프로모터의 경우에 정상 세포에서는 메틸화되고 정상 세포에서는 비메틸화되는 것으로 알려져 있으므로 특정 유전자가 발암 유전자의 프로모터인 경우, 비메틸화 비율이 높은 경우에는 암으로 진단할 수 있다. 이와 관련된 예시가 발명의 실시를 위한 구체적인 내용에서 설명될 것이다.

하나의 시험관 내에서 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머가 서로 경쟁 반응을 통하여 하나의 공통 센스 프라이머와 반응하여 증폭산물을 합성하기 때문에 특정 유전자의 메틸화 비율이 증폭반응 이후에 유지될 수 있다.

또한, 특정 유전자에 대하여 비메틸화 증폭산물이던 메틸화 증폭산물이던지 간에 반드시 하나 이상의 증폭산물을 합성하기 때문에 PCR 에러로 인한 위음성 판정의 위험성 문제를 원천적으로 해결할 수 있게 된다.

또한, 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 한번의 PCR만으로 동시에 수행할 수 있기 때문에 소듐 바이설파이트로 처리된 DNA의 사용량이 줄게 되어 훨씬 더 많은 관심 유전자에 대한 메틸화 여부를 확인할 수 있게 된다.

아울러, 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머에 의해 증폭된 산물과, 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머에 의해 증폭된 산물의 크기는 임의로 조절이 가능하여 다중 유전자에 대한 메틸화 여부를 추가적인 고가의 장비나 시약의 구입 없이도 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 지노믹 DNA 의 분리 및 바이설파이트 처리

키트를 이용하여, 폐암 세포주인 Calu6와 H358와 환자의 객담에서 지노믹 DNA를 추출하고 Nano Drop을 이용하여 그 농도를 측정하였다. 이후, 추출한 DNA 약 1~2 ㎍ 정도를 0.5 N 농도의 수산화나트륨과 섞어 16 ㎕로 만들어 37 ℃에서 15분간 반응시켜 DNA가 단일가닥 형태가 되도록 변형시켰다. 이후, 3.5 M 농도의 소듐 바이설파이트와 (Sodium bisulfate) 0.01M 농도의 하이드로퀴논 (Hydroquinone) 시약을 첨가하고 56℃에서 16시간 화학 반응시켰다. 이후 에탄올을 이용한 침전반응을 수행하여 변환된 DNA만을 농축시켜 순수 분리하여 50 ㎕의 3차 증류수로 녹인 후, 0.1 M 농도가 되도록 수산화나트륨을 첨가하고 상온에서 15분간 반응함으로써 사이토신의 탈황산화 반응을 수행하고 다시 한번 에탄올 침전반응으로 농축시키고, 최종적으로 30 ㎕의 3차 증류수에 녹여서 -20℃에 보관하였다.

실시예 2: 메틸화 표준 양성 샘플 DNA 준비 및 바이설파이트 처리

DSBP 방법의 민감도와 특이도를 확인하는데 필요한 표준 양성 대조군 시료를 준비하기 위해, 폐암 세포주인 Calu6에서 순수 분리한 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용한 효소 반응을 수행하였다. Sss1 효소는 New England Biolabs사(社)에서 구입하여 이용하였는데, 반응 조건은 다음과 같다. DNA 5 ㎍을 효소와 함께 제공되는 완충용액 2, 최종 0.16 M 농도가 되도록 첨가한 SAM (S-Adenosylmethionine), 그리고 Sss1 효소 10 유니트와 함께 섞는다. 여기에 최종적으로 3차 증류수를 추가로 첨가하여 전체 반응액의 양이100 ㎕가 되도록 하고 잘 섞어 혼합한 후, 37℃에서 1 시간 반응시켜 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시켜 표준 양성 시료로 만들어 주었다. 이후, 65℃에서 20분간 추가 반응시켜 Sss1 효소를 열 변성시켜 비활성화함으로써 이 반응을 마무리하였다. 이렇게 준비된 표준 양성 DNA를 실시예 1에서 기술한 바와 같은 방법을 통해 바이설파이트 변환반응을 수행한다.

실시예 3: HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 프라이머 설계 및 합성

DSBP 프라이머를 설계하기 위해 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 CpG 섬에 대한 표준 염기서열을 확인하고, 기 상술한 조건대로 각각 공통 센스 프라이머, 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머, 메틸화 특이적 안티센스 프라이머를 설계하여 합성하였다. HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자 각각의 비메틸화 증폭산물의 크기는 순서대로 각각 108bp, 183bp, 117bp 이며, 메틸화 증폭산물의 크기는 각각 148bp, 232bp, 162bp 이다. 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

DSBP 공통 센스 프라이머

HOX D9-공통 : 5'-GTGTGAGTAGGGAGAGAGG-3' (서열번호: 1)

HOX D11-공통 : 5'-CTACCTTCTACTACCCCCTT-3' (서열번호: 2)

HOX D13 : 5'-GAGGTTTATAGAGGGAGAGAG-3' (서열번호: 3)

DSBP 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머

HOX D9-비메틸화 : 5'-CAACCACAAAAACACCAAACCA-3' (서열번호: 4)

HOX D11-비메틸화 : 5'-GTTTTATGAGGTAGTGTTTGGG-3' (서열번호: 5)

HOX D13-비메틸화 : 5'-CATCCCAACAAACACAAACACA-3' (서열번호: 6)

DSBP 메틸화 특이적 안티센스 프라이머

HOX D9-메틸화 : 5'- AACTTCCGAACCGCGAACG-3' (서열번호: 7)

HOX D11-메틸화 : 5'- TTTATAGCGCGGTGGGTCG-3' (서열번호: 8)

HOX D13-메틸화 : 5'- CAAAACCGAAAACTACCGCCG-3' (서열번호: 9)

표 1에 메틸화를 확인하고자 하는 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 CpG 섬에 대한 일부의 표준 염기서열과, 각 유전자의 DSBP 프라이머들이 결합하는 위치를 표시하였다.

HOX D9 증폭산물 표준 염기서열
메틸화 산물	GTGTGAGTAGGGAGAGAGGCGAGGGGAGAACAGCTCCCCTCGGGCGCTAGGGGCCGCCCCGAGGGCCCGCCTGCCTCGGGCGACACCGGCCTGGCGCCCCCGCGGCCGCTCCGTGTGCCCTGGACTCGCCGCCCGCGGCTCGGAAGCT(서열번호: 10)
비메틸화 산물	GTGTGAGTAGGGAGAGAGGCGAGGGGAGAACAGCTCCCCTCGGGCGCTAGGGGCCGCCCCGAGGGCCCGCCTGCCTCGGGCGACACCGGCCTGGCGCCCCCGCGGCCG(서열번호: 11)
HOX D11 증폭산물 표준 염기서열
메틸화 산물	TCTACAGCGCGGTGGGCCGCAATGGCATCTTGCCACAGGGCTTCGACCAGTTCTACGAGGCAGCGCCCGGGCCCCCGTTCGCCGGGCCGCAGCCCCCGCCGCCACCCGCGCCGCCACAGCCCGAGGGCGCAGCCGACAAGGGCGACCCCAGGACCGGGGCTGGTGGCGGCGGGGGCAGTCCCTGCACCAAGGCGACCCCTGGCTCGGAGCCCAAGGGGGCAGCAGAAGGCAG(서열번호: 12)
비메틸화 산물	GTTCTACGAGGCAGCGCCCGGGCCCCCGTTCGCCGGGCCGCAGCCCCCGCCGCCACCCGCGCCGCCACAGCCCGAGGGCGCAGCCGACAAGGGCGACCCCAGGACCGGGGCTGGTGGCGGCGGGGGCAGTCCCTGCACCAAGGCGACCCCTGGCTCGGAGCCCAAGGGGGCAGCAGAAGGCAG(서열번호: 13)
HOX D13 증폭산물 표준 염기서열
메틸화 산물	AGAGAGAAAGGAGAGGAGGGAGGAGGCGCGCCGCGCCATGGTGTCCTGCGCGGGGCCAGGGCCAGGGCCGGGGCCGGGCCAGGCCGGGCCATGAGCCGCGCCGGGAGCTGGGACATGGACGGGCTGCGGGCAGACGGCGGGGGCGCCGGTGGCGCCCCGGCC(서열번호: 14)
비메틸화 산물	AGAGAGAAAGGAGAGGAGGGAGGAGGCGCGCCGCGCCATGGTGTCCTGCGCGGGGCCAGGGCCAGGGCCGGGGCCGGGCCAGGCCGGGCCATGAGCCGCGCCGGGAGCTGGGACATG(서열번호: 15)

실시예 4: 변환된 DNA의 DSBP에 의한 증폭

앞서 바이설파이트로 변환시킨 DNA를 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대해 PCR을 수행하기 위해, 다음과 같은 조건으로 각 시약을 혼합하였다.

먼저, 각각의 유전자에 대한 공통 센스 프라이머, 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머, 메틸화 특이적 안티센스 프라이머를 각각 10 μΜ이 되도록 혼합하여, HOX D9 DSBP 프라이머 믹스, HOX D11 DSBP 프라이머 믹스, 그리고 HOX D13 DSBP 프라이머 믹스를 준비하였다.

이렇게 준비된 각 유전자의 DSBP 프라이머 믹스 1 ㎕를, 10X PCR 완충용액 2 (100mM Tris HCl (pH 8.3), 15mM MgCl₂, 500 mM KCl, 0.01% gelatin) 2㎕, 2.5mM dNTP 혼합물 (2.5mM dATP, 2.5mM dGTP, 2.5mM dTTP, 2.5mM dCTP) 2㎕, Amplitaq-Gold 중합효소 (Applied Biosystem) 1.0 유니트와 3차 증류수를 섞어서 총 18㎕로 맞춰준 후, 메틸화를 확인하고자 하는 변형된 DNA 2㎕를 첨가하여 다음의 조건대로 PCR을 수행하였다. 94℃에서 5분간 둔 후, 94℃에서 15초, 62℃ (-0.5℃ /사이클) 에서 30초, 72℃에서 50초 반응시키는 조건으로 20 사이클 수행한 후, 다시 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 50초 반응시키는 조건으로 20 사이클을 더 수행하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. 이 조건으로 PCR을 수행할 경우, HOX D9, HOX D11, 및 HOX D13 유전자 모두 특별한 최적화 과정 없이 증폭반응을 잘 수행할 수 있었다.

실시예 5: 전기영동을 통한 DSBP 증폭산물의 결과 확인

전기 실시예 4에서 DSBP 반응으로 증폭시킨 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 증폭산물 5 ㎕를 1 ㎕의 6X DNA 아가로스 젤 로딩 완충용액(0.25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol, 30% glycerol)과 섞어 2.5% 아가로스 젤에 로딩하여 150 V로 30분간 전기영동하였다. 이후, Ultra-LUM 기기를 포함하는 아가로스 젤 이미지 인식 기기에서 각 시료 DNA에 의해 증폭된 비메틸, 메틸 증폭산물의 밴드를 확인하여 메틸화 여부를 결정하였다. 이 후, 1Dscan EX 프로그램을 포함하는 밴드 진하기를 산술화 할 수 있는 프로그램을 이용하여 각 증폭산물의 양을 산술화하여 각 유전자의 메틸화 비율을 측정하였다.

실시예 6: HOX D9, HOX D11, HOX D13에 대한 DSBP의 민감도 확인 결과

실시예 6-1: HOX D9 유전자에 대한 DSBP의 민감도 확인

Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D9 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인하였고, 젤 사진을 도 3에 나타내었다.

도 3에서 레인 1은 주형 DNA 대신 3차 증류수를 이용한 음성 대조군이고, 레인 2는 100% Calu6 DNA를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 3은 99% Calu6 DNA와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 1%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 4는 95% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 5%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 5는 90% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 10%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 6은 75% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 25%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 7은 50% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 50%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 8은 10% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 90%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 9는 5% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 95%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 10은 1% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 99%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 11은 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 100%를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D9유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이다.

도 3에 나타난 바와 같이 Sss1 변환시켜 메틸화시킨 DNA의 비율이 점차 늘어남에 따라 비례하여 HOX D9의 메틸화 증폭산물의 진하기도 점차 증가하며, 역시 기대치대로 비메틸화 증폭산물의 진하기는 점차 줄어듦을 확인할 수 있다.

실시예 6-2: HOX D11 유전자에 대한 DSBP의 민감도 확인 결과

Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D11 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인하였고, 젤 사진을 도 4에 나타내었다.

도 4에서 레인 1은 주형 DNA 대신 3차 증류수를 이용한 음성 대조군이고, 레인 2는 100% Calu6 DNA를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 3은 99% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 1%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 4는 95% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 5%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 5는 90% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 10%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 6은 75% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 25%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 7은 50% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 50%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 8은 10% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 90%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 9는 5% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 95%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 10은 1% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 99%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 11은 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 100%를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D11유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이다.

도 4에 나타난 바와 같이 Sss1 변환시켜 메틸화시킨 DNA의 비율이 점차 늘어남에 따라 비례하여 HOX D11의 메틸화 증폭산물의 진하기도 점차 증가하며, 역시 기대치대로 비메틸화 증폭산물의 진하기는 점차 줄어듦을 확인할 수 있다.

실시에 6-3: HOX D13 유전자에 대한 DSBP의 민감도 확인 결과

Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D13 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인하였고, 도 5에 나타내었다.

도 5에서 레인 1은 주형 DNA 대신 3차 증류수를 이용한 음성 대조군이고, 레인 2는 100% Calu6 DNA 를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 3은 99% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 1%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 4는 95% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 5%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 5는 90% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 10%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 6은 75% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 25%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 7은 50% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 50%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 8은 10% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 90%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 9는 5% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 95%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 10은 1% Calu6 DNA 와 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 99%를 섞은 후, 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이고, 레인 11은 Sss1 반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA 100%를 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 HOX D13유전자에 대한 DSBP를 수행한 증폭산물이다.

도 5에 나타난 바와 같이 Sss1 변환시켜 메틸화시킨 DNA의 비율이 점차 늘어남에 따라 비례하여 HOX D13의 메틸화 증폭산물의 진하기도 점차 증가하며, 역시 기대치대로 비메틸화 증폭산물의 진하기는 점차 줄어듦을 확인할 수 있다.

실시예 7: HOX D9 , HOX D11 , HOX D13 유전자에 대한 DSBP 의 정확도 확인 결과

HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 프라이머 중, 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트와, 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 각각 PCR 실시하고 아가로스 젤에서 전기영동하여 각 증폭산물이 정확한 크기를 지니고 증폭되는지를 확인하였고, 젤 사진을 도 6에 나타내었다.

도 6에서 레인 1은 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D9 유전자의 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 108bp이며, 레인 2는 Sss1 효소반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D9 유전자의 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 148bp이며, 레인 3은 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D11 유전자의 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 183bp이며, 레인 4는 Sss1 효소반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D11 유전자의 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 232bp이며, 레인 5는 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D13 유전자의 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 117bp이며, 레인 6은 Sss1 효소반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA를 주형으로 하여 HOX D13 유전자의 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응시킨 결과로 162bp이다.

실시예 8: HOX D9 , HOX D11 , HOX D13 유전자에 대한 개별적 DSBP 증폭반응 결과

Clau6과 H358 세포주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여, HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대하여 개별적으로 DSBP 증폭반응시키고, 젤 사진을 도 7에 나타내었다.

도 7에서 레인 1부터 3은 Calu6 DNA를, 레인 4부터 6은 Sss1 효소반응시켜 메틸화된 Calu6 DNA를, 레인 7부터 9는 H358 DNA를, 레인 10부터 12는 Sss1 효소반응시켜 메틸화된 H358 DNA를 주형으로 하여, 각각 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭반응시킨 결과이다.

실시예 9: HOX D9, HOX D11 유전자에 대한 다중 DSBP 증폭반응

HOX D9과 HOX D11에 대한 DSBP 프라이머들을 모두 섞은 후, Clau6와 H358 세포주의 지노믹 DNA를 바이설파이트 화학반응시킨 변환 DNA를 주형으로 하여 증폭반응시킨 결과를 아가로스 젤 상에서 전기영동하였고, 젤 사진을 도 8에 나타내었다.

실제로 Calu6 DNA는 HOX D9, HOX D11 유전자가 모두 비메틸화 되어 있고, H358 DNA는 비메틸화와 메틸화가 공존하고 있다.

도 8에서 레인 1은 Calu6 세포의 변환 DNA를 주형으로 하여 HOX D9과 HOX D11의 두 유전자에 대한 다중 DSBP의 증폭결과이며, 레인 2는 H358 세포의 변환 DNA를 주형으로 하여 HOX D9과 HOX D11의 두 유전자에 대한 다중 DSBP의 증폭결과이다.

각 증폭산물은 예상대로, 레인 1에서는 HOX D9, HOX D11 유전자의 비메틸화 증폭산물만이 증폭되었고, 레인 2에서는 HOX D9, HOX D11 유전자의 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물이 동시에 증폭되었음을 보여준다.

실시예 10: DSBP의 정확도 확인 결과

HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭이 바이설파이트 변환된 DNA만을 특이적으로 인식하여 증폭됨을 보여주기 위해, Calu6 지노믹 DNA를 바이설파이트 변환시키지 않은 것과 바이설파이트 변환시킨 것을 주형으로 하여, HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭반응을 수행한 결과를 아가로스 젤 상에 전기영동하고, 젤 사진을 도 9에 나타내었다.

도 9에서 레인 1부터 3까지는 각각 3차 증류수, 바이설파이트 변환시킨 Calu6 DNA, 바이설파이트 변환시키지 않은 Calu6 DNA를 주형으로 HOX D9 유전자에 대한 DSBP 증폭반응의 결과이다. 레인 4부터 6까지는 각각 3차 증류수, 바이설파이트 변환시킨 Calu6 DNA, 바이설파이트 변환시키지 않은 Calu6 DNA를 주형으로 HOX D11 유전자에 대한 DSBP 증폭반응의 결과이다. 레인 7부터 9까지는 3차 증류수, 바이설파이트 변환시킨 Calu6 DNA, 바이설파이트 변환시키지 않은 Calu6 DNA를 주형으로 HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭반응의 결과이다.

실시예 11: HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 메틸화 빈도와 폐암과의 관련성

폐암 확진된 환자와, 페암이 아닌 것으로 확진된 환자 각 100명씩의 DNA를 대상으로 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 메틸화 빈도와 폐암과 관련성을 확인하였다(표 2).

HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 메틸화 빈도와 폐암과의 관련성

	객담검사 양성 폐암 환자군	객담검사 음성 폐암 환자군	대조군
HOX D9	66%	22%	2%
HOX D11	34%	46%	8%
HOX D13	59%	30%	7%

표 2에 나타난 바와 같이 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 메틸화 빈도가 높을수록 폐암에 걸려있을 가능성도 높은 것으로 확인되었다.

비교예 1: HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 종래 MSP 프라이머 설계 및 합성

DSBP 증폭반응의 정확성을 확인해 보기 위해, 종래 MSP의 방법대로 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자 각각에 대한 비메틸화 특이적 프라이머와 메틸화 특이적 프라이머 세트를 설계하고 합성하였다.

HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자 각각에 대한 비메틸화 증폭산물의 크기는 순서대로 각각 151bp, 111bp, 147bp이며, 메틸화 증폭산물의 크기는 각각 151bp, 111bp, 148bp이다. 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

종래 MSP 비메틸화 특이적 센스 프라이머

HOX D9-비메틸화 센스 프라이머 :

5'- TTGGTGGTTTGGGTGTTGGT -3' (서열번호: 16)

HOX D11-비메틸화 센스 프라이머 :

5'- TGTATGTTTAGTTTGTGTGT -3' (서열번호: 17)

HOX D13-비메틸화 센스 프라이머 :

5'- GTATTGGTTAATGAGGTGTTAGT -3' (서열번호: 18)

종래 MSP 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머

HOX D9-비메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- CACACCACAAACACCTCATCA -3' (서열번호: 19)

HOX D11-비메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- CACTACTACCACCCCCCACA -3' (서열번호: 20)

HOX D13-비메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- CATAAAAATATAAACCTCATACCA -3' (서열번호: 21)

종래 MSP 메틸화 특이적 센스 프라이머

HOX D9-메틸화 센스 프라이머 :

5'- TCGGTGGTTCGGGCGTCGGC -3' (서열번호: 22)

HOX D11-메틸화 센스 프라이머 :

5'- TCGTACGTTTAGTTCGTGCGC -3' (서열번호: 23)

HOX D13-메틸화 센스 프라이머 :

5'- TATCGGTTAACGAGGTGTTAGC -3' (서열번호: 24)

종래 MSP 메틸화 특이적 안티센스 프라이머

HOX D9-메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- GCGCCGCGAACACCTCGTCG -3' (서열번호: 25)

HOX D11-메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- GCTACTACCGCCCCCCGCG -3' (서열번호: 26)

HOX D13-메틸화 안티센스 프라이머 :

5'- CATAAAAATATAAACCTCGTACCG -3' (서열번호: 27)

비교예 2: 전기영동을 통한 종래 MSP 증폭산물의 결과 확인

종래 MSP 증폭반응도 DSBP 증폭반응과 마찬가지 과정을 수행하였다. 다만 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자 각각에 대해, 비메틸화 특이적인 프라이머 세트와, 메틸화 특이적 프라이머 세트를 이용한 PCR을 독립적으로 수행하여야 한다. PCR 조건과, 각 시약의 조성비는 실시예 4에 기 상술한 것과 동일하게 하여 증폭반응을 수행하였고, 이 후 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물 5㎕를 1㎕의 6X DNA 아가로스 젤 로딩 완충용액(0.25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol, 30% glycerol)과 섞어 2.5% 아가로스 젤에 로딩하여 150 V로 30분간 전기영동 하였다. 이후, 실시예 5와 같은 기기와 프로그램을 이용하여 메틸화 특이적 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 증폭산물이 생성되었는지를 확인함으로써 메틸화의 여부를 확인한다.

비교예 3: 종래 MSP 분석 결과

비교예 3-1: HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 종래 MSP 분석 결과

종래 MSP 프라이머를 이용하여 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 각각 별도로 PCR 실시하였고, 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 레인 1부터 6까지는 Calu6 DNA를 주형으로 하여, 각각 HOX D9 유전자에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D11에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D13에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 보여준다. 레인 7부터 12는 Sss1 효소반응시켜 메틸화시킨 Calu6 DNA 10%와 비메틸화 상태의 Calu6 DNA 90%를 섞은 후 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여 각각 HOX D9 유전자에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D11에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D13에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 보여준다. 레인 13부터 18은 Sss1 효소반응시켜 메틸화시킨 Calu6 DNA 25%와 비메틸화 상태의 Calu6 DNA 75%를 섞은 후 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여 각각 HOX D9 유전자에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D11에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D13에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 보여준다. 레인 19부터 24는 Sss1 효소반응시켜 메틸화시킨 Calu6 DNA 90%와 비메틸화 상태의 Calu6 DNA 10%를 섞은 후 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여 각각 HOX D9 유전자에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D11에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물, HOX D13에 대한 비메틸화 증폭산물과 메틸화 증폭산물을 보여준다.

Calu6 지노믹 DNA의 경우, HOX D9, D11, D13 유전자가 모두 비메틸화 되어 있고, 이는 DSBP 기술을 이용한 도 7의 레인 1, 2, 3에서 보여지는 것처럼 비메틸화 산물만 증폭되어야 한다. 하지만, 도 10의 레인 2에서 보여지는 것처럼, 종래 MSP 프라이머를 비메틸화와 메틸화 산물을 별도로 증폭시킬 경우에는 메틸화 특이적 프라이머 세트를 이용한 경우에도 증폭산물이 나타나고 있다. 이는, 메틸화 프라이머만 이용해서 독립적으로 증폭반응을 수행하는 종래 MSP 반응의 원천적인 문제점 때문에, 극히 일부 (바이설파이트 미 변환 등의 이유) 남아있는 메틸화를 인식하여 기하급수적으로 증폭되기 때문이다.

또한, HOX D9유전자에 대한 메틸화 특이적 증폭산물인 레인 8, 14, 20에서 보여지는 것과 같이, 종래 MSP 방법으로 비메틸화 산물과 메틸화 산물을 독립적으로 따로 증폭반응을 수행할 경우에는, 메틸화 비율이 10%, 25%, 90%의 차이를 가지고 있음에도 불구하고 증폭산물의 양은 별 차이가 나지 않아 비율을 구분할 수가 없다. 이러한 현상은 HOX D13 유전자에서도 마찬가지임을 알 수 있어, 이 문제 역시 특정 염기서열의 문제가 아니라 종래 MSP 증폭반응 자체의 문제임을 알 수 있다.

비교예 3-1: HOX D11 유전자에 대한 종래 MSP의 민감도 확인 결과

Calu6 DNA와 Sss1 효소반응시켜 메틸화시킨 Calu6 DNA를 100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 75:25, 50:50, 10:90, 5:95, 1:99, 100%의 비율로 섞은 후 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여, HOX D11 유전자에 대한 종래 MSP 반응을 수행하고, 결과를 도 11에 나타내었다.

즉, 도 11은 HOX D11 유전자에 대해 비메틸화 특이적인 프라이머 세트와, 메틸화 특이적인 프라이머 세트를 각각 이용하여 PCR을 수행하여 전기영동한 결과이다. 레인 1은 3차 증류수를, 레인 2는 바이설파이트 변환시키지 않은 지노믹 DNA를 각각 주형으로 하였고, 레인 3부터 12는 메틸화 DNA의 비율이 0, 1, 5, 10, 25, 50, 90, 95, 99, 100%인 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여 HOX D9 유전자에 대한 비메틸화 특이적 프라이머 세트를 이용하여 종래 MSP 증폭반응시킨 결과이다. 레인 13은 3차 증류수를, 레인 14는 바이설파이트 변환시키지 않은 지노믹 DNA를 각각 주형으로 하였고, 15부터 24는 메틸화 DNA의 비율이 0, 1, 5, 10, 25, 50, 90, 95, 99, 100%인 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여 HOX D9 유전자에 대한 메틸화 특이적 프라이머 세트를 이용하여 종래 MSP 반응시킨 결과이다. 비록, 메틸화 여부의 확인은 가능하지만, 본 발명에서 기 상술한 종래 MSP의 문제점 중 일부인 메틸화의 비율 확인이 불가능함을 알 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 공통 센스 프라이머, 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머, 메틸화 특이적 안티센스 프라이머의 설계를 위한 대략적인 도면이다.

도 2는 증폭산물의 전기영동 결과를 간략하게 나타낸 도면이다.

도 3은 Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D9 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인한 젤 사진이다.

도 4는 Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D11 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인한 젤 사진이다.

도 5는 Calu6 세포주에서 순수 분리한 지노믹 DNA를 Sss1 메틸레이져를 이용하여 모든 CpG 염기서열의 사이토신을 메틸화시킨 표준 양성 시료 DNA를 이용하여 HOX D13 유전자에 대한 DSBP의 민감도를 확인한 젤 사진이다.

도 6은 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 프라이머 중, 공통 센스 프라이머와 비메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트와, 공통 센스 프라이머와 메틸화 특이적 안티센스 프라이머 세트를 이용하여 각각 PCR 실시하고 아가로스 젤에서 전기영동하여 각 증폭산물이 정확한 크기를 지니고 증폭되는지를 확인한 젤 사진이다.

도 7은 Clau6와 H358 세포주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여, HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭반응시킨 결과이다.

도 8은 HOX D9과 HOX D11에 대한 DSBP 프라이머들을 모두 섞은 후, Clau6와 H358 세포주의 지노믹 DNA를 바이설파이트 화학반응시킨 변환 DNA를 주형으로 하여 증폭반응시킨 결과를 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과이다.

도 9는 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭이 바이설파이트 변환된 DNA만을 특이적으로 인식하여 증폭됨을 보여주기 위해, Calu6 지노믹 DNA를 바이설파이트 변환시키지 않은 것과 바이설파이트 변환시킨 것을 주형으로 하여, HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자에 대한 DSBP 증폭반응을 수행한 결과를 아가로스 젤 상에 전기영동한 사진이다.

도 10은 도 10은 종래 MSP 프라이머를 이용하여 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자의 비메틸화 산물과 메틸화 산물을 각각 별도로 PCR 실시한 결과이다.

도 11은 Calu6 DNA와 Sss1 효소반응시켜 메틸화시킨 Calu6 DNA를 100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 75:25, 50:50, 10:90, 5:95, 1:99, 100%의 비율로 섞은 후 바이설파이트 변환시킨 DNA를 주형으로 하여, HOX D11 유전자에 대한 종래 MSP 반응을 수행한 결과이다.

<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Method for Analysis of Gene Methylation and Ratio Thereof <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtgtgagtag ggagagaggg tgtgagtagg gagagagg 38 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctaccttcta ctaccccctt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaggtttata gagggagaga g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caaccacaaa aacaccaaac ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gttttatgag gtagtgtttg gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 catcccaaca aacacaaaca ca 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aacttccgaa ccgcgaacg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttatagcgc ggtgggtcg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 caaaaccgaa aactaccgcc g 21 <210> 10 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation product <400> 10 gtgtgagtag ggagagaggc gaggggagaa cagctcccct cgggcgctag gggccgcccc 60 gagggcccgc ctgcctcggg cgacaccggc ctggcgcccc cgcggccgct ccgtgtgccc 120 tggactcgcc gcccgcggct cggaagct 148 <210> 11 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> non-methylation product <400> 11 gtgtgagtag ggagagaggc gaggggagaa cagctcccct cgggcgctag gggccgcccc 60 gagggcccgc ctgcctcggg cgacaccggc ctggcgcccc cgcggccg 108 <210> 12 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation product <400> 12 tctacagcgc ggtgggccgc aatggcatct tgccacaggg cttcgaccag ttctacgagg 60 cagcgcccgg gcccccgttc gccgggccgc agcccccgcc gccacccgcg ccgccacagc 120 ccgagggcgc agccgacaag ggcgacccca ggaccggggc tggtggcggc gggggcagtc 180 cctgcaccaa ggcgacccct ggctcggagc ccaagggggc agcagaaggc ag 232 <210> 13 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> non-methylation product <400> 13 gttctacgag gcagcgcccg ggcccccgtt cgccgggccg cagcccccgc cgccacccgc 60 gccgccacag cccgagggcg cagccgacaa gggcgacccc aggaccgggg ctggtggcgg 120 cgggggcagt ccctgcacca aggcgacccc tggctcggag cccaaggggg cagcagaagg 180 cag 183 <210> 14 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation product <400> 14 agagagaaag gagaggaggg aggaggcgcg ccgcgccatg gtgtcctgcg cggggccagg 60 gccagggccg gggccgggcc aggccgggcc atgagccgcg ccgggagctg ggacatggac 120 gggctgcggg cagacggcgg gggcgccggt ggcgccccgg cc 162 <210> 15 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> non-methylation product <400> 15 agagagaaag gagaggaggg aggaggcgcg ccgcgccatg gtgtcctgcg cggggccagg 60 gccagggccg gggccgggcc aggccgggcc atgagccgcg ccgggagctg ggacatg 117 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttggtggttt gggtgttggt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tgtatgttta gtttgtgtgt 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtattggtta atgaggtgtt ag 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cacaccacaa acacctcatc a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cactactacc accccccaca 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cataaaaata taaacctcat acca 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcggtggttc gggcgtcggc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tcgtacgttt agttcgtgcg c 21 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tatcggttaa cgaggtgtta gc 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcgccgcgaa cacctcgtcg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gctactaccg ccccccgcg 19 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cataaaaata taaacctcgt accg 24

Claims

(1) 시료 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하는 단계;

(2) 상기 소듐 바이설파이트로 처리된 시료 DNA를 주형으로 한 프라이머로서,

(a) 특정 유전자의 염기서열 상에서 CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제1의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어진 제1의 올리고뉴클레오타이드,

(b) 상기 제1의 영역과 일정 염기서열 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제2의 영역에 상보적이되, 상기 CpG 염기서열을 UpG 염기서열로 간주하여 그에 상보적인 염기서열을 포함하도록 이루어지고, 제1의 올리고뉴클레오타이드와 동일한 방향성을 갖는 제2의 올리고뉴클레오타이드, 및

(c) 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(3) 상기 PCR 반응에 따른 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 일정 염기서열은 40 내지 50bp인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법.
제 1항에 있어서, 프라이머는 55 내지 65℃ 용융온도, 40 내지 50%의 GC 비율이 포함되는, 20 내지 25bp 크기의 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법.
제 1항에 있어서, 특정 유전자는 암 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법.
제 4항에 있어서, 암 관련 유전자는 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 5항에 있어서, 프라이머는 서열번호: 1 내지 서열번호: 9에 나타낸 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석방법.
(1) 소듐 바이설파이트;

(2) 하기 프라이머:

(a) 특정 유전자의 염기서열 상에서 CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제1의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어진 제1의 올리고뉴클레오타이드,

(b) 상기 제1의 영역과 일정 염기서열 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 3-4개 포함된 제2의 영역에 상보적이되, 상기 CpG 염기서열을 UpG 염기서열로 간주하여 그에 상보적인 염기서열을 포함하도록 이루어지고, 제1의 올리고뉴클레오타이드와 동일한 방향성을 갖는 제2의 올리고뉴클레오타이드,

(c) 상기 제1의 영역 및 제2의 영역과 이격되어 위치하는, CpG 염기서열이 포함되지 않은 제3의 영역에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 제1 및 제2의 올리고뉴클레오타이드와 반대 방향성을 갖는 제3의 올리고뉴클레오타이드;

(3) 특정 유전자를 증폭시킬 수 있는 dNTP 및 DNA 폴리머라제;를 포함하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.
제 7항에 있어서, 상기 일정 염기서열은 40 내지 50bp인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.
제 7항에 있어서, 프라이머는 55 내지 65℃ 용융온도, 40 내지 50%의 GC 비율이 포함되는, 20 내지 25bp 크기의 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.
제 7항에 있어서, 특정 유전자는 암 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.
제 10항에 있어서, 상기 유전자는 HOX D9, HOX D11, HOX D13 유전자인 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.
제 11항에 있어서, 프라이머는 서열번호: 1 내지 서열번호: 9에 나타낸 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 특정 유전자의 메틸화 여부 및 비율 분석용 키트.