KR101388702B1

KR101388702B1 - Ｅｇｆｒ 돌연변이 검출을 위한 다중 ｐｃｒ 용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR101388702B1
Application number: KR1020120100273A
Authority: KR
Inventors: 이명훈; 이수빈; 한상미; 이형경
Original assignee: 주식회사 디앤피바이오텍
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-04-24
Also published as: KR20140033854A

Abstract

본 발명은 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 목적으로 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21에 나타난 돌연변이를 한 번에 분석하기 위한, 다중 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 EGFR 돌연변이 검출 키트, 및 EGFR 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.

Description

ＥＧＦＲ 돌연변이 검출을 위한 다중 ＰＣＲ 용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 {Multiplex PCR primer set for detecting EGFR mutant and kit comprising the same}

폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망에서 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인중의 하나이다. 이 중 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다.

폐암은 상피세포들의 비정상적인 가속화된 성장을 특징으로 하는 상피세포암(epithelial cell cancer)의 일종으로, 상피세포의 표면에 발현되는 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; 이하 "EGFR")가 암화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. EGFR 은 인체 내 상피성 수용체인 타이로신 키나아제(tyrosine kinase)에 속하는 세포막 당단백으로, 자체 타이로신 키나아제 활성을 가지고 있는데, 이것이 활성화되면 유전자 발현, 세포 증식, 주변 조직에 대한 침범, 세포사멸사 억제 및 혈관 신생 등의 효과를 유발한다.

따라서, EGFR 은 폐암 치료의 표적으로 인식되어 왔으며, EGFR 을 표적으로 하는 암 치료법의 대표적인 예로, EGFR 타이로신 키나아제 저해제(EGFR tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI)의 개발을 들 수 있다. 현재 폐암, 특히 비소세포폐암 치료에 유용한 타이로신 키나아제 억제제로서 제피티닙(gefitinib, Iressa) 과 엘로티닙(erlotinib, Tarceva)이 개발되어 있다.

그런데, 상기 EGFR 타이로신 키나아제 저해제들은 임상에 적용시 많은 환자들에게서 내성을 나타내거나 처음부터 반응을 나타내지 않으며, 진행된 폐암 환자들 중 단지 10 내지 15% 만이 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 것으로 알려져 있다. 이에 대한 종래의 연구 결과, EGFR의 키나아제 도메인에서의 체세포 돌연변이의 존재가 EGFR 키나아제 저해제 약물의 민감성을 현저하게 증가시킨다는 것이 발견되었다. 상기 EGFR 돌연변이는 여성, 아시아인, 비흡연자, 및 선암(adenocarcinoma)성 폐암 환자에서 주로 관찰되며, 이러한 돌연변이의 존재는 약물 반응성 및 환자의 예후와 관계가 있다. EGFR 의 돌연변이는 주로 엑손 18 내지 엑손 21번에서 대부분 관찰되며, 그 중에서도 엑손 19 내의 인-프레임 결실이나 엑손 21 내의 L858R 점돌연변이가 가장 흔한 돌연변이형이다. EGFR 돌연변이가 있는 비소세포폐암 환자는 EGFR 돌연변이가 없는 비소세포 폐암 환자에 비하여 EGFR 키나아제 저해제 약제에 대한 반응성이 현저하게 우수하여 유의한 생존률의 증가가 보고되었다.

이와 같이, EGFR 돌연변이의 존재는 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 EGFR 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.

지금까지, EGFR 돌연변이의 검출을 위하여 가장 많이 사용되는 방법 중 하나는 직접 염기서열분석법으로, EGFR 의 엑손 18번 내지 21번에 해당하는 유전자의 염기서열을 직접 확인하는 것이다. 이 방법은 실시간 중합효소연쇄반응(realtime- polymerase chain reaction)이나 DNA 칩 분석에 비하여 시간은 많이 소요되는 단점이 있으나, 특정 염기만이 아니라 표적부위 전체의 염기분석이 가능하다는 점에서 가장 정확한 분석이 가능하다는 장점을 가진다.

직접 염기서열분석을 위하여서는 특정 서열의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응이 우선되어야 한다. 이 반응은 이미 알고 있는 유전자 염기서열에서, 그 서열의 말단에 상보적인 염기들로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 그 사이에 있는 유전자를 짧은 시간 안에 수 십만 배 이상 증폭을 시키는 것이다. 그런데 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20, 21은 총 염기의 길이가 17,954bp로, 단일 중합효소연쇄반응을 통해 한 번에 증폭하는 것이 불가능한 크기이다. 또한, EGFR 돌연변이 검사에 사용되는 시료는 환자의 생체조직으로 파라핀으로 고정이 되어 있는데, 파라핀에서 추출한 DNA는 혈액에서 추출한 DNA에 비해 절편화가 많이 이루어져 있는 특징이 있어, 중합효소연쇄반응 산물의 크기가 300bp 미만일 때 DNA의 증폭이 잘 일어난다. 따라서, 엑손 18, 19, 20, 21을 모두 증폭시키기 위해서는 4번의 단일 중합효소연쇄반응이 필요한데, 폐암 환자에게서 얻어지는 생체조직은 수술조직에 비해서 그 양이 현저히 적으므로 여러 번의 중합효소연쇄반응을 위한 충분한 양이 되지 않는 문제가 있다.

이에, 국내특허공개 제10-2011-0098440호는 EGFR 돌연변이 위치에 상응하는 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 기술을 제공하고 있으나, 이 방법은 엑손 18, 19, 20, 21에서 나타나는 돌연변이를 모두 검출해 내지 못한다는 한계를 가지고 있으며, 특히 돌연변이 검출 여부를 확인하기 위하여 여러 개의 PNA 프로브와 반응시켜야 하기 때문에 시료의 양이 많이 든다는 단점을 가진다.

이에, 본 발명자들은 폐암의 약물 감수성을 검정하기 위하여 보다 효과적이고 신속하게 EGFR 돌연변이를 검출하기 위하여, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR, 이하 편의상 "다중 PCR"이라 함)을 적용하여 엑손 18, 19, 20, 21 을 한 번에 증폭시키는 기술을 고안하게 되었다. 다중 PCR 은 여러 가지 유전자를 동시에 증폭하는 방법으로써, 하나의 반응 용기에서 한꺼번에 반응이 이루어지므로 경제적이며 시간과 노동력을 크게 줄일 수 있다. 다중 PCR 반응을 위해서는 유전자 증폭 시작 부위의 염기로 이루어지는 프라이머들을 디자인할 때, 각각의 프라이머들이 특정 유전자 조각만을 증폭시키고, 각각의 유전자 조각의 증폭이 다음 단계의 분석에 충분할 만큼 이루어져야 하고, PCR 반응시 프라이머 간의 방해가 없어야 하는 등의 조건을 만족시켜야 한다.

본 발명자들은 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21에서 나타나는 돌연변이를 한번에 검출할 수 있는 다중 PCR 용 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용할 경우 돌연변이의 검출률이 기존에 보고된 것보다 현저히 증가하고 분석 감도가 향상된다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 기반의 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21에 나타난 돌연변이를 한 번에 분석할 수 있는 다중 중합효소연쇄반응 기반의 분석법을 제공한다. 본 발명에 의하여 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21에 나타난 돌연변이의 동시 분석이 가능하며, 본 발명에 의해 검출된 EGFR 돌연변이의 유무는 폐암 환자의 타이로신 키나아제 저해제 처방의 중요 지표로 작용 가능함으로써 폐암 환자의 효율적인 치료를 가능하게 할 수 있다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 본 발명은

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍,

서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍,

서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍, 및

서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는,

폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 기반의 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 본 발명은

(a) 폐암 환자의 시료로부터 핵산을 추출하는 단계,

(b) 상기 추출한 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 다중 PCR 을 수행하는 단계, 및

(c) 상기 다중 PCR 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는,

폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20, 21에 나타난 돌연변이를 한 번에 분석하기 위한 다중 PCR용 프라이머 및 이를 이용한 다중 PCR 기반의 분석법에 관한 것으로, 바람직하게, 본 발명에 의해 검출 가능한 EGFR 유전자 돌연변이는 EGFR 유전자의 엑손 18번, 19번, 20번 및 21번의 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이이다.

보다 바람직하게, 엑손 18에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 2155의 구아닌이 아데닌으로 치환된 결과(2155G>A 로 명명), 코돈 719의 야생형 글리신이 세린으로 치환된 돌연변이(G719S 로 명명)를 포함한다.

또한, 엑손 19에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 2236 과 뉴클레오티드 2250 사이의 15mer의 뉴클레오티드가 결실된 결과(2236_2250del15 로 명명), 코돈 746의 글루탐산 내지 750의 알라닌의 결실된 돌연변이(E746_A750del 로 명명)를 포함한다.

또한, 엑손 20에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 2307과 뉴클레오티드 2308 사이에 15mer의 뉴클레오티드가 삽입된 결과(2307_2308ins9 로 명명), 코돈 769의 발린과 770의 아스파르트산 사이에 알라닌-세린-발린(ASV)이 삽입된 돌연변이(V769_D770insASV 로 명명)를 포함한다.

또한, 엑손 21에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로 치환된 결과(2573T>G 로 명명), 코돈 858의 야생형 류신이 아르기닌으로 치환된 돌연변이(L858R 로 명명)를 포함한다.

본 발명의 용어, '프라이머' 란 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 NTP(nucleoside triphospate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명의 용어, 'EGFR 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트' 란 EGFR 의 엑손 18 내지 21에 존재하는 돌연변이를 검출하기 위하여, EGFR 의 엑손 18 내지 21의 각 돌연변이 부위에 특이적으로 결합하여 신장 반응을 일으킬 수 있는 프라이머 쌍들로 구성된 집합을 말하며, 바람직하게 각 프라이머 쌍들은 7 내지 50 개의 올리고 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산 서열로 구성되어 있다. 상기 각 프라이머 쌍은 EGFR 유전자의 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 EGFR 유전자에 대해서는 생성하지 않는다.

보다 바람작하게, 본 발명의 프라이머 세트는, EGFR 의 엑손 18의 돌연변이를 검출하기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍, EGFR 의 엑손 19의 돌연변이를 검출하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍, EGFR 의 엑손 20의 돌연변이를 검출하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍, EGFR 의 엑손 21의 돌연변이를 검출하기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 프라이머 쌍은 각각 EGFR 의 엑손 18번 내의 G749S 치환 돌연변이, 엑손 19번 내의 E746-A750 의 결실 돌연변이, 엑손 20번의 V769-D770 의 ASV 삽입 돌연변이, 및 엑손 21번의 L858R 치환 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이다.

본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, Tm값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복 금지 등을 충분히 고려하고, EGFR 돌연변이 검출의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.

또한, 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 네 쌍의 프라이머 쌍은, 각각 특정 유전자 조각만을 증폭시키고, 각각의 유전자 조각의 증폭이 다음 단계의 분석에 충분할 만큼 이루어지며, PCR 반응시 프라이머 간의 방해가 없이 각 유전자 부위를 동시에 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 네 쌍의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기의 PCR 증폭 산물을 형성함으로써, EGFR 엑손 18 내지 21에 해당하는 각 돌연변이의 유무를 보다 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명의 용어, 'EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트' 란, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 세트를 포함하며, 다중 PCR 을 통해 EGFR 유전자의 엑손 18 내지 21 상의 돌연변이 유무를 동시에 검출함으로써 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하는데 사용할 수 있는 키트를 말한다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트 외에 통상적으로 PCR 반응 및 염기서열 분석에 필요한 물질들을 더 포함시킬 수 있다. 예를 들어, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 반응 완충액, 증류수 등으로 구성된 PCR 반응 혼합물을 포함할 수 있으며, PCR 산물의 검출 여부를 확인할 수 있는 아가로스 및 전기영동 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 용어, 'EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법' 이란, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 법에 의하여 EGFR 유전자의 엑손 18~21 상의 돌연변이 유무를 동시에 검출함으로써 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하는 데 사용되는 방법을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법은, (a) 폐암 환자의 시료로부터 핵산을 추출하는 단계, (b) 상기 추출한 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 다중 PCR 을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 다중 PCR 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (a) 에서, '폐암 환자의 시료' 란 폐암 환자에서 유래한 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액, 혈액 등의 시료일 수 있다. 또한, 상기 폐암 환자의 시료로부터 추출된 핵산은, 검출하고자 하는 유전자 돌연변이가 존재하는 표적 유전자인 EGFR 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 핵산으로서, DNA 또는 RNA 일 수 있으며, 엑손 18~21 부위를 포함하는 약 5 내지 1,000,000 bp, 바람직하게는 약 5 내지 100,000 bp, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 5000 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 단계 (b) 에서 다중 PCR은 상기에서 추출한 핵산을 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 변성, 어닐링 및 합성 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 말한다. 바람직하게, 다중 PCR은 폐암 환자 시료에서 추출한 핵산을 주형으로 하여, 본 발명의 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTP, 반응 완충액, 증류수 등으로 구성된 PCR 반응 혼합물을 처리하여 수행할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 네 쌍의 프라이머 쌍은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것이 가능하다. 구체적인 PCR 조건으로는 90~95℃에서 5~20분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계 (denaturation); 58~60℃에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 70~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~40회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 94℃에서 15분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 10초씩 30번 반복한 다음 72℃에서 10분 반응시킬 수 있다.

상기 단계 (c) 은 다중 PCR 결과를 분석하여 EGFR 돌연변이 유무를 검출하는 단계로, 다중 PCR 증폭 산물의 크기 또는 염기서열 분석을 통하여 돌연변이를 검출할 수 있다.

다중 PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 네 쌍의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기의 PCR 증폭 산물을 형성하므로, EGFR 엑손 18~21에 해당하는 각 돌연변이의 유무를 보다 용이하게 확인할 수 있다.

염기서열 분석 방법으로는 당업계에 공지된 염기서열 분석방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 그 서열 부분을 직접 결정하는 방법으로서 자동염기서열분석기를 사용하거나 생거법(sanger sequencing) 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 확인된 EGFR 돌연변이 유무는 약물 처방에 대한 폐암, 특히 비소세포폐암 치료의 예후를 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명은 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 타이로신 키나아제 억제제에 대한 반응성 및 예후를 예측하는데 유용하다.

바람직하게, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 결과 증폭 산물이 전혀 생성되지 않은 경우 타이로신 키나아제 억제제 약물이 양성적으로 반응하지 않는 것으로 판단할 수 있으며, 하나 이상의 증폭 산물이 생성된 경우 타이로신 키나아제 억제제 약물이 양성적으로 반응하여 예후가 좋은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21에 대하여 각각 단일 PCR과 다중 PCR을 수행한 후 전기영동을 통해 비교한 결과, 단일 PCR의 경우와 비교하여 다중 PCR 결과에서 동일한 증폭산물의 크기가 나타남을 확인할 수 있었으며 (도 1), 단일 PCR과 다중 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 키트를 이용하여 EGFR 유전자 검진을 받은 비소세포폐암 환자 162명의 임상 샘플로부터 EGFR 돌연변이를 검출한 결과, 돌연변이 검출률이 40.1%로 나타났다. 지난 2009년에 대한병리학회 산하 심폐병리 연구회가 EGFR 유전자 검진을 받은 전국 15개 병원 1,753명의 비소세포폐암 환자를 대상으로 『한국 폐암 환자의 EGFR 유전자 돌연변이 발현율』을 조사한 결과, 전체 환자의 34.3%에서 EGFR 돌연변이가 발견된 것으로 나타난 것으로 보고된 바 있는데, 본 발명은 이러한 종전의 보고와 비교해 볼 때, EGFR 돌연변이를 검출률을 11.69% 나 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 이는 본 발명의 프라이머 세트가 이전에 제작된 다른 프라이머와 비교하여 성능이 우수함을 보여주는 것이다.

나아가, 야생형 DNA에 대한 돌연변이형 DNA의 비율을 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%로 정하여 본 발명 키트의 분석적 감도를 평가한 결과, 돌연변이의 비율이 10%인 것에서부터 돌연변이가 검출되었다 (도 2 및 도 3).　이와 관련하여, 종래의 연구 결과에서는　돌연변이 DNA의 농도가 25% 이상일 경우에 비로소 염기서열 분석 결과 돌연변이가 발견될 수 있다고 보고된 바 있는데(J Thorac Oncol. 2012 Feb;7(2):355-64), 본 발명은 이러한 종전의 보고와 비교해 볼 때, 25%보다도 훨씬 낮은 돌연변이 DNA 비율 10%에서도 돌연변이를 검출할 수 있어 본 발명 키트의 민감도가 매우 뛰어남을 보여준다.

이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 PCR 기반의 EGFR 돌연변이 검출 기법은 종래의 단일 PCR 기반의 검출법에 비하여 특이성, 정확성, 정밀성 및 민감성이 우수할 뿐만 아니라, 많은 반응을 하나의 반응 용기 내에서 수행하므로 시간과 노동력을 크게 줄일 수 있는 경제적이고 효율적인 장점이 있다.

본 발명의 다중 PCR 방법 및 이 PCR 방법에 사용되는 프라이머는 종래의 PCR 방법 및 프라이머에 비해 특이성 및 민감성이 우수할 뿐만 아니라 빠르고 정확하게 EGFR 돌연변이를 검출할 수 있는 우수한 효과가 있다. 본 발명에서 확인된 EGFR 돌연변이 유무는 약물 처방에 대한 폐암 치료의 감수성 및 예후를 예측하는데 유용한 정보를 제공하며, 특히, 본 발명의 방법은 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 타이로신 키나아제 억제제의 예후를 예측하는데 유용하다.

도 1은 단일 PCR 산물과 다중 PCR 산물을 비교한 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1은 엑손18(150bp), 레인 2는 엑손19(204bp), 레인 3은 엑손20(262bp), 레인 4는 엑손21(289bp)의 단일 PCR 증폭 산물을 나타내며, 레인 5는 엑손18, 19, 20, 21의 다중 PCR 증폭 산물을 나타낸다.
도 2는 야생형 DNA에 대한 엑손 18 및 19에서의 돌연변이형 DNA의 비율을 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%로 정하여 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 야생형 DNA에 대한 엑손 20 및 21에서의 돌연변이형 DNA의 비율을 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%로 정하여 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 프라이머 세트의 제작

EGFR 유전자의 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 EGFR 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위하여, Primer3Plus 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내에서 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 8개의 프라이머를 디자인하였다. 이 때 각 프라이머 쌍에 의한 엑손 18, 19, 20, 21의 PCR 증폭 산물의 크기가 서로 차이가 나도록 설계하여 전기영동시 확인이 용이하도록 하였다. 디자인된 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타내었다.

엑손		염기서열	증폭산물의 크기(bp)
18	정방향	5'-CCCCAGCTTGTGGAGCCTCT-3'(서열번호1)	150
18	역방향	5'-GGCCTGTGCCAGGGACCTTA-3'(서열번호2)	150
19	정방향	5'-TGCCAGTTAACGTCTTCCTT-3'(서열번호3)	204
19	역방향	5'-GCCAGACATGAGAAAAGGTG-3'(서열번호4)	204
20	정방향	5'-ACCATGCGAAGCCACACT-3'(서열번호5)	262
20	역방향	5'-TATCTCCCCTCCCCGTATCT-3'(서열번호6)	262
21	정방향	5'-ATGATCTGTCCCTCACAGCAG-3'(서열번호7)	289
21	역방향	5'-CCTCCCCTGCATGTGTTAAA-3'(서열번호8)	289

실시예 2. 표준물질의 제작

돌연변이가 있는 것으로 확인된 조직에서 추출한 DNA에 대하여 제작된 프라이머 세트를 적용하여 EGFR 엑손 18, 19, 20, 21의 유전자를 각각 증폭하였다. 엑손 18, 19, 20, 21의 증폭된 핵산을 T-Blunt vector(Solgent, KR)를 이용하여 E.Coli DH5α 세포에 형질전환하여 각 엑손의 야생형 DNA와 돌연변이형 DNA를 확보하였다. 엑손 21이 증폭된 핵산은 pTOP TA2 vector(Enzynomics, KR)를 이용하여 E.Coli DH5α 세포에 형질전환하여 야생형 클론과 돌연변이형 클론을 확보하였다. 야생형 클론과 돌연변이형 클론의 확인은 직접 염기서열분석법에 의해 확인하였다. 클론을 통해 추출된 엑손 18, 19, 20, 21의 야생형 DNA와 돌연변이형 DNA는 EGFR 돌연변이 검출 키트의 성능을 평가하기 위한 표준물질로 사용하였다.

표준물질로 사용된 돌연변이의 종류는 표 2에 나타내었다.

번호	엑손	아미노산 변화	염기의 변화
1	18	p.G719S	c.2155G>A
2	19	p.E746_A750del	c.2236_2250del15
3	20	p.V769_D770insASV	c.2307_2308ins9
4	21	p.L858R	c.2573T>G

실시예 3. 다중 중합효소연쇄반응

표준물질로 제작된 주형 DNA 용액(0.1ng/ul) 10ul, 표 1에 나타난 프라이머 혼합물(2pmol/ul) 5ul, 2X Multiplex PCR Master Mix(Qiagen) 25ul, 증류수 10ul를 한 개의 튜브에 모두 넣어서 섞어주었다. DNA 증폭기(PCR machine)를 이용하여 94도에서 15분간 변성시킨 후, 94도에서 30초, 60도에서 60초, 72도에서 10초씩 30번 반복한 다음 72도에서 10분 반응시키고, 4도에서 보관하였다. DNA의 증폭 여부는 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 확인하였다.

엑손 18, 19, 20, 21의 단일 중합효소연쇄반응과 다중 중합효소연쇄반응을 하고 난 후 전기영동을 통해 비교한 것은 도 1에 나타내었다. 1번, 2번, 3번, 4번 레인은 단일 중합효소연쇄반응의 산물의 전기영동결과이며, 5번 레인은 다중 중합효소연쇄반응 산물의 전기영동결과이다. 다중 중합효소연쇄반응 결과 단일 중합효소연쇄반응을 했을 때와 비교하여 동일한 증폭산물의 크기가 나타남을 확인할 수 있다. 또한, 단일 중합효소연쇄반응과 다중중합효소연쇄반응산물은 염기서열 분석을 통해 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명의 키트를 이용하여 EGFR 유전자 검진을 받은 비소세포폐암 환자 162명의 임상 샘플로부터 EGFR 돌연변이를 검출한 결과, 돌연변이 검출률이 40.1%로 나타났다 (표 3).

	EGFR 돌연변이	야생형(wild)
검출률	62건 (40.1%)	97건 (59.9%)

지난 2009년에 대한병리학회 산하 심폐병리 연구회가 EGFR 유전자 검진을 받은 전국 15개 병원 1,753명의 비소세포폐암 환자를 대상으로『한국 폐암 환자의 EGFR 유전자 돌연변이 발현율』을 조사한 결과, 전체 환자의 34.3%에서 EGFR 돌연변이가 발견된 것으로 나타난 것으로 보고된 바 있는데, 본 발명은 이러한 종전의 보고와 비교해 볼 때, EGFR 돌연변이를 검출률이 11.69% 나 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 이는 본 발명의 프라이머 세트가 이전에 제작된 다른 프라이머와 비교하여 성능이 우수함을 보여주는 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍,
서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍,
서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍, 및
서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는,
폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
(a) 폐암 환자의 시료로부터 핵산을 추출하는 단계,
(b) 상기 추출한 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계, 및
(c) 상기 다중 중합효소연쇄반응 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는,
폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법.
제3항에 있어서, 상기 EGFR 유전자 돌연변이는 EGFR 유전자의 엑손 18번, 19번, 20번 및 21번 내에서의 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 EGFR 유전자 돌연변이는 EGFR 의 엑손 18번 내에서의 코돈 749의 아미노산인 글리신의 치환, 엑손 19번 내에서의 코돈 746, 747, 748, 749 및 750의 아미노산인 글루탐산, 류신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌의 결실, 엑손 20번 내에서의 코돈 769의 아미노산인 발린과 770의 아미노산인 아스파르트산 사이에 아미노산 삽입, 및 엑손 21번 내에서의 코돈 858의 아미노산인 류신의 치환을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암인 방법.
제3항에 있어서, 상기 약물은 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor)인 방법.
제3항에 있어서, 상기 약물은 제피티닙(gefitinib) 또는 엘로티닙(erlotinib)인 방법.
제3항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 인 방법.