ES2344147T3

ES2344147T3 - Amplicon cpg y protocolo de matrices.

Info

Publication number: ES2344147T3
Application number: ES05706493T
Authority: ES
Inventors: Arturas Petronis; Axel Schumacher
Original assignee: Centre for Addiction and Mental Health; Center for Addiction and Mental Health CAMH
Current assignee: Centre for Addiction and Mental Health; Center for Addiction and Mental Health CAMH
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2010-08-19
Anticipated expiration: 2025-02-18
Also published as: EP1723256A1; CA2556611C; ATE464397T1; CA2556611A1; AU2005212393B2; EP1723256B1; WO2005078121A1; US20080064030A1; US8043808B2; EP1723256A4; DK1723256T3; AU2005212393A1; DE602005020592D1

Abstract

Método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de: a) seleccionar una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de uno o más sujetos que presentan un fenotipo de interés, y una o más secuencias genómicas de control correspondientes de uno o más sujetos de control que carecen del fenotipo de interés; b) digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, para producir extremos que pueden ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador; c) ligar las secuencias de nucleótidos de adaptador a los extremos producidos en la etapa b) para producir secuencias ligadas; d) escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas específicas de metilación escindiendo sólo secuencias de nucleótidos metilados, para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables; e) amplificar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificables y las secuencias de nucleótidos de control amplificables para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas y secuencias de nucleótidos de control amplificadas; f) marcar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas de la etapa e) con un primer marcador, y marcar las secuencias de nucleótidos de control amplificadas de la etapa e) con un segundo marcador; g) hibridar los productos marcados de la etapa f) con una matriz que comprende una serie de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con los mismos; y h) determinar la razón de las señales emitidas por el primer marcador en relación con el segundo marcador para cada secuencia de nucleótidos hibridada en la matriz.

Description

Amplicón CpG y protocolo de matrices.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y sistemas para elaborar perfiles epigéneticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos y sistemas para evaluar los niveles de metilación de secuencias de nucleóti-
dos.

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Antecedentes de la invención

Muchas líneas de pruebas han mostrado que la modificación de las bases de citosina que se encuentran en la secuencia dinucleotídica CpG en genomas de vertebrados desempeña un papel esencial en la regulación de una variedad de funciones del genoma tales como inactivación del cromosoma X, impronta parental, inactivación de retroelementos genómicos y expresión génica diferencial. En todo el genoma humano, aproximadamente el 80% de los dinucleótidos CpG están fuertemente metilados, aunque algunas zonas permanecen no metiladas, preferentemente en las islas CpG ricas en GC [Bird, A.P., CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature, 1986. 321(6067): págs. 209-13]. La metilación del ADN puede realizar su función reguladora a través del marcaje diferencial de genes. La metilación de la citosina es un proceso estable pero potencialmente reversible que permite la regulación específica espacial y temporal de genes en organismos superiores.

Se han aplicado varias estrategias diferentes para detectar dinucleótidos CpG metilados en genomas eucariotas (revisadas en [van Steensel, B. y S. Henikdef, Epigenomic profiling using microarrays. Biotechniques, 2003. 35(2): págs. 346-50, 352-4, 356-7]). El método más frecuentemente usado es la estrategia basada en la modificación con bisulfito, desarrollada por Frommer et al. [Frommer, M., et al., A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(5): págs. 1827-31]. En este método, el bisulfito convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, mientras las citosinas metiladas permanecen inalteradas. Pueden secuenciarse directamente tales secuencias usando el método de secuenciación de Sanger o pueden examinarse usando micromatrices. En tales micromatrices, los pares de oligonucleotidos que difieren por tener o bien una citosina o bien una timina en una posición que puede metilarse de una citosina, pueden discriminar los dos nucleótidos incubando a una temperatura que permite sólo emparejamientos exactos entra la sonda y el oligonucleótido, Adorjan, P., et al., Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res, 2002. 30(5): p. e21; Gitan, R.S., et al., Methylation-specific oligonucleotide microarray: a new potential for high-throughput methylation analysis. Genome Res, 2002. 12(1): págs. 158-64; Balog, R.P., et al., Parallel assessment of CpG methylation by two-color hybridization with oligonucleotide arrays. Anal Biochem, 2002. 309(2): págs. 301-10; Hou, P., et al., A microarray to analyze methylation patterns of p16(Enk4a) gene 5'-CpG islands. Clin Biochem, 2003. 36(3): págs. 197-202.

Se han publicado varios otros métodos para proporcionar el estado de metilación en una escala global incluyendo experimentos con micromatrices. En un método denominado hibridación de metilación diferencial (DMH) [Huang, T.H., documento US 6.605.432 B1 expedido el 12 de agosto de 2003.], se trató ADN genómico (ADNg) de células de cáncer de mama con el cortador de cuatro bases MseI que restringe el ADNg en fragmentos pequeños de 100-200 pb. Esta enzima raramente corta en regiones ricas en CpG, dejando muchas islas CpG intactas. La escisión mediante MseI va seguida por el ligamiento de adaptadores de extremos específicos para extremos cohesivos de MseI, la escisión con la enzima BstUI sensible a metilación y la posterior amplificación por PCR. Este método da como resultado la amplificación de la fracción hipermetilada de ADNg, e ignora la fracción hipometilada o no metilada.

Las micromatrices en este estudio contienen fragmentos de ADN que representan diversas islas CpG. Varias otras publicaciones usaron la etapa de enriquecimiento para la fracción hipermetilada de un genoma dado [Yan, P.S., et al., Applications of CpG island microarrays for high-throughput analysis of DNA methylation. J Nutr, 2002. 132(Supl. 8): págs. 2430S-2434S; Yan, P.S., et al., Use of CpG island microarrays to identify colorectal tumors with a high degree of concurrent methylation. Methods, 2002. 27(2): págs. 162-9; Shi, H., et al., Triple analysis of the cancer epigenome: an integrated microarray system for assessing gene expression, DNA methylation, and histone acetylation. Cancer Res, 2003. 63(9): págs. 2164-71; Toyota, M., et al., Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res, 1999. 59(10): págs. 2307-12; Yan, P.S., et al., Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays. Cancer Res, 2001. 61(23): págs. 8375-80]. La amplificación de las secuencias no metiladas se suprime mediante la digestión del ADN molde antes de PER con las enzimas de restricción BstUI y HpaII, que se bloquean mediante la metilación de su secuencia diana [Yan, P.S., et al., Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays. Cancer Res, 2001. 61(23): págs. 8375-80.]. Se usó la fracción de ADN hipermetilada resultante para comparar los patrones de metilación del tumor y tejidos control hibridando con micromatrices que contenían fragmentos genómicos clonados aleatoriamente que estaban enriquecidos en islas CpG.

Un método relacionado usa una etapa de digestión con SnaiI, seguido por digestión con XmaI, que es un isoesquizómero insensible a metilo de SmaI [Hatada, I., et al., A microarray-based method for detecting methylated loci. J Hum Genet, 2002. 47(8): págs. 448-51.]. La escisión con SmaI produce un fragmento de ADN de extremos romos, mientras que los productos de escisión de XmaI contienen extremos salientes, que se ligan a adaptadores de XmaI específicos. Tras un PCR que usa cebadores específicos para estos adaptadores, los productos de amplificación resultantes, que consisten principalmente en secuencias 5'-CCCGGG-3' metiladas, se hibridan con micromatrices.

Se presentó otro método que usa enzimas de restricción sensibles a metilación para fraccionar ADN por Tompa et al. [Tompa, R., et al., Genome-wide profiling of DNA methylation reveals transposon targets of CHROMOMETHYLASE3. Curr Biol, 2002. 12(1): págs. 65-8.]. Esta estrategia usó la enzima sensible a metilación MspI, que escinde 5'CCGG-3' pero se bloquea mediante la metilación de la citosina externa (^{m}5'-CCGG-3'). Se fraccionaron por tamaño las muestras de ADN digeridas en gradientes de sacarosa (5%-30%) mediante ultracentrifugación tal como se describió anteriormente [van Steensel, B., J. Delrow, y S. Henikdef, Chromatin profiling using targeted ADN adenine methyltransferase. Nat Genet, 2001. 27(3): págs. 304-8.]. Las fracciones de gradientes que contienen fragmentos de ADN vegetal menores de 2,5 kb, tal como se determinó mediante electroforesis en gel, se reunieron y se concentraron mediante precipitación con isopropanol. Entonces se marcaron las muestras de control y prueba con Cy3- o Cy5-dCTP mediante cebado aleatorio y se hibridaron conjuntamente con micromatrices que contenían productos de amplificación por PCR en puntos que representaban principalmente ubicaciones aleatoriamente elegidas del genoma de Arabidopsis [Tompa, R., et al., Genome-wide profiling of DNA methylation reveals transposon targets of CHROMOMETHYLASE3. Curr Biol, 2002. 12(1): págs. 65-8].

Wang (documento WO 03/027259, publicado el 3 de abril de 2003) da a conocer la escisión del ADN genómico del ratón con la enzima sensible a metilo HpaII, ligamiento de adaptadores específicos para extremos cohesivos de HpaII y PCR usando cebadores marcados con Cy-3 o Cy-5. Los amplicones producidos mediante este método pueden retener secuencias metiladas que están entremedias de los sitios de restricción de HpaII escindidos.

Martienssen et al. (Documento US 2004/0132048, publicado el 8 de julio de 2004) sugiere métodos para obtener fracciones metiladas o no metiladas de ADN genómico obtenido mediante la escisión con enzimas dependientes de metilo tales como McrBC que escinde específicamente secuencias metiladas, o mediante la escisión con, por ejemplo, HpaII que no escinde secuencias metiladas. Al igual que Wang, los métodos de Martienssen et al. pueden complicarse mediante la retención de secuencias metiladas entre sitios de restricción no metilados. Además, puede haber retención de secuencias no metiladas entre los sitios de restricción metilados. Otra desventaja de estos métodos es una etapa de separación física de las fracciones metiladas o no metiladas escindidas del resto del ADN genómico mediante electroforesis en gel, cromatografía de exclusión molecular y centrifugación diferencial por tamaño en una gradiente de sacarosa. Los métodos que usan una etapa de separación física requieren cantidades relativamente grandes de material de partida debido a ineficacias de la recuperación de ADN inherentes en la etapa de separación.

Hay una necesidad en la técnica de desarrollar nuevos métodos y sistemas para elaborar perfiles epigenéticos. Además, hay una necesidad en la técnica de nuevos métodos y sistemas para elaborar perfiles epigenéticos de cromosomas y genomas. Además aún, hay una necesidad en la técnica de desarrollar métodos y sistemas para evaluar los niveles de metilación de locus estudiados con sonda tales como elementos repetitivos, genes, elementos de impronta, promotores, elementos potenciadores, secuencias de intrón y genomas completos.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y sistemas para elaborar perfiles epigenéticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos y sistemas para evaluar los niveles de metilación de secuencias de nucleótidos.

Según la presente invención se proporciona un método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:

a): seleccionar una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de uno o más sujetos que presentan un fenotipo de interés, y una o más secuencias genómicas de control correspondientes de uno o más sujetos de control que carecen del fenotipo de interés;

b): digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, para producir extremos que pueden ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador;

c): ligar las secuencias de nucleótidos de adaptador a los extremos producidos en la etapa b) para producir secuencias ligadas;

d): escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas específicas de metilación de CpG, escindiendo secuencias de nucleótidos metilados para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;

e): amplificar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificables y las secuencias de nucleótidos de control amplificables para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas y secuencias de nucleótidos de control amplificadas;

f): marcar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas de la etapa e) con un primer marcador, y marcar las secuencias de nucleótidos de control amplificadas de la etapa e) con un segundo marcador;

g): hibridar los productos marcados de la etapa f) con una matriz que comprende una serie de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con los mismos;

h): determinar la razón de las señales emitidas por el primer marcador en relación con el segundo marcador para cada secuencia de nucleótidos hibridada en la matriz.

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La presente invención contempla además un método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprenden las etapas de:

b): digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción de corte frecuente;

c): ligar secuencias de nucleótidos de adaptador a los extremos producidos en la etapa b) para producir secuencias ligadas;

d): escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, escindiendo secuencias de nucleótidos metilados para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;

h): determinar la razón de las señales emitidas por el primer marcador en relación con el segundo marcador para cada grupo de secuencias de nucleótidos hibridadas en la matriz.

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La presente invención también contempla un método para identificar o detectar efectos de la variación de la secuencia de ADN en un análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos tal como en los párrafos 12 y 13 que comprende las etapas de:

a): seleccionar una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de uno o más sujetos que presentan un fenotipo de interés, por ejemplo una enfermedad tal como pero no limitada a cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia o similares, y una o más secuencias genómicas de control correspondientes de uno o más sujetos de control que carecen del fenotipo de interés;

b): amplificar las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y amplificar por separado las secuencias genómicas de control con una ADN polimerasa, por ejemplo sin limitación una ADN polimerasa de Phi29, para producir una copia no metilada de las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y una copia no metilada de las secuencias genómicas de control;

c): tratar la copia no metilada de las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y tratar por separado la copia no metilada de las secuencias genómicas de control con digestión mediante endonucleasas de restricción, ligamiento al adaptador, amplificación, marcaje, hibridación con matriz y etapas de determinación de la razón que son equivalentes a etapas correspondientes en el análisis del estado de metilación;

d): comparar la una o más razones determinadas en la etapa c) con la una o más razones del análisis del estado de metilación, identificando o detectando de ese modo efectos de la variación de la secuencia de ADN en el análisis del estado de metilación.

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La presente invención también contempla un método tal como se definió anteriormente en el que el fenotipo de interés comprende una enfermedad, por ejemplo, pero no limitada a cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, esclerosis múltiple, psoriasis, ateroesclerosis, asma, autismo, artritis reumatoide u otra enfermedad. Sin embargo, la presente invención también contempla emplear el método de la presente invención para analizar el estado de metilación o cambios en el estado de metilación de una o más secuencias genómicas de nucleótidos en sujetos, por ejemplo, pero sin limitarse a sujetos humanos, o en cultivos celulares que se tratan con un fármaco o similares, o que se someten a uno o más estados o estímulos físicos específicos.

La presente invención contempla además un método tal como se definió anteriormente en el que la endonucleasa de restricción de corte frecuente es selectiva para secuencias ricas en A/T con respecto a secuencias C/G, por ejemplo Csp61, Tas1, o una combinación de las mismas.

La presente invención contempla además un método tal como se definió anteriormente en el que la sonda es un fluoróforo químicamente reactivo, por ejemplo, pero sin limitación, la primera sonda puede ser Cy3 y la segunda sonda puede ser Cy5.

La presente invención contempla además un método tal como se definió anteriormente en el que las endonucleasas de restricción de metilación comprenden un cóctel que comprende HpaII, Bsu151 (ClaI), Hin61, AciI (SsiI) y TaiI.

También se contempla por la presente invención tal como se definió anteriormente el uso de una endonucleasa de restricción específica de metilación de CpG tal como, sin limitación, McrBC, McrA, o MrrA.

La presente invención contempla además un kit que comprende una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba, una o más secuencias genómicas de nucleótidos de control correspondientes, una o más endonucleasas de restricción de corte frecuente, una o más secuencias de nucleótidos de adaptador específicas, una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, una o más endonucleasas de restricción específicas de metilación de CpG, una o más sondas para marcar las secuencias de nucleótidos, una o más micromatrices que pueden hibridar con las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y control, un software para presentar y/o analizar las secuencias hibridadas con la micromatriz, reactivos y/o enzimas para amplificar secuencias de nucleótidos, o cualquier combinación de los mismos.

Los métodos de la presente invención permiten el enriquecimiento de una fracción no metilada o de una fracción metilada debido al ligamiento al adaptador y a la amplificación específica del adaptador. Por consiguiente, la presente invención no requiere una etapa de separación física de una fracción metilada o no metilada escindida del resto del ADN genómico mediante, por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía de exclusión molecular y centrifugación diferencial por tamaño en una gradiente de sacarosa.

Hasta la fecha, los enfoques de micromatriz "epigenómica" se han basado en el enriquecimiento del ADN hipermetilado y se han usado predominantemente para la identificación de islas CpG anómalamente metiladas en células malignas. Aunque esta estrategia parece ser útil para la detección de cambios epigenéticos importantes en algunas regiones del genoma, la proporción global de los sitios CpG examinados es sustancialmente inferior en comparación con el enfoque basado en el análisis de la fracción no metilada. Los inventores han descubierto que el examen de la fracción no metilada del ADN genómico puede ser hasta varios cientos de veces más eficaz en comparación con el escenario de la fracción hipermetilada.

La presente invención proporciona métodos que pueden superar una complicación de secuencias metiladas reteniéndose entre los sitios de restricción no metilados, y secuencias no metiladas reteniéndose entre los sitios de restricción metilados. Por ejemplo, con el fin de delecionar fragmentos de ligamiento internamente metilados, los productos de ligamiento pueden tratarse con una o más enzimas específicas de metilo, tales como, sin limitación, McrBC o MrrA. Como otro ejemplo, con el fin de delecionar fragmentos de ligamiento internamente no metilados, los productos de ligamiento pueden tratarse con enzimas de restricción sensibles a metilación tales como, sin limitación, HpaII, Hin6I, AciI o HpyCH4IV. Se incubaron los productos de ligamiento durante 8 h a 37ºC en una mezcla que contenía 10 U/microgramo de HpaII, 6 U/microgramo de Hin6I y 8 U/microgramo de AciI en tampón 2xY+/Tango (Fermentas).

Otra ventaja de los métodos de elaboración de perfiles de metilación de la presente invención es la posibilidad de trabajar con recursos de ADN limitados. Aunque el protocolo convencional requiere 0,5 microgramos - 1 microgramo de ADN genómico, la cantidad del ADN molde puede ser significativamente inferior. Parece viable aplicar el protocolo de enriquecimiento también para células individuales, lo que permitiría una medición cuantitativa de la metilación.

Este sumario de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 muestra una representación esquemática de un ejemplo de la presente invención. La figura 1A es un perfil esquemático del método basado en micromatrices para la identificación de las diferencias en la metilación del ADN y los polimorfismos del ADN en el ADN genómico. Panel izquierdo: Análisis de la variación de la secuencia de ADN. Panel central: Aislamiento y enriquecimiento de fragmentos de ADN no metilados. El ADN de prueba y de control se escinden mediante endonucleasas de restricción sensibles a metilación, y los fragmentos de ADN resultantes se enriquecen entonces selectivamente mediante aminoalil-PCR específicas del adaptador, se marcan y se hibridan con micromatrices. Panel derecho: Procedimiento alternativo para enriquecer la fracción de ADN hipermetilada. La figura 1B muestra un ejemplo de un gráfico de dispersión que revela diferencias en los patrones de metilación del ADN entre muestras y controles. Dos flechas grandes indican señales de hibridación que se desvían de la línea de regresión.

La figura 2 muestra un ejemplo de la presente invención que logra un enriquecimiento selectivo de fragmentos de restricción con el adaptador universal U-CG1. Figura 2A: Las fotografías del gel muestran que se amplificaron de manera constante fragmentos de ADN Lambda de entre \sim250 pb y \sim1,5 kb, mientras que no se amplificaron los fragmentos de ADN humano. Para evaluar la exactitud de los métodos de enriquecimiento, se cortó ADN Lambda con enzimas de restricción sensibles a metilación (HpyCH4IV, HpaII o Hin6I) y se mezcló con un exceso de ADN genómico humano, que se escindió con una enzima de restricción insensible a metilación (EcoRI). Se ligaron los fragmentos de ADN mezclados al adaptador U-CG1, y entonces se amplificaron en una PCR específica del adaptador. Se compararon los productos de amplificación con un producto escindido de ADN Lambda nativo en un gel de agarosa al 1%. Figura 2B: muestra un frotis de ADN de entre \sim0,2 kb y \sim2,5 kb en una PCR del adaptador convencional (con hibridación a 68ºC) indicando un ligamiento y una amplificación eficaces. El tamaño de los productos de amplificación varía con la temperatura de hibridación usada para la PCR. Habitualmente, una alta temperatura de hibridación/alargamiento conducirá a un aumento del tamaño del producto. Figura 2C: Gráfico de dispersión que muestra una comparación de los productos de ligamiento tratados con McrBC frente a la muestra no tratada en la matriz de COMT. Se escindieron los fragmentos tratados con McrBC que contienen dinucleótidos de CpG metilados y no pudieron amplificarse en la siguiente PCR del adaptador, dando como resultado intensidades de señal reducidas en el canal de Cy5.

La figura 3 muestra otro ejemplo de un método de la presente invención que proporciona el análisis de la metilación del ADN de la región de COMT de 100 kb. Figura 3A: Estructura y contenido en GC de la región cromosómica en el cromosoma humano 22q11.2 que abarca el gen de catecol-o-metiltransferasa (COMT), el gen de tiorredoxina reductasa 2 (TXNRD2) y el gen de repeticiones armadillo delecionado en VCFS (ARVCF). Figura 3B: Para determinar el perfil de metilación de la región de COMT de 100 kb, se diseñaron oligonucleótidos de 50 meros (barras horizontales negras) basándose en los sitios de restricción para las endonucleasas sensibles a metilación, HpaII, Hin6I y AciI (las enzimas alternativas adicionales son HpyCH4IV o Hin1I). Dependiendo del estado de metilación de los dinucleótidos CpG, varias combinaciones de amplicones (barras horizontales verdes) pueden hibridar potencialmente con los oligonucleótidos. Figura 3C: Patrones de hibridación típicos en la micromatriz de oligonucleótidos que muestran que la complejidad y el suministro de información de las señales de hibridación aumenta con un número creciente de enzimas de restricción sensibles a metilación.

La figura 4 muestra la reproducibilidad y sensibilidad de un método de la presente invención con respecto a la región de COMT. Figura 4A: Diagrama gráfico de dispersión que representa dos conjuntos de productos de amplificación derivados de la misma fuente de ADN pero producidos en diferentes puntos de tiempo por diferentes investigadores. El alto coeficiente de correlación de las intensidades de los puntos demuestra una alta reproducibilidad del método. Figura 4B: Influencia del número de ciclos de PCR. Los diagramas gráficos de dispersión muestran intensidades de señal de hibridación de la fracción no metilada que se amplificó usando 20 ciclos de PCR (canal de Cy3) y 30 ciclos (canal de Cy5). Se hibridaron conjuntamente los productos de amplificación de cada PCR con la micromatriz de COMT que contenía oligonucleótidos que representan secuencias de copia única (círculos negros), secuencias parcialmente repetitivas (cuadrados grises; >20 copias/genoma) y fragmentos de ADN altamente repetitivos (cuadrados blancos; >100 copias/genoma), tales como repeticiones ALU y LINE. Las 2 etapas de hibridación y extensión de la PCR produjeron una amplificación no sesgada. Figura 4C: Gráfico de dispersión que representa la fracción no metilada del ADN genómico humano "con adiciones conocidas" de diferentes cantidades de ADN control. Las muestras de prueba contenían o bien un exceso de 16 veces de ADN Lambda (16 equivalentes genómicos [GE] frente a 1 GE) o bien un exceso de 16 veces de pBR322 (128 GE frente a 8 GE), respectivamente. Los amplicones del ADN con adiciones conocidas (que representan ADN no metilado) pueden distinguirse fácilmente como datos aberrantes, mientras que las señales que representan el ADN genómico se ubican cerca de la línea de regresión. Las intensidades de señal medias de oligonucleótidos de diferentes longitudes (40-50 pb) que seleccionan como diana un fragmento de restricción HpaII específico en ADN Lambda revelan que la longitud de las secuencias en puntos influye directamente en la intensidad de los puntos y, por tanto, en la sensibilidad de la micromatriz. Figura 4D: Sensibilidad de la hibridación de micromatrices de islas CpG. Se marcaron 2 mg de ADNg control con Cy5 y se hibridaron conjuntamente con 2 microgramos (0% de diferencia), 1,9 microgramos (5% de diferencia), 1,8 microgramos (10% de diferencia), 1,5 microgramos (25% de diferencia) o 1,0 microgramos (50% de diferencia) de ADNg marcado con Cy3. Para cada hibridación, las líneas de regresión representan la intensidad global que imita las diferencias de metilación con respecto a la muestra completa. La disminución de la cantidad de ADN se refleja en el ángulo de las líneas de regresión, que se desvían en un 5%-7% de los valores esperados.

La figura 5 muestra resultados representativos de la aplicación de los métodos de la presente invención en diversas tipos de células o tejidos. Figura 5A: Cambios de perfiles de metilación en TXNRD2-COMT-ARVCF en un tumor cerebral. Los datos de los dos experimentos de micromatrices diferentes están superpuestos unos sobre otros. El análisis de dos muestras de cerebro post-mortem (puntos negros) no revela ninguna diferencia importante en los niveles de metilación, mientras que las intensidades de la señal varían significativamente en el tumor cerebral (puntos blancos) en comparación con el cerebro normal. Figura 5B: Comparación de fracciones de TXNRD2-COMTARVCF no metiladas en células Jurkat y de la mucosa. El gráfico de dispersión sugiere diferencias de metilación en toda la región génica global significativas en los genes COMT, TXNRD2 y ARVCF entre los dos tipos celulares. Figura 5C: Hibridación conjunta de fragmentos no metilados e hipermetilados enriquecidos derivados de la misma fuente de ADN. Una gran parte de los amplicones está presente sólo en una de las fracciones enriquecidas. Mientras que la fracción no metilada contiene sólo amplicones que albergan dinucleótidos CpG, la fracción hipermetilada también contiene fragmentos que no contienen citosinas que puedan metilarse. Figura 5D: Comparación de los perfiles de metilación del ADN en los tejidos cerebrales de un control sano y un paciente con esquizofrenia.

La figura 6 muestra un ejemplo de la presente invención usando una micromatriz de islas CpG que contiene más de 12.000 fragmentos que representan islas CpG humanas. Hibridación de la fracción no metilada de ADN de placenta y ADN de cerebro post-mortem en una matriz de islas CpG. Pudieron identificarse dos grupos de elementos de islas CpG que presentan niveles de metilación significativamente diferentes entre estos tejidos. Se muestran ejemplos de lecturas de escáner como R= canal rojo (Cy5), G= canal verde (Cy3), C= combinación de ambos canales. Para validar las diferencias de metilación identificadas, se sometieron varias islas CpG a mapeo de citosinas metiladas basado en modificación con bisulfito tal como se mostró a modo de ejemplo para los clones 22_B_12 de isla CpG (región promotora de Galectina-1) y 52_C_03 (región promotora de un transcrito específico de cerebro, CR606704). La primera secuencia muestra la hebra inversa (-) de los sitios de restricción originales, la segunda secuencia presenta el ADN modificado con bisulfito. Por cada isla CpG modificada con bisulfito, se secuenciaron de 8 a 10 clones por tejido. El dato aberrante robusto 5_2_C_03 reveló una metilación completa en todas las CpG examinadas en el cerebro y no mostró metilación en la placenta. En cambio, el clon 22_B_12 mostró diferencias de metilación más sutiles (15-100%), dependiendo del dinucleótido CpG.

La figura 7 muestra gráficos de dispersión representativos obtenidos usando los métodos de la presente invención. La figura 7A muestra un gráfico de dispersión representativo de un experimento que detecta diferencias de metilación dentro de elementos repetitivos (por ejemplo, elementos ALU o LINE) en diferentes tejidos. Los círculos grises indican secuencias parcialmente repetitivas (de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 copias/genoma); mientras que los círculos blancos indican secuencias altamente repetitivas (aproximadamente >100 copias/genoma). La figura 7B muestra un gráfico de dispersión representativo de un experimento que detecta diferencias de metilación en las secuencias génicas e intergénicas únicas así como de elementos repetitivos en la región cromosómica de COMT-ARVCF en el cromosoma humano 22.

La figura 8 muestra un ejemplo de la presente invención que proporciona la metilación combinada y el análisis de SNP en una micromatriz de islas CpG. Se representan gráficamente, unos frente a otros, los datos de las dos hibridaciones separadas de las muestras de ADN derivadas de dos individuos. El eje y contiene los datos derivados de un análisis de metilación (escisión triple con HpaII, Hin6I y AciI), mientras el eje x contiene los datos de SNP derivados de la hibridación de las mismas muestras de ADN, que se sometieron a la amplificación de todo el genoma antes de la escisión mediante las enzimas de restricción sensibles a metilación. Los datos aberrantes significativos (razón logarítmica <-0,3; >0,3) pueden clasificarse en cuatro agrupaciones (S = SNP, M = diferencias de metilación del ADN), permitiendo la diferenciación de diferencias epigenéticas y polimorfismos de nucleótidos entre las muestras de prueba. Amp = Muestra amplificada del genoma completo; ADNg = ADN genómico.

La figura 9 proporciona un gráfico de dispersión representativo que ilustra las diferencias de metilación que existen entre el ADN del tejido de placenta humana y el ADN del tejido del cuerpo estriado humano post-mortem.

Descripción detallada

La siguiente descripción es de una realización preferida.

Según una realización de la presente invención y refiriéndose en general a la figura 1, se proporciona un método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos. El método de la presente invención puede comprender las etapas tal como se muestran en el panel central de la figura 1, el panel derecho de la figura 1 o tanto el panel central como el panel derecho de la figura 1. En un aspecto adicional de la invención, las etapas mostradas en el panel izquierdo de la figura 1 pueden usarse para corregir el efecto de la variación de la secuencia de ADN en el análisis de metilación diferencial. Además, el método de la presente invención puede comprender cualquier combinación de las etapas mostradas en la figura 1, por ejemplo en el panel derecho, el panel izquierdo o una combinación de los mismos.

Un ejemplo de la presente invención, que no pretende ser limitativo de ninguna manera, proporciona un método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:

a): seleccionar una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de uno o más sujetos que presentan un fenotipo de interés, por ejemplo una enfermedad tal como pero no limitada a cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia o cualquier otra enfermedad que puede verse afectada por metilación del ADN diferencial o metilación del ADN aberrante, y una o más secuencias genómicas de control correspondientes de uno o más sujetos de control que carecen del fenotipo de interés;

b): digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, por ejemplo un cóctel que comprende HpaII, Bsu151 (clan, Hin61, AciI (SsiI) y TaiI para producir extremos que puedan ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador;

d): escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas específicas de metilación de CpG escindiendo secuencias de nucleótidos metilados; por ejemplo, pero sin limitarse a McrBC para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;

f): marcar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas de la etapa e) y opcionalmente marcar la secuencia de nucleótidos de prueba no amplificada de la etapa d) con un primer marcador, por ejemplo, pero sin limitarse a un fluoróforo químicamente reactivo, por ejemplo, pero sin limitarse al fluoróforo que es Cy3, y marcar la secuencia de nucleótidos de control amplificada de la etapa e) y opcionalmente marcar la secuencia de nucleótidos de control no amplificada de la etapa d) con un segundo marcador, por ejemplo, un fluoróforo químicamente reactivo, por ejemplo, pero sin limitarse al fluoróforo que es Cy5;

g): hibridar los productos marcados de la etapa f) en una matriz que comprende una serie de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con los mismos;

h): determinar la razón de las señales emitidas por el primer marcador y el segundo marcador para cada una de las secuencias de nucleótidos hibridadas en la matriz.

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Un ejemplo del método tal como se describió anteriormente se muestra esquemáticamente mediante el panel central de la figura 1.

La mayoría de los estudios epigenéticos basados en matrices seleccionan como diana las secuencias de ADN hipermetiladas. Aunque el análisis de las fracciones hipermetiladas es un enfoque valido, el examen de la fracción no metilada puede ser mucho más informativo. Por ejemplo, en la región de 100 kb que comprende el gen de catecol-o-metiltransferasa (COMT) del cromosoma 22, que contiene 2.193 citosinas que pueden metilarse, el enriquecimiento de la fracción no metilada podría generar teóricamente \sim401 amplicones de tamaño suficiente (\geq50 pb), representando cada uno el estado de metilación de al menos una citosina. En cambio, la combinación de MseI (+BsuI, para eliminar fragmentos no metilados), las enzimas más frecuentemente usadas para el enriquecimiento de la fracción hipermetilada producirían 227 amplicones. Setenta y siete amplicones o bien no contendrían dinucleótidos CpG o bien serían demasiado cortos para hibridar en condiciones rigurosas con una micromatriz. De los 150 fragmentos restantes, 144 contienen CpG múltiples; por tanto, no son completamente informativos puesto que un único sitio de restricción no metilado eliminaría el fragmento completo de la amplificación final. Globalmente, la mayoría de los dinucleótidos CpG verdaderamente informativos no se seleccionan como diana usando el enfoque de BsuI y ninguno de estos dinucleótidos CpG se seleccionan como diana por BsuI. En experimentos con los tipos de micromatrices (véase el ejemplo 1), los productos de PCR de la fracción no metilada produjeron señales fuertes (razón de señal con respecto a ruido >6) para hasta un 98% de todos los clones/oligonucleótidos dispuestos en matrices, mientras que la fracción hipermetilada produjo menos señales (hasta un 86%). En promedio, la fracción no metilada detectó aproximadamente un 18% más de manchas. El análisis por ordenador de 50 secuencias de islas CpG escogidas aleatoriamente reveló que, por ejemplo, la fracción no metilada derivada de la escisión con HpaII da como resultado aproximadamente 22 veces más fragmentos (19,9 fragmentos/kb) de un intervalo de tamaño preferido (75-2.000 pb) que la fracción hipermetilada (0,9 fragmentos/kb) usando MseI.

No obstante, el análisis de la fracción de ADN hipermetilada también puede añadir información relevante a los perfiles de metilación. Por consiguiente, en otro ejemplo de la presente invención, se proporciona un método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:

b): digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción de corte frecuente, preferiblemente selectivas para secuencias ricas en A/T, por ejemplo, pero sin limitarse a Csp61 y TasI para producir extremos que puedan ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador;

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d): escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación escindiendo secuencias de nucleótidos metilados para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;

f): marcar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas de la etapa e) y opcionalmente marcar la secuencia de nucleótidos de prueba no amplificada de la etapa d) con un primer marcador, por ejemplo, pero sin limitarse a un fluoróforo químicamente reactivo, por ejemplo, pero sin limitarse al fluoróforo que es Cy 3, y marcar la secuencia de nucleótidos de control amplificada de la etapa e) y opcionalmente marcar la secuencia de nucleótidos de control no amplificada de la etapa d) con un segundo marcador, por ejemplo, un fluoróforo químicamente reactivo, por ejemplo, pero sin limitarse al fluoróforo que es Cy 5;

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Un ejemplo del método tal como se describió anteriormente puede encontrarse tal como se representa en el panel derecho de la figura 1.

Alternativamente, la etapa de digestión (etapa b) en el método anterior puede sustituirse por la siguiente etapa:

b): digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más enzimas sensibles a metilo, seguido por la digestión de las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y las secuencias genómicas de control con una enzima insensible a metilo que produce un extremo diferente, o bien un extremo romo o bien uno cohesivo. La enzima insensible a metilo puede ser un neoesquizómero de la enzima sensible a metilo correspondiente. Por ejemplo, BsiSI es una enzima insensible a metilo (para C/(^{met}C)GG) y produce un extremo (^{met}C)GG que es diferente de un extremo producido por Sth302II, una enzima sensible a metilo (para CC/GG) para producir el extremo romo GG. Otro ejemplo incluye XmaI, que es una enzima insensible a metilo (para C/C(^{met}C)GGG) y produce un extremo C(^{met}C)GGG que es diferente de un extremo producido por SmaI o PaeBI, enzimas sensibles a metilo (para CCC/GGG) para producir el extremo romo GGG.

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Aún otro ejemplo de la presente invención proporciona un método de identificación o corrección de efectos de la variación de la secuencia de ADN, un análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos en los párrafos 38 y 41 que comprende las etapas de:

d): comparar la una o más razones determinadas en la etapa c) con la una o más razones del análisis del estado de metilación, identificando de ese modo la variación de la secuencia de ADN en un análisis del estado de metilación.

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El panel izquierdo de la figura 1 muestra un ejemplo de un método de corrección que va a usarse en conjunto con un análisis del estado de metilación basado en el enriquecimiento de una fracción no metilada tal como se describió, por ejemplo, en el panel central de la figura 1. Sin embargo, el método de corrección mostrado en el panel izquierdo puede adaptarse fácilmente para usarse con el análisis del estado de metilación que enriquece las fracciones metiladas del ADN genómico tal como se muestra, por ejemplo, en el panel derecho de la figura 1 usando simplemente escisión equivalente, ligamiento al adaptador y etapas de amplificación específicas del adaptador como las usadas en el análisis del estado de metilación que enriquece las fracciones metiladas del ADN genómico. La figura 8 muestra un gráfico de dispersión representativo que demuestra las ventajas de usar el análisis correctivo de la variación de la secuencia de ADN en conjunto con un análisis del estado de metilación. El método de corrección descrito anteriormente puede realizarse antes o después del método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de ácido nucleico tal como se describió anteriormente.

La presente invención también contempla una combinación de los métodos dados a conocer anteriormente, por ejemplo, pero sin limitarse a tal como se muestra en general mediante la figura 1.

El método de la presente invención puede emplearse para identificar secuencias de nucleótidos específicos que pueden estar hipermetilados o hipometilados en enfermedades relacionadas con secuencias genómicas de control y, por tanto, proporciona dianas específicas para la intervención terapéutica. Además, el método puede proporcionar indicadores de diagnóstico y/o pronóstico para una enfermedad.

El método de la presente invención puede emplearse también con cultivos celulares, por ejemplo, pero sin limitarse a monitorizar y medir los cambios en la metilación tras tratarse las células con un agente biológico, por ejemplo, pero sin limitarse a un fármaco, o tras someterse a estímulos o condiciones ambientales específicos.

Las enzimas de restricción sensibles a metilación no examinan cada citosina. Por consiguiente, los métodos de la presente invención pueden usarse en conjunto con otras técnicas con el fin de obtener más información referente a las modificaciones epigenéticas del ADN. Por ejemplo, el análisis basado en matrices puede incluir fácilmente tanto el análisis de la metilación del ADN de la presente invención como el análisis de la modificación de histonas a través de la tecnología de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), que identifica secuencias de ADN asociadas con histonas modificadas. Las modificaciones del ADN y las histonas parecen ser dependientes, y en consecuencia la posibilidad de un enfoque combinatorio que examine tanto la metilación del ADN como la modificación de la cromatina en paralelo podría ser un enfoque productivo en el mapeo fino de cambios epigenéticos. El método de la presente invención también puede usarse en combinación con otros métodos para detectar y cuantificar el ADN metilado, por ejemplo, pero sin limitarse al método de bisulfito tal como se describió anteriormente, o cualquier otro método que se conozca en la técnica.

La presente invención contempla además un kit que comprende una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba, una o más secuencias genómicas de nucleótidos de control correspondientes, una o más endonucleasas de restricción de corte frecuente, una o más secuencias de nucleótidos de adaptadores específicos, una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, una o más endonucleasas de restricción específicas de CpG, una o más sondas para marcar las secuencias de nucleótidos, una o más micromatrices que pueden hibridarse con las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y control, software para presentar y/o analizar las secuencias hibridadas en la micromatriz, reactivos y/o enzimas para amplificar secuencias de nucleótidos, o cualquier combinación de los mismos. Se entenderá que los reactivos y/o enzimas para amplificar secuencias de nucleótidos pueden pertenecer a la etapa de amplificación en el análisis del estado de metilación, la etapa de amplificación en el análisis de la variación de la secuencia de ADN, o la amplificación en ambos de estos análisis.

En una realización de la presente invención, el método tal como se describió anteriormente proporciona un análisis de la metilación del ADN basado en matrices de secuencias genómicas de nucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a genes, elementos repetitivos tales como pero sin limitarse a ALU, LINE etc., elementos potenciadores, elementos represores, regiones cromosómicas, cromosomas/genomas completos o cualquier combinación de los mismos. Se muestran etapas representativas del método que no pretenden ser limitativas de ninguna manera en la figura 1.

Refiriéndose ahora a la figura 1, se muestra una representación esquemática de una realización de la presente invención. El procedimiento se describe para una "muestra" y un "control", sin embargo, tal como resultará evidente para un experto en la técnica, el término "muestra" puede comprender una secuencia genómica de nucleótidos de prueba de un sujeto que presenta un fenotipo particular y el término "control" puede comprender una secuencia genómica de control de un sujeto de control en el que el fenotipo está ausente. Por ejemplo, pero sin desear ser limitativo de ninguna manera, la muestra puede ser de un sujeto que presenta un fenotipo de enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse a cáncer (por ejemplo pero sin limitarse a cáncer de mama, cerebro, huesos, sangre, próstata, piel, etc.), diabetes, enfermedad de Alzheimer, hipertensión, esclerosis múltiple, psoriasis, aterosclerosis, asma, autismo, artritis reumatoide o cualquier otra enfermedad que puede verse afectada por metilación del ADN diferencial o metilación del ADN aberrante. Por el contrario, el "control" no presenta el fenotipo.

Para enriquecer la fracción hipermetilada del ADN genómico (véase el panel derecho de la figura 1), en primer lugar se escinde el ADN con una endonucleasa de restricción de corte frecuente, preferiblemente una endonucleasa de restricción específica para secuencias ricas en A/T, que produce extremos en el ADN que pueden ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador. Se conocen varias enzimas con una secuencia de reconocimiento de 4-pb que producen extremos cohesivos. Por ejemplo, pero sin desear ser limitativos de ninguna manera, Csp6I y TasI producen extremos adecuados. Tras el ligamiento de unas secuencias de nucleótidos de adaptador específicas de TasI o Csp6I que comprenden secuencias internas adecuadas para la amplificación por PCR, se escinden las muestras con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación por ejemplo, pero sin limitarse a HpaII, AciI (SsiI), Bsu15I (ClaI) y/o Hin6I (HhaI), preferiblemente un cóctel que comprende 2, 3, 4, 5 o más de tales enzimas. En consecuencia, se cortan sustancialmente todos los fragmentos no metilados y no pueden amplificarse en la siguiente reacción de PCR. Los productos de PCR de la muestra y el control se marcan por separado con colorantes fluorescentes, se combinan y se hibridan con una matriz de oligonucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a una matriz de COMT-ARVCF, una matriz de ADNc o una micromatriz de islas CpG. La cuantificación y el análisis de los datos de la matriz permiten una comparación detallada del estado de metilación entre la muestra y el control.

Para enriquecer la fracción hipometilada/no metilada de ADN en la muestra y el control (véase el panel central de la figura 1), se escinde el ADN con una o más, preferiblemente un cóctel de enzimas de restricción sensibles a metilación, por ejemplo, pero sin limitarse a HpaII, Bsul5I (ClaI), Hin6I, AciI (SsiI), TaiI o cualquier combinación de las mismas. Dependiendo del estado de metilación de las muestras, estas enzimas producen más o menos fragmentos con extremos cohesivos en los que pueden ligarse una o varias secuencias de nucleótidos de adaptador. Posteriormente, se someten los productos de ligamiento a un procedimiento de amplificación, que usa las secuencias de adaptador como cebadores. Por tanto, tal como se muestra en la figura 1, dependiendo de las enzimas elegidas, es posible enriquecer fragmentos hipo o hipermetilados de secuencias de nucleótidos en una muestra y un control. Los fragmentos de ADN resultantes pueden marcarse en la reacción PCR (método de marcado indirecto) o marcarse tras la reacción PCR (método de marcado directo). Finalmente, los productos marcados se hibridan con matrices, que contienen secuencias de oligonucleótidos cortas, y se cuantifican y se analizan los marcadores fluorescentes.

Las variaciones de la secuencia de ADN, por ejemplo, polimorfismos de ADN, en un sitio de restricción relevante para los métodos de la presente invención pueden simular diferencias de modificación de ADN a través de los individuos. Los datos del consorcio SNP (ncbi.nlm.nih.gov/SNP) indican que aproximadamente cada nucleótido número 360 en el genoma humano representa un SNP. En seres humanos pueden detectarse aproximadamente 2,16 millones de SNP en dinucleótidos CpG, y tales SNP de CpG son 6,7 veces más abundantes de lo esperado. Dependiendo de la combinación de enzimas de restricción, los estudios basados en matrices de islas CpG mostrados en la figura 8 indican que el 10%-30% de todos los datos aberrantes que se detectaron originalmente como diferencias de metilación contenían SNP. La información en los SNP dentro de los sitios de restricción de las enzimas usadas para el enriquecimiento de las fracciones no metiladas o hipermetiladas es útil en la diferenciación de las variaciones epigenéticas a partir de las variaciones de la secuencia de ADN.

Con el fin de corregir los efectos de la variación de la secuencia de ADN en el análisis del estado de metilación con respecto a la fracción o bien hipermetilada o bien hipometilada/no metilada, se realiza un experimento de matrices equivalente usando una copia de ADN genómico de prueba y control que se separa de todas las citosinas metiladas. Por ejemplo, la figura 1 (panel izquierdo) muestra el uso de ADN polimerasa de Phi29 para amplificar todo el ADN genómico, lo que crea una copia del genoma con todas las citosinas metiladas sustituidas por citosinas no metiladas. Se trata entonces la copia no metilada del ADN genómico de muestra y control con escisión por restricción equivalente, ligamiento al adaptador, amplificación específica del adaptador, marcaje, hibridación en matriz, etapas de análisis y cuantificación tal como se usa en el análisis del estado de metilación del ADN. Estos datos pueden representarse gráficamente entonces frente a los datos de la metilación del ADN correspondientes. Con respecto a la realización de un análisis de la variación de la secuencia de ADN correctivo con un análisis del estado de metilación que enriquece la fracción no metilada, se entenderá que la escisión con la enzima específica de metilación puede omitirse opcionalmente en el análisis de la variación de la secuencia de ADN cuando este análisis se realiza con una copia de ADN genómico que está desprovisto de metilación y por tanto no se esperaría que se escinda por una enzima de restricción específica de metilación.

Durante la escisión por restricción de los ADN moldes, preferiblemente se añaden a la reacción adiciones conocidas de oligonucleótidos específicos de matriz que funcionan como controles de normalización, por ejemplo, pero sin limitarse a secuencias de Lambda, Arabidopsis, plásmidos procariotas o una combinación de los mismos.

En la realización mostrada en el panel central de la figura 1, las secuencias de nucleótidos de adaptador específicas para los dinucleótidos CpG no metilados se ligan a los fragmentos de ADN hipometilados mientras que las regiones de ADN hipermetiladas (sin cortar) permanecen sin modificación. Los fragmentos largos, que aún podrían contener CpG metilados, se cortan mediante una endonucleasa de restricción específica de CpG, por ejemplo, pero sin limitarse a McrBC. Sin desear que se considere limitativo de ninguna manera o restringido por la teoría, se cree que la McrBC corta sólo si dos o más ^{m}CpG están presentes en un fragmento de ADN. En una reacción PCR posterior, se usan cebadores complementarios a los adaptadores de CpG para amplificar preferentemente los fragmentos de ADN hipometilados en la muestra y el control.

La figura 1B muestra un ejemplo de un gráfico de dispersión derivado de una matriz de "catecol-o-metiltransferasa, gen de repeticiones armadillo delecionado en el síndrome VCFS" (COMT-ARVCF), que revela diferencias en los patrones de metilación del ADN entre muestras y controles (véase en particular las flechas en la figura 1).

En una realización de la presente invención, el método emplea secuencias de nucleótidos de adaptador específicas que son altamente específicas para los extremos salientes, generados por las enzimas de restricción mencionadas anteriormente. Las secuencias de nucleótidos de adaptador contienen preferiblemente un extremo saliente específico de secuencia pequeña y una secuencia central homóloga no diana. Las secuencias de nucleótidos de adaptador pueden comprender también una proyección antisentido específica que impide la formación de repeticiones en tándem y el ligamiento de extremos romos, una secuencia "interruptora", que interrumpe los sitios de restricción tras el ligamiento, un extremo no complementario 5' y un nuevo sitio de restricción que facilita la escisión del adaptador de las secuencias diana si se desea, o una combinación de los mismos.

Las siguientes secuencias de nucleótidos de adaptador se muestran a modo de ejemplo y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. El término "adaptador" y la expresión "secuencia de nucleótidos de adaptador" se usan indistintamente.

Secuencias de nucleótidos de adaptador

(a) El adaptador universal específico de proyección de CpG "U-CG1" para la fracción de ADN hipometilada es un adaptador que se ajusta a los extremos de ADN producidos por las siguientes enzimas de restricción sensibles a metilación: HpaII, MspI, Hin6I Bsul5I (ClaI), AciI (SsiI), Pspl406I (AclI), Bsp119I (AsuII), HinII (AcyI), XmiI (AccI) y la enzima insensible a metilación Taq1. El adaptador es el producto de hibridación de los dos cebadores:

U-CG1a:	5'-CGTGGAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:1

U-CG1B:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCCA-3',	SEC ID NO:2

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(b) El adaptador específico de proyección de ACGT "ACGT-1" para la fracción de ADN hipometilada es un adaptador que se ajusta a los extremos de ADN producidos por la enzima de restricción sensible a metilación TaiI. El adaptador es el producto de hibridación de estos dos cebadores:

ACGT-1a:	5'-GAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:3

ACGT-1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCACGT-3',	SEC ID NO:4.

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(c) El adaptador específico de proyección de AATT "AATT-1" para la fracción de ADN hipermetilada es un adaptador que se ajusta a los extremos de ADN producidos por la enzima de restricción insensible a metilación TasI (TspEI). El adaptador es el producto de hibridación de estos dos cebadores:

AATT-1a:	5'-GAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:5

AATT-1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCAATT-3',	SEC ID NO:6

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(d) El adaptador específico de proyección de TA "TA-1" para la fracción de ADN hipermetilada es un adaptador que se ajusta a los extremos de ADN producidos por la enzima de restricción insensible a metilación Csp6I. El adaptador es el producto de hibridación de estos dos cebadores:

TA-1a:	5'-TATGAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:7

TA-1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCA-3',	SEC ID NO:8

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Se ligan los adaptadores mediante una ligasa de T4 a los fragmentos de restricción producidos por las enzimas específicas para las fracciones de ADN hiper e hipometiladas.

Para enriquecer las fracciones hiper e hipometiladas, ambos grupos de ligamiento se someten a escisión por restricción específica antes de la amplificación por PCR: Se escinden los fragmentos de ligamiento hipometilados mediante una endonucleasa de restricción específica de CpG, por ejemplo, pero sin limitarse a, McrBC. McrBC de Escherichia coli K-12 es una enzima de restricción que pertenece a la familia de proteínas AAA+ y escinde ADN que contiene metilcitosina en una o ambas cadenas [Sutherly, E., L. Coe, y E.A. Raleigh, McrBC: a multisubunit GTP-dependent restriction endonuclease. J Mol Biol, 1992. 225(2): págs. 327-48; Kruger, T., C. Wild, y M. Noyer-Weidner, McrB: a prokaryotic protein specifically recognizing ADN containing modified cytosine residues. Embo J, 1995. 14(11): págs. 2661-9; Stewart, F.J. y E.A. Raleigh, Dependence of McrBC cleavage on distance between recognition elements. Biol Chem, 1998. 379(4-5): págs. 611-6.]. McrBC no corta sustancialmente el ADN no metilado. Los sitios en el ADN reconocidos por McrBC pueden consistir en dos medios sitios de la forma (G/A)^{m}C. Sin desear ser limitativo de ninguna manera o restringirse por la teoría, estos medios sitios pueden estar separados por hasta aproximadamente 3 kb, aunque están separados preferiblemente por aproximadamente 55 a aproximadamente 103 pares de bases. McrBC actúa tras un par de elementos de secuencia Pu^{m}CG, detectando de ese modo una alta proporción de CpG metilados dentro de los fragmentos de ligamiento, pero no reconoce apreciablemente sitios HpaII/MspI (CCGG) en los que la citosina interna está metilada.

Refiriéndose ahora a la figura 2c, se muestra una representación gráfica de un gráfico de dispersión de una comparación de un ligamiento tratado con McrBC frente a un ligamiento no tratado en la matriz de COMT-ARVCF. Tal como se muestra en la figura 2c, se cortan los fragmentos tratados con McrBC y no pueden amplificarse en la PCR del adaptador, por tanto, la señal será mucho más baja en la matriz (mostrada en el canal de Cy5).

Los fragmentos de ligamiento hipermetilados se escinden preferiblemente mediante combinaciones específicas de las enzimas de restricción PaII, MspI, Hin6I, Bsul5I (ClaI), AciI (SsiI), Psp1406I (AclI), Bspl191 (AsuII), HinII (AcyI) o XmiI (AccI) dependiendo de la rigurosidad del enfoque. En una realización de la presente invención, que no pretende ser limitativa de ninguna manera, se emplean todas las enzimas. En una realización alternativa pueden emplearse cualquiera de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 enzimas. Además, se contempla que otras enzimas no enumeradas a continuación puedan emplearse en combinación con una o más enzimas enumeradas
anteriormente.

Tras la escisión por restricción de las fracciones de ADN, se amplifican los productos de ligamiento con cebadores específicos para los adaptadores usados en el ensayo. O bien los fragmentos de amplicones ya están marcados durante la PCR, por ejemplo, pero sin limitarse a mediante marcaje con alilo (el método convencional usa la incorporación de nucleótidos de aminoalilo (aa) seguido por el acoplamiento a N-hidroxisuccenimida (NHS), colorantes funcionalizados (por ejemplo, pero sin limitarse a colorantes monofuncionales FluoroLink de Amersham/RU)) o bien se realiza una PCR convencional con los dNTP normales con el marcaje posterior de los productos de amplificación mediante cebado aleatorio. En otro ejemplo, pueden usarse cebadores marcados para realizar la reacción PCR.

Para la amplificación de cantidades pequeñas de ADN (por ejemplo, pero sin limitarse a tejidos microdiseccionados), se amplifican los amplicones mediante una enzima adecuada, por ejemplo, pero sin limitarse a la enzima Phusion (MJ Research, Finlandia). Normalmente, se genera un frotis de fragmentos de ADN durante la reacción de amplificación (véase la figura 2b).

La figura 2b muestra un "frotis" típico de productos de amplificación de ADN. La temperatura de hibridación influye en el tamaño del producto. Dependiendo del tamaño deseado de los fragmentos, las condiciones de la PCR pueden ajustarse en consiguiente. Habitualmente, un aumento de la temperatura de hibridación/alargamiento conducirá a un aumento de tamaño del producto. Dado que los fragmentos de PCR más grandes pueden hibridar de manera cruzada con más oligonucleótidos en la micromatriz, preferiblemente se evitan.

Tras el marcaje de la muestra y las muestras control con un marcador apropiado, por ejemplo, pero sin limitarse a un fluoróforo tal como colorantes Cy3/Cy5 monofuncionales, las muestras marcadas pueden hibridarse con una matriz de nucleótidos. En realizaciones separadas de la presente invención, que no pretenden ser limitativas de ninguna manera, las matrices pueden comprender matrices de ADNc de 1,7 k humano (UHN/Toronto, Canadá; que contiene 1718 EST humanos bien caracterizados), matrices de islas CpG (UHN/Toronto, Canadá), que contiene 12192 clones de islas CpG del Centro Sanger/RU y matrices de oligonucleótidos preparadas por encargo, por ejemplo, pero sin limitarse a, una matriz que abarca aproximadamente 100 kb de la región de COMT-ARVCF humana en el cromosoma 22, que se han empleado con éxito como matrices en la puesta en práctica del método de la presente invención. La presente invención contempla además el uso de cualquier matriz conocida en la técnica en el método de la presente invención.

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Diseño de las matrices de oligonucleótidos

Sin desear ser limitativo de ninguna manera, pueden prepararse micromatrices de oligonucleótidos epigenéticas en portaobjetos CMT-GAPS (Corning Inc.) o portaobjetos de micromatrices procesadas anteriormente equivalentes. Los oligonucleótidos para una región cromosómica deseada (por ejemplo, pero sin limitarse a elementos repetitivos LINE humanos) son preferiblemente de aproximadamente 25 pb a aproximadamente 50 pb en longitud o más largos. La secuencia de los oligonucleótidos se deriva preferiblemente de locus entre sitios de restricción sensibles a metilación usados en el método (más preferiblemente AciI, HpaII e Hin6I). Los oligonucleótidos se diseñan preferiblemente o bien entre cada uno de los sitios de restricción adyacentes o bien para cada segundo sitio, dependiendo de la especificidad deseada para cada región cromosómica.

El método de la presente invención puede emplearse en una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, pero sin limitarse a la detección de las diferencias de metilación dentro de elementos repetitivos humanos en diferentes tipos de células (figura 5b y figura 7a).

En la figura 5b, como ejemplo, se comparó ADN de un hisopo bucal con el ADN de células Jurkat. El análisis mostró que el nivel de metilación global de elementos repetitivos no era significativamente diferente en las dos muestras de prueba. En cambio, varios locus en la región de COMT presentaron niveles de metilación diferentes, acompañado por un aumento de hipermetilación de esta región cromosómica en células Jurkat.

La figura 7a muestra un gráfico de dispersión representativo de un experimento que detecta diferencias de metilación dentro de los elementos repetitivos (por ejemplo, elementos ALU o LINE) en diferentes tejidos. Los círculos grises indican secuencias parcialmente repetitivas (de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 copias/genoma); mientras que los círculos blancos indican secuencias altamente repetitivas (aproximadamente >100 copias/genoma).

Los métodos de la presente invención también pueden emplearse para detectar diferencias de metilación en secuencias génicas únicas tal como se muestra a modo de ejemplo para el análisis de tumores cerebrales en comparación con cerebros control (véase la figura 5a y la figura 7b).

La figura 7b muestra un gráfico de dispersión de un experimento que detecta diferencias de metilación en las secuencias intergénicas y génicas únicas así como de elementos repetitivos en la región cromosómica de COMT-ARVCF en el cromosoma humano 22. En esta comparación, el análisis de las matrices de oligonucleótidos reveló una hipermetilación relativa de elementos repetitivos en el tumor cerebral.

En la figura 5a se usó la matriz de oliconucleótidos de COMT para producir un gráfico que identifica los cambios de metilación del ADN en un tumor cerebral. En contraposición al par de muestras de ADN control no tumorigénicas, en el que las señales de hibridación están cerca de la línea de regresión (indicando patrones de metilación del ADN similares), una proporción visible de las señales de hibridación procedentes de la fracción de ADN no metilada del tumor cerebral se desvía de la línea de regresión.

Las figuras 6 y 9 muestran ejemplos de aplicación del método de la presente invención para comparar diferentes tejidos con respecto a su perfil de metilación en el cromosoma 22. Tal como se muestra en las figuras 6 y 9, existen diferencias de metilación entre el ADN de tejido de placenta humana y el ADN de tejido de cuerpo estriado humano post-mortem. El método revela una diferencia de metilación espacial y temporal significativa entre estos dos tipos de tejidos. Cuanto más lejana sea la ubicación de un punto con respecto a la línea de regresión, mayor será la diferencia de metilación del ADN en la ubicación facilitada del fragmento de ADN.

Refiriéndose específicamente a la figura 6, se muestra un gráfico de dispersión representativo que identifica efectos específicos del tejido tal como se determinan usando micromatrices de islas CpG que contienen 12.192 clones de islas CpG. Las islas CpG tienden a encontrarse en muchas secuencias promotoras y su metilación tiene efectos profundos sobre el silenciamiento génico en genomas de mamíferos. El gráfico de dispersión en la figura 6 muestra dos zonas de puntos distintas, que representan fragmentos predominantemente hipometilados en placenta (región indicada mediante la línea de regresión más cercana al eje y) y cerebro (región indicada mediante la línea de regresión más cercana al eje x), respectivamente. Aproximadamente el 11% de los fragmentos de islas CpG presentan una diferencia de intensidad de señal de dos veces entre los dos tejidos. Algunas de las señales específicas del cerebro más fuertes podrían identificarse por islas CpG asociadas con genes neuronales tales como DPYSL5, FABP7, DIRAS2, GRIN3A, SLC24A3 o DSCAML1, mientras que los datos aberrantes específicos de placenta robustos estaban asociados con genes tales como PCM1, CCND1, HA-1 o ADAMTSL1. Globalmente, el análisis reveló que el ADN de cerebro albergaba aproximadamente 2,6x más islas CpG hipometiladas que el ADN de placenta. En seres humanos, aproximadamente el 70% de todas las islas CpG están asociadas con 24 genes (el 56% con regiones promotoras), por tanto puede esperarse que un determinado porcentaje de las islas CpG no metiladas estén asociadas con la expresión de genes cercanos. Se identificaron más cambios sutiles en los patrones de metilación del ADN cuando se compararon tejidos de cerebro post-mortem de un individuo sano con el mismo tejido de un paciente con esquizofrenia (figura 5d).

Los métodos para analizar el estado de metilación de citosinas proporcionan un enfoque de alto rendimiento para la elaboración del perfil de los patrones de metilación del ADN. La posibilidad de analizar cantidades mínimas de ADN (< 10 ng) puede permitir el examen epigenético de pequeñas cantidades de ADN, por ejemplo, cuando se extrae ADN del plasma, suero u otros fluidos corporales o en diagnósticos prenatales. Aunque todos los ejemplos dados a conocer en el presente documento pertenecen a ADN humano, se reconocerá que pueden usarse las mismas estrategias para análisis epigenéticos de muchas otras especies.

Hasta la fecha, los enfoques de micromatrices "epigenómicas" se han basado en el enriquecimiento del ADN hipermetilado y se han usado predominantemente para la identificación de islas CpG anómalamente metiladas en células malignas. Aunque esta estrategia parece ser útil para la detección de cambios epigenéticos importantes en algunas regiones del genoma, la proporción global de los sitios CpG examinados es sustancialmente inferior en comparación con el enfoque basado en el análisis de la fracción no metilada. Tal como se muestra en el ejemplo 1, el examen de la fracción no metilada del ADN genómico puede ser hasta varios cientos de veces más eficaz en comparación con el escenario de la fracción hipermetilada. Además, puesto que las citosinas no metiladas representan una parte mucho más pequeña de citosinas en comparación con la metilada (dependiendo del tejido, el 70%-90% de las citosinas están metiladas), el análisis de esta fracción no metilada más pequeña del ADN genómico es más sensible para detectar cambios sutiles. Por ejemplo, un aumento del 10% de la densidad normal de metC daría como resultado una diferencia del 100% (de desde el 20% hasta el 10%) en la fracción no metilada, pero sólo del 12% (de desde el 80% hasta el 90%) en la fracción hipermetilada del ADN genómico.

La elaboración de los perfiles de metilación del ADN, tal como se contempla en la presente invención, puede implementarse de una manera imparcial, sistemática que no se limita a las regiones tradicionalmente preferibles tales como islas CpG. Fuera de las islas CpG, hay muchos otros locus genómicos que pueden ser los sitios para la modificación epigenética diferencial, por ejemplo, sin limitación, potenciadores, elementos de control de la impronta, o las regiones que codifican para ARNnp específicos de intrón.

Los métodos de la presente invención pueden ser de beneficio significativo en la identificación de variación entre individuos, la identificación de cambios epigenéticos durante la diferenciación del tejido y diferencias a través de especies, y el entendimiento de efectos epigenéticos de diversos factores ambientales, entre muchos otros desarrollos. De interés particular es la aplicación del análisis de la metilación del ADN de alto rendimiento para abordar las bases moleculares de diversas irregularidades no mendelianas de enfermedades complejas, tales como discordancia de gemelos monocigóticos, remisiones y recaídas de una enfermedad, antecesor de efectos de origen y sexo, especificidad de tejido y sitio.

La descripción anterior no pretende limitar la invención reivindicada de ninguna manera, además, la combinación tratada de características podría no ser absolutamente necesaria para la solución inventiva.

La presente invención se ilustrará además en los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son sólo para fines ilustrativos, y no deben usarse para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

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Ejemplos Ejemplo 1 Elaboración de perfiles a gran escala de la metilación del ADN en una variedad de elementos genéticos, tipos celulares, tejidos, y sujetos de prueba

El ejemplo 1 presenta una tecnología de alto rendimiento basada en micromatriz completa para elaborar perfiles de la metilación del ADN de las regiones del ADN que se extienden desde cientos de kilobases hasta megabases y podrían aplicarse a todo el genoma humano: el enfoque se basa en el enriquecimiento de fracciones diferencialmente metiladas del ADN genómico y el examen posterior de estas fracciones en micromatrices de ADN de alta densidad. Ya están disponibles algunas tecnologías basadas en micromatriz usadas para análisis epigenéticos, sin embargo, a continuación hay una serie de alternativas y nuevos aspectos, tales como el enfoque en la fracción no metilada (en lugar de la hipermetilada) del ADN genómico y la detección paralela de efectos de confusión de la variación de la secuencia de ADN, entre otros.

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Enriquecimiento de la fracción no metilada del ADN genómico

El esquema para el enriquecimiento de las partes no metiladas del genoma se presenta en la figura 1. Se digiere el ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la metilación (figura 1, panel central). Mientras los sitios de restricción metilados permanecen inalterados, los sitios que contienen las CpG no metiladas se escinden por las enzimas, y se generan fragmentos de ADN con extremos salientes de 5'-CpG. La proporción de los sitios CpG examinados depende de las enzimas de restricción sensibles a metilación usadas para la restricción de ADN. Basándose en un análisis (datos resumidos en la tabla 1) de los dinucleótidos CpG dentro de los sitios de enzimas de restricción sensibles a metilación a lo largo de varias megabases del ADN genómico humano, debe examinarse la combinación de tres enzimas, HpaII, Hin6I y AciI, \sim32% de todos los dinucleótidos CpG en ADN de mamífero. La adición de otras dos enzimas que generan proyecciones de CpG sensibles a la metilación relativamente económicas, HpyCH4IV e Hin1I aumentaría teóricamente la proporción de las CpG examinadas hasta \sim41%. Dependiendo del tipo de matriz, pueden usarse normalmente o bien un único cortador o un "cóctel" de aproximadamente 2, 3, 4, 5, o más enzimas de restricción.

La aplicación de un conjunto de enzimas podría ser desventajosa para el análisis de regiones ricas en GC tal como una estrategia de este tipo produciría fragmentos de restricción demasiado cortos para una hibridación eficaz. En el último caso, es preferible usar un número de enzimas de restricción más pequeño. Basándose en los resultados experimentales y en un análisis por ordenador de 100 islas CpG escogidas aleatoriamente y regiones no de islas CpG en el genoma humano, las enzimas de restricción más adecuadas para el análisis de islas CpG son Hin6I o HpaII, seguido por AciI, e Hin1I (tabla 1). Por el contrario, para secuencias de ADN regulares, pueden preferirse combinaciones de digestiones dobles o triples de AciI, HpaII, HpyCH4IV e Hin6I.

TABLA 1 Enzimas que generan extremos salientes en los fragmentos de restricción, que son complementarias al adaptador U-CG1, TA-1 y AATT-1. El asterisco (*) indica el número de fragmentos de 75 pb-2 kb de longitud ("informativos"), derivados de varios Mpb de secuencias de isla CpG seleccionadas aleatoriamente y secuencias no de isla CpG en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 6, 9, 17, 19 y 20

1

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Tras la digestión del ADN genómico, se liga el adaptador bicatenario U-CG1 a las proyecciones de CpG. En este punto, se espera que la mayoría de los fragmentos de ADN amplificables y relativamente cortos se deriven de las regiones del ADN no metiladas. Sin embargo, algunos fragmentos de ligamiento, aún pueden contener metCpG. Una proporción de tales fragmentos puede eliminarse mediante tratamiento con McrBC, que escinde ADN que contiene metC y no actuará sobre el ADN no metilado. Los sitios de restricción McrBC consisten de dos medios sitios de la forma (G/A)metC, que pueden separarse en hasta 3 kb, 19, 20. Por tanto, tal como puede observarse en la fig. 2C, se escinde una proporción de fragmentos de ADN con 2 o más (G/A)metC dentro del fragmento de restricción y por tanto, se deleciona de las etapas de enriquecimiento posteriores. Entonces se enriquece el grupo restante de fragmentos de ADN
no metilado mediante la amplificación por aminoalil-PCR que usa cebadores complementarios al adaptador U-CG1.

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La exactitud del enfoque de adaptador-amplificación se ilustra mediante amplificaciones selectivas de fragmentos de 1 fago de la mezcla con ADN humano (figura 2A).

Una ventaja de usar extremos salientes en la etapa de ligamiento al adaptador es que los fragmentos de ADN degradados no se ligarán ni amplificarán, y por tanto no interferirán con el análisis de metilación. La figura 2a también demuestra que el enriquecimiento de los fragmentos de ADN dependen de su longitud (no se amplifican fragmentos pobres en CpG, grandes), y además que la amplificación preferencial de fragmentos de tamaño específico es altamente reproducible.

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Comparación de la fracción no metilada/hipometilada con la fracción metilada

La mayoría de los estudios epigenéticos basados en micromatriz anteriores tienen como objetivo las secuencias de ADN hipermetiladas; aunque, sin embargo, un enfoque válido, el examen de la fracción no metilada, es mucho más informativo. Por ejemplo, en la región de 100 kb del cromosoma 22 (COMT, véase la sección de diseño de micromatriz a continuación), que contiene 2.193 citosinas que pueden metilarse, el enriquecimiento de la fracción no metilada generaría teóricamente de manera aproximada 401 amplicones de tamaño suficiente (\geq50 pb), representando cada uno el estado de metilación de al menos una citosina. Por el contrario, la combinación de MseI (+BsuI, para eliminar fragmentos no metilados), las enzimas más frecuentemente usadas para el enriquecimiento de la fracción hipermetilada, produciría 227 amplicones. Setenta y siete amplicones o bien no contendrían dinucleótidos CpG o bien serían demasiado cortos para hibridar estrictamente con una micromatriz. De los 150 fragmentos restantes, 144 contienen múltiples CpG; por tanto, no son completamente informativas puesto que un solo sitio de restricción no metilado eliminaría el fragmento completo de la amplificación eventual. En general, sólo seis de las 2.193 citosinas que pueden metilarse son verdaderamente informativas, y ninguno de estos dinucleótidos CpG se seleccionan como diana por BsuI. En experimentos con los tipos de micromatrices, los productos de PCR de la fracción no metilada producían señales intensas (razón de señal con respecto a ruido >6) para hasta el 98% de todos los clones/oligonucleótidos dispuestos en matrices, mientras la fracción hipermetilada producía menos señales (hasta el 86%). En promedio, la fracción no metilada detectaba aproximadamente un 18% más de puntos. El análisis por ordenador de 50 secuencias de isla CpG escogidas aleatoriamente reveló que, por ejemplo, la fracción no metilada derivada de la escisión con HpaII da como resultado aproximadamente 22 veces más fragmentos (19,9 fragmentos/kb) del intervalo de tamaño apropiado (75-2.000 pb) que la fracción hipermetilada (0,9 fragmentos/kb) usando MseI.

No obstante, el análisis de la fracción de ADN hipermetilada también puede añadir alguna nueva información a los perfiles de metilación. Por tanto, en el presente documento se da a conocer un método de enriquecimiento de secuencias metiladas (figura 1, panel derecho). Este método de enriquecimiento comprende la escisión con los cortadores frecuentes de 4 pares de bases, por ejemplo, TasI (AATT/) y/o Csp6I (G/TAC). Como otro ejemplo, pueden usarse BfaI o MseI en combinación con el adaptador específico de Csp6I. Las cuatro enzimas son relativamente económicas y producen fragmentos de ADN en genomas de mamífero de una longitud promedio de aproximadamente 400 pb a aproximadamente 750 pb. Las secuencias de reconocimiento de TasI y Csp6I son poco frecuentes dentro de las regiones ricas en GC, dejando la mayoría de islas CpG intactas. El análisis de 50 islas CpG escogidas aleatoriamente y varias megabases de diferentes cromosomas reveló que una digestión con Csp6I produciría más fragmentos informativos en islas CpG que una digestión con MseI, mientras TasI y MseI producen fragmentos informativos preferiblemente en regiones del ADN fuera de las islas CpG (tabla 1). Tras el ligamiento a los adaptadores específicos de proyecciones de AATT y TA "AATT-1" y "TA-1", se eliminan los productos de ligamiento no e hipometilados de la reacción mediante la escisión con un cóctel de enzimas de restricción sensibles a la metilación tales como HpaII, HhaI (Hin6I), HpyCH4IV, Hin1I y AciI. En comparación con una única digestión con BstUI, un cóctel de enzimas de restricción delecionará un porcentaje superior de secuencias no metiladas de la fracción de ADN y además, no se requiere la preselección de clones de isla CpG que contengan sitios BstUI. Entonces se enriquece el grupo restante de los fragmentos de ADN más hipermetilados mediante la amplificación por aminoalil-PCR tal como se describió para la fracción hipometilada y finalmente se hibrida con una micromatriz (figura 5C).

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Diseño de micromatriz

Se investigaron diversos aspectos de la obtención de perfiles de modificación de ADN basados en micromatriz en la micromatriz de oligonucléotidos que examina un fragmento de aproximadamente 100 kb en la región cromosómica 22q11.2 (figura 3a). Esta región cromosómica contiene el gen que codifica para la catecol-O-metiltransferasa (COMT), y también el gen de tiorredoxina reductasa 2 (TXNRD2) y el gen de repetición del armadillo delecionado en el síndrome velocardiofacial (ARVCF). Para máxima capacidad de información, es preferible diseñar los oligonucleótidos según los sitios de restricción de las endonucleasas sensibles a metilación usadas para el tratamiento de ADN genómico (figura 3b). Para la matriz de COMT, se diseñaron 384 oligonucleótidos, cada uno de 50 nucleótidos de longitud, representando cada fragmento de restricción flanqueado por sitios de restricción HpaII, Hin6I y AciI. Además, los fragmentos de ADN control que contienen secuencias de fago lambda, pBR322, PhiX174, pUC57, y Arabidopsis se pusieron por puntos en la matriz. Adicionalmente, se usaron micromatrices del cromosoma 21/22 de alta densidad e islas CpG que contenían 12.192 elementos.

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Reproducibilidad

Para someter a prueba la reproducibilidad de los métodos de la presente invención, se dividió una muestra de ADN genómico y se sometió al procedimiento de enriquecimiento de la fracción no metilada. Se marcaron con Cy5 y Cy3 los productos de amplificación resultantes generados y entonces se hibridaron conjuntamente con la matriz de COMT, que contiene sondas que flanquean los fragmentos de restricción HpaII, Hin6I y AciI alrededor del gen COMT. Las intensidades de hibridación de Cy3 y Cy5 mostraban valores muy similares (R2=0,997; figura 4A). Experimentos análogos, incluyendo cambios hibridaciones con colorante, también se repitieron varias veces con las matrices de isla CpG y en todos los casos fueron altamente reproducibles (R2>0,97).

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Desviaciones específicas de la secuencia de control durante la amplificación del ADN

La tasa de amplificación de secuencias repetitivas generalmente disminuye más rápido que la de fragmentos menos abundantes en los últimos ciclos de la PCR. Con ciclos de amplificación crecientes, las cadenas de ADN repetitivas alcanzan concentraciones relativamente altas y pueden empezar a alinearse de nuevo entre sí durante las etapas por debajo de la temperatura de fusión del ADN. Para evitar esto, se aplicó una PCR de dos temperaturas que usa una etapa de alargamiento-hibridación de temperatura alta combinada. Se realizaron una serie de experimentos investigando cómo afectaría el número de ciclos de PCR a los patrones de hibridación. Tal como puede observarse en la figura 4B, las intensidades relativas de las señales de hibridación de ambas, secuencias de copias simples y fragmentos de ADN repetitivos, eran similares en el intervalo de 20 a 30 ciclos de amplificación (R2=0,991). Sólo, al aumentar los números de ciclo a más de 40 ciclos, se observó una amplificación sesgada de algunas secuencias de ADN (datos no mostrados).

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Sensibilidad

Para probar si los fragmentos de ADN diferencialmente representados en dos muestras de ADN diferentes pueden detectarse mediante este método, al ADN genómico humano se le "añadió" ADN heterólogo no metilado, fago Lambda y plásmido pBR322 (figura 4C). La cantidad de Lambda y pBR322 correspondía a los números crecientes de equivalentes genómicos humanos (1 GE de ADN "añadido" es igual a 16,28 picogramos de Lambda/microgramo de ADNg y 1,45 picogramos/microgramo de ADNg de pBR322, respectivamente). Por tanto, cada uno de los experimentos comparó las intensidades generadas por 1 GE de Lambda más 128 GE de pBR322 (eje Y) frente a 16 GE de Lambda más 8 GE de pBR322 (eje X). Mientras que las intensidades de la señal representadas de las secuencias del ADN genómico humano se sitúan en o cerca de la línea de regresión, los fragmentos Lambda y pBR322 se identificaron como datos aberrantes. La razón de la intensidad de señal promedio de oligonucleótidos Lambda era 15,4 que está muy cerca de la razón de ADN añadido (16:1). Los valores de intensidad para pBR322 no eran tan lineales y mostraron una diferencia de 6,5-10 veces (se esperaba la misma razón de 1:16), de la manera más probable debido a efectos de saturación durante la hibridación.

Con el fin de determinar la sensibilidad de la hibridación en sí, se comparó un ADN amplicón control consigo mismo pero disminuyendo las cantidades de ADN en un 5%, 10%, 25% y 50%. En el nivel global, las líneas de regresión [y=f(x)] reflejaron de manera reproducible las diferencias de la cantidad de ADN amplicón usado en la hibridación y variaron en un 5%-7% con respecto a los valores esperados (figura 4D). Tal como se esperaba, los sitios individuales mostraban un grado inferior de precisión, y la exactitud dependía de la intensidad de la señal, es decir, cuanto más fuerte era la señal, más cerca estaba la intensidad del punto observado a la esperada. Las tasas de datos aberrantes falsos (razón logarítmica <-0,3; >0,3) eran aproximadamente del 3% y 1%-15% para las matrices de isla CpG y matrices de oligonucleótidos de COMT, respectivamente. Habitualmente, la replicación de los experimentos de micromatrices reducían el grado de aberración (razón logarítmica <-0,3; >0,3) por debajo del 2% para todos los tipos de micromatrices.

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Ejemplos de aplicación del análisis de la metilación del ADN

A continuación se proporciona la identificación de las diferencias de la metilación del ADN en una serie de ejemplos. Se usó la matriz de oligonucleótidos de COMT para identificar cambios en la metilación del ADN en un tumor cerebral (figura 5A). Al contrario del par de muestras de ADN control no tumorigénicas, en el que las señales de hibridación están cerca de la línea de regresión (indicando patrones de metilación del ADN similares), una proporción visible de las señales de hibridación que se originan a partir de la fracción de ADN no metilada del tumor cerebral se desvía de la línea de regresión.

Otra aplicación de la tecnología incluye la elaboración de perfiles epigenéticos de diferentes tejidos. Como ejemplo, se comparó ADN de una muestra bucal obtenida con hisopo con el ADN de células de Jurkat (figura 5B). El análisis mostró que el nivel de metilación global de los elementos repetitivos no era significativamente diferente en las dos muestras de prueba. Por el contrario, varios loci en la región COMT mostraron diferentes niveles de metilación, acompañados por hipermetilación aumentada de esta región cromosómica en células de Jurkat.

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Se mostró un segundo ejemplo de los efectos específicos de tejido en las micromatrices de isla CpG que contienen 12.192 clones de isla CpG. Las islas CpG tienden a encontrarse en muchas secuencias promotoras y su metilación tiene efectos profundos en el silenciamiento de genes en genomas de mamífero. El gráfico de dispersión muestra dos zonas de puntos distintas, que representan fragmentos predominantemente hipometilados en placenta (la línea de regresión más cercana al eje y) y cerebro (la línea de regresión más cercana al eje x), respectivamente (figura 6). Aproximadamente el 11% de los fragmentos de isla CpG mostraron una diferencia de intensidad de señal de 2 veces entre los dos tejidos. Algunas de las señales específicas de cerebro más intensas pudieron identificarse para islas CpG asociadas con genes neuronales tales como DPYSL5, FABP7, DIRAS2, GRIN3A, SLC24A3 o DSCAML1, mientras que los datos aberrantes específicos de placenta robustos se asociaron con genes tales como PCM1, CCND1, HA-1 o ADAMTSL1. En general, el análisis reveló que el ADN del cerebro albergaba aproximadamente 2,6x más islas CpG hipometiladas que el ADN de placenta. En seres humanos, aproximadamente el 70% de todas las islas CpG se asocian con genes (el 56% con regiones promotoras), por tanto puede esperarse que un determinado porcentaje de las islas CpG no metiladas esté asociado con la expresión de genes cercanos.

Se identificaron cambios más sutiles en los patrones de metilación del ADN cuando se compararon tejidos del cerebro post mortem de un individuo sano con el mismo tejido de un paciente con esquizofrenia (figura 5D).

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Verificación de las diferencias de metilación detectadas

Se seleccionaron varios loci que mostraron diferencias de metilación en los presentes experimentos para la verificación mediante la modificación con bisulfito de sodio, del mapeo de citosinas metiladas. La técnica se basa en la reacción del ADN genómico con bisulfito de sodio en condiciones tales que se desamina la citosina para dar uracilo pero la 5-metilcitosina permanece sin reaccionar. En la secuenciación de productos amplificados, todos los residuos de uracilo y timina se detectan como timina y sólo los residuos metC permanecen como citosina. Los sitios para las enzimas de restricción sensibles a metilación usados en los presentes experimentos mostraron la diferencia de metilación esperada a lo largo de las muestra de ADN, tal como se muestra a modo de ejemplo para clones de isla CpG ubicados en la región promotora de galectina-1 y en la región promotora de un transcrito específico de cerebro CR606704 (figura 6) Ambas secuencias de la isla CpG mostraron diferencias de metilación entre cerebro (no metilada) y placenta (metilada). Es interesante observar que las diferencias no se limitaron a dinucleótidos CpG dentro de los sitios de restricción. En la mayoría de casos, los patrones de metilación en los sitios de enzimas también reflejaron los patrones de metilación de las CpG circundantes.

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Mapeo fino a gran escala de las diferencias de metilación

El análisis de la fracción no metilada de ADN específico del cerebro de 8 adultos usando una matriz parcheada de cromosoma 21/22 detectó de 488 a 747 sitios hipometilados por muestra. Este número aumentó hasta 977 en un mapa combinado, mostrando que muchos sitios eran comunes entre individuos diferentes. La gran mayoría de los sitios (aproximadamente el 90%) se hallaban fuera de los extremos 5' y regiones flanqueantes en 5' de los genes compatibles con actividad transcripcional abundante y una fracción significativa de sitios de unión a factor de transcripción se encontraron fuera de las anotaciones conocidas.

Los sitios no metilados fuera de los extremos 5' de genes conocidos estaban distribuidos de manera aproximadamente igual entre sitios que residían dentro de intrones de genes conocidos y fuera de los límites génicos. De manera interesante, mientras que algunos genes, como BCR en el cromosoma 22, mostraron un gran número de sitios dentro de los limites génicos, algunos loci, como ADARB 1 extendiéndose sobre aproximadamente 150 kb del cromosoma 22, estaban esencialmente desprovistos de sitios no metilados internos y en algunos casos, tal como el locus SIM2, los sitios no metilados detectados se limitaban al primer intrón (figura 7 A-C). Esta observación sugiere una distribución no aleatoria de sitios no metilados. En general, los sitios no metilados detectados en este estudio cubren aproximadamente 0,47 Mpb o aproximadamente el 4% de los 12 Mpb de secuencias no repetitivas de cromosomas 21 y 22 examinados en el mapa combinado de los 8 individuos con un promedio de 0,28 Mpb o el 2,3% en cualquier individuo dado.

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Detección de los efectos de confusión de la variación de la secuencia de ADN

Puesto que se usan enzimas de restricción en el enriquecimiento de fracciones de ADN diferencialmente modificadas, la variación de la secuencia de ADN puede estimular diferencias epigenéticas. Sin embargo, hasta ahora, los métodos de micromatrices usados en estudios epigenéticos no han diferenciado entre los cambios de metilación y la presencia de los SNP dentro de los sitios de restricción de las enzimas de restricción aplicadas. Un enfoque para excluir el impacto de la variación de la secuencia de ADN, es verificar las bases de datos de SNP disponibles con el fin de identificar la variación de la secuencia de ADN dentro de los sitios de restricción de las enzimas usadas. Por ejemplo, la presente matriz COMT de 100 kb contiene un total de 273 SNP (SNPper, http://snpper.chip.org/bio/snpper-enter) de los que 101 (37 %) residen dentro de dinucleótidos CpG y 55 (20%) SNP se ubican dentro del sitio de restricción de las cuatro enzimas principales, HpaII, Hin6I, AciI y HpyCH4IV, que se usan para examinar los patrones de metilación. La mayoría de estos CpG-SNP se ubicaron en los sitios de restricción AciI y HpaII, mientras los sitios Hin6 y HpyCh4IV contenían menos polimorfismos (datos no mostrados).

Otro ejemplo de un enfoque para diferenciar los efectos de la secuencia de ADN de las diferencias epigenéticas genuinas consiste en realizar un experimento de micromatriz equivalente en el ADN que se despoja de todas las citosinas metiladas (figura 8). Se usa la ADN polimerasa de Phi29 para amplificar el ADN genómico completo, que crea una copia del genoma con todas las citosinas metiladas sustituidas por citosinas no metiladas. Entonces se someten pares de ADN control de muestra amplificada a las mismas etapas representadas en la figura 1 y se hibridan conjuntamente con las micromatrices. En el gráfico de dispersión resultante de este experimento, los datos aberrantes se consideran un resultado de los polimorfismos de nucleótidos dentro de los sitios de restricción de las enzimas usadas. Además, estos datos pueden representarse frente a los datos de metilación del ADN, que se someten a ensayo en paralelo (figura 8). En seis experimentos que usaron ADN amplificado, el número de datos aberrantes basados en SNP (razón logarítmica umbral <-0,3, >0,3) osciló desde 272 hasta 741 (432 \pm 165, media \pm DE), o del 2,2%-6,1% de 12.192 islas CpG. Fuera de estos datos aberrantes de SNP, de 72 a 234 (120 \pm 66, media \pm DE) se identificaron inicialmente como diferencias de metilación del ADN en experimentos de micromatrices usando la fracción no metilada derivada de la triple digestión con HpaII, AciI e Hin6I (figura 8). A partir de los estudios de matriz de isla CpG, la estimación es que del 10% al 30% de los datos aberrantes detectados en el experimento de metilación del ADN podrían deberse a la variación de la secuencia de ADN.

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Fabricación de micromatrices y tratamiento de datos

Las micromatrices de isla CpG y COMT se imprimieron en portaobjetos Corning CMT-GAPSII (Corning Life Sciences, Acton, Ma) usando un ``VersArray Chip Writer Pro Systems (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para la matriz COMT, se diseñaron 384 oligonucleótidos (Operon/Qiagen, EE.UU.), cada uno de 50 bases de longitud, representando cada fragmento de restricción flanqueado por sitios de restricción HpaII, Hin6I y AciI. Además, se pusieron por puntos en la matriz los fragmentos de ADN control que contenían secuencias de fago Lambda, pBR322, PhiX174 y pUC57. Se diluyó cada oligonucleótido hasta una disolución 25 micromolar y se pusieron por puntos cuatro veces para dar un total de 1.536 manchas del cromosoma 22. Además, 192 puntos de blanco consistían en tampón SSC y 48 puntos contenían clones de Arabidopsis. La matriz de isla CpG de ser humano contiene 12.192 clones de isla CpG secuenciados derivados de una biblioteca de isla CpG que se creó originalmente con columnas de unión ADN de MeCP2.

Se barrieron las matrices hibridadas en un escáner GenePix 4000A (Axon Instruments, Union City/CA, EE.UU.) y se analizaron usando el software GenePix 6.0. El voltaje de del PMT de GenePix para canales de Cy3 y Cy5 se equilibró con la función del histograma del software del escáner para garantizar un intervalo dinámico similar para los dos canales. Los barridos finales se tomaron a resolución 10 micromolar, y se guardaron las imágenes para cada canal como archivos TIFF de 16-bits separados. Se determinaron las señales de emisión para cada canal restándole el nivel inicial local a su intensidad promedio media correspondiente. Estos datos sin procesar o bien se exportaron a un hoja de cálculo de Excel personalizada para el análisis posterior de los datos o bien se importaron directamente al software Acuity 4.0 (Axon Instruments). Se normalizaron los conjuntos de datos resultantes para las características de normalización (los ADN añadidos) y para la intensidad de señal (normalización de Lowess).

Se llevó a cabo la elaboración de perfiles de sitios hipometilados en el tejido cerebral de 8 adultos usando una matriz parcheada que se extendía sobre aproximadamente 12 Mb de secuencias no repetitivas de la parte distal 1/3 (aproximadamente) del cromosoma 21 y 1/3 (aproximadamente) de la parte proximal del cromosoma 22 con sondas espaciadas en promedio cada 35 pb de centro a centro. El ADN genómico de estos individuos se cortó con HpaII e Hin6I, sin el tratamiento de McrBC, se amplificó e hibridó con la micromatriz. El ADN genómico total, no enriquecido para regiones no metiladas, se usó como control. Se definieron los sitios no metilados usando un enfoque de análisis de dos etapas esencialmente idéntico al usado para determinar los sitios de unión a factor de transcripción en el ensayo CHIP-chip descrito en Cawley et al [Cawley S et al. (2004). Unbiased mapping of transcription factor binding sites along humanchromosomes 21 and 22 points to widespread regulation of noncoding RNAs. Cell 116, 499-509]. En primer lugar, se aplicó un enfoque de Wilcoxon de ventana de suavizado para generar un gráfico del valor de p para cada individuo en el que la señal de sonda de la fracción enriquecida se comparó con el ADN genómico total en una prueba para datos emparejados superior unilateral. La ventana usada en este informe era de 501 pb. En segundo lugar, se aplicaron tres umbrales para determinar las uniones del sitio no metilado: umbral de sonda individual de p<10^{-4} para determinar si una sonda se enriquece significativamente en la fracción no metilada en comparación con el ADN genómico total de control; la distancia máxima entre las dos sondas positivas = 250 pb y el tamaño mínimo de un sitio = 1 pb. Se hicieron todos los análisis de coordenadas y anotación en la versión de abril de 2003 del
genoma.

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Digestión sensible al metilo de ADNg

Antes del tratamiento con enzimas de restricción, se complementó ADN genómico con los ADN "añadidos" (diferentes concentraciones de fragmentos lambda y Arabidopsis), que se usaron como controles para normalización de señales. Para el enriquecimiento de la fracción no metilada, dependiendo del número de dinucleótidos CpG que van a examinarse, se usaron varias combinaciones de enzimas sensibles a metilación, HpaII, Hin6I, AciI y HpyCH4IV. Se escindió ADN genómico con un cóctel de estas enzimas (10 U/microlitro en tampón 2xY+/Tango, Fermentas Life Sciences/Lituania) durante 8 h a 37ºC para generar fragmentos con una proyección 3'-GC-5' saliente. Para el enriquecimiento de la fracción metilada, se escindió ADN genómico con TasI o Csp6I (10 U/microlitro en tampón G+, Fermentas) durante 8 h a 65ºC (TasI) o a 37ºC (Csp6I). Ambas enzimas seleccionan como diana secuencias de reconocimiento de 4 bases fuera de los dinucleótidos CpG, produciendo de ese modo extremos 5'-AATT-3' o 3'-AT-5' cohesivos, respectivamente. Tras la reacción de restricción, se inactivó TasI con EDTA 0,5 M.

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Ligamiento al adaptador

Para la etapa de ligamiento, se complementó ADN genómico con 8 GE de plásmido pBR322 escindido con MspI (1 GE = 1,45 pg/microgramo de ADNg), que se usó como control para un sesgo de ligamiento potencial. Se ligaron los extremos de los fragmentos de ADN escindidos a los adaptadores no fosforilados. Los presentes adaptadores contenían un extremo saliente específico de secuencia, una secuencia central homologa no diana, una proyección antisentido específica que impide la formación de repeticiones en tándem y ligamiento de extremos romos, una secuencia "interruptora" que interrumpe los sitios de restricción originales tras el ligamiento, un nuevo sitio de restricción Alw26I (BsmAI) no palindrómico que permite la escisión de extremos romos del adaptador de las secuencias diana (por ejemplo, para el enriquecimiento de la biblioteca) y un extremo no complementario 5'.

El adaptador universal específico de proyección de CpG "U-CG1" para la fracción de ADN no metilada se liga con fragmentos de ADN generados por 11 enzimas de restricción sensibles a metilación HpaII, Hin6I (Hinp1I), HpyCH4IV, Bsu15I (ClaI, BspDI), AciI (SsiI), Psp1406I (AclI), Bsp119I (AsuII), Hin1I (AcyI, BsaHD, XmiI (AccI), NarI, BstBI (FspII) y las enzimas insensibles a metilación TaqI y MspI. El adaptador representa el producto de hibridación de los dos cebadores:

U-CG1a:	5'-CGTGGAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:1;

U-CG1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCCA-3',	SEC ID NO:2

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El adaptador específico de proyección de AATT "AATT-1" para la fracción de ADN metilada se fija a los extremos de ADN producidos por la enzima de restricción TasI (TspEI), mientras el adaptador "TA-1" se fija a los extremos producidos por Csp6I, BfaI o MseI, respectivamente:

AATT-1a:	5'-AATTGAGACTGACTACCAGAT-3',	SEC ID NO:5;

AATT-1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTC-3',	SEC ID NO:6;

TA-1a:	5'-TATGAGACTGAXTACCAGAT-3',	SEC ID NO:7;

TA-1b:	5'-AGTTACATCTGGTAGTCAGTCTCA-3',	SEC ID NO:8.

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Se prepararon todos los adaptadores mezclando cantidades equimolares de los pares de cebadores, incubando la mezcla a 80ºC durante 5 min., y entonces enfriándolo hasta 4ºC con 1ºC/min. Se añadieron adaptadores bicatenarios [200 pmoles/microlitro] a 0,1 pmoles por enzima para cada ng de ADN escindido (por ejemplo, 0,3 pmoles/ng en una triple digestión con HpaII/Hin6I/AciI). Se complementó la mezcla de ligamiento con 400 ng de ADN molde con 2 microlitros de tampón de ligamiento 10x (Fermentas), 1 microlitro de ATP [10 mM], y agua hasta 18 microlitros. Se inició la reacción en un ciclador térmico a 45ºC durante 10 min., se enfrió sobre hielo y se añadieron 2 microlitros de ligasa de T4 (Fermentas). Se llevó a cabo la reacción de ligamiento a 22ºC durante 18 h, seguido por una etapa de inactivación térmica a 65ºC durante 5 min. Entonces se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente con 1ºC/min. y se almacenó a 4ºC para procedimientos posteriores.

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Escisión específica de metilación de productos de ligamiento

Fracción no metilada: con el fin de delecionar fragmentos de ligamiento metilados internamente, se trataron los productos de ligamiento con McrBC (NEB) durante 8 h a 37ºC en una mezcla que contenía GTP 2 mM (complementados con McrBC), 1x BSA, McrBC 10 U/microgramo y tampón 2 NEB y se almacenaron a 4ºC. Para controlar las actividades de McrBC, se complementó la mezcla de ADN con 8 GE del plásmido pUC57 (1 GE = 0,9 pg de pUC57 corresponde a 1 microgramo de ADNg) que se cortó con HpyCH4VI, se ligó al adaptador y se metiló con SssI-metilasa. Fracción metilada: para delecionar fragmentos de ligamiento no metilados internamente, se cortaron los productos de ligamiento con las enzimas de restricción sensibles a metilación HpaII, Hin6I, AciI o HpyCH4IV. Se incubaron los productos de ligamiento durante 8 h a 37ºC en una mezcla que contenía HpaII 10 U/microgramo, Hin6I 6 U/microgramo y AciI 8 U/microgramo en tampón 2xY+/Tango (Fermentas).

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PCR

Para controlar un posible sesgo de la PCR, se complementó la mezcla de ADN con 2 GE del plásmido PhiX174 (1 GE = 1,8 pg de PhiX174 corresponde a 1 microgramo de ADNg) que se cortó con HpyCH4IV y se ligó al adaptador. Se llevaron a cabo las amplificaciones por PCR durante hasta 25 ciclos. Una mezcla de aminoalil-PCR convencional incluía 400 ng del ligado, 40 microlitros de tampón de reacción 10x (Sigma), 42 microlitros de MgCl2 [25 mM], 3 microlitros de mezcla aminoalil-dNTP [que contenía aminoalil-dUTP 15 mM, dTTP 10 mM y dCTP, dGTP y dATP 25 mM cada uno], 200 pmoles de cebador (U-CGla, AATT-1b o TA-1b, respectivamente), 3 microlitros de enzima Taq 5 U/microlitro, NEB) y agua hasta un volumen final de 400 microlitros. El programa de amplificación era tal como sigue: 5 min. iniciales a 72ºC para llenar los extremos salientes del ADN ligado, 30 s de desnaturalización a 95ºC seguido por 25 ciclos de 30 s a 94ºC y 2 min. a 67ºC, y una extensión final de 5 min. a 72ºC. Para analizar los patrones de metilación del ADN usando cantidades pequeñas de molde de ADN (<20 ng), se usó un protocolo diferente de amplificación sin aminoalil-dUTP. En lugar de Taq polimerasa, las reacciones PCR contenían 2,5 ml de enzima Phusion (2 U/microlitro; Finnzyme, Oy, Finlandia). La reacción de amplificación inició con 5 min. iniciales a 72ºC, 1 min. a 98ºC seguido por 30 ciclos de 20 s a 98ºC y 1:40 min. a 68ºC, y una extensión final de 5 min. a 72ºC.

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Generación de productos del adaptador acoplados al colorante

Se purificaron los productos de aminoalil-PCR en columnas Microcon Y-50 (Millipore) según las instrucciones del fabricante, se concentraron mediante centrifugación a vacío, y se resuspendieron en 9 microlitros de tampón bicarbonato de sodio 0,1 M (Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3} pH 9,0) y 2 microlitros de dimetilsulfóxido (DMSO). Se disolvió el contenido de un vial de colorantes reactivos monofuncionales Cy3 o Cy5 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) en 72 microlitros de DMSO. Se mezcló el aminoalil-ADN (4 microgramos) se mezcló con 4,8 microlitros de colorante, se desnaturalizó brevemente en un bloque de calor a 100ºC y se incubó durante 2 h a 30ºC en la oscuridad. Para impedir la reactividad cruzada entre las muestras de Cy5 y Cy3, se extinguió ADN marcado con 4,5 microlitros de hidroxilamina 4 M (Sigma). Se combinaron muestras control y de prueba marcadas y se purificaron en columnas MeniElute (Qiagen).

Se reconstituyeron los productos de amplificación de Phusion (4 microgramos) en 29 microlitros de agua y se sometieron a marcado directo. Se desnaturalizaron la mezcla de ADN, 4 microlitros de tampón de reacción 10x (Fermentas), y 1 microlitro de cebador aleatorio (Invitrogen) a 95ºC durante 5 minutos, se enfriaron en hielo, y se complementaron con 4 microlitros de mezcla dNTP 10x (dGTP, dTTP, dATP 1 mM cada uno; dCTP 0,65 mM; Cy3/Cy5-dCTP 0,35 mM; EDTA 1 mM; Tris 10 mM, pH 8,0), 2 microlitros de fragmentos Klenow [10 U/microlitro, se incubaron en la oscuridad a 37ºC durante 2 h y se purificaron en columnas MiniElute. Se concentraron los eluatos hasta aproximadamente 5 microlitros mediante centrifugación a vacío y se midió la eficiencia de marcaje mediante la absorbancia a 260 nm y 550 nm para Cy3 y 650 nm para Cy5. Se calculó la frecuencia de incorporación del colorante (FOI) con las siguientes fórmulas: para Cy3: 86,52 x (A550/A260) y para la incorporación de Cy5: 51,92 x (A650/A260). Antes de la hibridación, se añadió el ADN marcado al tampón de hibridación (SlideHybTM n.º 2, Ambion, Austin, EE.UU.) que contenía ARNt 0,9 microgramos/microlitro (Sigma) y ADN de Cot-1 0,1 microgramos/microlitro (Roche Diagnostics), y se calentó hasta 72ºC durante 5 min.

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Hibridaciones con matriz

Se hibridó previamente cada portaobjeto con micromatriz con una mezcla que consistía en DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics), ARNt 25 microgramos/ml y BSA 200 microgramos/ml. Se cubrió el área impresa con la mezcla de prehibridación bajo un cubreobjetos durante 1 h a 45ºC. Entonces, se lavaron los portaobjetos con micromatriz en dos cambios de agua durante 2 min. a 45ºC, seguido por dos etapas de lavado a temperatura ambiente y una etapa de lavado final en isopropanol durante 1 min. Se secaron por soplado inmediatamente los portaobjetos con aire presurizado y se almacenaron para su hibridación. Entonces, se pipetearon las mezclas de hibridación sobre las matrices y se cubrieron con Hybri-slips de Sigma. Se colocaron las micromatrices en cámaras de hibridación (Corning Microarray Technologies, Nueva York, EE.UU.) y se incubaron sobre una superficie plana durante 16 h a 37ºC en un baño de agua cubierto. Se retiraron los cubreobjetos mediante inmersión de las matrices en una disolución de lavado que contenía SSC 2x y SDS al 0,5% (tampón de lavado I). Se lavó dos veces la matriz durante 15 min. a 37ºC en tampón de lavado I (rigurosidad baja), seguido por dos etapas de lavado en tampón de lavado II (SSC 0,5x, SDS al 0,5%), seguido por 2 min. de incubación en agua. Entonces, se enjuagaron los portaobjetos rápidamente en isopropanol y finalmente se secaron con aire presurizado.

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Amplificación del genoma completo

Se amplificó ADN genómico usando el kit GenomiPhi (Amersham Biosciences) según el protocolo del fabricante. En resumen, se mezclaron 10 ng de ADNg (1 microlitro) con 9 microlitros de tampón de muestra, se desnaturalizaron a 95ºC durante 3 min., se enfriaron sobre hielo y entonces se añadieron a 9 microlitros de tampón de reacción y 1 microlitro de ADN polimerasa de Phi29. Se incubó la reacción a 30ºC durante 16 h y entonces se inactivó a 65ºC durante 10 min.

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Secuenciación con bisulfito

Se analizó el estado de metilación de varias islas CpG mediante secuenciación directa de ADN genómico modificado con bisulfito de sodio. Se sometieron muestras de ADN genómico a modificación con bisulfito usando un protocolo convencional. La figura 6 muestra datos de secuencias modificadas con bisulfito para clones de islas CpG 22_B_12 (región promotora de Galectina 1) y 52_C_03 (región promotora de un transcrito específico de cerebro, CR606704). Las secuencias de cebador para los clones mostrados en la figura 6 eran tal como sigue: se analizó el clon 22_B_12 usando un enfoque anidado con dos conjuntos de cebadores:

22B12F1	(GTAGAATGTTAATTTTGGGTAGAAATAAT),	SEC ID NO:9;

22B12R1	(CTCAACCAT CTTCTCTAAACACC),	SEC ID NO:10;

22B12F2	(GTTATTGAGGTTTAGAAAAGAGAAGGTAT),	SEC ID NO:11;

22B12R2	(ACTTATAAACCTAACTCATCATCAAACTAT),	SEC ID NO:12;

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Se analizó el clon 52_C_3 con los siguientes cebadores:

52C3F1	(AGTTTGTATTAAGGAGATTTATAAGGATAG),	SEC ID NO:13;

52C3R1	(AACCAACAAAACACACAAACC),	SEQ ID NO:14;

52C3F2	(AATTTAGATTTTGAGTTTTTGAAAG),	SEC ID NO:15;

52C3R2	(AACACAACATAACAACAAACAAAAC),	SEC ID NO:16.

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Se realizó PCR usando para la primera ronda una perla (aproximadamente 10 microlitros) de ADN modificado con bisulfito, 200 mmoles de dNTP, 100 pmoles de cada cebador y 1 U de Taq polimerasa (New England Biolabs) en un volumen total de 100 microlitros. El ciclo consistió en desnaturalización de 3 min. a 95ºC seguido por 35 ciclos de 30 s a 95ºC; 30 s a 56ºC, 40 s a 72ºC, terminando con una extensión final de 5 min. a 72ºC. La segunda ronda de PCR usó 2 microlitros de una dilución 1:20 de la primera ronda de PCR como molde en una reacción de 20 microlitros. El ciclo de PCR consistió en desnaturalización de 3 min. a 95ºC seguido por 10 ciclos de un protocolo de descenso de 30 s a 95ºC; 30 s a 60ºC (-1ºC/ciclo), 40 s a 72ºC, seguido por 30 ciclos de 30 s a 95ºC; 30 s a 50 grad. C, 40 s a 72ºC, terminando con 5 min. de extensión final a 72ºC. Se purificaron los productos de PCR con el kit de purificación MinElute (Qiagen) y se clonaron directamente en el vector pGEM-T (Promega). Se secuenciaron quince clones a partir de cada PCR directamente con el cebador inverso M13 usando el kit de reacción ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready (PE Applied Biosistem), y se analizaron en un aparato ABI Avante 3100.

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ADN genómico

Se purificó ADN genómico de todos los tejidos con métodos de laboratorio convencionales (fenol/cloroformo o columnas Midi para ADN celular y de sangre de Qiagen). Para evitar la reactividad cruzada de grupos amino con el procedimiento de marcaje con aminoalilo, se almacenaron muestras de ADN en tampón POPSO 0,5 M (pH 8,0) en lugar de Tris-EDTA. Se adquirió ADN de placenta de hombre de Sigma y se proporcionaron las muestras de cerebro post mortem por el Instituto de Investigación Médica de Stanley.

El ejemplo 1 muestra que la tecnología basada en matriz para el análisis de modificación de ADN permite un examen altamente paralelo de numerosos fragmentos de restricción que representan los perfiles de metilación del ADN sobre grandes segmentos de ADN genómico.

En comparación con los enfoques existentes para ayudar en la detección de la modificación del ADN, los presentes métodos muestran varias ventajas. El enfoque anterior usaba un fraccionamiento en un gradiente de sacarosa, lo que requiere una gran cantidad de molde de ADN y es bastante impreciso en cuanto al límite superior de los fragmentos que se someten a hibridación. Los otros métodos basados en micromatiz para el análisis de metilación del ADN puede clasificarse en dos clases principales: i) enfoques que identifican transiciones de C a T inducidas por bisulfito, e ii) enfoques que se basan en el enriquecimiento de la fracción de hipermetilación del ADN genómico. En las matrices con bisulfito, cada CpG sometida a prueba está representada por un par de o bien C(G) o bien T(A), que contienen oligonucleótidos que miden la razón de C(G)/T(A) en el ADN tratado con bisulfito (que corresponde a metC/C en el ADN nativo). Aunque informativa y precisa, la micromatriz puede contener sólo un número limitado de oligonucleótidos puesto que el tratamiento con bisulfito degenera el código de cuatro nucléotidos, lo que da como resultado la pérdida de especificidad de una gran parte del genoma. Por ejemplo, tras el tratamiento con bisulfito las 16 permutaciones posibles de una secuencia de cuatro bases que contienen C y T no metiladas (CCCC, CTCT, CCCT, CCTT, TCTC, TTTC, TTTT, etc...) se volverán idénticas TTTT. Además, es difícil diseñar oligonucleótidos adecuados que muestren temperaturas de fusión similares dado que la especificidad de discriminación de bases varía considerablemente. Usando los métodos de la presente invención, las matrices pueden contener prácticamente un número ilimitado de oligonucleótidos: desde genes individuales hasta cromosomas completos representados por millones de oligonucleótidos en chips de vidrio. Matrices para parcheo de genoma completo ya están disponibles para Arabidopsis thaliana y E. coli, y pronto estarán disponibles para todo el genoma humano.

Otra ventaja de los métodos para elaborar perfiles de metilación de la presente invención es la posibilidad de trabajar con recursos de ADN limitados. Aunque el protocolo convencional requiere desde 0,5 mg - 1 mg de ADN genómico, la cantidad del ADN molde puede ser significativamente inferior. Los patrones de metilación en la región de la catecol-o-metil transferasa (COMT) generados a partir de un número relativamente pequeño de células de cultivo tisular Jurkat (hasta 500 células, o 3 ng) no revelaron ninguna diferencia significativa en comparación con los patrones de metilación generados a partir de un número sustancialmente mayor de células del mismo tejido (datos no mostrados). Parece viable aplicar el protocolo de enriquecimiento también para células individuales, lo que permitiría una medición cuantitativa de la metilación.

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Ejemplo 2 Elaboración de perfiles de DRD2 epiG usando micromatrices

En una realización de la presente invención, puede emplearse el método para elaborar perfiles de DRD2 epiG usando micromatrices. En la realización, se diseña una micromatriz que es específica para elaborar perfiles epiG de la longitud completa de DRD2, incluyendo el intron 1 muy largo (\sim250 kb). Sin desear ser limitativo de ninguna manera, el principio general de la matriz "epiG" comprende la hibridación de la fracción hipometilada (o hipermetilada) de ADN genómico (o la fracción de ADN asociada con por ejemplo, pero sin limitarse a, histonas acetiladas, metiladas) con la micromatriz que contiene oligonucleótidos que representan la región genómica de interés. La intensidad de la hibridación se correlaciona con el estado de metilación del ADN en el locus genómico homólogo a un oligonucleótido específico en la matriz. El análisis epiG basado en micromatriz de DRD2 comprende las siguientes
etapas:

i): Oligonucleótidos para micromatrices. Usando la secuencia de genoma humano públicamente disponible de DRD2 más las regiones en el sentido de 5' y en el sentido de 3' amplias (http://genome.ucsc.edu/), se diseñan oligonucleótidos de 40-50 bases (con modificadores de amino en el extremo 5') que cubren la región genómica que puede someterse a prueba de \sim350 kb. En estudios epiG, se alcanza suficiente cobertura con aproximadamente 3-5 (o más) oligonucleótidos por kilobase de ADN genómico. Pueden excluirse los elementos de ADN repetitivo usando el RepeatMasker, que reduce la longitud de la secuencia diana desde aproximadamente 350 kb hasta aproximadamente 200 kb. Esto requiere aproximadamente 800 oligonucleótidos que se sintetizarán por ejemplo, pero sin limitarse a en Qiagen, y entonces se ponen por puntos en el vidrio en una ubicación específica, por ejemplo, pero sin limitarse a la UHN Microarray Facility.

ii): Se extraen muestras de ADN de líneas celulares que expresan D2 tratadas con i) haloperidol; ii) clozapina; iii) haloperidol + VPA; iv) clozapina + VPA; v) VPA sólo, y se extrae el ADN control de la línea celular idéntica de la misma edad, pero sin exposición a un antipsicótico. Se usan dos líneas celulares que expresan receptor D2: HTB-18 (Y-79)57 (disponible de la ATCC) y hNT58 (disponible de Layton BioScience, Inc.).

iii): Intervalos de tiempo. Se extraen muestras de ADN de cada uno de los tratamientos anteriores tras 1, 6 y 24 horas, y después 3 y 7 días (intervalos de tiempo seleccionados arbitrariamente).

iv): Preparación de la fracción hipometilada de ADN genómico. Sin querer restringirse a la teoría, un cóctel de enzimas de restricción sensibles a metilación, tales como HpaII, Hin6I, AciI, TaiI, y una adición reciente de McrBC, puede examinar del 25%-50% de todas las CpG (Schumacher, Petronis et al; en preparación). Con el fin de enriquecer la fracción hipometilada de ADN genómico, tras digestión con enzimas de restricción sensibles a metilación del ADN, se ligan adaptadores de ADN a los fragmentos de restricción, lo que va seguido por la posterior amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que son complementarios a los adaptadores. Se ajustan las condiciones de PCR de manera que se amplificarán preferiblemente sólo fragmentos menores de 1 kb (es decir cortos, digeridos y por tanto no metilados). Entonces se marca la fracción hipometilada de ADN genómico de pares correspondientes con Cy3- (por ejemplo, ADN de células tratadas con haloperidol) y Cy5- (por ejemplo, ADN de las células control) y se hibrida conjuntamente con la micromatriz. Se realiza cada comparación por duplicado o más veces, y se usan las intensidades promedio para los análisis adicionales.

v): Se realizan hibridaciones usando protocolos de matriz convencionales tal como se describe en el presente documento, y puede realizarse el barrido de micromatrices en la UHN Micromatriz Facility usando el software GenePix (Pro 3.1). El software proporciona una salida de datos sin procesar, que se normalizan mediante NormalizingSuite 2.0 y se someten a un análisis adicional usando las macros de Excel propias. Un conjunto de experimentos en un gen usando una micromatriz de 100+ oligonucleótidos (más recientemente con 300+ oligonucleótidos), muestra resultados consecuentes de perfiles de metilación del ADN de esta región.

vi): Análisis de datos. El análisis de los perfiles de hibridación y la identificación de los cambios epiG inducidos por fármaco es sencillo. La fracción hipometilada de ADN de líneas celulares tratadas se compara con la de un control no tratado, y se generarán diagramas de dispersión para cada comparación. Se buscan señales de hibridación que se desvíen de la línea de regresión.

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El método de enriquecimiento de las fracciones de ADN hiper e hipometiladas es diferente y mejorado en comparación con métodos publicados previamente. El método tal como se da a conocer en el presente documento es el primero que usa una estrategia novedosa para el enriquecimiento de una fracción hipometilada e hipermetilada de ADN genómico, que compara eficazmente el estado de metilación de dinucleótidos de CpG en muestras control y de pruebas a lo largo de segmentos grandes y muy grandes de ADN genómico. Además, el método emplea una combinación informativa de enzimas de restricción sensibles a metilación que escinden o no escinden ADN que contiene metil-citosina en una o ambas cadenas y permite un análisis más riguroso y detallado de los perfiles de metilación en comparación con los otros métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también permite el análisis de muestras de tejido muy pequeñas (por ejemplo de muestras microdiseccionadas por láser). La cantidad necesaria de ADN genómico (ADNg) para un análisis puede ser de tan sólo 50 pg (< 10 células).

El método basado en matriz tal como se describió anteriormente tiene también varias ventajas en comparación con los métodos dependientes de bisulfito. Los métodos que se basan en el método con bisulfito se usan comúnmente pero requieren etapas de clonación y secuenciación que requieren mucho tiempo y son muy laboriosas, que pueden omitirse cuando se usa el método de la presente invención. Además, las estrategias basadas en bisulfito proporcionan sólo información sobre residuos específicos que se han elegido previamente como informativos, mientras que el método tal como se describe en el presente documento puede usarse para examinar genomas completos para determinar diferencias de metilación. Además, si se usa el enfoque con bisulfito en el formato de micromatriz, la técnica requiere numerosas permutaciones de oligonucleótidos, lo que aumenta drásticamente los costes de los oligonucleótidos o se limita a un segmento de ADN relativamente corto.

La presente invención se ha descrito con respecto a una o más realizaciones. Sin embargo, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse varias variaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.

Claims

1. Método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:

d): escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas específicas de metilación escindiendo sólo secuencias de nucleótidos metilados, para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;

g): hibridar los productos marcados de la etapa f) con una matriz que comprende una serie de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con los mismos; y

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2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de corrección para el efecto de la variación de la secuencia de ADN en el análisis del estado de metilación según la reivindicación 1:

i): amplificar las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de la etapa a) de la reivindicación 1 y amplificar por separado las secuencias genómicas de control de la etapa a) de la reivindicación 1 con una ADN polimerasa para producir una copia no metilada de las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y una copia no metilada de las secuencias genómicas de control;

ii): tratar la copia no metilada de las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y tratar por separado la copia no metilada de las secuencias genómicas de control con digestión mediante endonucleasas de restricción, ligamiento al adaptador, amplificación, marcaje, hibridación en matriz y etapas de determinación de la razón que son equivalentes a las etapas correspondientes b), c) y e-h); y

iii): comparar la una o más razones determinadas en la etapa ii con la una o más razones determinadas en la etapa h) de la reivindicación 1.

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3. Método según la reivindicación 2, en el que la ADN polimerasa de la etapa 1) es ADN polimerasa de Phi29.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la endonucleasa especifica de metilación es la endonucleasa específica de CpG McrBC.

5. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la endonucleasa de restricción sensible a metilación es un cóctel que comprende HpalI, Bsul51 (ClaI), Hin61, AciI (SsiI), TaiI, o cualquier combinación de las mismas.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa f) comprende además marcar las secuencias de nucleótidos de prueba no amplificadas de la etapa d) con el primer marcador, y marcar las secuencias de nucleótidos de control no amplificadas de la etapa d) con un segundo marcador.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fenotipo de interés comprende una enfermedad tal como cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer o esquizofrenia, esclerosis múltiple, psoriasis, aterosclerosis, asma, autismo o artritis reumatoide.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha sonda es un fluoróforo químicamente reactivo.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho fluoróforo es Cy 3 o Cy 5.