KR102019800B1 - 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법, 검출 키트 및 pcr 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법, 검출 키트 및 PCR 장치에 관한 것으로서, 바이설파이트 또는 메틸화 특이적 효소를 처리하지 않고도 유전자의 메틸화를 검출할 수 있어 간편하고, 우수한 민감도 및 정확도로 검출할 수 있어 암을 포함한 다양한 질병 진단 분야에서 유용하다.
Description
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 기반의 PCR을 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법, 키트 및 PCR 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메틸화(또는 비메틸화) 유전자에 특이적으로 결합하는 리덕션 프로브를 이용하여 상기 유전자와 리덕션 프로브간의 Tm값 차이 및 상기 PCR 산물의 ΔΔCt값을 (비메틸화 된 컨트롤 DNA 및 메틸화를 검출 하고자 하는 DNA 시료를 대상으로 PNA를 사용하지 않은 컨트롤 PCR 및 PNA 리덕션 프로브를 이용한 메틸화 분석 PCR의 증폭 효율 차이) 측정하여 유전자의 메틸화 여부를 분석, 검출하는 방법, 상기 방법에 이용하기 위한 키트 및 PCR 장치에 관한 것이다.
DNA 메틸화는 원핵생물에서는 외부 유전자의 침입으로부터 보호해 주는 역할을 하며, 진핵생물에서는 발달과정에서 유전자의 발현을 조절해주는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서는 DNA 메틸화가 그 외에도 유전체 각인 및 안정화나 X염색체의 불활성화 등에도 관여하며, 조직특이적 유전자 활성, 질병과 연관된 유전자들의 발현 증가 또는 억제에도 영향을 미친다는 것이 밝혀지고 있다.
포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 고리의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 메틸화 현상은 암을 포함한 다양한 질병의 원인으로 알려져 있으며, CpG섬의 메틸화에 의해 해당하는 유전자의 발현이 억제된다고 알려져 있다.
특히, 종양 억제 유전자의 CpG섬이 메틸화되어 발현이 차단됨으로써 암이 발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 메틸화 현상은 암 발생의 가장 초기에 일어나는 대표적인 현상이기 때문에 암 조기진단을 위한 최적의 도구로 인식되고 있다. 최근에는, 암 조기진단 및 스크리닝을 위해서 특정 유전자의 메틸화 현상을 바이오마커로 이용한 진단기술의 개발이 활발히 연구되고 있다. 이러한 바이오마커 유전자와 연관된 CpG섬 메틸화를 검출하기 위하여 bisulfite sequencing, combined bisulfite restriction analysis(COBRA), 그리고 pyrosequencing과 메틸화특이 PCR(polymerase chain reaction) 등과 같은 방법들이 적극적으로 시도되고 있다.
PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.
Nielsen et al., Science, 254, pp. 1497-1500, 1991
현재 연구자들이 DNA 메틸화 확인을 위해 가장 일반적으로 이용하고 있는 방법은 바이설파이트(bisulfite) 및 메틸화 특유한 효소를 처리한 후 MSP(메틸화 특이적 PCR)을 수행하는 것이다. 본 발명자들은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 리덕션 프로브가 메틸화된 유전자에 결합되는 경우 표적 DNA와 PNA 리덕션 프로브 간의 용융온도(Tm)가 비메틸화 DNA와 PNA 프로브 간의 Tm 보다 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 이용하여 메틸화된 유전자의 증폭을 선택적으로 억제시킴에 따라 메틸화된 DNA의 Ct값이 비메틸화 DNA의 Ct값대비 증가하는 것을 확인하였다. 더불어 PNA 리덕션 프로브가 특정 염기서열을 가지게 되는 경우 PNA 리덕션 프로브와 메틸화 또는 비메틸화된 DNA간의 Tm 값 차이 더욱 높아지는 것을 확인하여 높은 민감도 및 정확도를 가지는 메틸화 검출 방법에 관한 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 종래 기술보다 간편하게, 바이설파이트 또는 다른 효소 처리 없이 리덕션 프로브를 이용하여 유전자의 메틸화 여부를 PCR 증폭 후 추가 분석 단계 없이 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 리덕션 프로브를 이용하여 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 리덕션 프로브를 이용하여 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 PCR 장치를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 유전자(표적 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재 하에, 상기 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계; 메틸화 되지 않은 유전자(컨트롤 시료의 동일 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재하에, 상기 메틸화 되지 않은 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계; 상기 PCR에서의 ΔTm(melting temperature)과 ΔCt(cycle threshold) 중 적어도 하나 이상을 측정하는 단계; 및 ΔTm의 수치를 통해 유전자의 메틸화 여부를 판단 또는 ΔΔCt값을 특정하여 메틸화의 여부 및 메틸화 정도를 판단하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법을 제공한다(상기 ΔTm은 상기 메틸화가 일어날 수 있는 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값-메틸화 되지 않은 동일 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값이고, 상기 ΔΔCt=(리덕션 프로브의 첨가 없는 유전자 시료의 ΔCt-리덕션 프로브를 첨가한 유전자 시료의 ΔCt)이고, ΔCt=(메틸화되지 않은 유전자의 Ct값-메틸화된 유전자의 Ct값)이다).
본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브를 포함하는 유전자의 메틸화 검출 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 리덕션 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하는 장치에 있어서, 상기 ΔTm 정보를 획득하는 Tm 분석부; 상기 ΔΔCt 정보를 획득하는 Ct 분석부; 사전에 설정된 ΔTm 및 ΔΔCt 정보를 바탕으로 상기 획득한 ΔTm 및 ΔΔCt값으로부터 유전자의 메틸화 여부를 판단하는 제어부; 및 상기 제어부에서 판단된 메틸화 여부, 메틸화 정도(X), 상기 ΔTm 및 ΔΔCt 중 적어도 하나에 기초한 정보를 사용자에게 전달하는 출력부; 를 포함하는 유전자 메틸화 검출용 PCR 장치를 제공한다.
본 발명에 따른 리덕션 프로브를 사용한 유전자 메틸화 검출 방법을 사용하는 경우, 유전자의 메틸화 여부를 우수한 민감도 및 정확도로 검출할 수 있으며, 최근 들어 많이 사용하고 있는 방법인 바이설파이트(bisulfite) 및 메틸화 특이적 제한효소 등을 처리하여 메틸화를 분석하는 방법과는 다르게 이러한 효소의 처리 없이 간편하게 일 단계 과정만으로 DNA 메틸화를 검출할 수 있다.
도 1은 메틸화 또는 비메틸화 DNA를 표적으로 하는 DNA 프로브와 PNA 프로브 간의 Tm 값을 비교한 그래프이다.
도 2는 메틸화 또는 비메틸화 DNA를 표적으로 하는 sdPNA(self dimer PNA)와 일반 PNA프로브 간의 Tm 값을 비교한 그래프이다.
도 3은 2~4개의 메틸화 또는 비메틸화된 시토신을 포함한 DNA를 표적으로 하는 PNA 프로브 간의 Tm 값을 비교한 그래프이다.
도 4는 비메틸화된 DNA의 경우, PNA 리덕션 프로브의 self dimer 형성의 도식 및 그로 인한 메틸화된 DNA인 경우와의 Ct차이를 보여주는 그래프이다.
도 5는 sdPNA 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 검증 및 민감도 테스트 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PNA 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 정확도 테스트 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 메틸화 또는 비메틸화 DNA를 표적으로 하는 sdPNA(self dimer PNA)와 일반 PNA프로브 간의 Tm 값을 비교한 그래프이다.
도 3은 2~4개의 메틸화 또는 비메틸화된 시토신을 포함한 DNA를 표적으로 하는 PNA 프로브 간의 Tm 값을 비교한 그래프이다.
도 4는 비메틸화된 DNA의 경우, PNA 리덕션 프로브의 self dimer 형성의 도식 및 그로 인한 메틸화된 DNA인 경우와의 Ct차이를 보여주는 그래프이다.
도 5는 sdPNA 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 검증 및 민감도 테스트 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PNA 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 정확도 테스트 결과를 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 유전자(표적 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재 하에, 상기 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계; 메틸화 되지 않은 유전자(컨트롤 시료의 동일 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재하에, 상기 메틸화 되지 않은 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계; 상기 PCR에서의 ΔTm(melting temperature)과 ΔCt(cycle threshold) 중 적어도 하나 이상을 측정하는 단계; 및 ΔTm의 수치를 통해 유전자의 메틸화 여부를 판단 또는 ΔΔCt값을 특정하여 메틸화의 여부 및 메틸화 정도를 판단하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법(상기 ΔTm은 상기 메틸화가 일어날 수 있는 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값-메틸화 되지 않은 동일 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값이고, 상기 ΔΔCt=(리덕션 프로브의 첨가 없는 유전자 시료의 ΔCt-리덕션 프로브를 첨가한 유전자 시료의 ΔCt)이고, ΔCt=(메틸화되지 않은 유전자의 Ct값-메틸화된 유전자의 Ct값))에 관한 것이다.
본 발명에서 리덕션 프로브(저해 프로브; reduction probe)란 메틸화된 검출 부위에 결합하여 유전자의 증폭을 저해하는 프로브를 말한다. 비메틸화된 검출 부위보다 메틸화된 검출 부위에 더욱 강하게 결합하여 증폭의 차이를 유도할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 메틸화가 일어날 수 있는 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재 하에, 상기 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계에서는 메틸화된 시토신과 리덕션 프로브가 상보적 결합을 이룬다. 상보적 결합은 메틸화된 시토신과 리덕션 프로브의 구아닌 염기가 3개의 수소 결합을 함으로써 강한 분자 간의 인력을 형성하는 것이다.
메틸화된 시토신은 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸화가 되어 있는 시토신을 가리키는데 메틸기는 전자 주는 기(Electron Donation Group; EDG)에 해당하므로 메틸화된 시토신은 상보적 염기에 해당하는 구아닌과 더 강한 수소 결합을 하게 된다. 구아닌과 메틸화된 시토신의 분자간 상호 작용의 증가는 C5-치환체의 전자 공여 특성의 증가와 관련이 있다. 또한, 5-메틸 시토신을 포함하는 쌍만이 표준 시토신에 의해 형성된 구아닌과 시토신 쌍보다 더 강하게 결합한다. 이 결과 PCR 수행시 메틸화된 DNA와 리덕션 프로브 간의 Tm은 비메틸화된 DNA와 리덕션 프로브 간의 Tm 보다 높은 값을 가진다.
상기 단계에서 수행된 PCR에서의 ΔTm과 ΔCt값 중 적어도 하나 이상을 측정한다. 메틸화된 시토신을 가진 표적 DNA의 경우 비메틸화된 DNA에 비하여 리덕션 프로브와 더 강한 결합을 함으로써 PCR 수행 시 증폭 억제 효과가 나타난다. 이를 이용하여 메틸화가 일어난 유전자의 Tm값 또는 Ct값이 높게 측정이 되고, 메틸화가 일어난 유전자의 Tm값에서 메틸화가 일어나지 않은 유전자의 Tm값을 뺀 ΔTm의 수치 또는 메틸화가 일어난 DNA의 Ct값에서 메틸화가 일어나지 않은 DNA의 Ct값을 뺀 ΔCt의 수치를 확인함으로써 표적 DNA의 메틸화 여부를 판단할 수 있다.
ΔΔCt(cycle threshold)값을 특정하여 메틸화의 정도(X)를 판단하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법을 제공한다. 상기 ΔΔCt는 (리덕션 프로브의 첨가 없는 유전자 시료의 ΔCt-리덕션 프로브를 첨가한 유전자 시료의 ΔCt)이고, ΔCt는(메틸화되지 않은 유전자의 Ct값-메틸화된 유전자의 Ct값)을 나타낸다.
반응이 진행되는 동안 실시간으로 증폭된 DNA를 검출할 수 있다.
| 분석법 | 분석 공식 | |
| Control ΔCt | Ct(분석PCR)-Ct(control PCR)= ΔCt(control DNA) |  X=2 ΔΔCt |
| Sample ΔCt | Ct(분석PCR)-Ct(control PCR)= ΔCt(분석 DNA) | |
| 메틸화 정도(X) | ΔCt(control DNA)- ΔCt(분석 DNA)= 메틸화 정도 |
증폭이 저해되면 Ct값이 높게 나타나는 결과 메틸화된 DNA의 ΔCt>0 이고, ΔΔCt<0의 값을 가진다. 상기 공식에 의할 때, 메틸화 정도(X)는 0 내지 1사이의 값을 나타낼 수 있다. 1에 가까울수록 메틸화 정도가 낮으며 0에 가까울수록 메틸화 정도가 높은 것을 의미한다. 비메틸화 컨트롤 DNA의 X값이 1이라는 절대 조건을 바탕으로 분석한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 리덕션 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 표적 유전자의 염기서열은 메틸화된 염기서열, 하이드록시 메틸화된 염기서열, 포르밀 메틸화된 염기서열, 카르복실 메틸화된 염기서열 중 어느 하나 또는 2이상의 조합으로 메틸화된 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 ΔTm은 하기의 식 (1)을 만족하는 것을 특징으로 한다.
ΔTm=k×mC×n 식 (1)
[상기 식에서 k는 상수, mC는 메틸화된 시토신이 1개일 경우의 Tm의 차이, n은 메틸화된 시토신의 개수이다.]
표적 DNA상에 메틸화된 시토신이 많을수록 수소결합력은 강하게 나타나므로 컨트롤 DNA와의 ΔTm은 커진다. 도 3에 나타난 그래프에서 이를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 리덕션 프로브는 self-dimer 형성 가능한 서열을 포함할 수 있다. Self-dimer란 상보적인 염기서열을 내부에 가지고 있어 self-folding이 되는 경우를 가리킨다. 도 4는 비메틸화된 DNA의 경우 PNA 리덕션 프로브는 self-folding을 하여 self dimer를 형성하게 되고, PCR 증폭의 저해 작용이 나타나지 않아 Ct값이 메틸화된 DNA의 경우에 비해 큰 값을 나타내는 것을 보여주고 있다. Self dimer 형성 가능한 PNA 리덕션 프로브(이하, sdPNA라 함)의 염기서열은 다음의 표 1에 나타내었으나, 이에 한정하지 않고 내부에 상보적인 염기서열을 가진 것이라면 제한없이 사용 가능하다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5' ---->3') |
| 1 | PNA_2mC | Dabcyl-ACCCCGCGGTCA-O-K(FAM) |
| 2 | PNA_2mC_2 | Dabcyl-ACCCCGCGGGCA-O-K(FAM) |
| 3 | PNA_2mC_3 | Dabcyl-ACACCGCGGTCA-O-K(FAM) |
| 4 | PNA_3mC | Dabcyl-CCGCGGTCAACGC-O-K(FAM) |
| 5 | PNA_3mC_2 | Dabcyl-ACCGCGGTCAACGC-O-K(FAM) |
| 6 | PNA_3mC_3 | Dabcyl-GACCGCGGTCAACGC-O-K(FAM) |
| 7 | PNA_4mC | Dabcyl-CGCGGTCAACGCGC-O-K(FAM) |
| 8 | PNA_4mC_2 | Dabcyl-CGCGTTCAACGCGC-O-K(FAM) |
| 9 | PNA_4mC_3 | Dabcyl-CGCGGTCACCGCGC-O-K(FAM) |
| 10 | PNA_5mC | Dabcyl-TTTCGGACTTCGAAG-O-K (FAM) |
| 11 | PNA_6mC | Dabcyl-ATGTCGGACCCCG-O-K (FAM) |
| 12 | PNA_7mC | Dabcyl-GCGATTTCGGACTTCGC-O-K (FAM) |
sdPNA와 메틸화된 표적 DNA 사이의 Tm값은 PNA self dimer를 형성한 Tm보다 높게 나타나고, PNA self dimer를 형성한 Tm은 sdPNA와 비메틸화된 DNA와의 Tm보다 높거나 같게 나타난다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 ΔTm은 메틸화된 시토신이 1개일 경우 2℃ 이상 5℃ 이하로 나타나고, sdPNA를 사용한 경우 3℃이상이며, 바람직하게는 4℃이상 나타난다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 메틸화 검출 방법은 유전자의 증폭 없이, 상기 비메틸화 또는 메틸화된 유전자와 리덕션 프로브의 ΔTm을 측정하여 메틸화 여부 및 메틸화 정도를 분석하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 검출 방법은 표준 PCR, 실시간 PCR(Real Time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 정량 PCR, DNA 칩, DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또는 상기 검출 방법은 유전자 증폭 효율 또는 PCR 산물을 검출할 수 있는 방법을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 실시간 PCR을 사용하는 것일 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 PCR은 이 기술 분야에서 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
실시간 PCR은 quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 이라고도 불리는데, 타켓 유전자를 증폭시킴과 동시에 정량 분석하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브를 포함하는 유전자의 메틸화 검출 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 리덕션 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하는 장치에 있어서, ΔTm 정보를 획득하는 Tm 분석부; ΔΔCt 정보를 획득하는 Ct 분석부; 사전에 설정된 ΔTm 및 ΔΔCt 정보를 바탕으로 상기 획득한 ΔTm 및 ΔΔCt값으로부터 유전자의 메틸화 여부 또는 메틸화 정도(X)를 판단하는 제어부; 및 상기 제어부에서 판단된 메틸화 여부, 메틸화 정도(X), 상기 ΔTm 및 ΔΔCt 중 적어도 하나에 기초한 정보를 사용자에게 전달하는 출력부; 를 포함하는 유전자 메틸화 검출용 PCR 장치를 제공한다.
상기 출력부는 디스플레이를 통하여 사용자에게 시각적 전달 또는 오디오를 통한 음성 전달 방식일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
PNA 리덕션
프로브와
비메틸화
또는 메틸화된
DNA타겟의
결합 온도 분석
<1-1. 메틸화 또는 비메틸화된 시토신을 포함한 표적 DNA 및 DNA 형광 프로브 또는 PNA 리덕션 프로브의 결합 온도 비교 분석>
본 발명에서 사용한 PNA 리덕션 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 합성한 것이며, DNA 올리고머(Integrated DNA technologies, 미국)를 사용하였다. PNA 리덕션 프로브 서열 번호 16 또는 DNA 형광 프로브 서열번호 15 1μM, 비메틸화 서열번호 13 또는 메틸화된 서열번호 14 타켓 DNA 올리고머 1μM와 PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)을 넣고 혼합한 뒤 실시간 유전자 증폭기(Real Time PCR machine, CFX96TM Real Time PCR System, 바이로라드, 미국)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응 후, 30℃까지 낮춘 뒤에, 30℃부터 90℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 상기 실험에 사용된 서열은 하기 표 3와 같다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(N→C) |
| 13 | 비메틸화 DNA 타켓 | GTTGAC[C]G[C]GGGGTCT |
| 14 | 메틸화 DNA 타켓 | GTTGAC[iMe-dC]G[iMe-dC]GGGGTCT |
| 15 | DNA 형광 프로브 | Dabcyl-ACCCCGCGGTCA- (FAM) |
| 16 | PNA 리덕션 프로브 | Dabcyl-ACCCCGCGGTCA- (FAM) |
| [C]: 비메틸 시토신 [iMe-dC]: 메틸 시토신 |
||
도 1은 상기 실험에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것으로서, DNA 형광 프로브와 비메틸화 DNA 또는 메틸 시토신을 2개 포함한 DNA 타겟 간의 ΔTm은 1°C, PNA 리덕션 프로브와 비메틸화 DNA 또는 메틸 시토신 2개를 포함한 DNA 타겟 간의 ΔTm은 4°C로 확인되었다.
<1-2. 메틸화 또는 비메틸화된 시토신을 포함한 표적 DNA 및 일반 PNA 프로브 또는 sdPNA 리덕션 프로브의 결합 온도 비교 분석>
메틸 시토신 2개를 포함한 DNA 타겟 서열번호 14와 self-dimer PNA 리덕션 프로브 서열번호 16 또는 일반 PNA 프로브 서열번호 17 간의 ΔTm 확인한 결과 PNA 리덕션 프로브가 self-dimer 형태를 가질 수 있는 특정 염기서열을 포함하는 경우 PNA 리덕션 프로브와 메틸화 또는 비메틸화된 DNA간의 Tm값 차이가 더욱 높아지는 것을 확인하였다. 실험 방법은 실시예 1-1와 같으며 실험 결과는 도 2에 도시 되어있다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(N→C) |
| 17 | PNA_2mC_1 | Dabcyl-ACCCCGCGATCA- (FAM) |
| 18 | 메틸화 DNA 타켓 | G[iMe-dC]GTTGAC[iMe-dC]G[iMe-dC]GG |
| 19 | 메틸화 DNA 타켓 | G[iMe-dC]G[iMe-dC]GTTGAC[iMe-dC]G[iMe-dC]G |
| [iMe-dC]: 메틸 시토신 | ||
<1-3. 메틸화 시토신 개수에 따른 표적 DNA와 PNA 리덕션 프로브 간의 Tm 비교 분석>
메틸 시토신 2개, 3개 또는 4개를 포함한 DNA 타겟 (서열번호 14, 18, 19)와 self-dimer PNA 리덕션 프로브 (서열번호 16) 간의 Tm 확인한 결과 표적 DNA를 포함하는 메틸 시토신 개수가 많을수록 PNA 리덕션 프로브 간의 Tm 차이가 더 높아지는 것을 확인하였다. 실험 방법은 실시예 1-1와 같으며 실험 결과를 도 3에 도시 되어있다.
sdPNA
프로브를
이용한 메틸화 검출 방법의 검증
<2-1. DNA 메틸화 확인을 위한 pyrosequencing 분석>
비메틸화 컨트롤 DNA로 septin 9 유전자의 CpG 섬의 해당 염기서열 부분이 메틸화 되지 않다고 알려져 있는 Jurkat 세포주 (thermofisher사, 미국)에서 추출 한 DNA (Timothy Robert Church et al., 2013)와 메틸화된 DNA 시료로 상기 유전자가 메틸화 되어 있는 대표적인 세포주 대장암 세포주 SW480에서 (Tao Peng et al., 2017) 추출한 DNA를 이용하여 실험을 진행하였다. 상기 세포주에서 분리된 gDNA 각각 500ng을 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits (Qiagen, 미국)를 이용하여 bisulfite 처리를 실시한 후, pyrosequencing 분석을 통해 상기 DNA 시료들의 Septin 9 유전자의 CpG 섬에 해당 시토신 염기서열의 메틸화 여부를 확인하였다. 증폭(서열번호 20, 21)과 pyrosequencing(서열번호 22)에 사용된 서열은 하기 표 5와 같다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(N→C) |
| 20 | sepF_BS1 | GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT |
| 21 | sepR_BS3 | Biotin - CTA CCC ACC AAC CAT CAT AT |
| 22 | sepS-S1 | GTT AGA AAT GAT TTT ATT TAG TTG |
bisulfite 처리된 gDNA 45ng을 표 3에 나열한 DNA 프라이머(서열번호 20, 21)를 각각 0.1 uM 와 PCR 증폭용액 (엔지노믹스, 한국)을 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 다음과 같다. 95 ℃ 에서 5분 처리 후, 95 ℃ 에서 30초, 58 ℃ 에서 30초, 72 ℃ 에서 30초로 총 25회 실시한 다음, 72 ℃ 에서 5분 동안 반응한다. 상기 PCR 산물은 표 5에 나열한 서열번호 22를 이용하여 pyrosequencing을 진행하였다 (지노믹트리, 대전).
<2-2. sdPNA 리덕션 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 민감도 테스트>
상기 2-1의 실험에 따라, sdPNA의 표적 사이트의 시토신이 87%-91% 메틸화된 것으로 측정된 SW480 gDNA를 상기 표적 사이트의 시토신이 0% 메틸화된 것으로 측정된 대조 샘플인 jurkat gDNA와 1%, 5%, 20%, 40%, 75%로 혼합 또는 혼합하지 않은 gDNA를 표적으로 하여 PNA 리덕션 프로브를 이용하여 메틸화 분석 PCR(CFX-96 Real-time)을 실시하였다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다. 95 ℃에서 5분 처리 후, 95 ℃ 에서 30초, 58 ℃에서 45초, 65 ℃에서 30초로 총 45회 수행하였으며, 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다. 10㎕ PCR 증폭용액 (엔지노믹스, 한국), 1uM forward primer 서열번호 22, 0.1 uM reverse primer 서열번호 23, 0.1uM sdPNA 서열번호 1, 45ng gDNA 를 혼합한 후, 총 부피가 20㎕ 되도록 증류수를 첨가하여 실시간 PCR을 실시하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(N→C) |
| 23 | Sep_F | GCCGCAGCAGCCAGCCCA |
| 24 | SepR_C2 | ACCAGCCATCATGTCGGACC |
도 5는 상기 실험에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것으로서, Septin 9 유전자가 메틸화 되지 않은 표준 세포(Jurkat)와 Septin 9이 약 90% 메틸화된 SW480 세포에서 분리된 DNA의 비율별 조합을 통한 메틸화 검출 성능 및 민감도를 확인할 수 있다.
sdPNA 리덕션 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 검증 및 본 발명에 따른 검출 방법의 민감도 테스트를 진행한 결과 본 분석법을 이용하여 5%이하의 메틸화된 DNA를 포함한 검체까지 검출이 가능하다는 것이 확인되었다.
<2-3. sdPNA 리덕션 프로브를 이용한 메틸화 검출법의 정확도 테스트>
상기 실험 2-1에 따라, sdPNA의 표적 사이트 (septin 9 유전자)의 시토신이 메틸화 되지 않은 것으로 측정된 jurkat gDNA를 대조군으로 하고, 대장암으로 확정되어 표적 사이트 시토신이 메틸화 된 걸로 확인된 임상샘플(20개)을 이용하여, 본 발명에 따른 검출 방법의 정확도 테스트를 실시하였다. PCR(CFX-96 Real-time) 증폭 조건은 다음과 같다. 95 ℃에서 5분 처리 후, 95 ℃에서 30초, 58 ℃에서 45초, 65 ℃에서 30초로 총 45회 수행하였으며, 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 상기 실험 2-2와 같다.
도 6은 Septin 9 유전자가 메틸화 되지 않은 표준 Jurkat gDNA 및 상기 유전자의 메틸화된 Hela, SW480, Lovo 세포(Tao peng et al., 2017) 또는 대장암 임상샘플 20개에서 뽑은 genomic DNA를 이용하여 정확도 테스트를 진행한 결과 본 발명에 따른 검출 방법을 이용하였을 때, 100%의 정확도를 나타낸다는 것을 보여준다.
Claims (11)
- 메틸화가 일어날 수 있는 유전자(표적 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재 하에, 상기 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계;
메틸화 되지 않은 유전자(컨트롤 시료의 동일 유전자)의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브의 존재하에, 상기 메틸화 되지 않은 유전자에 대한 PCR을 수행하는 단계;
상기 PCR에서의 ΔTm(melting temperature)과 ΔCt(cycle threshold) 중 적어도 하나 이상을 측정하는 단계; 및
상기 ΔTm의 수치를 통해 유전자의 메틸화 여부를 판단 또는 ΔΔCt값을 특정하여 메틸화의 여부 및 메틸화 정도를 판단하는 단계; 를 포함하고,
상기 ΔTm은 하기의 식 (1)을 만족하며,
ΔTm=k×mC×n 식 (1)
[상기 식에서 k는 상수, mC는 메틸화된 시토신이 1개일 경우의 Tm의 차이, n은 메틸화된 시토신의 개수이다]
상기 각 유전자에 대한 PCR은 바이설파이트(bisulfite) 전처리 없이 수행하는 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법
[상기 ΔTm은 상기 메틸화가 일어날 수 있는 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값-메틸화 되지 않은 동일 유전자와 리덕션 프로브 간의 Tm값이고, 상기 ΔΔCt=(리덕션 프로브의 첨가 없는 유전자 시료의 ΔCt-리덕션 프로브를 첨가한 유전자 시료의 ΔCt)이고, ΔCt=(메틸화되지 않은 유전자의 Ct값-메틸화된 유전자의 Ct값)이다].
- 제 1항에 있어서,
상기 리덕션 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 표적 유전자의 염기서열은 메틸화된 염기서열, 하이드록시 메틸화된 염기서열, 포르밀 메틸화된 염기서열, 카르복실 메틸화된 염기서열 중 어느 하나 또는 2이상의 조합으로 메틸화된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 리덕션 프로브는 self-dimer 형성 가능한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 ΔTm은 n=1일 때, 2℃ 이상 5℃ 이하인 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 메틸화 검출 방법은 유전자의 증폭 없이, 상기 비메틸화 또는 메틸화된 유전자와 리덕션 프로브의 ΔTm 을 측정하여 메틸화 여부 및 메틸화 정도를 분석하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 검출 방법은 표준 PCR, 실시간 PCR(Real Time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 절량 PCR, DNA 칩, DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 리덕션 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 검출 방법은 유전자 증폭 효율 또는 PCR 산물을 검출할 수 있는 방법을 포함하는 유전자의 메틸화 검출 방법.
- 메틸화가 일어날 수 있는 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 리덕션 프로브를 포함하는, 제 1항 내지 제 3항 및 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 유전자의 메틸화 검출 방법에 사용하기 위한 키트.
- 리덕션 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하는 장치에 있어서,
제 1항에 따른 ΔTm 정보를 획득하는 Tm 분석부;
제 1항에 따른 ΔΔCt 정보를 획득하는 Ct 분석부;
사전에 설정된 ΔTm 및 ΔΔCt 정보를 바탕으로 상기 획득한 ΔTm 및 ΔΔCt값으로부터 유전자의 메틸화 여부를 판단하는 제어부; 및
상기 제어부에서 판단된 메틸화 여부, 메틸화 정도(X), 상기 ΔTm 및 ΔΔCt 중 적어도 하나에 기초한 정보를 사용자에게 전달하는 출력부;
를 포함하는 유전자 메틸화 검출용 PCR 장치.
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