KR20120140252A - Ｋｒａｓ 프라이머 및 프로브 - Google Patents

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KR20120140252A
KR20120140252A KR1020127028176A KR20127028176A KR20120140252A KR 20120140252 A KR20120140252 A KR 20120140252A KR 1020127028176 A KR1020127028176 A KR 1020127028176A KR 20127028176 A KR20127028176 A KR 20127028176A KR 20120140252 A KR20120140252 A KR 20120140252A
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dna
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KR1020127028176A
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크레이그 스테펜스
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리스판스 지네틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 KRAS 유전자의 변이를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 사용하여 KRAS 유전자에서 변이를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 더욱이 본 발명은 표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제에 대한 환자의 종양의 감수성을 예측하기 위한 방법을 포함하고 상기 방법은 종양으로부터 DNA를 얻는 단계; 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브 중 적어도 하나를 이용하는 방법을 사용하여 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 12의 변이 및/또는 코돈 13의 변이가 있는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.

Description

ＫＲＡＳ 프라이머 및 프로브 {KRAS Primers and Probes}
본 출원은 2010년 4월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/323,114호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 개시 사항은 참조문헌으로 본원에 통합되어 있다. 본 발명은 DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브 및 이를 이용하여 KRAS 변이를 검출하는 방법 및 표피 성장 인자 수용체-지정(directed) 화학요법제에 대한 암의 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 암 성장에 중요한 역할을 하는 티로신 키나아제이다. 예를 들어, 전이성 결장암(CRC)을 갖는 환자의 종양 중 85%를 초과하는 종양에서 EGFR의 과발현이 관찰된다. 문헌[Lee JJ and Chu E, Clin Colorectal Cancer 2007; 6 Suppl 2:S42-6]을 참조하라. EGFR을 표적으로 하는 항암 약물이 개발되어 왔다. 세툭시맵(cetuximab) 및 파니툼맵(panitumumab)은 전이성 CRC를 위한 2차 용도 및 옥살리플라틴 및 이리노테칸-기반의 치료요법과 조합된 1차 용도에 있어서 유망한 치료 효과를 나타내는 두 가지 EGFR 억제제이다. 문헌[Lee JJ and Chu E, Clin Colorectal Cancer. 2007; 6 Suppl 2:S42-6; Zhang W, et al., Ann Med. 2006; 38: 545-51]을 참조하라. 그러나 모든 환자들이 세툭시맵 및 파니툼맵에 반응하는 것은 아니다.
라스(Ras) 유전자인 H-ras, K-ras(KRAS) 및 N-ras는 EGFR 신호전달 경로와 관련된 작은 GTPase를 암호화한다. 엑손 2 내의 중요한 코돈 12, 13, 또는 61 가운데 하나의 코돈에서의 KRAS 유전자의 점 돌연변이는 종양 성장을 촉진한다. KRAS 변이는 결장선암의 약 37%에서 발생한다. 문헌[Brink M, et al., Carcinogenesis 2003; 24: 703-10]을 참조하라. 변이된 K-ras 유전자와 세툭시맵 및 파니툼맵 치료요법 모두에 대한 반응성 결여로 인한 환자의 짧은 생존 간에는 높은 상호 관련성이 알려져있다. KRAS 변이의 존재는 세툭시맵 또는 파니툼맵에 대한 반응성이 없음이 매우 높게 예측될 수 있기 때문에, 변이된 KRAS를 지니는 환자들은 이들 EGFR 억제제를 이용한 앞으로의 화학요법제를 고려해 보아야 한다.
KRAS 변이는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, DNA는 예를 들면 냉동된 조직 시료로부터 표준 프로티나아제 K에 의한 절단 및 페놀-클로로포름 추출법에 의해 추출되어 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켜 이후 상기 PCR 산물의 서열분석에 의해 KRAS 변이를 검출할 수 있다. 문헌[Tam IY, et al., Clin Cancer Res. 2006; 12(5): 1647-53]을 참조하라.
KRAS 변이는 또한 증폭 불응성(refractory) 변이 시스템 PCR(ARMS PCR)로 검출될 수도 있다. 대립 유전자-특이적 PCR(ASP) 또는 특이적인 대립 유전자의 PCR 증폭 (PASA)으로도 불리는 ARMS PCR은 단일 염기 변이를 검출할 수 있는 PCR 기반의 방법이다. 문헌[Newton et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17(7): 2503-16]을 참조하라. ARMS PCR에서, PCR 프라이머 중 하나의 3' 말단이 표적 변이와 일치한다. ARMS PCR은 불일치 복구(mismatch repair)에 필요한 3' 엑소뉴클레아제 활성(일반적으로 Taq 폴리머라제)이 결핍된 폴리머라제를 이용하기 때문에, 원칙적으로 ARMS PCR은 표적 변이를 갖는 DNA 주형(template)만을 증폭시킬 것이다. 증폭된 산물의 존재가 특정 변이의 존재를 표시하기 때문에, ARMS는, 예컨대 아가로스 겔 전기영동에 의해 반응 혼합물을 검출하는 것 만으로 변이 검출이 가능하게 한다. 문헌[Newton et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17(7): 2503-16; Bottema, CD, et al., Methods Enzymol. 1993; 218: 388-402]을 참조하라.
본 발명은 다음에서 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공한다:
(a) GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:1)(이하 "13ASP 역방향 프라이머" 또는 "Kras38A_2GT-R"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(b) GGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:2)(이하 "C13 정방향 프라이머" 또는 "KrasC13-F4"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(c) 6FAM-CAACTACCACAAGTTT (서열번호:3)(이하 "C13 프로브" 또는 "KrasC13-Mc2 ")의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(d) AGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:4)(이하 "Kras38A_3TG-R"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(e) GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:5)(이하" KrasC13-F"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(f) 6FAM-CTCCAACTACCACAAGTT (서열번호:6)(이하 "KrasC13_Mc"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(g) CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호: 7)(이하 "13ASP 정방향 프라이머" 또는 "Kras38A_1GA-F"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(h) AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호: 8)(이하 "12VAL 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(Ⅰ) GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호: 9)(이하 "KrasM35T_1GA-F"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(j) TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호: 10)(이하 "Kras35T_3CG-F"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(k) TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA (서열번호: 11)(이하 "KrasEx4 대조군 정방향 프라이머" 또는 "KrasEx4_C-F"로도 칭함) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(l) GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA (서열번호: 12)(이하 "KrasEx4 대조군 역방향 프라이머" 또는 "KrasEx4_C-R"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(m) 6FAM-TAGAAGGCAAATCACA (서열번호: 13)(이하 "KrasEx4 대조군 프로브" 또는 "KrasEx4_C-M"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(n) TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:14)(이하 "12SER 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(o) AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:15)(이하 "12ARG 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(p) TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:16)(이하 "12CYS 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(q) AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:17)(이하 "12ASP 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(r) AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:18)(이하 "12ALA 정방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(s) CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:19)(이하 "C12 공통 역방향 프라이머"로도 칭함)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(t) 6FAM-TCAAGGCACTCTTGCCT (서열번호:20)(이하 "C12 공통 프로브"로도 칭함)로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 하나의 측면은 본 발명의 상기 기재된 (a) 내지 (t)의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 적어도 하나를 포함하는 키트이다.
본 발명은 다음 단계로 이루어진 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 방법을 제공한다:
(1) 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제 및 하기를 사용하여 DNA를 PCR로 증폭시키는 단계:
(Ⅰ) 대조군 시험(assay)을 위한 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KRAS 유전자의 엑손 4의 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 상기 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호:11로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasEx4 대조군 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호:12로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasEx4 대조군 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(Ⅱ) 변이 시험을 위한 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 한 쌍의 상기 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KRAS 유전자의 엑손 2에 위치한 코돈 12에서 변이 및/또는 코돈 13에서 변이를 갖는 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 상기 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기의 프라이머 세트로부터 선택된다:
(A) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
(i) (a) 서열번호:1(Kras38A-2GT-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 13ASP 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 역방향 프라이머, 및
(ⅱ) (a) 서열번호:2 (KrasC13-F4)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 정방향 프라이머;
(B) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
(i) 서열번호:7 (13ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는
(C) 다음의 적어도 한 쌍의 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
(i) 다음에서 선택된 적어도 하나의 정방향 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(2) 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물이 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계로서, 예를 들면 엑손 4의 DNA 영역이 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버에 이르는 범위 내에 포함되는지 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버의 상보적인 영역으로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버의 상보적 영역에 이르는 범위 내에 포함되는지를 결정하는 것으로 증폭 산물의 검출은 DNA 내의 KRAS 유전자의 존재를 나타냄을 특징으로 하는 결정 단계; 및
(3) 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계로서, 예를 들면 엑손 2의 DNA 영역이 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버까지의 범위 내에 포함되는지 또는 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버의 상보적인 영역으로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버의 상보적 영역에 이르는 범위 내에 포함되는지를 결정하는 것에 있어서,
(a) 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍이 단계 (1)(Ⅱ) 에서 사용될 때의 증폭 생성물의 검출은 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13에서 변이의 존재를 나타내고/내거나;
(b) 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍이 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용될 때의 증폭 생성물의 검출은 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12에서 변이의 존재를 나타내는 단계.
로 이루어진 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제에 대한 환자의 종양의 감수성을 예측하는 방법을 제공한다:
(1) 종양으로부터 DNA를 얻는 단계; 및
(2) 본 명세서에서 개시된 DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법을 사용하여 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 12의 변이 및/또는 코돈 13의 변이가 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 상기 코돈 12의 변이 및/또는 코돈 13의 변이의 검출은, 종양이 코돈 12 및 코돈 13에서 변이를 갖지 않는 동일한 유형의 종양과 비교하여 표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제에 대해 감소된 감수성을 갖는다는 것을 예측하는 단계;
로 이루어진 환자의 종양의 감수성을 예측하는 방법을 제공한다.
KRAS 유전자 내의 변이의 존재는 EGFR 지정된 화학요법제, 예컨대 세툭시맵 및 파니툼맵과 같은 EGFR 억제제를 이용한 종양 치료에 대한 종양 환자의 반응성이 없음을 높게 예측한다. 본 발명은 DNA 내 KRAS 변이를 정확 신뢰성 있게 검출하기 위해 PCR에서 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로 이용하여 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성을 포함하는 당해 기술분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "KRAS"는, 달리 명시하지 않는 한, 인간의 키르스텐(Kirsten) 라스(ras) 종양유전자를 지칭한다. KRAS의 뉴클레오티드 서열은 널리 알려져 있다. KRAS의 두 가지 이소폼(isoform)이 존재하며 및 상기 두 가지 이소폼의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에서 은 NM_033360 및 NM_004985으로 찾을 수 있고, 이들의 내용이 참조문헌에 의해 본원에 혼입되어 있다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일련의 연결된 뉴클레오티드 잔기를 지칭하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 프라이머 또는 프로브로 사용되기에 충분한 개수의 뉴클레오티드 잔기를 갖는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표지(label), 예를 들어, 형광성 표지를 포함하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1 (13ASP 역방향 프라이머), 서열번호: 2 (C13 정방향 프라이머), 서열번호: 4 (Kras38A_3TC-R), 서열번호: 5 (KrasC13-F), 서열번호: 7 (13ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 8 (12VAL 정방향 프라이머), 서열번호: 9 (KrasM35T_1GA-F), 서열번호: 10 (Kras35G_3CG-F), 서열번호: 11 (KrasEx4 대조군 정방향 프라이머), 서열번호: 12 (KrasEx4 대조군 역방향 프라이머), 서열번호: 14 (12SER 정방향 프라이머), 서열번호: 15 (12ARG 정방향 프라이머), 서열번호: 16 (12CYS 정방향 프라이머), 서열번호: 17 (12ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 18 (12ALA 정방향 프라이머) 또는 서열번호: 19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 "실질적으로 동일"하고, 여기서 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖고, 여기서 3' 말단의 5개의 뉴클레오티드 잔기에서는 불일치(mismatch)가 존재하지 않는 것이다.
서열번호: 1 (13ASP 역방향 프라이머), 서열번호: 2 (C13 정방향 프라이머), 서열번호: 4 (Kras38A_3TC-R), 서열번호: 5 (KrasC13-F), 서열번호: 7 (13ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 8 (12VAL 정방향 프라이머), 서열번호: 9 (KrasM35T_1GA-F), 서열번호: 10 (Kras35G_3CG-F), 서열번호: 11 (KrasEx4 대조군 정방향 프라이머), 서열번호: 12 (KrasEx4 대조군 역방향 프라이머), 서열번호: 14 (12SER 정방향 프라이머), 서열번호: 15 (12ARG 정방향 프라이머), 서열번호: 16 (12CYS 정방향 프라이머), 서열번호: 17 (12ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 18 (12ALA 정방향 프라이머) 또는 서열번호: 19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 상기 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드의 잔기를 제거한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
서열번호: 1 (13ASP 역방향 프라이머), 서열번호: 2 (C13 정방향 프라이머), 서열번호: 4 (Kras38A_3TC-R), 서열번호: 5 (KrasC13-F), 서열번호: 7 (13ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 8 (12VAL 정방향 프라이머), 서열번호: 9 (KrasM35T_1GA-F), 서열번호: 10 (Kras35G_3CG-F), 서열번호: 11 (KrasEx4 대조군 정방향 프라이머), 서열번호: 12 (KrasEx4 대조군 역방향 프라이머), 서열번호: 14 (12SER 정방향 프라이머), 서열번호: 15 (12ARG 정방향 프라이머), 서열번호: 16 (12CYS 정방향 프라이머), 서열번호: 17 (12ASP 정방향 프라이머), 서열번호: 18 (12ALA 정방향 프라이머) 또는 서열번호: 19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 잔기를 부가한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
서열번호: 1 (13ASP 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 CGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:21), TCGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:22) 및 ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:23)일 수 있다.
서열번호: 2 (C13 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 AGGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:24), AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:25) 및 TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:26)일 수 있다.
서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 AAGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:27), CAAGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:28) 및 TCAAGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:29)일 수 있다.
서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 GGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:30), AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:31) 및 AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:32)일 수 있다.
서열번호: 7 (13ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호:33), AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호:34) 및 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호:35)일 수 있다.
서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호:36), TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호:37) 및 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호:38)일 수 있다.
서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호:39), CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호:40) 및 ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호:41)일 수 있다.
서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호:42), AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호:43) 및 GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호:44)일 수 있다.
서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:45), ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:46) 및 GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:47)일 수 있다.
서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:48), TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:49) 및 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:50)일 수 있다.
서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:51), ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:52) 및 GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:53)일 수 있다.
서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:54), ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:55) 및 TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:56)일 수 있다.
서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:57), TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:58) 및 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:59)일 수 있다.
서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드의 예는 CCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:60), TCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:61) 및 GTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:62)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 3 (C13 프로브), 서열번호: 6 (KrasC13_Mc) 또는 서열번호: 13 (KrasEx4 대조군 프로브)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드와 "실질적으로 동일"하고, 여기서 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 "% 서열 동일성(identity)"은 뉴클레오티드 삽입 및 결실을 적절히 고려하여, 각각의 올리고뉴클레오티드 단편, 또는 이들의 상보성 가닥(complementary strands)을 적절히 배열함으로써 결정된다. 비교한 서열이 동일한 길이를 갖지 않는 경우, "% 서열 동일성"은 더 긴 서열에서의 뉴클레오티드 잔기의 총 개수와 비교하여 상기 서열들 간의 동일한 뉴클레오티드 잔기의 개수의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "프로브"는 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 표적 DNA 서열과 결합하여 시료 내의 표적 서열의 존재 및/또는 수준을 표시할 것이다. 예를 들어, 프로브는 형광성 표지를 가지며 적합한 조건 하에서 형광을 방출하여 표적 DNA 서열의 존재 및/또는 수준을 표시할 수 있다.
본원에 사용된 "6FAM"은 6-카르복시플루오레세인을 지칭한다.
본원에 사용된 "PCR"은 일반적으로 열-안정성 폴리머라제 및 두 가지 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉 증폭될 서열의 한 쪽 말단에서 (+)-가닥에 상보적인 하나 및 다른 말단에서 (-)-가닥에 상보적인 다른 하나를 사용하여 DNA 서열을 증폭하는 방법인 중합 효소 연쇄 반응을 지칭한다. 새롭게 합성된 DNA 가닥은 그 후 추가적인 주형으로서 제공될 수 있기 때문에, 연속적인 프라이머 어닐링 횟수, 가닥의 유연성 및 분리는 목적하는 DNA 서열을 빠르고 매우 특이적으로 증폭시킨다.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법 중 단계 (1)에서 DNA는 실시간 PCR과 같은 PCR 기술을 이용하여 증폭될 수 있다.
PCR은 본 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, PCR은 분석할 DNA 혼합물, 올리고뉴클레오티드 프라이머, dNTP, Mg++, 열-안정성 DNA 폴리머라제 및 적합한 완충액을 준비하는 단계; 상기 혼합물을 예컨대 10분간 95℃로 초기 가열하는 단계 및 그 후에 적합한 온도 사이클로 가열하여 DNA를 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 각 온도 사이클은 PCR 혼합물을 30초간 95℃로 가열한 다음, 상기 PCR 혼합물을 1분간 60℃로 냉각하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, PCR은 폴리머라제 3' 엑소-뉴클레아제 활성(예컨대, Taq 폴리머라제)이 결핍된 폴리머라제가 사용되며 프라이머 중 하나의 3' 말단이 검출될 표적 KRAS 변이와 일치하는 ARMS PCR일 수 있다. ARMS PCR과 다른 기술, 예컨대 형광 표지된 프로브와의 조합은 실시간 PCR 반응에서 변이의 검출을 가능하게 한다.
형광성 표지된 프로브로 DNA 내 KRAS 변이의 존재를 검출하는 것은 예컨대 ABI PRISM 7700 또는 7900 서열 검출 시스템[TaqMan®](Applied Biosystems, Foster City, California) 또는 문헌[Heid et al., (Genome Res 1996;6:986-994) 및 Gibson et al.(Genome Res 1996;6:995-1001)]에 기술된 것과 같은 비슷한 시스템과 같은 형광 기반의 실시간 검출법을 이용하여 수행될 수 있다. ABI 7700 또는 ABI 7900의 출력물은 "Ct" 또는 "사이클 역치(cycle threshold)"로 표시되며, 이는 검출된 신호가 실제 신호로 간주되는 임의적인 수준을 초과하는 형광 수준인, 역치(threshold)보다 리포터 형광이 더 큰 PCR 사이클 횟수를 지칭한다. 역치는 기준선 가변성에 기초하여 선택될 수 있고, 각 실험에 대하여 조정될 수 있다. 시료 내의 더 많은 수의 표적 분자는 더 적은 PCR 사이클(낮은 Ct)을 갖는 신호를 생성하며, 시료 내의 더 적은 수의 표적 분자는 더 많은 PCR 사이클(높은 Ct)을 갖는 신호를 생성한다.
본원에 사용된 "프라이머"는 증폭될 DNA 주형 단편의 가닥의 출발 부분과 혼성화될 짧은 올리고뉴클레오티드 가닥을 지칭하며, 여기에 DNA 폴리머라제가 결합하여 프라이머의 3' 말단을 연장시킴으로써 새로운 DNA 가닥을 합성한다.
본원에 사용된 "표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제" 또는 "EGFR 지정된 화학요법제"는 EGFR과 관련된 신호 경로를 손상시키거나 또는 저해할 수 있는 물질의 투여를 통한 화학요법제이다. EGFR 지정된 화학요법제는 EGFR 억제제의 투여를 포함할 수 있다. EGFR 억제제의 예는 게피티닙 및 엘로티닙과 같은 작은 분자 티로신 키나아제 억제제 또는 세툭시맵 및 파니툼맵과 같은 항-EGFR 항체를 포함한다.
본 발명의 한 가지 측면은 본원에 개시된 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법을 이용하여, 종양으로부터 얻은 DNA 내의 KRAS 유전자의 엑손 2 내의 코돈 12에서의 변이 및/또는 코돈 13에서의 변이가 존재하는지 여부를 규명하는 것을 포함하는 EGFR 지정된 화학요법제에 대한 환자 내 종양의 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 코돈 12에서의 변이 및/또는 코돈 13에서의 변이의 검출은 코돈 12 및 코돈 13에서의 변이가 없는 동일한 유형의 종양에 비해 상기 종양이 EGFR 지정된 화학요법제에 대해 감수성이 감소되었다는 것을 예측한다. 본 발명의 예측 방법의 일부 실시예에서 상기 종양은 폐 종양, 예컨대 폐 선암과 같은 비소-세포(nonsmall-cell) 폐암 및 흡연 이력, 특히 심한 흡연 이력을 갖는 환자에서의 폐선암과 같은 폐선암이다. 본 발명의 예측 방법의 일부 실시예에서 종양은 췌장암, 또는 바람직하게는 결장암이다. KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12에서의 변이 및/또는 코돈 13에서의 변이가 종양에서 검출되면, EGFR 지정된 화학요법제를 이용하지 않는 종양 치료법을 사용하는 것이 유익하다.
본 발명은 본원에 개시된 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 방법을 제공한다. 단계 (1)에서 증폭된 DNA는 인간의 조직으로부터 얻은 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 게놈 DNA 또는 cDNA를 얻기 위해 당해 기술분야에 알려진 수많은 공정들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직 내의 세포를 예컨대 세정제를 이용하여 용해하고, 고농도의 아세트산 암모늄 또는 칼륨을 이용하여 단백질 및 기타 오염물질을 염석한 다음 원심분리함으로써 DNA를 수득할 수 있다. 여기서 또한 상기 DNA는 알코올을 이용한 침전을 통해 수득한다. 또 다른 DNA 분리 방법에서 세포의 용해물 내의 DNA를 알코올로 침전한 다음 염화세슘 그라디언트에서 원심분리하여 정제한다. 세포의 용해물 내의 DNA는 또한 고상 음이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다.
상업적으로 이용가능한 키트 예컨대 Invitrogen의 Dynabeads DNA Direct Kit 또는 Qiagen의 DNeasy Tissue Kit가 또한 게놈 DNA를 얻는데 사용될 수 있다. 게놈 DNA는 그 내용이 본원에 참조문헌으로 통합되어 있는 미국 특허 제6,248,535호 및 제6,610,488호에 개시된 방법을 이용하여 포르말린-고정된 파라핀-포매된(FFPE) 조직으로부터 분리된 DNA일 수 있다.
게놈을 얻는 방법은 조직 시료를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(10:1.93:0.036)과 같은 유기 용매 및 구아니디늄 이소티오시아네이트와 같은 적절한 카오트로픽제(chaotropic agent)와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 원심분리하여 세 가지 상(phase)인 낮은 유기상(DNA 함유), 중간상(DNA 함유), 및 상부 수성상(RNA 함유)으로 분리하는 단계; 상기 중간상을 제거하는 단계; 중간상 내의 DNA를 차가운 에탄올 또는 이소프로판올로 침전시킨 다음 원심분리하는 단계; 얻어진 DNA 펠렛을 차가운 알코올로 세척하고 다시 원심분리하는 단계; 상기 DNA 펠렛을 건조시키는 단계; DNA를 트리스(Tris) 또는 TE(Tris-EDTA)와 같은 완충액에 재용해시키는 단계를 포함할 수 있다.
cDNA는 역-전사효소 PCR 및 폴리 dT 올리고뉴클레오티드와 같은 적절한 프라이머를 이용하는 것과 같은 역 전사를 이용하여 조직으로부터 분리된 mRNA로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, RT-PCR은 적합한 완충액에서 mRNA를 dNTP, 소혈청 알부민(BSA), RNAse 억제제, 무작위 헥사머(hexamer) 및 몰로니-뮤린(Moloney-Murine) 백혈병 바이러스 역전사효소와 혼합하고, 상기 혼합물을 열 사이클링 함으로써 수행될 수 있다. 각각의 열 사이클링은 26℃에서 8분, 42℃에서 45분, 및 95℃에서 5분을 포함할 수 있다. mRNA는 미국 특허 제6,248,535호 및 제6,610,488호에 개시된 방법을 이용하여 FFPE로부터 분리될 수 있다.
mRNA는 또한 그 내용이 참조문헌으로 본원에 통합되어 있는 미국 특허 제6,428,963호에 개시된 체액의 수성 시료가 아닌 조직으로부터 분리될 수 있다. 게놈 DNA 또는 mRNA가 분리될 수 있는 조직은 결장암, 예컨대 전이성 결장암, 췌장암, 또는 폐암, 예컨대 폐 선암 및 비소세포 폐암과 같은 종양 조직일 수 있다.
파라핀-포매된 조직 시료로부터 mRNA를 분리하는 예시적인 방법은 다음을 포함한다: a) 예컨대, 시료를 자일렌과 격렬하게 혼합한 다음, 튜브 내에서 조직을 펠렛화시키기에 충분한 속도, 일반적으로 약 10,000 내지 약 20,000×g로 원심분리함으로써, 시료를 유기 용매를 이용하여 탈파라핀화하는 공정; b) 상기 탈파라핀화된 시료를 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 부탄올과 같은 저급 알코올 수용액으로 재수화하는 공정; c) 선택적으로 기계, 초음파 또는 다른 방식의 균질화를 이용하여 시료를 임의적으로 균질화하는 공정; d) 구아니디늄 티오시아네이트와 같은 무질서 유발제를 포함하는 무질서 유발 용액 내의 시료를 약 50 내지 약 100℃ 범위의 온도로 약 30 내지 약 60분간 가열하는 공정; 및 e) 유기 용매를 이용한 추출, 예컨대, 클로로포름 추출, 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 또는 이소프로판올 또는 임의의 다른 저급 알코올을 이용한 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 실리카 겔 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피에 의한 방법, 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 아가로스 겔 전기영동을 포함하는 전기영동 방법을 포함하는 수많은 방법 중 어느 것에 의해 무질서 유발 용액으로부터 RNA를 회수하는 공정을 포함한다.
예를 들어, RNA는 하기와 같이 회수될 수 있다: 1) pH 4.0의 2M 아세트산 나트륨 및 새롭게 준비한 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(10:1.93:0.036)을 이용하여 약 10초 동안 강하게 교반한 다음 약 15분간 얼음 위에서 냉각함으로써 시료를 추출한다; 2) 상기 용액을 최대 속도로 약 7분간 원심분리하고 상부(수성) 상을 새로운 튜브로 옮긴다; 3) RNA를 -20℃에서 30분간 글리코겐 및 이소프로판올로 침전시킨다; 4) RNA를 벤치탑(benchtop) 원심분리기에서 최대 속도로 약 7분간 원심분리하여 펠렛화하고; 상층액을 분리 제거하고, 펠렛을 약 70 내지 75% 에탄올로 세척한다; 그리고 5) 시료를 최대 속도로 7분간 다시 원심분리한다. 상기 상층액을 분리하여 펠렛을 공기 건조한다. 그리고 상기 펠렛을 적절한 완충액(예컨대 50 μL 5 mM 트리스 클로라이드, pH 8.0)에 용해시킨다.
본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 유형에 적용될 수 있으며, 따라서 유방암, 두경부암, 폐암, 식도암, 결장암, 췌장암 등을 포함하는 다양한 암에 대한 예후를 평가하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 비소세포 폐암(NSCLC) 및 결장암(CRC)의 예후에 적용된다. 암에서 KRAS 유전자의 엑손 2 내의 코돈 12 및/또는 코돈 13에서의 변이는 EGFR 지정된 화학요법제에 대한 암의 감수성 감소를 표시한다. 상기 암은 폐선암 및 NSCLC와 같은 폐암, 및 결장암일 수 있다.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 본 방법의 단계 (1)에 사용된 DNA 폴리머라제는 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제이다. 3' 엑소뉴클레아제 활성의 부재으로 인해, DNA 폴리머라제는 프라이머의 3' 말단에서 증폭될 DNA와의 불일치를 지닌 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장하는 것은 어려울 것이다. 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제의 예는 하기를 포함한다: 바실러스 스테레어썸머필러스 (Bacillus stearothermophilus)로부터 단리된 열안정성 Bst DNA 폴리머라제 I (Alitotta et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 1996, vol. 12, pp. 185-195); IsoTherm DNA 폴리머라제 (Epicentre Technologies, Madison, Wisconin로부터 이용가능); 엑소뉴클레아제 활성에 필수적인 아미노산 잔기의 산화를 통해(Sequenase Vertion 1) 또는 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성에 필수적인 28개의 아미노산를 결실하여 유전적으로(Sequenase Version 2) 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성이 제거된 T7 DNA 폴리머라제; VentR(exo-) DNA 폴리머라제; 및 바람직하게는 Taq 폴리머라제이다.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 본 방법의 단계 (2)에서, 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물이 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 산물을 포함하는지 여부를 결정하는 단계로서, 예를 들면 엑손 4의 DNA 영역이 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버까지의 증폭된 범위 내에 포함되는지 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 하나의 멤버의 상보적인 영역으로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 다른 멤버의 상보적 영역까지의 증폭된 범위 내에 포함되는지를 결정하는 것으로 당 분야에 공지된 적절한 절차로 측정될 수 있다. 예를 들면, 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물이 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는지 여부는 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물의 DNA 서열분석 및 수득된 뉴클레오티드 서열을 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나로부터 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나에 이르는 KRAS 유전자의 엑손 4의 뉴클레오티드 서열과의 비교로 측정될 수 있다.
대안적으로, DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 단계 (2)에서 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물이 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나의 멤버로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나의 멤버까지의 증폭된 범위 내에 포함되는지 또는 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나의 멤버에 대한 상보적인 영역으로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나의 멤버에 대해 상보적인 영역까지의 증폭된 범위 내에서 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물이 포함되어 있는지 여부를 결정하는 것으로, 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나의 멤버로부터 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나의 멤버에 이르는 KRAS 유전자의 엑손 4 서열의 적합한 단편을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용으로 측정될 수 있다.
예를 들면 상기 방법의 단계 (2)는 단계 (1)(Ⅰ)의 PCR 생성물을 (a) KrasEx4 대조군 정방향 프라이머 및 KrasEx4 대조군 역방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 사이에 존재하는 또는 (b) KrasEx4 대조군 역방향 프라이머 및 KrasEx4 대조군 정방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 사이에 위치한 엑손 4의 DNA 영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 측정을 통해 확인할 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브와 엑손 4의 DNA 영역과의 혼성화는 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물이 상기 DNA가 KRAS 유전자를 지님을 확인시키는 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 예는 서열번호:13의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasEx4 대조군 프로브, 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드이다.
유사하게 DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 단계 (3)에서, 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 변이된 코돈 12 및/또는 변이된 코돈 13을 함유하는 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는지 여부는 당 분야에 공지된 적절한 방법으로 측정될 수 있고, 여기서 상기 증폭 생성물은 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 영역에 이르거나, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나에 대해 상보적인 영역으로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나에 대해 상보적인 영역까지의 영역을 포함하는 것이다. 예를 들면, 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 엑손 2의 변이된 코돈 12 및/또는 변이된 코돈 13을 함유하는 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는지 여부는 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물의 DNA 서열분석 및 수득된 뉴클레오티드 서열과, 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍의 하나로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 영역에 포함된 KRAS 유전자의 엑손 2의 뉴클레오티드 서열과의 비교로 측정될 수 있다.
대안적으로, DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위한 발명의 본 방법의 단계 (3)에서 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 변이된 코돈 12 및/또는 변이된 코돈 13를 함유하는 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는지 여부는 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍의 하나로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 범위에 포함되는 KRAS 유전자의 엑손 2 서열의 적합한 세그먼트를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 통해 측정될 수 있고, 여기서 상기 증폭 생성물은 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 범위에 포함되는 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나에 대해 상보적인 영역으로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 범위를 포함하는 상보적인 영역을 포함하는 것이다.
예를 들면, 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍이 단계 (1)(Ⅱ)(A)에서 인용된 바와 같이 KRAS 변이를 검출하기 위해 본 발명의 방법 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용될 때, 상기 방법의 단계 (3)은 단계 (1)(Ⅱ)의 PCR 생성물과 (a) 단계 (1)(Ⅱ)(A)(i)에서 인용된 역방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(A)(ⅱ)에서 인용된 정방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 또는 (b) 단계 (1)((Ⅱ)(A)(ⅱ)에서 인용된 정방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(A)(i)에서 인용된 역방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 사이에 위치한 엑손 2의 DNA 영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼합하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브와 엑손 2의 DNA 영역과의 혼성화는 엑손 2의 코돈 13을 함유하는 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함한다는 것을 보여주고 이는 상기 DNA가 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈13에 변이를 포함한다는 것을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 예는 (a) 서열번호:3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 프로브, 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및 (b) 서열번호:6으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasC13_Mc, 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드이다.
예를 들면 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍이 단계 (1)(Ⅱ)(B)에서 언급된 바와 같이 KRAS 변이를 검출하기 위해 본 발명의 단계 (1)(Ⅱ) 방법에서 사용될 때, 본 방법의 단계 (3)은 단계 (1)(Ⅱ)의 PCR 생성물과 (a) 단계 (1)(Ⅱ)(B)(i)에서 언급된 정방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(B)(ⅱ)에서 언급된 역방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 또는 (b) 단계 (1)((Ⅱ)(B)(ⅱ)에서 언급된 역방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(B)(i)에서 언급된 정방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 사이에 위치한 엑손 2의 DNA 영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼합을 포함할 수 있고, 올리고뉴클레오티드 프로브와 엑손 2의 DNA 영역과의 혼성화는 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 엑손 2의 코돈 13를 함유하는 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함한다는 것을 나타내고, 이는 DNA가 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13에서 변이를 포함한다는 것을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 예는 서열번호:20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C12 공통 프로브 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드이다.
예를 들면, 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍이 단계 (1)(Ⅱ)(C)에서 언급된 바와 같이 KRAS 변이를 검출하기 위해 본 발명의 방법 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용될 때, 상기 방법의 단계 (3)은 단계 (1)(Ⅱ)의 PCR 생성물과 (a) 단계 (1)(Ⅱ)(C)(i)에서 언급된 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(C)(ⅱ)에서 언급된 적어도 하나의 역방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 또는 (b) 단계 (1)((Ⅱ)(C)(ⅱ)에서 언급된 적어도 하나의 역방향 프라이머 및 단계 (1)(Ⅱ)(C)(i)에서 언급된 적어도 하나의 정방향 프라이머에 대해 상보적인 영역 사이에 위치한 엑손 2의 DNA 영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼합하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브와 엑손 2의 DNA 영역과의 혼성화는 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물이 엑손 2의 코돈 12를 함유하는 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함한다는 것을 보여주고, 이는 상기 DNA가 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12에서 변이를 포함한다는 것을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 예는 서열번호:20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C12 공통 프로브, 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드이다.
DNA의 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (1)(Ⅱ)은 다음에 언급된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다:
(A) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
(i) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 13ASP 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 및
(ⅱ) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 C13 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는
(B) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
(i) 서열번호:7로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 13ASP 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 C12 공통 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용한다.
DNA의 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 단계 (1)(Ⅱ)은 다음의 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다:
(A) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
(i) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 13ASP 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
(ⅱ) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 C13 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(B) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
(i) 서열번호:7로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 13ASP 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 C12 공통 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
DNA의 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 단계 (1)(Ⅱ)은 하기를 포함하는 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다:
(C) 다음의 적어도 한 쌍의 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
(i) 정방향 프라이머로서의 하기 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
DNA의 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (1)(Ⅱ)은 하기를 포함하는 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다:
(C) 하기를 갖는 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
(i) 정방향 프라이머로서의 하기 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
DNA의 KRAS 변이를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음을 포함한다:
(A) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
(i) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 13ASP 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
(ⅱ) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 C13 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
(B) 다음과 같은 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
(i) 서열번호:7로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머로서의 13ASP 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 서열번호:19로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머로서의 C12 공통 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(C) 다음과 같은 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
(i) 정방향 프라이머로서의 하기 정방향 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
(ⅱ) 올리고뉴클레오티드 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 단계 (1)에서 DNA, 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 및 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머가 Applied Biosystems의 TaqMan 1000 반응 골드/완충액 A 팩 및 Applied Biosystems 또는 GE Healthcare로부터 입수가능한 100 mM 총 dNTP의 혼합물인 반응 믹스 A와 혼합된다.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 상기 방법은 DNA 이외에도 비-주형 대조군(no-template control, NTC)으로도 지칭되는 DNA-음성 대조군에도 적용된다. 상기 방법은 DNA에 적용되며, 상기 방법의 별개의 실행은 또한 평행 방식으로 NTC에 실질적으로 동시에 적용되며, 여기서 NTC에서 DNA 대신에 DNA를 함유하지 않는 액체 시료가 단계 (1)에서 사용된다.
즉 DNA를 함유하지 않는 액체 시료에 대하여 3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 열 안정성 DNA 폴리머라제 및 단계 (1)에서 언급된 프라이머를 이용한 PCR이 수행된다. DNA 대신에 DNA를 함유하지 않는 액체 시료가 사용되는 경우, 상기 방법은 단계 (2) 및 (3)에서 증폭 산물을 생성하지 않아야 한다. DNA를 함유하지 않는 상기 액체 시료는 액체 매질 중에 DNA가 존재하지 않는 것을 제외하면, DNA를 수용하기 위해 사용된 동일한 액체 매질, 예컨대 5 mM Tris, pH 8.0과 같은 적합한 완충액이어야 한다. 예를 들어, DNA가 FFPE 조직으로부터 얻어지는 경우, DNA-음성 대조군 또는 NTC 실행을 위한 DNA를 함유하지 않는 액체 시료는, 구아니디늄 이소티오시아네이트를 함유하나 DNA는 함유하지 않는 5 mM 트리스 완충액, pH 8.0 일 수 있다.
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법의 특정 실시예에서, 실시간 PCR이 사용될 수 있으며, 상기 실시간 PCR은 하기 사이클 파라미터에 따라 수행될 수 있다:
단계 1: 1 사이클에 대해 15초 동안 50℃;
단계 2: 1 사이클에 대해 10분 동안 95℃; 및
단계 3: 42 사이클에 대해 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃.
실시간 PCR을 이용하여 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 DNA는 대조군 시험 및 변이 시험에서(각각 본 발명의 KRAS 변이를 검출하는 방법 중 단계 (1)(I) 및 단계 (1)(II)에서) PCR을 이용하여 증폭되며, 상기 증폭 산물은 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 확인될 수 있고, 그런 다음 상기 방법은 변이 Ct, 대조군 Ct, 및 델타 Ct 값을 결정하는 것, 및 상기 델타 Ct 값을 표 2에 개시된 미리결정된 델타 Ct 값과 비교함으로써 DNA 내 KRAS 변이의 존재를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "변이 Ct"는 본 발명의 KRAS 변이를 검출하는 방법 중 단계 (1)(Ⅱ)에 기술된 바와 같은 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 DNA가 증폭되는 변이 시험을 위한 Ct를 지칭하며, 여기에서 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엑손 2의 코돈 12 또는 13에서의 변이에 대해 특이적이다. "변이 Ct"는 변이 시험에서 나온 리포터 형광이 역치보다 큰 PCR 사이클 횟수이다. 본원에 사용된 용어 "대조군 Ct"는 본 발명의 KRAS 변이를 검출하는 방법의 단계 (1)(I)에 기술된 바와 같은 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 DNA가 증폭되는 대조군 시험을 위한 Ct를 지칭한다. 대조군 Ct는 대조군 시험에서 나온 리포터 형광이 역치보다 큰 PCR 사이클 횟수를 지칭한다. 상기 역치는 단계 (1)(I)에서 KrasEx4 정방향 대조군 및 KrasEx4 역방향 대조군 프라이머를 사용하는 gDNA의 대조군 시험에 대하여 27.0 내지 29.0 사이의 Ct 값을 제공하는 지점에서 정해질 수 있으며, 여기에서 프로메가(Promega)사로부터 상업적으로 입수가능한 gDNA(#G3041)가 단계 (1)에서 또는 시험 DNA 대신에 사용된다.
본원에 사용된 "델타 Ct(△Ct)"는 변이 Ct 및 대조군 Ct 사이의 차이, 즉
△Ct = [변이 Ct] - [대조군 Ct]를 지칭한다
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법의 일부 실시예에서 상기 방법은 DNA의 시험 시료에 적용되며 별도로 상기 방법은 또한 평행 방식으로 DNA-음성 대조군(NTC) 시료에 적용될 수도 있다. NTC 시료 및 DNA의 시험 시료 각각은 2회 반복으로 실행될 수 있으며, NTC 시료 및 시험 시료 각각의 2회 반복 실행에 대한 변이 Ct의 평균값 및 대조군 Ct의 평균값을 계산하고, 상기 평균 변이 Ct 및 평균 대조군 Ct로부터 NTC 시료 및 시험 시료 각각에 대한 델타 Ct가 또한 계산한다. NTC에 대한 평행 실행과 더불어, DNA의 시험 시료에 대해 실시간 PCR이 사용되는 경우, 상기 방법은 NTC에 대해 표 1에 열거된 허용 기준보다 크거나 같은 평균 Ct 값을 제공하여야 한다.
NTC 시료에 대한 평균 Ct의 허용 기준
사용된 프라이머 NTC
KrasEx4 37
12SER 정방향 (AGT) 40
12ARG 정방향 (CGT) 40
12CYS 정방향 (TGT) 40
12ASP 정방향 (GAT) 40
12ALA 정방향 (GCT) 40
12VAL 정방향 (GTT) 40
13ASP 역방향 (GAC_R) 40
DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 본 발명의 방법 이들 실시예에서, NTC에 대한 평균 Ct 값이 표 1에 열거된 Ct 허용 기준보다 크거나 같은 경우, DNA의 시험 시료에 대한 평균 Ct 값이 사용된 특이적 프라이머에 대해 표 2에 열거된 최대 Ct 값보다 적거나 같으면, DNA의 시험 시료에 대한 상기 방법의 결과가 수용가능한 것으로 간주된다.
시험 시료에 대한 Ct 허용 기준
사용된 프라이머 최대 Ct 최대 △Ct
KrasEx4 30 N/A
12SER 정방향 37.4 6.5
12ARG 정방향 35.9 6.6
12CYS 정방향 36.8 6.7
12ASP 정방향 36.0 6.8
12ALA 정방향 37.7 6.6
12VAL 정방향 38.4 6.7
13ASP 역방향 36.7 6.7
이들 실시예에서 델타 Ct 값이 사용된 특이적 변이 프라이머에 대해 표 2에 열거된 최대 델타 Ct 값보다 낮은 경우, DNA의 시험 시료 내의 사용된 특이적 변이 프라이머에 상응하는 코돈에 KRAS 변이가 존재하는 것으로 확인된다.
<110> Response Genetics, Inc. <120> KRAS PRIMERS AND PROBES <130> 11220/300 <140> PCT/US2011/032108 <141> 2011-04-12 <150> US 61/323,114 <151> 2010-04-12 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gtcaaggcac tcttgcctaa gt 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggcctgctga aaatgactga 20 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 caactaccac aagttt 16 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aggcactctt gcctccgt 18 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcctgctgaa aatgactgaa tat 23 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 6 ctccaactac cacaagtt 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cttgtggtag ttggagctgg taa 23 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aatataaact tgtggtagtt ggagcttt 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gaatataaac ttgtggtagt tggagctat 29 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tataaacttg tggtagttgg aggtgt 26 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tgaagatgta cctatggtcc tagtagga 28 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gtcctgagcc tgttttgtgt cta 23 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 13 tagaaggcaa atcaca 16 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tgaatataaa cttgtggtag ttggagata 29 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 aatataaact tgtggtagtt ggaggtc 27 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tgaatataaa cttgtggtag ttggagttt 29 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aaacttgtgg tagttggagc aga 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aacttgtggt agttggagca gc 22 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cacaaaatga ttctgaatta gctgtatc 28 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 20 tcaaggcact cttgcct 17 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 cgtcaaggca ctcttgccta agt 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 tcgtcaaggc actcttgcct aagt 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 atcgtcaagg cactcttgcc taagt 25 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 aggcctgctg aaaatgactg a 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 aaggcctgct gaaaatgact ga 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 taaggcctgc tgaaaatgac tga 23 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 aaggcactct tgcctccgt 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 caaggcactc ttgcctccgt 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tcaaggcact cttgcctccg t 21 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ggcctgctga aaatgactga atat 24 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 aggcctgctg aaaatgactg aatat 25 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 aaggcctgct gaaaatgact gaatat 26 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 acttgtggta gttggagctg gtaa 24 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 aacttgtggt agttggagct ggtaa 25 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 aaacttgtgg tagttggagc tggtaa 26 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gaatataaac ttgtggtagt tggagcttt 29 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 tgaatataaa cttgtggtag ttggagcttt 30 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ctgaatataa acttgtggta gttggagctt t 31 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 tgaatataaa cttgtggtag ttggagctat 30 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 ctgaatataa acttgtggta gttggagcta t 31 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 actgaatata aacttgtggt agttggagct at 32 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 atataaactt gtggtagttg gaggtgt 27 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 aatataaact tgtggtagtt ggaggtgt 28 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 gaatataaac ttgtggtagt tggaggtgt 29 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 ctgaatataa acttgtggta gttggagata 30 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 actgaatata aacttgtggt agttggagat a 31 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 gactgaatat aaacttgtgg tagttggaga ta 32 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gaatataaac ttgtggtagt tggaggtc 28 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 tgaatataaa cttgtggtag ttggaggtc 29 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ctgaatataa acttgtggta gttggaggtc 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ctgaatataa acttgtggta gttggagttt 30 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 actgaatata aacttgtggt agttggagtt t 31 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 gactgaatat aaacttgtgg tagttggagt tt 32 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 taaacttgtg gtagttggag caga 24 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 ataaacttgt ggtagttgga gcaga 25 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 tataaacttg tggtagttgg agcaga 26 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 aaacttgtgg tagttggagc agc 23 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 taaacttgtg gtagttggag cagc 24 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 ataaacttgt ggtagttgga gcagc 25 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 ccacaaaatg attctgaatt agctgtatc 29 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 tccacaaaat gattctgaat tagctgtatc 30 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 gtccacaaaa tgattctgaa ttagctgtat c 31

Claims (32)

  1. (a) GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:1)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (b) GGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:2)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (c) 6FAM-CAACTACCACAAGTTT (서열번호:3)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (d) AGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:4)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (e) GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:5)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (f) 6FAM-CTCCAACTACCACAAGTT (서열번호: 6)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (g) CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호: 7)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (h) AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호: 8)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (i) GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호: 9)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (j) TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호: 10)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (k) TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA (서열번호: 11)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (l) GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA (서열번호: 12)로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (m) 6FAM-TAGAAGGCAAATCACA (서열번호: 13)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (n) TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:14)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (o) AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:15)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (p) TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:16)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (q) AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:17)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (r) AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:18)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (s) CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:19)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (t) 6FAM-TCAAGGCACTCTTGCCT (서열번호:20)로 이루어진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:1)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    GGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:2)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:4)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:5)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호: 7)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호: 8)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호: 9)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호: 10)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA (서열번호: 11)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA (서열번호: 12)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:14)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:15)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:16)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:17)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:18)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:19)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 2항에 있어서,
    GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT (서열번호:1)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AGGCACTCTTGCCTCCGT (서열번호:4)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA (서열번호: 7)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 2항에 있어서,
    GGCCTGCTGAAAATGACTGA (서열번호:2)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT (서열번호:5)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 2항에 있어서,
    AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT (서열번호: 8)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA (서열번호:14)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC (서열번호:15)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT (서열번호:16)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA (서열번호:17)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC (서열번호:18)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC (서열번호:19)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 2항에 있어서,
    GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT (서열번호: 9)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT (서열번호: 10)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 2항에 있어서,
    TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA (서열번호: 11)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA (서열번호: 12)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드
    에서 선택된 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 1항에 따른 (a) 내지 (t)에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 를 포함하는 키트.
  9. 제 8항에 있어서, (a), (b), (d), (e), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (n), (o), (p), (q), (r) 및 (s)에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 (c), (f), (m) 및 (t)에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  10. (1) 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제 및 다음 방법으로 DNA를 PCR로 증폭시키는 단계:
    (Ⅰ) 상기 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KRAS 유전자의 엑손 4의 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 상기 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호:11로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasEx4 대조군 정방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 서열번호:12로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 KrasEx4 대조군 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드인 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머인 대조군 시험을 위한 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머 ; 및
    (Ⅱ) 적어도 한 쌍의 상기 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KRAS 유전자의 엑손 2에 위치한 코돈 12에서 변이 및/또는 코돈 13에서 변이를 갖는 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 다음에서 선택되는 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이 시험을 위한 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
    (A) 다음의 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
    (i) (a) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 13ASP 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 역방향 프라이머, 및
    (ⅱ) (a) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 정방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 또는 (b) 서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 정방향 프라이머;
    (B) 다음의 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
    (i) 서열번호:7 (13ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는
    (C) 다음의 적어도 한 쌍의 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머:
    (i) 다음에서 선택된 적어도 하나의 정방향 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅱ) 올리고뉴클레오티드 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드;
    (2) 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는 단계 (1)(Ⅰ)의 생성물을 측정하는 단계로서, 상기 증폭 생성물의 검출은 DNA에서 KRAS 유전자의 존재를 나타내는 단계; 및
    (3) 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물을 포함하는 단계 (1)(Ⅱ)의 생성물을 측정하는 단계로서,
    (a) 적어도 한 쌍의 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머가 단계 (1)(Ⅱ) 에서 사용될 때의 증폭 생성물의 검출이 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13에서 변이의 존재를 나타내고/내거나;
    (b) 적어도 한 쌍의 코돈 12 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머가 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용될 때의 증폭 생성물의 검출은 DNA에서 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12에서 변이의 존재를 나타내는 단계.
    포함하는 DNA 내 KRAS 변이를 검출하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 (1)(Ⅱ)에서, 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머가 KRAS 유전자의 엑손 2에 위치한 코돈 12에서 변이를 갖는 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 적어도 한 쌍의 코돈 12를 위한 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (i) 다음에서 선택된 적어도 하나의 정방향 프라이머: (a) 서열번호:8 (12VAL 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (b) 서열번호:14 (12SER 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (c) 서열번호:15 (12ARG 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (d) 서열번호:16 (12CYS 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (e) 서열번호:17 (12ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (f) 서열번호:18 (12ALA 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; (g) 서열번호:9 (KrasM35T_1GA-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 또는 (h) 서열번호:10 (Kras35T_3CG-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  12. 제 10항에 있어서, 단계 (1)(Ⅱ)에서, 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KRAS 유전자의 엑손 2에 위치한 코돈 13에서 변이를 갖는 DNA 영역의 증폭을 위한 것이고, 적어도 한 쌍의 코돈 13을 위한 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (A) 다음의 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 쌍:
    (i) 다음에서 선택되는 역방향 프라이머: (a) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 13ASP 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
    (ⅱ) 다음에서 선택되는 정방향 프라이머: (a) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 정방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (B) 다음의 코돈 13 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 쌍:
    (i) 서열번호:7 (13ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  13. 제 12항에 있어서, 단계 (1)(Ⅱ)에서, 적어도 한 쌍의 상기 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (i) 다음에서 선택되는 역방향 프라이머: (a) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 13ASP 역방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
    (ii) 다음에서 선택되는 정방향 프라이머: (a) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 정방향 프라이머 또는 제 1항에 따른 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (i) 서열번호:1로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 13ASP 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
    (ⅱ) 서열번호:2로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 C13 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 단계 (1)(Ⅱ)에서 사용된 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (i) 서열번호:4 (Kras38A_3TG-R)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드, 및
    (ⅱ) 서열번호:5 (KrasC13-F)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 11항에 있어서, 단계 (1)(Ⅱ)에서, 적어도 한 쌍의 코돈 13을 위한 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 프라이머에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    (i) 서열번호:7 (13ASP 정방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅱ) 서열번호:19 (C12 공통 역방향 프라이머)로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 역방향 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 10항에 있어서, 단계 (2)에서 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물은 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 이르는 영역이거나, 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나에 대해 상보적인 영역으로부터 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나에 대해 상보적인 영역까지의 범위인 DNA 영역임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10항에 있어서, 단계 (3)에서 상기 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍의 하나로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나까지에 이르는 영역이거나, 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 적어도 한 쌍의 하나에 대해 상보적인 영역으로부터 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 다른 하나에 대해 상보적인 영역까지의 범위인 DNA 영역임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 10항에 있어서, 단계 (1)에서 사용된 상기 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제는 바실러쓰 스테레어썸머필러스 (Bacillus stearothermophilus) 로부터 분리된 열안정성 Bst DNA 폴리머라제 I, IsoTherm DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 활성에 필수적인 아미노산 잔기의 산화를 통해(Sequenase Vertion 1) 또는 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성에 필수적인 28개의 아미노산를 결실하여 유전적으로(Sequenase Version 2) 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성이 제거된 T7 DNA 폴리머라제, VentR(exo-) DNA 폴리머라제 및 Taq 폴리머라제로부터 선택되는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 열안정성 DNA 폴리머라제는 Taq 폴리머라제인 방법.
  21. 제 17항에 있어서, 단계 (2)에서, 한 쌍의 대조군 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 4의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:13으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 단계 (2)에서, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:3 또는 6으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 단계 (2)에서, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:3으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 단계 (2)에서, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:6으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  25. 제 14항에 있어서, 단계 (2)에서, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:3으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  26. 제 15항에 있어서, 단계 (2)에서, 적어도 한 쌍의 변이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 엑손 2의 DNA 영역의 증폭 생성물은 서열번호:6으로 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 표지된 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드로 측정되는 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 단계 (1)에서 사용된 상기 DNA는 게놈 DNA 또는 조직으로부터 얻은 cDNA인 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 단계 (1)에서 사용된 상기 DNA는 조직으로부터 얻은 cDNA인 방법.
  29. (1) 종양으로부터 DNA를 얻는 단계; 및
    (2) DNA 내 KRAS 변이를 검출하기 위해 제 10항 내지 제 28항 중 어느 하나의 방법을 사용하여 DNA 내의 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 12의 변이 및/또는 코돈 13의 변이의 존재를 측정하는 단계로서, 여기서 상기 코돈 12의 변이 및/또는 코돈 13의 변이의 검출은 상기 종양이 코돈 12 및 코돈 13에서 변이를 갖지 않는 동일한 유형의 종양과 비교하여 표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제에 대한 감소된 감수성을 갖는다는 것을 예측하는 단계
    로 이루어진 표피 성장 인자 수용체 지정된 화학요법제에 대한 환자의 종양의 감수성을 예측하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 단계 (2)는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 12의 변이를 측정하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 단계 (2)는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 13의 변이를 측정하는 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 단계 (2)는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 코돈 12의 변이 및 코돈 13의 변이를 측정하는 방법.
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