KR20120024205A - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｍｔｈｆｒ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트 - Google Patents

Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｍｔｈｆｒ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 발생 또는 고호모시스테인혈증과 관련된 질병과 연관되어 있는 MTHFR(Methylenetetrahydrofolate Reductase) 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 야생형 또는 돌연변이형과 특이적으로 결합하는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 이용한 MTHFR의 유전형을 분석하는 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것으로서, MTHFR 유전자의 야생형과 돌연변이형을 높은 민감도와 특이도로 분석할 수 있다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＭＴＨＦＲ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트{Methods and kits for genotyping of MTHFR gene using PNA mediated Real-Time PCR clamping}
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 MTHFR(Methylenetetrahydrofolate Reductase) 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고호모시스테인혈증(hyperhomo-cysteinemia)을 일으키는 MTHFR의 돌연변이를 PNA 프로브를 이용하여 높은 민감도로 분석하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
엽산(folic acid) 대사과정의 효소인 MTHFR은 5,10-메틸렌 THF(5,10-methylenetetrahydrofolate, 이하 '5,10-메틸렌 THF'라 함)를 체내 순환 형태인 5-메틸 THF(5-methyltetrahydrofolate, 이하 '5-메틸 THF'라 함)로 전환시켜 메티오닌 합성에 관여하고, 이어서 형성되는 SAM(S-adenosylmethionine, 이하 'SAM'이라 함)은 DNA 메틸화에 주된 역할을 하게 된다. 이 효소의 돌연변이형은 열에 약하고, 효소로서의 특이성이 감소되므로, 결국 DNA 메틸화에 이상을 초래하여 생체 내에서 발암성 변형을 일으키게 된다고 보고되어 있다. 지금까지 알려진 MTHFR의 대표적인 두 가지 변이형의 유전자 다형성으로는 677번 C가 T로 바뀌는 돌연변이(알라닌 → 발린)와 1298번 A가 C로 바뀌는 돌연변이(글루타메이트 → 알라닌)가 알려져 있다[Guttormsen et al., J Clin Invest., 1996, 98, 2174-2183; Blount et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1997, 94, 3290-3295]. 따라서 MTHFR 유전자의 돌연변이는 다양한 암 등과 연관성이 있을 것으로 예상되나, 암이 발생한 장기나 인종에 따라 다양한 양상으로 나타나며 나이나 식습관의 영향을 받는 등 아직 암의 발생과 MTHFR 유전자 다형성 간의 상관관계는 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다[Sandananda Adiga et al., Indian J Cancer., 2010, 47, 40-45; Pereira et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 2006, 15, 1956-1963; Hubner and Houlston, Int J Cancer., 2007, 120, 1027-1035; Larsson et al., Gastroenterology., 2006, 131, 1271-1283; Kono and Chen, Cancer Sci., 2005, 96, 535-542]. 그 외에도 MTHFR 유전자의 돌연변이는 호모시스테인(homocysteine) 수치를 증가시켜 뇌혈관질환, 심혈관질환, 말초정맥 혈전, 심부정맥 혈전증과 같은 다양한 질병과 연관된 고호모시스테인혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다[Agarwal et al., J Mol Diagn., 2007., 9, 345-350; Han et al., Yonsei Med J., 2010, 51, 253-260]. 또한 기형아 출산, 특히 태아의 신경관 결손과 조산 등을 일으키는 것으로 알려져 있다[Greene et al., Hum Mol Genet., 2009, 18, 113-129; Garcia-Fragoso et al., Int J Genet Mol Biol., 2010, 2, 43-47]. 이러한 MTHFR의 유전형 분석을 통해 다양한 암 발생의 연관성 파악에 이용하거나 고호모시스테인혈증에 의해 유발되는 다양한 질병과 임신과 연관된 각종 질병의 유발을 예측하여 대처할 수 있다.
MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 특정 염기서열을 인식해 절단하는 제한효소를 사용하여 절단된 유전형과 절단되지 않은 유전형의 증폭산물의 크기를 통해 분석하는 방법, 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 제작하여 프라이머에 의한 증폭 유무에 의해 유전형을 분석하는 방법 등을 사용하고 있다. 상기 방법들은 최근까지도 널리 사용되고 있지만, PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 분석하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 실험 시 조건에 따라 결과 분석이 달라질 수도 있다[de Alvarenga et al., J Biomol Tech., 2008, 19, 103-105; Lee et al., Hum Reprod., 2006, 21, 3162-3170; Patnaik et al., J Mol Diagn., 2004, 6, 137-144].
상기한 방법의 단점을 보완하기 위해 대두된 것이 실시간(Real-Time) PCR을 이용하여 MTHFR 유전자의 돌연변이를 분석하는 방법이다[Agarwal et al., J Mol Diagn., 2007, 9, 345-350; Cui et al., BMC Cancer., 2010, 10, 236]. 상기한 실시간 PCR법은 PCR 증폭량을 실시간으로 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동이 필요 없어 신속하고 또한 Ct(cycle threshold)값으로 간접적 정량이 가능하며, 여러 실험 단계를 거칠 필요가 없어 실험 조건이 결과에 미치는 영향도 없다. 이 실시간 PCR은 형광시약을 사용하게 되는데, 형광을 측정하는 방법에 따라 형광시약을 다르게 사용할 수 있다. 형광을 측정하는 방법에는 크게 인터컬레이팅(interchalating)법, TaqManTM 프로브법, 분자 비컨(Molecular Beacon)법 등이 있다. 인터컬레이팅법은 두 가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(인터컬레이터(Interchalator: 사이버 그린 I, 에티디움브로마이드 등))을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터의 형광감도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있고, 또한 증폭 DNA의 용융온도(Tm)를 측정할 수 있다. 반면 TaqManTM 프로브법이나 분자 비컨법의 경우, 표적 핵산에 대한 서열-특이적인 프로브에 형광물질을 표지하여 사용하므로 비특이적인 형광을 발산하지 않아 정확하고 증폭산물의 크기에 상관없이 형광이 일정하다는 장점이 있지만, 프라이머와 증폭산물에 따라서 프로브를 따로 제작해줘야 한다는 단점이 있다. 인터컬레이팅법을 이용하는 경우 염기서열과 상관없이 두 가닥 DNA와 반응해서 형광을 발산하기에 부정확하고 증폭산물의 크기에 따라 형광의 세기가 달라지는 단점이 있지만 어느 PCR에나 적용할 수 있다는 장점이 있다[Mayor-Olea et al., BMC Medical Genetics., 2008, 9, 104; de Jonge et al., Blood., 2005, 106, 717-720; Szuhai et al., Am J Pathol., 2001, 159, 1651-1660].
PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다[Nielsen et al., Science., 1991, 254, 1497-1500]. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹 가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹 가닥은 DNA/DNA 겹 가닥보다, PNA/RNA 겹 가닥은 DNA/RNA 겹 가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹 가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.
PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 프로브에 상보적이지 않은 서열이 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 단순히 인터컬레이팅법을 사용하는 실시간 PCR법보다는 특이적으로 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체를 빠르고 정확하게 분석할 수 있다.
본 발명자들은 종래 기술보다 간편하게 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하기 위해 PNA를 이용하여 각각 MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 야생형 및 돌연변이형을 포함하는 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브를 설계하고, 이들을 이용하여 높은 민감도와 특이도로 해당 유전형을 분석할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 MTHFR 유전자의 유전형 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 MTHFR 유전자의 유전형 분석 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제 1면은
(1) MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트와, 야생형 또는 돌연변이형의 해당 염기를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, MTHFR 유전자에 대해 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는;
단계를 포함하는, MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 2면은
서열번호 1 내지 25 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 본 발명에 따른 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 암 발생 또는 고호모시스테인혈증과 관련된 질병과 연관되어 있는 MTHFR 유전자의 677번 및 1298번 염기의 유전형을 우수한 민감도 및 특이도로 분석할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 분석하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 분석이 이루어지므로 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
도 1은 야생형 또는 돌연변이형 PNA 클램핑 프로브를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고;
도 2는 MTHFR 677번 염기의 야생형(677CC)과 돌연변이형(677TT)의 동형접합체와 이형접합체의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이며;
도 3은 MTHFR 1298번 염기의 야생형(1298AA)과 돌연변이형(1298CC)의 동형접합체와 이형접합체의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 2 내지 4의 PNA 프로브 또는 서열번호 12 내지 17의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 MTHFR 677번 염기의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이며;
도 5는 본 발명에 따른 서열번호 7 내지 11의 PNA 프로브 또는 서열번호 18 내지 22의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 MTHFR 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이고;
도 6은 본 발명에 따른 서열번호 4 및 13의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 MTHFR 677번 염기의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이며;
도 7은 본 발명에 따른 서열번호 8 및 24의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 MTHFR 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 것이다.
1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
본 발명의 PNA 프로브는 각각 MTHFR 유전자의 677번 염기의 야생형과 돌연변이형, 및 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형에 완벽하게 결합할 수 있는 것으로서, 13 내지 30개, 보다 바람직하게는 15 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 23개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 PNA 프로브는 각각 MTHFR 677번 염기와 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 1에 기재한 서열번호 1 내지 25 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인바, 본 발명에 따른 PNA 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 유전형을 효과적으로 분석할 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
서열번호 이름 서열(5'→3') Mer수
1 MTHFR C677T-1 ATGAAATCGGCTCCCGCAGA 20
2 MTHFR C677T-2 ATGAAATCGGCTCCCGCA 18
3 MTHFR C677T-3 TGAAATCGGCTCCCGCAG 18
4 MTHFR C677T-4 GAAATCGGCTCCCGCA 16
5 MTHFR C677T-5 GAAATCGGCTCCCGC 15
6 MTHFR C677T-6 GAAATCGGCTCCCGCA 16
7 MTHFR A1298C-1 AGACACTTTCTTCACTGGT 19
8 MTHFR A1298C-2 AGACACTTTCTTCACTGGTC 20
9 MTHFR A1298C-3 AAGACACTTTCTTCACTGGTC 21
10 MTHFR A1298C-4 AAGACACTTTCTTCACTGGTCAG 23
11 MTHFR A1298C-5 AAGACACTTTCTTCACTGGTCA 22
12 MTHFR 677T-1 ATGAAATCGACTCCCGCAGA 20
13 MTHFR 677T-2 ATGAAATCGACTCCCGCA 18
14 MTHFR 677T-3 TGAAATCGACTCCCGCAG 18
15 MTHFR 677T-4 GAAATCGACTCCCGCA 16
16 MTHFR 677T-5 GAAATCGACTCCCGC 15
17 MTHFR 677T-6 GAAATCGACTCCCGCA 16
18 MTHFR 1298C-1 AGACACTTGCTTCACTGGT 19
19 MTHFR 1298C-2 AGACACTTGCTTCACTGGTC 20
20 MTHFR 1298C-3 AAGACACTTGCTTCACTGGTC 21
21 MTHFR 1298C-4 AAGACACTTGCTTCACTGGTCAG 23
22 MTHFR 1298C-5 AAGACACTTGCTTCACTGGTCA 22
23 MTHFR 1298C-6 AAGACACTTGCTTCACTGG 19
24 MTHFR 1298C-7 GACACTTGCTTCACTGGTC 19
25 MTHFR 1298C-8 ACACTTGCTTCACTGGTC 18
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal)에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다 [Shakeel et al., J Chem Technol Biotechnol., 2006, 81, 892-899; Gildea et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 7255-7258; Demidov et al., PNAS., 2002, 99, 5953-5958; Wang et al., Anal Chem., 1997, 69, 5200-5202]. 구체적으로, 본 발명에서는 N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착되거나 또는 N-말단과 C-말단에 라이신(lysine)이 1개씩 부착된 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다[Dueholm et al., J Org Chem., 1994, 59, 5767-5773; Christensen et al., J Peptide Sci., 1995, 3, 175-183; Thomson et al., Tetrahedron., 1995, 51, 6179-6194].
2. MTHFR 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "MTHFR 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 미스매치가 존재하는) 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다.
본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 돌연변이형에 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 해당 야생형과 돌연변이형의 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브의 5' 부위의 9 내지 12개의 염기서열이 포함되도록 19mer 내지 21mer의 클램핑 프라이머를 설계하였다.
본 발명에서 예시된 서열번호 26 내지 31은 MTHFR 유전자의 677번 염기를 포함하여 증폭하도록 설계되었고, 서열번호 32 내지 36은 MTHFR 유전자의 1298번 염기를 포함하여 증폭하도록 설계되었다. 각각의 프라이머의 조합에 의한 증폭산물의 크기가 150bp가 넘지 않도록 고안되었다. 각 프라이머의 특성은 하기 표 2에 정리되어 있다.
서열번호 이름 방향 서열(5'→3') 길이(mer)
26 MTHFR C677T FC-R 역방향 tagccctggatgggaaagat 20
27 MTHFR C677T RC-F 정방향 tgacatctgtgtggcaggtt 20
28 MTHFR C677T RC-R 역방향 agctgcgtgatgatgaaatc 20
29 MTHFR C677T FC-F 정방향 ttgaaggagaaggtgtctgc 20
30 MTHFR C677T FC-R2 역방향 ctcacctggatgggaaagat 20
31 MTHFR C677T RC-F2 정방향 tattggcaggttaccccaaa 20
32 MTHFR A1298C FC-R2 역방향 ccactccagcatcactcactt 21
33 MTHFR A1298C FC-F 정방향 ggaggagctgaccagtgaag 20
34 MTHFR A1298C FC-R 역방향 ttcagcaggctggtctcag 19
35 MTHFR A1298C RC-F 정방향 tttggggagctgaaggacta 20
36 MTHFR A1298C RC-R 역방향 agaacgaagacttcaaagacactt 24
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 MTHFR 유전자의 유전형 분석
본 발명에 따른 MTHFR 유전자의 유전형 분석 방법은
(1) MTHFR 유전자의 677번 염기 또는 1298번 염기를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 클램핑 프라이머 세트와 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, MTHFR 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 MTHFR 유전자의 유전형을 결정하는 단계:
를 포함한다.
본 발명의 MTHFR 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비된다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액으로부터 DNA를 추출하여 준비된다.
본 발명의 실시간 PCR 클램핑 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라 함)로 나타내므로, 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 상기 방법은 전기영동 후 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화 및 수치화시켜 신속?간편하게 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 인터컬레이팅법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 결합해 형광을 발하게 되며 이 때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 분석방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, SYBR 그린 I 외에 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX 오렌지 등을 사용할 수 있다[Gudnason et al., Nucl Acids Res., 2007, 35, e127; Bengtsson et al., Nucl Acids Res., 2003, 31, e45; Wittwer et al., Clinical Chemistry., 2003, 49, 853-860].
본 발명에서는 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여, MTHFR 유전자의 유전형을 결정하는바, 증폭된 Ct값을 비교하여 MTHFR 유전자의 유전형을 확인할 수 있다. MTHFR유전자의 유전형은 하기 식 1에 의해 얻어지는 △Ct 값으로부터 확인한다.
[식 1]
△Ct = 양성대조 시료로부터 얻어진 Ct값 - 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값
[양성대조 시료: 프로브가 완벽하게 결합하는 유전자(야생형 프로브의 경우 야생형 유전자, 돌연변이형 프로브의 경우 돌연변이형 유전자) 시료]
야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브(야생형 프로브)가 MTHFR 유전자의 야생형에 혼성화되면 염기서열이 완벽하게 결합되어 증폭이 저해되어 높은 Ct값을 갖게 되며, 야생형 프로브가 돌연변이형 유전자에 혼성화되면 염기서열이 완벽하게 결합되지 않아 증폭이 일어나 낮은 Ct값을 갖게 되므로, △Ct값은 큰 값을 나타내게 된다. 반면, 돌연변이형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브(돌연변이형 프로브)가 돌연변이형 유전자에 혼성화되면 염기서열이 완벽하게 결합되어 증폭이 저해되어 높은 Ct값을 갖게 되며, 돌연변이형 프로브가 야생형 유전자에 혼성화되면 염기서열이 완벽하게 결합되지 않아 증폭이 일어나 낮은 Ct값을 갖게 되므로, △Ct값은 큰 값을 나타내게 된다. 도 1에 본 발명에 따른 야생형 또는 돌연변이형 PNA 클램핑 프로브를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 모식적으로 나타내었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형 PNA 프로브 합성
MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 야생형과 돌연변이형에 완벽하게 결합하는 25개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각각의 PNA 프로브는 야생형과 돌연변이형 유전자의 효과적인 분리를 위하여 해당 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464,261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다[Lee et al., Org Lett., 2007, 9, 3291-3293].
실시예 2: MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기의 클론 확보
아래 표 3에 나열한 프라이머의 조합으로 증폭된 PCR 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝(cloning)하였다. 클론들을 대장균 JM109에 형질전환하여 야생형 유전자를 대량확보하고, 클론 유전자를 시퀀싱(sequencing)하여 유전자형을 확인하였다. 확인된 야생형 유전자를 바탕으로 퀵체인지 부위-특이적 돌연변이유발 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타진(STRATAGENE Inc.), 미국)로 돌연변이 유전자를 제작하고, 대장균 JM109에 형질전환한 후 시퀀싱(sequencing)하여 변이 유무를 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형과 돌연변이형 클론은 본 발명의 PNA기반 실시간 PCR 클램핑의 대조군 검체로 사용하였다.
서열번호 이름 방향 서열(5'→3') 길이(mer)
37 MTHFR C677T-sequencing-F 정방향 ctttgaggctgacctgaagc 20
38 MTHFR C677T-sequencing-R 역방향 ctgggaagaactcagcgaac 20
39 MTHFR A1298C-sequencing-F 정방향 tttggggagctgaaggacta 20
40 MTHFR A1298C-sequencing-R 역방향 acaggatggggaagtcacag 20
41 MTHFR A1298C-sequencing-F2 정방향 cactgccctctgtcaggagt 20
42 MTHFR A1298C-sequencing-R2 역방향 acaggatggggaagtcacag 20
43 MTHFR A1298C RC-F 정방향 tttggggagctgaaggacta 20
44 MTHFR A1298C FC-R 역방향 ttcagcaggctggtctcag 19
실시예 3: MTHFR 유전자의 677번 염기와 1298번 염기를 증폭하기 위한 프라이머 합성
MTHFR 유전자에 속하는 677번 염기와 1298번 염기의 표적핵산 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머로는 677번 염기의 야생형 및 돌연변이형을 확인하기 위한 서열번호 29 및 30으로 이루어진 프라이머 한 세트와 1298번 염기의 야생형 및 돌연변이형을 확인하기 위한 서열번호 35 및 36으로 이루어진 프라이머 한 세트를 합성하였으며, 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 4: MTHFR 유전자의 유전형 분석을 위한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
상기 실시예 2의 클론 유전자를 이용하여 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법을 확립하고 최적의 PNA 프로브를 선정하였다.
주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타낸 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 ㎕, 2X IQ 사이버 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-Time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 70℃에서 20초, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.
도 2 및 3에 각각 야생형 및 돌연변이형 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 수행한 경우, MTHFR 유전자의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 분석 결과를 나타내었다. 상기 도면에 나타낸 결과로부터, 해당 유전자에 대한 야생형 프로브를 사용하는 경우, 야생형 유전자의 증폭은 억제되는 반면 돌연변이형 유전자의 증폭이 일어나고, 돌연변이형 프로브를 사용하는 경우, 돌연변이형 유전자의 증폭은 억제되는 반면 야생형 유전자의 증폭이 일어남을 알 수 있다. 아울러, 야생형과 돌연변이형의 이형 접합체의 경우 야생형의 동형 접합체와 돌연변이형의 동형 접합체와 유사한 증폭이 일어남을 알 수 있다.
실시예 5: PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 MTHFR 유전자의 검출한계 측정
유전자의 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하기 위하여 1 ㎕ 당 106, 105, 104, 103, 102, 101개의 표적핵산을 포함하는 주형 DNA 용액을 제조하고, 이들에 상기 실시예 4에서 확립된 실시간 PCR 클램핑 방법을 적용하여, 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출한계를 확인하였다.
도 4 내지 7에 각각 야생형 및 돌연변이형 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 수행한 경우, MTHFR 유전자의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도를 비교한 결과(도 4 및 5: △Ct, 도 6 및 7: 사이클 수와 △Ct)를 나타내었다. 상기 도면들에 나타난 바와 같이, 용액 내 상대적인 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치 값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소하여 용액 내 돌연변이 유전자의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for genotyping of MTHFR gene using PNA mediated Real-Time PCR clamping <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 atgaaatcgg ctcccgcaga 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 atgaaatcgg ctcccgca 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tgaaatcggc tcccgcag 18 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 gaaatcggct cccgca 16 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 gaaatcggct cccgc 15 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 gaaatcggct cccgca 16 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 agacactttc ttcactggt 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 agacactttc ttcactggtc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 aagacacttt cttcactggt c 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 10 aagacacttt cttcactggt cag 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 11 aagacacttt cttcactggt ca 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 12 atgaaatcga ctcccgcaga 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 13 atgaaatcga ctcccgca 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 14 tgaaatcgac tcccgcag 18 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 15 gaaatcgact cccgca 16 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 16 gaaatcgact cccgc 15 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 17 gaaatcgact cccgca 16 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 18 agacacttgc ttcactggt 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 19 agacacttgc ttcactggtc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 20 aagacacttg cttcactggt c 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 21 aagacacttg cttcactggt cag 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 22 aagacacttg cttcactggt ca 22 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 23 aagacacttg cttcactgg 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 24 gacacttgct tcactggtc 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 25 acacttgctt cactggtc 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tagccctgga tgggaaagat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 tgacatctgt gtggcaggtt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 agctgcgtga tgatgaaatc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ttgaaggaga aggtgtctgc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ctcacctgga tgggaaagat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 tattggcagg ttaccccaaa 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 ccactccagc atcactcact t 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 ggaggagctg accagtgaag 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ttcagcaggc tggtctcag 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 tttggggagc tgaaggacta 20 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 agaacgaaga cttcaaagac actt 24 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ctttgaggct gacctgaagc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ctgggaagaa ctcagcgaac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 tttggggagc tgaaggacta 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 acaggatggg gaagtcacag 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 cactgccctc tgtcaggagt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 acaggatggg gaagtcacag 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 tttggggagc tgaaggacta 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 ttcagcaggc tggtctcag 19

Claims (9)

  1. (1) MTHFR(Methylenetetrahydrofolate Reductase) 유전자의 677번 염기 또는 1298번 염기를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트와, 야생형 또는 돌연변이형의 해당 염기를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, MTHFR 유전자에 대해 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    (2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 MTHFR 유전자를 유전형을 분석하는:
    단계를 포함하는, MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 MTHFR 유전자의 유전형 분석은 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 야생형과 돌연변이형의 유전형을 분석하는 방법
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 15 내지 23mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 PNA 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 25로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 MTHFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 해당 유전자에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 MTHFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 27, 29 또는 31의 정방향 프라이머와 서열번호 26, 28 또는 30의 역방향 프라이머로 이루어지는 것이거나, 서열번호 33 또는 35의 정방향 프라이머와 서열번호 32, 34 또는 36의 역방향 프라이머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    MTHFR 유전자의 유전형 분석은 DNA 인터컬레이팅(interchalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 DNA 인터컬레이팅 형광물질은 사이버 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  9. 서열번호 1 내지 25 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA 클램핑 프로브:
    를 포함하는, 제4항에 따른 MTHFR 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트.
KR1020100086969A 2010-09-06 2010-09-06 Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｍｔｈｆｒ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트 KR101927884B1 (ko)

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