CN110546274A - minor BCR-ABL1基因的检测方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包括以下的方法：(1)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以获得自对象的核酸试样作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和(2)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象具有minor BCR‑ABL1基因的步骤。

Description

minor BCR-ABL1基因的检测方法

技术领域

本申请要求日本专利申请第2017-087666号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

本公开涉及对象中minor BCR-ABL1基因的检测方法以及用于该目的的试剂盒。

背景技术

BCR-ABL1融合基因是在慢性骨髓性白血病(CML)和费城染色体阳性急性淋巴性白血病(Ph+ALL)的患者中发现的染色体异常。表示为t(9；22)的9号染色体和22号染色体之间的染色体易位导致9号染色体的c-ABL1基因(带区域q34)与22号染色体的bcr基因(带区域q11)融合。融合基因编码嵌合 BCR-ABL1蛋白。BCR-ABL1蛋白具有酪氨酸激酶活性，并且通过持续刺激细胞增殖信号和抑制细胞凋亡导致造血干细胞的无限增殖。最近开发的靶向BCR-ABL1蛋白的酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)，已改善对 CML和Ph+ALL的治疗结果。

根据BCR的切断点的不同，BCR-ABL1可主要分为Major型 BCR-ABL1(M-BCR-ABL1)和minor型BCR-ABL1(m-BCR-ABL1)。在约95％的CML患者中发现M-BCR，在约20至30％的Ph+ALL患者中发现m-BCR。各个BCR-ABL1基因的表达水平可作为辅助CML和Ph+ALL的诊断或监测治疗效果的指标。本发明人贩售以"Major BCR-ABL1 mRNA测定试剂盒"为商品名的、用于测定M-BCR-ABL1的表达水平的试剂盒。试剂盒通过一步定量实时RT-PCR测定M-BCR-ABL1的表达水平。非专利文献1公开了一种测定 m-BCR-ABL1的表达水平的方法。

现有技术文献

专利文献

[专利文献1]美国专利第6391592号

非专利文献

[非专利文献1]Gabert J等人Leukemia.2003；17:2318-2357

发明内容

发明要解决的问题

本公开的目的是提供比常规方法更精确的minor BCR-ABL1基因的检测方法。

用于解决问题的方案

本公开的一个方面提供一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的方法，其包括：

(1)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以获得自对象的核酸试样作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和

(2)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象具有minor BCR-ABL1基因的步骤。

本公开的一个方面提供一种用于检测对象中minor BCR-ABL1基因的试剂盒，其包括具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸、具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物、和具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物。

发明的效果

根据本发明，可以比常规方法更精确地检测对象中的minor BCR-ABL1 基因。这可以给出有利于诊断或治疗对象的CML或Ph+ALL的信息。

附图说明

图1示出m-BCR基因和M-BCR基因的结构以及本文所述方法的示意图。

图2-1示出SEQ ID NO:1的碱基序列。

图2-2示出SEQ ID NO:1的碱基序列(续)。

图2-3示出SEQ ID NO:1的碱基序列(续)。

图3-1示出SEQ ID NO:2的碱基序列。

图3-2示出SEQ ID NO:2的碱基序列(续)。

图3-3示出SEQ ID NO:2的碱基序列(续)。

图3-4示出SEQ ID NO:2的碱基序列(续)。

图4-1示出SEQ ID NO:3的碱基序列。

图4-2示出SEQ ID NO:3的碱基序列(续)。

图4-3示出SEQ ID NO:3的碱基序列(续)。

图4-4示出SEQ ID NO:3的碱基序列(续)。

图5示出在试验1中、在PNA的存在下，minor BCR-ABL1 mRNA的RT-PCR 的扩增曲线。

图6示出在试验1中、在PNA的存在下，ABL1 mRNA的RT-PCR扩增曲线。

图7示出在试验2中、在PNA的存在下，1.0×10⁷拷贝的Major BCR-ABL1 mRNA的RT-PCR的扩增曲线。

图8示出在试验2中、在PNA的存在下，1.0×10⁶拷贝的Major BCR-ABL1 mRNA的RT-PCR的扩增曲线。

图9示出在试验2中、在PNA的存在下，ABL1 mRNA的RT-PCR的扩增曲线。

具体实施方式

除非另外定义，本说明书所用术语具有例如有机化学、医学、药学、分子生物学、和微生物学等技术领域的普通技术人员通常理解的含义。本说明书使用的一些术语如下所述定义。本说明书的定义优先于通常的理解。

在数值伴有术语"约"的情况下，所述值旨在表示该值的±10％的范围内的任何值。例如，"约20"意味着包含"18至22的值"。数值的范围包括两端点之间的全部数值以及两端点的数值。在范围伴有术语"约"的情况下，所述术语适用于该范围的两个端点。例如，"约20至30"意味着包含"18至33"。

BCR-ABL1基因是在慢性骨髓性白血病和费城染色体阳性急性淋巴性白血病的患者中发现的ABL1基因和BCR基因的融合基因。表示为t(9；22)的9号染色体和22号染色体之间的染色体易位产生了融合基因。根据BCR的切断点的位置的不同，BCR-ABL1基因主要分类为minor型和Major型。前者"minor BCR-ABL1(m-BCR-ABL1)基因"是BCR基因的外显子1与ABL1基因的外显子 2至11的融合基因。后者"Major BCR-ABL1(M-BCR-ABL1)基因"是BCR基因的外显子1至13或外显子1至14与ABL1基因的外显子2至11的融合基因。图1中示出m-BCR-ABL1基因和M-BCR-ABL1基因的结构。

在本公开方法的开发过程中，本发明人试验了可以用现有试剂盒进行的 m-BCR-ABL1 mRNA水平的检测的公知方法，并且发现公知方法有时无法精确确定水平。公知方法不仅检测m-BCR-ABL1 mRNA，还检测了 M-BCR-ABL1 mRNA(参见下文实施例中的试验2)。在试验中，使用基于BCR 基因的外显子1的碱基序列设计的正向引物和基于ABL1基因的外显子2的碱基序列设计的反向引物进行PCR来扩增m-BCR-ABL1 cDNA。如图1所示， M-BCR-ABL1cDNA在BCR基因的外显子1和ABL1基因的外显子2之间具有 BCR基因的外显子2至13(约1428bp)或外显子2至14(约1503bp)，因此比 m-BCR-ABL1 cDNA更长，已认为在用于m-BCR-ABL1 cDNA的扩增条件下的 PCR不可扩增M-BCR-ABL1 cDNA。然而，试验2中证明了，实际上公知方法可以扩增M-BCR-ABL1 cDNA。这是可导致错误检测或测定的严重缺陷。本公开提供的方法和试剂盒克服了该缺陷，实现了对m-BCR-ABL1基因或其表达的精确检测或m-BCR-ABL1的表达水平的精确判定。

m-BCR-ABL1基因的碱基序列通常由SEQ ID NO:1表示并且公知许多变体。M-BCR-ABL1基因的碱基序列通常由SEQ ID NO:2或3表示，并且公知许多变体。

在严格条件下，m-BCR-ABL1基因和M-BCR-ABL1基因可具有分别和具有与SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2或3序列互补的碱基序列的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸序列。关于"在严格条件下杂交"，可以使用例如"Molecular Cloning,T.Maniatis等,CSH Laboratory(1983)"中所述的标准方法来进行杂交。严格条件的实例是在45℃下在含有6×SSC和50％甲酰胺的溶液中形成杂交体然后在50℃下用2×SSC清洗，其中10×SSC是含有1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠的溶液(参见"Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6")。还可采用实现等效严格性的条件。

m-BCR-ABL1基因和M-BCR-ABL1基因可分别具有与SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2或3的碱基序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、或99％的序列同一性。术语"序列同一性"是指两个寡核苷酸序列之间的相似程度。通过比较在待比较区域上彼此最佳对齐的两个序列来确定同一性。术语"最佳对齐"是指对齐两个序列使得匹配的核苷酸数最大化。序列同一性的数值(％)是通过识别两个序列中的匹配碱基、确定匹配碱基数、将该数除以待比较区域中碱基的总数、并且将得到的数值乘以100来计算的。为了得到最佳对齐并计算序列同一性，可以使用本领域技术人员通常可用的各种算法，例如，BLAST算法和FASTA算法。可以使用例如BLAST和FASTA 等用于序列分析的软件来确定序列同一性。

对象通常为人类。对象可以是患有或怀疑患有例如慢性骨髓性白血病 (CML)或费城染色体阳性急性淋巴性白血病(Ph+ALL)等的白血病的患者。

本文所用术语"核酸试样"是指获得自对象的DNA或通过对获得自对象的RNA进行逆转录而得到的cDNA。RNA可以是总RNA或纯化的mRNA。核酸试样可以获得自含有造血干细胞、白细胞、或白血病细胞的对象的试样，例如血液、骨髓液(bone marrow aspirate)、或淋巴液。核酸试样可以获得自分离的造血干细胞、血细胞、白细胞、或白血病细胞。在一个实施方案中，核酸试样获得自末梢血白细胞(leukocytes in peripheral blood)或骨髓液有核细胞。在一个实施方案中，核酸试样获得自末梢血白细胞。

DNA或RNA可以通过任何公知方法，例如，通过PCI(苯酚-氯仿-异戊醇提取)法酸化含有DNA或RNA的溶液并从水层提取、通过使用市售DNA或 RNA提取试剂盒、或通过任何其他公知方法，从试样中提取。

上述方法的步骤(1)使用具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸。修饰核酸可结合至来源于Major BCR-ABL1 mRNA的PCR扩增产物中对应于BCR基因的外显子2至14的区域。本说明书中将该修饰核酸称为"M-BCR夹"。

术语"修饰核酸"是指含有至少一个人工核苷酸的核酸，其与mRNA或 DNA的杂交比具有相同碱基序列的DNA更强，并且不被逆转录酶和DNA聚合酶的核酸外切酶活性降解。逆转录酶和DNA聚合酶在修饰核酸结合至模板 mRNA或DNA的位点处停止延伸反应。M-BCR夹结合至来源于M-BCR-ABL1 基因的、含有对应于BCR基因的外显子2至14的碱基序列的多聚核苷酸，并且抑制使用多聚核苷酸作为模板的延伸反应。反之，M-BCR夹不结合至来源于m-BCR-ABL1基因的、不含有对应于BCR基因的外显子2至14的碱基序列的多聚核苷酸，并且不抑制使用多聚核苷酸作为模板的延伸反应。

可以将M-BCR夹设计为具有在BCR基因的外显子2至14、优选外显子2 至13中含有的约10至30个、约15至25个、约19至23个、或约20至22个、例如约21个连续核苷酸的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸。BCR基因的外显子2至14具有例如SEQ ID NO:4的碱基序列。BCR基因的外显子2至13 具有例如SEQ ID NO:5的碱基序列。在一个实施方案中，设计M-BCR夹使其结合至步骤(1)的PCR扩增产物中正向或反向引物的结合位点的邻近区域。具体地，设计M-BCR夹以结合至PCR扩增产物中自正向或反向引物的结合位点约300、约200、约150、或约100核苷酸以内的区域。在一个实施方案中，设计M-BCR夹以结合至PCR扩增产物中对应于BCR基因的外显子12和13的区域(例如，SEQ ID NO:6)，例如对应于外显子13的区域(例如，SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，M-BCR夹包括AGGGAGAAGCTTCTGAAACAC(SEQ IDNO:8)的碱基序列或其互补碱基序列。在一个实施方案中，M-BCR夹由SEQ ID NO:8的碱基序列或其互补碱基序列组成。

M-BCR夹包括至少一个人工核苷酸。可以使用具有与天然核苷酸不同结构的、并且通过增强核酸酶抗性以及与靶序列的结合亲和性来改善M-BCR 夹的人工核苷酸。例如，本说明书使用的人工核苷酸包括Deleavey,G.F.,& Damha,M.J.(2012).Designingchemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing.Chemistry&biology,19(8),937-954中所述的那些，其全部内容通过引用结合在此。人工核苷酸的实例包括无碱基(abasic)核苷；阿拉伯糖核苷、2’-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、和具有其他糖修饰的核苷；肽核酸(PNA)、有磷酸基的肽核酸(PHONA)、锁核酸(LNA)、2'-O,4'-C-亚乙基桥联的核酸(ENA)、约束乙基(constrained ethyl)(cEt)、吗啉代核酸。具有糖修饰的人工核苷酸的实例包括以下：具有取代的戊糖例如2'-o- 甲基核糖、2'-o-甲氧基乙基核糖、2'-脱氧-2'-氟代核糖、或3'-o-甲基核糖；1',2'- 脱氧核糖；阿拉伯糖；取代的阿拉伯糖；己糖、和α-异头物的那些。具有修饰的碱基的人工核苷酸的实例包括以下：具有例如5-羟基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、或4-硫尿嘧啶等的嘧啶类；例如6-甲基腺嘌呤和6-巯基鸟苷等的嘌呤类；和其他杂环碱基的那些。M-BCR夹可包括相同类型的或两种以上的不同类型的人工核苷酸。

在一个实施方案中，M-BCR夹包括至少一个PNA部分(portion)作为人工核苷酸。PNA在N-(2-氨乙基)甘氨酸之间具有肽键，因此具有其中DNA的磷酸二酯键被肽键取代的DNA样结构(Nielsen等人1991Science 254， 1457-1500)。PNA对多种核酸酶有抗性并且以类似于DNA和RNA的分子识别与DNA或RNA杂交。PNA和DNA之间的亲和性比DNA和DNA之间、或DNA 和RNA之间的更强。在一个实施方案中，M-BCR夹中的所有核苷酸是PNA。

在一个实施方案中，核酸试样是通过对获得自对象的RNA试样进行逆转录而得到的cDNA，在这种情况下，检测了对象中minor BCR-ABL1基因的表达。可以在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸、即M-BCR夹的存在下进行逆转录。修饰核酸可结合至Major BCR-ABL1 mRNA中对应于BCR基因的外显子2至14的区域。用于逆转录的M-BCR夹可以设计为具有与BCR基因的外显子2至14、优选外显子2至13中含有的约10至30个、约15至25个、约19至23个、或约20至22个、例如约21个连续核苷酸互补的碱基序列的修饰核酸。在一个实施方案中，设计用于逆转录的M-BCR 夹使其结合至M-BCR-ABL1 mRNA中用于逆转录的反向引物的结合位点的邻近区域，即BCR基因的外显子2至14的3'端的邻近区域。具体地，设计M-BCR 夹以结合至M-BCR-ABL1 mRNA中自来源于BCR基因的区域与来源于ABL1 基因的区域的融合位点约300、约200、约150、或约100核苷酸以内的区域。例如，设计M-BCR夹以结合至M-BCR-ABL1 mRNA中对应于BCR基因的外显子12和13的区域(例如，SEQ IDNO:6)，例如对应于外显子13的区域(例如， SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，用于逆转录的M-BCR夹包括 AGGGAGAAGCTTCTGAAACAC(SEQ ID NO:8)的碱基序列。在一个实施方案中，用于逆转录的M-BCR夹由SEQ ID NO:8的碱基序列组成。用于逆转录的M-BCR夹可以与用于PCR的M-BCR夹相同地制造和使用。

用于逆转录的M-BCR夹可以具有与用于PCR的M-BCR夹相同或不同的结构。在一个实施方案中，用于逆转录的M-BCR夹和用于PCR的M-BCR夹具有相同结构。

逆转录或PCR中的M-BCR夹的量可以为任何足以抑制逆转录或PCR的量。例如，M-BCR夹在最终反应溶液中的浓度可以在约0.01μM至10μM、约 0.01μM至5μM、约0.01μM至1μM、或约0.01μM至0.1μM的范围中，例如，约 0.025μM、约0.050μM、或约0.075μM。

对于逆转录，使用了具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物。在逆转录反应中，引物可结合至m-BCR-ABL1 mRNA和 M-BCR-ABL1 mRNA来引发延伸反应。ABL1基因的外显子2至11具有例如 SEQ ID NO:9的碱基序列。可以基于该碱基序列设计用于逆转录的反向引物。例如，可以基于ABL1基因的外显子2的碱基序列(例如，SEQ IDNO:10)设计反向引物。在一个实施方案中，反向引物包括 CCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCTAC(SEQ ID NO:11)的碱基序列。在一个实施方案中，反向引物由SEQ ID NO:11的碱基序列组成。适用于逆转录的引物的设计方法是本领域技术人员众所周知的。

例如逆转录酶、dNTP、和缓冲液等的用于逆转录反应的试剂可以是本领域中常用的那些。例如各个试剂的量、反应时间、和反应温度等的反应条件可以根据例如根据逆转录酶的包装所附说明书或本领域中常用的实验方案(protocol)等以常规方式适当地确定。例如，逆转录酶可以是分子生物学实验中使用的公知的任何逆转录酶，包括Tth DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、 AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶、及其衍生物。

可以设计用于PCR的正向引物和反向引物使得来源于m-BCR-ABL1 mRNA的PCR产物具有适用于扩增和定量的长度，例如，约10至1000、约20 至500、约50至300、约100至200、约130至180、约150至160核苷酸，例如长度为约155核苷酸。适用于PCR的引物的设计方法是本领域技术人员众所周知的。

用于PCR的正向引物具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列。引物可以结合至与m-BCR-ABL1 mRNA或M-BCR-ABL1 mRNA互补的单链DNA 中对应于BCR基因外显子1的区域，并引发延伸反应。BCR基因的外显子1具有例如SEQ ID NO:12的碱基序列。可以基于该碱基序列设计正向引物。在一个实施方案中，正向引物包括TCGCAACAGTCCTTCGACAG(SEQ IDNO: 13)的碱基序列。在一个实施方案中，正向引物由SEQ ID NO:13的碱基序列组成。

用于PCR的反向引物具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列。可以以与用于逆转录的反向引物的相同方式设计反向引物。用于 PCR的反向引物可以具有与用于逆转录的反向引物相同或不同的结构。在一个实施方案中，用于逆转录的反向引物和用于PCR的反向引物具有相同结构。

PCR可以是定量PCR如定量实时PCR。各种荧光PCR技术可以用于定量实时PCR。荧光PCR技术的实例包括但不限于，嵌入剂法(intercalator assay)，其使用荧光核酸结合染料如SYBR GREEN I和仪器如Roche的LightCycler(注册商标)或Perkin Elmer AppliedBiosystems的ABI Prizm 7700Sequence Detection System(注册商标)；TaqMan探针法，其通过DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性来实时监测扩增；和环形(cycling)探针法，其使用RNaseH的RNase 活性和专用的嵌合RNA探针。

在一个实施方案中，TaqMan探针法用于定量实时PCR。在TaqMan探针法中，通常将5'端标记有荧光物质、3'端有淬灭剂的寡核苷酸(TaqMan探针) 添加至PCR反应体系中。在退火步骤中，TaqMan探针与模板DNA特异性杂交。在该步骤中，由于探针上存在淬灭剂，即使在激发光照射下也抑制了荧光发生。在延伸步骤中，Taq聚合酶的5'核酸外切酶活性降解了与模板杂交的 TaqMan探针并且从淬灭剂释放荧光物质，允许荧光发生。由于探针可以与来源于m-BCR-ABL1 mRNA的PCR产物的任一条链上的任何地方结合，可以通过本领域内众所周知的任何方法来设计TaqMan探针。可以使用荧光物质和淬灭剂的任何组合。在一个实施方案中，TaqMan探针包括 ATCGTGGGCGTCCGCAAGAC(SEQ ID NO:14)的碱基序列。在一个实施方案中，TaqMan探针由SEQ ID NO:14的碱基序列组成。

可以在定量实时PCR中生成荧光的扩增曲线。在定量实时PCR中同时使用含有未知浓度的cDNA的样品溶液和含有已知浓度的cDNA的标准溶液。通过在x轴上绘制循环数并且在y轴上绘制来自报告物质的对数转换的荧光强度。在扩增曲线为线性的区域中确定荧光强度的中位数。在中位数的附近绘制平行于x轴的直线。确定平行线与扩增曲线相交处的循环数。此外，通过在x轴上绘制标准溶液中对数转换的cDNA溶度并且在y轴上绘制标准溶液的上述确定的循环数来生成cDNA浓度的标准曲线。样品溶液中的cDNA浓度可以通过使用样品的上述确定的循环数和cDNA浓度的标准曲线来确定。

由于逆转录和PCR中可使用相同的M-BCR夹和相同的反向引物，可以通过添加PCR所需试剂至逆转录的全部产物或一部分产物中来进行PCR。例如，可以在一个步骤即在同一容器中同时或顺序进行逆转录和PCR。例如，步骤 (1)可以作为定量实时RT-PCT的一部分进行。

例如DNA聚合酶、dNTP、和缓冲液等的PCR中使用的试剂可以是本领域常用的那些。例如各个试剂的量、反应时间、和反应温度等的反应条件可以例如根据酶的包装所附说明书或本领域中常用的实验方案等以常规方法适当地确定。例如，DNA聚合酶可以是分子生物学实验中使用的公知的任何 DNA聚合酶，包括rTth DNA聚合酶、Taq聚合酶、及其衍生物。

在上述方法的步骤(2)中，当通过PCR使核酸扩增时，判断对象具有minor BCR-ABL1基因。可以通过用于检测核酸的任何公知方法检测核酸扩增。例如，可以通过扩增后的核酸的电泳、与标记有可检测标签的核酸探针杂交、用插入性荧光染料染色双链DNA、或使用荧光探针来检测扩增。可以如上所述在定量PCR中检测核酸扩增。

与上述步骤(1)并行地，可以对含有对应于ABL1基因的外显子2至11的碱基序列(例如，SEQ ID NO:9)的核酸进行定量并且与m-BCR-ABL1基因的测定值比较。含有对应于ABL1基因的外显子2至11的碱基序列的核酸可以来源于 ABL1基因、m-BCR-ABL1基因、和M-BCR-ABL1基因。例如，对在步骤(1)中得到的m-BCR-ABL1基因的核酸进行定量、并将测定值除以含有对应于ABL1 基因的外显子2至11的碱基序列的核酸的测定值来得到标准化的 m-BCR-ABL1基因的测定值。类似地，可以用管家基因的测定值来标准化 m-BCR-ABL1基因的测定值。

在一个实施方案中，使用下表1中所示的引物、夹、和探针。所有这些可以组合使用或使用其中的至少一种。

[表1]

正向引物	TCGCAACAGTCCTTCGACAG(SEQ ID NO:13)
		反向引物	CCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCTAC(SEQ ID NO:11)
探针	ATCGTGGGCGTCCGCAAGAC(SEQ ID NO:14)
		夹	AGGGAGAAGCTTCTGAAACAC(SEQ ID NO:8)

本公开的一个方面提供了用于进行本文公开的方法的试剂盒。所述试剂盒包括至少：

(a)具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸；

(b)具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物；和

(c)具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物。

试剂盒还包括第2修饰核酸、第2反向引物、和用于定量PCR的探针中的至少一种。试剂盒可进一步包括标准品，例如，已知量的minor BCR-ABL1 mRNA。试剂盒可进一步包括用于定量对照基因的mRNA(例如，含有对应于 ABL1基因的外显子2至11的碱基序列的至少一部分的mRNA)的引物。试剂盒可进一步包括至少一种的进行本文公开的方法所必需的试剂，例如，用于逆转录、PCR、或定量PCR的试剂，包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、和缓冲液。试剂盒可进一步包括商业或使用试剂盒方面优选的任何组件，例如，含有试剂盒使用说明的包装说明书(package insert)(例如，书面或存储介质)。

试剂盒的各组分可以单独提供或可以以混合物提供。各个组分可以以在水或合适的缓冲液中的溶液、或以冻干形式、包含在合适的容器中提供。合适的容器的实例包括瓶、小瓶、试管、管、板、和多孔板。容器可以由至少一种的例如玻璃、塑料或金属等材料制成。容器可具有标签。

一方面，本公开提供了一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的方法，其包括：

(1)在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，使用具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第1反向引物对获得自对象的RNA试样进行逆转录的步骤；

(2)使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第2反向引物来进行PCR的步骤；和

(3)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象表达minor BCR-ABL1基因的步骤。

所述方法的细节与之前所述方法相同。

例如，本公开提供了以下实施方案。

[1]一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的方法，其包括：

(1)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以获得自对象的核酸试样作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和

(2)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象具有minor BCR-ABL1基因的步骤。

[2]根据第1项所述的方法，其中所述核酸试样是通过对获得自对象的 RNA试样进行逆转录而得到的cDNA。

[3]根据第1项或第2项所述的方法，其中所述核酸试样是在具有与BCR 基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，通过对获得自对象的RNA试样进行逆转录而得到的cDNA。

[4]一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的方法，其包括：

(1)使用具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第 1反向引物对获得自对象的RNA试样进行逆转录的步骤；

(2)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以步骤(1)中得到的逆转录产物作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1 基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和

(3)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象表达minor BCR-ABL1基因的步骤。

[5]一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的方法，其包括：

(1)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，使用具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第1反向引物对获得自对象的RNA试样进行逆转录的步骤；

(2)以步骤(1)中得到的逆转录产物作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第2反向引物来进行PCR的步骤；和

(3)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象表达minor BCR-ABL1基因的步骤。

[6]一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的方法，其包括：

(1)在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，使用具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第1反向引物对获得自对象的RNA试样进行逆转录的步骤；

(2)在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以步骤(1)中得到的逆转录产物作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与 ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和

(3)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象表达minor BCR-ABL1基因的步骤。

[7]根据第1项至第6项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸具有BCR 基因的外显子2至13的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

[8]根据第1项至第7项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸具有BCR 基因的外显子12和13的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

[9]根据第1项至第8项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括约10 个至约30个核苷酸。

[10]根据第1项至第9项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括约21 个核苷酸。

[11]根据第1项至第10项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括 SEQ ID NO:8的碱基序列。

[12]根据第1项至第11项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸由SEQ ID NO:8的碱基序列组成。

[13]根据第1项至第12项任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括 PNA部分。

[14]根据第3项和第6项至第13项任一项所述的方法，其中用于逆转录的修饰核酸和用于PCR的修饰核酸具有相同结构。

[15]根据第1项至第14项任一项所述的方法，其中用于逆转录的反向引物或用于PCR的反向引物包括SEQ ID NO:11的碱基序列。

[16]根据第1项至第15项任一项所述的方法，其中用于逆转录的反向引物或用于PCR的反向引物由SEQ ID NO:11的碱基序列组成。

[17]根据第2项至第16项任一项所述的方法，其中用于逆转录的反向引物和用于PCR的反向引物具有相同结构。

[18]根据第1项至第17项任一项所述的方法，其中所述正向引物包括 SEQ ID NO:13的碱基序列。

[19]根据第1项至第18项任一项所述的方法，其中所述正向引物由SEQ ID NO:13的碱基序列组成。

[20]根据第2项至第19项任一项所述的方法，其中逆转录和PCR在同一容器中进行。

[21]根据第1项至第20项任一项所述的方法，其中PCR为定量PCR。

[22]根据第1项至第21项任一项所述的方法，其中PCR为定量实时 RT-PCR。

[23]根据第1项至第22项任一项所述的方法，其中所述对象为人类。

[24]根据第1项至第23项任一项所述的方法，其中所述核酸试样是提取自末梢血白细胞或骨髓液有核细胞的核酸试样。

[25]根据第1项至第24项任一项所述的方法，其中所述核酸试样是提取自末梢血白细胞的核酸试样。

[26]根据第1项至第25项任一项所述的方法，其中使用了表1所示的引物、夹、和探针中的至少一种。

[27]根据第1项至第26项任一项所述的方法，其中使用了表1所示的引物、夹、和探针。

[28]一种用于检测对象中minor BCR-ABL1基因的试剂盒，其包括具有 BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸、具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物、和具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物。

[29]一种用于检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的试剂盒，其包括具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸、具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物、和具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物。

[30]根据第28项或第29项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸具有BCR基因的外显子2至13的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

[31]根据第28项至第30项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸具有 BCR基因的外显子12的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

[32]根据第28项至第31项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸包括约10个至约30个核苷酸。

[33]根据第28项至第32项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸包括 21个核苷酸。

[34]根据第28项至第33项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸包括 SEQ IDNO:8的碱基序列。

[35]根据第28项至第34项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸由 SEQ IDNO:8的碱基序列组成。

[36]根据第28项至第35项任一项所述的试剂盒，其中所述修饰核酸包括 PNA部分。

[37]根据第28项至第36项任一项所述的试剂盒，其中所述反向引物包括 SEQ IDNO:11的碱基序列。

[38]根据第28项至第37项任一项所述的试剂盒，其中所述反向引物由SEQ ID NO:11的碱基序列组成。

[39]根据第28项至第38项任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物包括 SEQ IDNO:13的碱基序列。

[40]根据第28项至第39项任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物由 SEQ IDNO:13的碱基序列组成。

[41]根据第28项至第40项任一项所述的试剂盒，其还包括用于定量PCR 的探针。

[42]根据第28项至第41项任一项所述的试剂盒，其还包括第2修饰核酸。

[43]根据第28项至第42项任一项所述的试剂盒，其还包括第2反向引物。

[44]根据第28项至第43项任一项所述的试剂盒，其还包括minor BCR-ABL1 mRNA。

[45]根据第28项至第44项任一项所述的试剂盒，其包括表1所示的引物、夹、和探针中的至少一种。

[46]根据第28项至第45项任一项所述的试剂盒，其包括表1所示的引物、夹、和探针。

本文引用的文献的全部内容通过引用结合与此。

上述实施方案是非限制性的并且可以在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下进行修改。以下实施例不约束或限制本发明并且仅用于说明目的。

实施例1

RT-PCR的反应溶液的制备

制备下表所示组成的RT-PCR反应混合物。

[表2]

minor BCR-ABL mRNA荧光标记探针具有6-FAM(6-羧基荧光素)作为报告物质和ATTO540Q作为淬灭剂。ABL1荧光标记探针具有HEX(六氯荧光素) 作为报告物质和ATTO540Q作为淬灭剂。

向RT-PCR反应混合物，以0、0.025、0.05或0.075μM的终浓度添加能够特异性结合至编码BCR基因的外显子12的一部分的mRNA的PNA夹 (Panagene)。

下表示出各个组分的碱基序列。

[表3]

试样的制备

(1)具有Major BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的RNA标准品

在体外合成含有Major BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的RNA(SEQ ID NO:18)。调节RNA的浓度至1.0×10⁷、1.0×10⁶拷贝/试验。

(2)具有minor BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的RNA标准品

在体外合成含有minor BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的RNA(SEQ ID NO:19)。调节RNA的浓度至1.0×10⁷、1.0×10⁵、1.0×10³、1.0×10²、或1.0 ×10¹拷贝/试验。

(3)具有ABL1 mRNA的碱基序列的RNA标准品

在体外合成含有ABL1 mRNA的碱基序列的RNA(SEQ ID NO:20)。调节 RNA浓度至1.0×10⁷、1.0×10⁵、1.0×10³、或1.0×10²拷贝/试验。

RT-PCR反应条件

RT-PCR在以下条件下进行。

仪器：Applied biosystems 7500Fast realtime PCR system

温度条件：在37℃下5分钟、在65℃下15分钟、并在94℃下1分钟反应后，以在94℃下5秒和在67℃下40秒为一反应循环，重复45次。

试验1：PNA夹对minor BCR-ABL1 mRNA和ABL1 mRNA的扩增的影响

使用上述试剂和反应条件对具有minor BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的 RNA标准品(2)和具有ABL1 mRNA的碱基序列的RNA标准品进行RT-PCR。

图5和图6中分别示出minor BCR-ABL1 mRNA(minor)和ABL1 mRNA (ABL1)的扩增曲线。下表中示出RT-PCR的阈值时的循环数(Cycle of threshold: Ct)。PNA夹的添加对扩增无影响。

[表4]

-：未试验

试验2：PNA夹对Major BCR-ABL1 mRNA和ABL1 mRNA的扩增的影响

使用上述试剂和反应条件对具有Major BCR-ABL1 mRNA的碱基序列的 RNA标准品(1)和具有ABL1 mRNA的碱基序列的RNA标准品进行RT-PCR。

对于Major BCR-ABL1 mRNA(Major)和ABL1 mRNA(ABL1)，下表示出 RT-PCR的阈值时的循环数(Cycle of threshold:Ct)。图7至9示出扩增曲线。Major BCR-ABL1 mRNA在PNA夹不存在的情况下扩增，但扩增产物非常长，即，长度为1630bp或1705bp。通过添加PNA夹增加Ct值，表明抑制了扩增。 PNA夹的添加对ABL1 mRNA的扩增无影响。

[表5]

使用minor BCR-ABL1 mRNA和ABL1 mRNA的mRNA浓度以及表4中所示的阈值时的循环数来得到mRNA浓度的标准曲线。使用标准曲线来计算表 5所示阈值时的循环数的mRNA浓度。结果示于表6中。

与PNA不存在的情况相比，在PNA的存在下通过用于检测minor BCR-ABL1 mRNA的浓度的体系检测到的Major BCR-ABL1 mRNA的浓度减少。这表明PNA的添加抑制了MajorBCR-ABL1 mRNA的扩增。PNA的添加对于在用于检测ABL1 mRNA的浓度的体系中检测到的Major BCR-ABL1 mRNA的浓度无影响。

[表6]

产业上的可利用性

本公开可提供比现有技术中的方法更精确地检测minor BCR-ABL1基因或确定其表达水平的方法。因此，本文公开的方法或试剂盒可以高精度地检测minor BCR-ABL1基因或确定其表达水平，对于例如诊断白血病的发作和复发、预测白血病的预后、和确定骨髓移植的时机是有用的。

序列表

<110> 大塚制药株式会社(OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.)

<120> minor BCR-ABL1的检测方法

<130> 674135

<150> JP 2017-087666

<151> 2017-04-26

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7200

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

ggggggaggg tggcggctcg atgggggagc cgcctccagg gggccccccc gccctgtgcc 60

cacggcgcgg cccctttaag aggcccgcct ggctccgtca tccgcgccgc ggccacctcc 120

ccccggccct ccccttcctg cggcgcagag tgcgggccgg gcgggagtgc ggcgagagcc 180

ggctggctga gcttagcgtc cgaggaggcg gcggcggcgg cggcggcacg gcggcggcgg 240

ggctgtgggg cggtgcggaa gcgagaggcg aggagcgcgc gggccgtggc cagagtctgg 300

cggcggcctg gcggagcgga gagcagcgcc cgcgcctcgc cgtgcggagg agccccgcac 360

acaatagcgg cgcgcgcagc ccgcgccctt ccccccggcg cgccccgccc cgcgcgccga 420

gcgccccgct ccgcctcacc tgccaccagg gagtgggcgg gcattgttcg ccgccgccgc 480

cgccgcgcgg gccatggggg ccgcccggcg cccggggccg ggctggcgag gcgccgcgcc 540

gccgctgaga cgggccccgc gcgcagcccg gcggcgcagg taaggccggc cgcgccatgg 600

tggacccggt gggcttcgcg gaggcgtgga aggcgcagtt cccggactca gagcccccgc 660

gcatggagct gcgctcagtg ggcgacatcg agcaggagct ggagcgctgc aaggcctcca 720

ttcggcgcct ggagcaggag gtgaaccagg agcgcttccg catgatctac ctgcagacgt 780

tgctggccaa ggaaaagaag agctatgacc ggcagcgatg gggcttccgg cgcgcggcgc 840

aggcccccga cggcgcctcc gagccccgag cgtccgcgtc gcgcccgcag ccagcgcccg 900

ccgacggagc cgacccgccg cccgccgagg agcccgaggc ccggcccgac ggcgagggtt 960

ctccgggtaa ggccaggccc gggaccgccc gcaggcccgg ggcagccgcg tcgggggaac 1020

gggacgaccg gggacccccc gccagcgtgg cggcgctcag gtccaacttc gagcggatcc 1080

gcaagggcca tggccagccc ggggcggacg ccgagaagcc cttctacgtg aacgtcgagt 1140

ttcaccacga gcgcggcctg gtgaaggtca acgacaaaga ggtgtcggac cgcatcagct 1200

ccctgggcag ccaggccatg cagatggagc gcaaaaagtc ccagcacggc gcgggctcga 1260

gcgtggggga tgcatccagg cccccttacc ggggacgctc ctcggagagc agctgcggcg 1320

tcgacggcga ctacgaggac gccgagttga acccccgctt cctgaaggac aacctgatcg 1380

acgccaatgg cggtagcagg cccccttggc cgcccctgga gtaccagccc taccagagca 1440

tctacgtcgg gggcatgatg gaaggggagg gcaagggccc gctcctgcgc agccagagca 1500

cctctgagca ggagaagcgc cttacctggc cccgcaggtc ctactccccc cggagttttg 1560

aggattgcgg aggcggctat accccggact gcagctccaa tgagaacctc acctccagcg 1620

aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca 1680

tgttccggga caaaagccgc tctccctcgc agaactcgca acagtccttc gacagcagca 1740

gtccccccac gccgcagtgc cataagcggc accggcactg cccggttgtc gtgtccgagg 1800

ccaccatcgt gggcgtccgc aagaccgggc agatctggcc caacgatggc gagggcgcct 1860

tccatggaga cgcagaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc 1920

tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct cgctggaccc agtgaaaatg 1980

accccaacct tttcgttgca ctgtatgatt ttgtggccag tggagataac actctaagca 2040

taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca caatggggaa tggtgtgaag 2100

cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta catcacgcca gtcaacagtc 2160

tggagaaaca ctcctggtac catgggcctg tgtcccgcaa tgccgctgag tatctgctga 2220

gcagcgggat caatggcagc ttcttggtgc gtgagagtga gagcagtcct ggccagaggt 2280

ccatctcgct gagatacgaa gggagggtgt accattacag gatcaacact gcttctgatg 2340

gcaagctcta cgtctcctcc gagagccgct tcaacaccct ggccgagttg gttcatcatc 2400

attcaacggt ggccgacggg ctcatcacca cgctccatta tccagcccca aagcgcaaca 2460

agcccactgt ctatggtgtg tcccccaact acgacaagtg ggagatggaa cgcacggaca 2520

tcaccatgaa gcacaagctg ggcgggggcc agtacgggga ggtgtacgag ggcgtgtgga 2580

agaaatacag cctgacggtg gccgtgaaga ccttgaagga ggacaccatg gaggtggaag 2640

agttcttgaa agaagctgca gtcatgaaag agatcaaaca ccctaacctg gtgcagctcc 2700

ttggggtctg cacccgggag cccccgttct atatcatcac tgagttcatg acctacggga 2760

acctcctgga ctacctgagg gagtgcaacc ggcaggaggt gaacgccgtg gtgctgctgt 2820

acatggccac tcagatctcg tcagccatgg agtacctgga gaagaaaaac ttcatccaca 2880

gagatcttgc tgcccgaaac tgcctggtag gggagaacca cttggtgaag gtagctgatt 2940

ttggcctgag caggttgatg acaggggaca cctacacagc ccatgctgga gccaagttcc 3000

ccatcaaatg gactgcaccc gagagcctgg cctacaacaa gttctccatc aagtccgacg 3060

tctgggcatt tggagtattg ctttgggaaa ttgctaccta tggcatgtcc ccttacccgg 3120

gaattgacct gtcccaggtg tatgagctgc tagagaagga ctaccgcatg gagcgcccag 3180

aaggctgccc agagaaggtc tatgaactca tgcgagcatg ttggcagtgg aatccctctg 3240

accggccctc ctttgctgaa atccaccaag cctttgaaac aatgttccag gaatccagta 3300

tctcagacga agtggaaaag gagctgggga aacaaggcgt ccgtggggct gtgagtacct 3360

tgctgcaggc cccagagctg cccaccaaga cgaggacctc caggagagct gcagagcaca 3420

gagacaccac tgacgtgcct gagatgcctc actccaaggg ccagggagag agcgatcctc 3480

tggaccatga gcctgccgtg tctccattgc tccctcgaaa agagcgaggt cccccggagg 3540

gcggcctgaa tgaagatgag cgccttctcc ccaaagacaa aaagaccaac ttgttcagcg 3600

ccttgatcaa gaagaagaag aagacagccc caacccctcc caaacgcagc agctccttcc 3660

gggagatgga cggccagccg gagcgcagag gggccggcga ggaagagggc cgagacatca 3720

gcaacggggc actggctttc acccccttgg acacagctga cccagccaag tccccaaagc 3780

ccagcaatgg ggctggggtc cccaatggag ccctccggga gtccgggggc tcaggcttcc 3840

ggtctcccca cctgtggaag aagtccagca cgctgaccag cagccgccta gccaccggcg 3900

aggaggaggg cggtggcagc tccagcaagc gcttcctgcg ctcttgctcc gcctcctgcg 3960

ttccccatgg ggccaaggac acggagtgga ggtcagtcac gctgcctcgg gacttgcagt 4020

ccacgggaag acagtttgac tcgtccacat ttggagggca caaaagtgag aagccggctc 4080

tgcctcggaa gagggcaggg gagaacaggt ctgaccaggt gacccgaggc acagtaacgc 4140

ctccccccag gctggtgaaa aagaatgagg aagctgctga tgaggtcttc aaagacatca 4200

tggagtccag cccgggctcc agcccgccca acctgactcc aaaacccctc cggcggcagg 4260

tcaccgtggc ccctgcctcg ggcctccccc acaaggaaga agctggaaag ggcagtgcct 4320

tagggacccc tgctgcagct gagccagtga cccccaccag caaagcaggc tcaggtgcac 4380

cagggggcac cagcaagggc cccgccgagg agtccagagt gaggaggcac aagcactcct 4440

ctgagtcgcc agggagggac aaggggaaat tgtccaggct caaacctgcc ccgccgcccc 4500

caccagcagc ctctgcaggg aaggctggag gaaagccctc gcagagcccg agccaggagg 4560

cggccgggga ggcagtcctg ggcgcaaaga caaaagccac gagtctggtt gatgctgtga 4620

acagtgacgc tgccaagccc agccagccgg gagagggcct caaaaagccc gtgctcccgg 4680

ccactccaaa gccacagtcc gccaagccgt cggggacccc catcagccca gcccccgttc 4740

cctccacgtt gccatcagca tcctcggccc tggcagggga ccagccgtct tccaccgcct 4800

tcatccctct catatcaacc cgagtgtctc ttcggaaaac ccgccagcct ccagagcgga 4860

tcgccagcgg cgccatcacc aagggcgtgg tcctggacag caccgaggcg ctgtgcctcg 4920

ccatctctag gaactccgag cagatggcca gccacagcgc agtgctggag gccggcaaaa 4980

acctctacac gttctgcgtg agctatgtgg attccatcca gcaaatgagg aacaagtttg 5040

ccttccgaga ggccatcaac aaactggaga ataatctccg ggagcttcag atctgcccgg 5100

cgacagcagg cagtggtcca gcggccactc aggacttcag caagctcctc agttcggtga 5160

aggaaatcag tgacatagtg cagaggtagc agcagtcagg ggtcaggtgt caggcccgtc 5220

ggagctgcct gcagcacatg cgggctcgcc catacccgtg acagtggctg acaagggact 5280

agtgagtcag caccttggcc caggagctct gcgccaggca gagctgaggg ccctgtggag 5340

tccagctcta ctacctacgt ttgcaccgcc tgccctcccg caccttcctc ctccccgctc 5400

cgtctctgtc ctcgaatttt atctgtggag ttcctgctcc gtggactgca gtcggcatgc 5460

caggacccgc cagccccgct cccacctagt gccccagact gagctctcca ggccaggtgg 5520

gaacggctga tgtggactgt ctttttcatt tttttctctc tggagcccct cctcccccgg 5580

ctgggcctcc ttcttccact tctccaagaa tggaagcctg aactgaggcc ttgtgtgtca 5640

ggccctctgc ctgcactccc tggccttgcc cgtcgtgtgc tgaagacatg tttcaagaac 5700

cgcatttcgg gaagggcatg cacgggcatg cacacggctg gtcactctgc cctctgctgc 5760

tgcccggggt ggggtgcact cgccatttcc tcacgtgcag gacagctctt gatttgggtg 5820

gaaaacaggg tgctaaagcc aaccagcctt tgggtcctgg gcaggtggga gctgaaaagg 5880

atcgaggcat ggggcatgtc ctttccatct gtccacatcc ccagagccca gctcttgctc 5940

tcttgtgacg tgcactgtga atcctggcaa gaaagcttga gtctcaaggg tggcaggtca 6000

ctgtcactgc cgacatccct cccccagcag aatggaggca ggggacaagg gaggcagtgg 6060

ctagtggggt gaacagctgg tgccaaatag ccccagactg ggcccaggca ggtctgcaag 6120

ggcccagagt gaaccgtcct ttcacacatc tgggtgccct gaaagggccc ttcccctccc 6180

ccactcctct aagacaaagt agattcttac aaggcccttt cctttggaac aagacagcct 6240

tcacttttct gagttcttga agcatttcaa agccctgcct ctgtgtagcc gccctgagag 6300

agaatagagc tgccactggg cacctgcgca caggtgggag gaaagggcct ggccagtcct 6360

ggtcctggct gcactcttga actgggcgaa tgtcttattt aattaccgtg agtgacatag 6420

cctcatgttc tgtgggggtc atcagggagg gttaggaaaa ccacaaacgg agcccctgaa 6480

agcctcacgt atttcacaga gcacgcctgc catcttctcc ccgaggctgc cccaggccgg 6540

agcccagata cgggggctgt gactctgggc agggacccgg ggtctcctgg accttgacag 6600

agcagctaac tccgagagca gtgggcaggt ggccgcccct gaggcttcac gccgggagaa 6660

gccaccttcc caccccttca taccgcctcg tgccagcagc ctcgcacagg ccctagcttt 6720

acgctcatca cctaaacttg tactttattt ttctgataga aatggtttcc tctggatcgt 6780

tttatgcggt tcttacagca catcacctct ttgcccccga cggctgtgac gcagccggag 6840

ggaggcacta gtcaccgaca gcggccttga agacagagca aagcgcccac ccaggtcccc 6900

cgactgcctg tctccatgag gtactggtcc cttccttttg ttaacgtgat gtgccactat 6960

attttacacg tatctcttgg tatgcatctt ttatagacgc tcttttctaa gtggcgtgtg 7020

catagcgtcc tgccctgccc cctcgggggc ctgtggtggc tccccctctg cttctcgggg 7080

tccagtgcat tttgtttctg tatatgattc tctgtggttt tttttgaatc caaatctgtc 7140

ctctgtagta ttttttaaat aaatcagtgt ttacattaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7200

<210> 2

<211> 8628

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ggggggaggg tggcggctcg atgggggagc cgcctccagg gggccccccc gccctgtgcc 60

cacggcgcgg cccctttaag aggcccgcct ggctccgtca tccgcgccgc ggccacctcc 120

ccccggccct ccccttcctg cggcgcagag tgcgggccgg gcgggagtgc ggcgagagcc 180

ggctggctga gcttagcgtc cgaggaggcg gcggcggcgg cggcggcacg gcggcggcgg 240

ggctgtgggg cggtgcggaa gcgagaggcg aggagcgcgc gggccgtggc cagagtctgg 300

cggcggcctg gcggagcgga gagcagcgcc cgcgcctcgc cgtgcggagg agccccgcac 360

acaatagcgg cgcgcgcagc ccgcgccctt ccccccggcg cgccccgccc cgcgcgccga 420

gcgccccgct ccgcctcacc tgccaccagg gagtgggcgg gcattgttcg ccgccgccgc 480

cgccgcgcgg gccatggggg ccgcccggcg cccggggccg ggctggcgag gcgccgcgcc 540

gccgctgaga cgggccccgc gcgcagcccg gcggcgcagg taaggccggc cgcgccatgg 600

tggacccggt gggcttcgcg gaggcgtgga aggcgcagtt cccggactca gagcccccgc 660

gcatggagct gcgctcagtg ggcgacatcg agcaggagct ggagcgctgc aaggcctcca 720

ttcggcgcct ggagcaggag gtgaaccagg agcgcttccg catgatctac ctgcagacgt 780

tgctggccaa ggaaaagaag agctatgacc ggcagcgatg gggcttccgg cgcgcggcgc 840

aggcccccga cggcgcctcc gagccccgag cgtccgcgtc gcgcccgcag ccagcgcccg 900

ccgacggagc cgacccgccg cccgccgagg agcccgaggc ccggcccgac ggcgagggtt 960

ctccgggtaa ggccaggccc gggaccgccc gcaggcccgg ggcagccgcg tcgggggaac 1020

gggacgaccg gggacccccc gccagcgtgg cggcgctcag gtccaacttc gagcggatcc 1080

gcaagggcca tggccagccc ggggcggacg ccgagaagcc cttctacgtg aacgtcgagt 1140

ttcaccacga gcgcggcctg gtgaaggtca acgacaaaga ggtgtcggac cgcatcagct 1200

ccctgggcag ccaggccatg cagatggagc gcaaaaagtc ccagcacggc gcgggctcga 1260

gcgtggggga tgcatccagg cccccttacc ggggacgctc ctcggagagc agctgcggcg 1320

tcgacggcga ctacgaggac gccgagttga acccccgctt cctgaaggac aacctgatcg 1380

acgccaatgg cggtagcagg cccccttggc cgcccctgga gtaccagccc taccagagca 1440

tctacgtcgg gggcatgatg gaaggggagg gcaagggccc gctcctgcgc agccagagca 1500

cctctgagca ggagaagcgc cttacctggc cccgcaggtc ctactccccc cggagttttg 1560

aggattgcgg aggcggctat accccggact gcagctccaa tgagaacctc acctccagcg 1620

aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca 1680

tgttccggga caaaagccgc tctccctcgc agaactcgca acagtccttc gacagcagca 1740

gtccccccac gccgcagtgc cataagcggc accggcactg cccggttgtc gtgtccgagg 1800

ccaccatcgt gggcgtccgc aagaccgggc agatctggcc caacgatggc gagggcgcct 1860

tccatggaga cgcagatggc tcgttcggaa caccacctgg atacggctgc gctgcagacc 1920

gggcagagga gcagcgccgg caccaagatg ggctgcccta cattgatgac tcgccctcct 1980

catcgcccca cctcagcagc aagggcaggg gcagccggga tgcgctggtc tcgggagccc 2040

tggagtccac taaagcgagt gagctggact tggaaaaggg cttggagatg agaaaatggg 2100

tcctgtcggg aatcctggct agcgaggaga cttacctgag ccacctggag gcactgctgc 2160

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atgggctctt cccccgcgtg cagcagtgga gccaccagca gcgggtgggc gacctcttcc 2340

agaagctggc cagccagctg ggtgtgtacc gggccttcgt ggacaactac ggagttgcca 2400

tggaaatggc tgagaagtgc tgtcaggcca atgctcagtt tgcagaaatc tccgagaacc 2460

tgagagccag aagcaacaaa gatgccaagg atccaacgac caagaactct ctggaaactc 2520

tgctctacaa gcctgtggac cgtgtgacga ggagcacgct ggtcctccat gacttgctga 2580

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agaacttcct gtccagcatc aatgaggaga tcacaccccg acggcagtcc atgacggtga 2700

agaagggaga gcaccggcag ctgctgaagg acagcttcat ggtggagctg gtggaggggg 2760

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agcagagcgg aggcaaaacg cagcagtatg actgcaaatg gtacattccg ctcacggatc 2880

tcagcttcca gatggtggat gaactggagg cagtgcccaa catccccctg gtgcccgatg 2940

aggagctgga cgctttgaag atcaagatct cccagatcaa gaatgacatc cagagagaga 3000

agagggcgaa caagggcagc aaggctacgg agaggctgaa gaagaagctg tcggagcagg 3060

agtcactgct gctgcttatg tctcccagca tggccttcag ggtgcacagc cgcaacggca 3120

agagttacac gttcctgatc tcctctgact atgagcgtgc agagtggagg gagaacatcc 3180

gggagcagca gaagaagtgt ttcagaagct tctccctgac atccgtggag ctgcagatgc 3240

tgaccaactc gtgtgtgaaa ctccagactg tccacagcat tccgctgacc atcaataagg 3300

aagaagccct tcagcggcca gtagcatctg actttgagcc tcagggtctg agtgaagccg 3360

ctcgttggaa ctccaaggaa aaccttctcg ctggacccag tgaaaatgac cccaaccttt 3420

tcgttgcact gtatgatttt gtggccagtg gagataacac tctaagcata actaaaggtg 3480

aaaagctccg ggtcttaggc tataatcaca atggggaatg gtgtgaagcc caaaccaaaa 3540

atggccaagg ctgggtccca agcaactaca tcacgccagt caacagtctg gagaaacact 3600

cctggtacca tgggcctgtg tcccgcaatg ccgctgagta tctgctgagc agcgggatca 3660

atggcagctt cttggtgcgt gagagtgaga gcagtcctgg ccagaggtcc atctcgctga 3720

gatacgaagg gagggtgtac cattacagga tcaacactgc ttctgatggc aagctctacg 3780

tctcctccga gagccgcttc aacaccctgg ccgagttggt tcatcatcat tcaacggtgg 3840

ccgacgggct catcaccacg ctccattatc cagccccaaa gcgcaacaag cccactgtct 3900

atggtgtgtc ccccaactac gacaagtggg agatggaacg cacggacatc accatgaagc 3960

acaagctggg cgggggccag tacggggagg tgtacgaggg cgtgtggaag aaatacagcc 4020

tgacggtggc cgtgaagacc ttgaaggagg acaccatgga ggtggaagag ttcttgaaag 4080

aagctgcagt catgaaagag atcaaacacc ctaacctggt gcagctcctt ggggtctgca 4140

cccgggagcc cccgttctat atcatcactg agttcatgac ctacgggaac ctcctggact 4200

acctgaggga gtgcaaccgg caggaggtga acgccgtggt gctgctgtac atggccactc 4260

agatctcgtc agccatggag tacctggaga agaaaaactt catccacaga gatcttgctg 4320

cccgaaactg cctggtaggg gagaaccact tggtgaaggt agctgatttt ggcctgagca 4380

ggttgatgac aggggacacc tacacagccc atgctggagc caagttcccc atcaaatgga 4440

ctgcacccga gagcctggcc tacaacaagt tctccatcaa gtccgacgtc tgggcatttg 4500

gagtattgct ttgggaaatt gctacctatg gcatgtcccc ttacccggga attgacctgt 4560

cccaggtgta tgagctgcta gagaaggact accgcatgga gcgcccagaa ggctgcccag 4620

agaaggtcta tgaactcatg cgagcatgtt ggcagtggaa tccctctgac cggccctcct 4680

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tggaaaagga gctggggaaa caaggcgtcc gtggggctgt gagtaccttg ctgcaggccc 4800

cagagctgcc caccaagacg aggacctcca ggagagctgc agagcacaga gacaccactg 4860

acgtgcctga gatgcctcac tccaagggcc agggagagag cgatcctctg gaccatgagc 4920

ctgccgtgtc tccattgctc cctcgaaaag agcgaggtcc cccggagggc ggcctgaatg 4980

aagatgagcg ccttctcccc aaagacaaaa agaccaactt gttcagcgcc ttgatcaaga 5040

agaagaagaa gacagcccca acccctccca aacgcagcag ctccttccgg gagatggacg 5100

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tggctttcac ccccttggac acagctgacc cagccaagtc cccaaagccc agcaatgggg 5220

ctggggtccc caatggagcc ctccgggagt ccgggggctc aggcttccgg tctccccacc 5280

tgtggaagaa gtccagcacg ctgaccagca gccgcctagc caccggcgag gaggagggcg 5340

gtggcagctc cagcaagcgc ttcctgcgct cttgctccgc ctcctgcgtt ccccatgggg 5400

ccaaggacac ggagtggagg tcagtcacgc tgcctcggga cttgcagtcc acgggaagac 5460

agtttgactc gtccacattt ggagggcaca aaagtgagaa gccggctctg cctcggaaga 5520

gggcagggga gaacaggtct gaccaggtga cccgaggcac agtaacgcct ccccccaggc 5580

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cgggctccag cccgcccaac ctgactccaa aacccctccg gcggcaggtc accgtggccc 5700

ctgcctcggg cctcccccac aaggaagaag ctggaaaggg cagtgcctta gggacccctg 5760

ctgcagctga gccagtgacc cccaccagca aagcaggctc aggtgcacca gggggcacca 5820

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ggagggacaa ggggaaattg tccaggctca aacctgcccc gccgccccca ccagcagcct 5940

ctgcagggaa ggctggagga aagccctcgc agagcccgag ccaggaggcg gccggggagg 6000

cagtcctggg cgcaaagaca aaagccacga gtctggttga tgctgtgaac agtgacgctg 6060

ccaagcccag ccagccggga gagggcctca aaaagcccgt gctcccggcc actccaaagc 6120

cacagtccgc caagccgtcg gggaccccca tcagcccagc ccccgttccc tccacgttgc 6180

catcagcatc ctcggccctg gcaggggacc agccgtcttc caccgccttc atccctctca 6240

tatcaacccg agtgtctctt cggaaaaccc gccagcctcc agagcggatc gccagcggcg 6300

ccatcaccaa gggcgtggtc ctggacagca ccgaggcgct gtgcctcgcc atctctagga 6360

actccgagca gatggccagc cacagcgcag tgctggaggc cggcaaaaac ctctacacgt 6420

tctgcgtgag ctatgtggat tccatccagc aaatgaggaa caagtttgcc ttccgagagg 6480

ccatcaacaa actggagaat aatctccggg agcttcagat ctgcccggcg acagcaggca 6540

gtggtccagc ggccactcag gacttcagca agctcctcag ttcggtgaag gaaatcagtg 6600

acatagtgca gaggtagcag cagtcagggg tcaggtgtca ggcccgtcgg agctgcctgc 6660

agcacatgcg ggctcgccca tacccgtgac agtggctgac aagggactag tgagtcagca 6720

ccttggccca ggagctctgc gccaggcaga gctgagggcc ctgtggagtc cagctctact 6780

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gccccgctcc cacctagtgc cccagactga gctctccagg ccaggtggga acggctgatg 6960

tggactgtct ttttcatttt tttctctctg gagcccctcc tcccccggct gggcctcctt 7020

cttccacttc tccaagaatg gaagcctgaa ctgaggcctt gtgtgtcagg ccctctgcct 7080

gcactccctg gccttgcccg tcgtgtgctg aagacatgtt tcaagaaccg catttcggga 7140

agggcatgca cgggcatgca cacggctggt cactctgccc tctgctgctg cccggggtgg 7200

ggtgcactcg ccatttcctc acgtgcagga cagctcttga tttgggtgga aaacagggtg 7260

ctaaagccaa ccagcctttg ggtcctgggc aggtgggagc tgaaaaggat cgaggcatgg 7320

ggcatgtcct ttccatctgt ccacatcccc agagcccagc tcttgctctc ttgtgacgtg 7380

cactgtgaat cctggcaaga aagcttgagt ctcaagggtg gcaggtcact gtcactgccg 7440

acatccctcc cccagcagaa tggaggcagg ggacaaggga ggcagtggct agtggggtga 7500

acagctggtg ccaaatagcc ccagactggg cccaggcagg tctgcaaggg cccagagtga 7560

accgtccttt cacacatctg ggtgccctga aagggccctt cccctccccc actcctctaa 7620

gacaaagtag attcttacaa ggccctttcc tttggaacaa gacagccttc acttttctga 7680

gttcttgaag catttcaaag ccctgcctct gtgtagccgc cctgagagag aatagagctg 7740

ccactgggca cctgcgcaca ggtgggagga aagggcctgg ccagtcctgg tcctggctgc 7800

actcttgaac tgggcgaatg tcttatttaa ttaccgtgag tgacatagcc tcatgttctg 7860

tgggggtcat cagggagggt taggaaaacc acaaacggag cccctgaaag cctcacgtat 7920

ttcacagagc acgcctgcca tcttctcccc gaggctgccc caggccggag cccagatacg 7980

ggggctgtga ctctgggcag ggacccgggg tctcctggac cttgacagag cagctaactc 8040

cgagagcagt gggcaggtgg ccgcccctga ggcttcacgc cgggagaagc caccttccca 8100

ccccttcata ccgcctcgtg ccagcagcct cgcacaggcc ctagctttac gctcatcacc 8160

taaacttgta ctttattttt ctgatagaaa tggtttcctc tggatcgttt tatgcggttc 8220

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caccgacagc ggccttgaag acagagcaaa gcgcccaccc aggtcccccg actgcctgtc 8340

tccatgaggt actggtccct tccttttgtt aacgtgatgt gccactatat tttacacgta 8400

tctcttggta tgcatctttt atagacgctc ttttctaagt ggcgtgtgca tagcgtcctg 8460

ccctgccccc tcgggggcct gtggtggctc cccctctgct tctcggggtc cagtgcattt 8520

tgtttctgta tatgattctc tgtggttttt tttgaatcca aatctgtcct ctgtagtatt 8580

ttttaaataa atcagtgttt acattagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 8628

<210> 3

<211> 8703

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ggggggaggg tggcggctcg atgggggagc cgcctccagg gggccccccc gccctgtgcc 60

cacggcgcgg cccctttaag aggcccgcct ggctccgtca tccgcgccgc ggccacctcc 120

ccccggccct ccccttcctg cggcgcagag tgcgggccgg gcgggagtgc ggcgagagcc 180

ggctggctga gcttagcgtc cgaggaggcg gcggcggcgg cggcggcacg gcggcggcgg 240

ggctgtgggg cggtgcggaa gcgagaggcg aggagcgcgc gggccgtggc cagagtctgg 300

cggcggcctg gcggagcgga gagcagcgcc cgcgcctcgc cgtgcggagg agccccgcac 360

acaatagcgg cgcgcgcagc ccgcgccctt ccccccggcg cgccccgccc cgcgcgccga 420

gcgccccgct ccgcctcacc tgccaccagg gagtgggcgg gcattgttcg ccgccgccgc 480

cgccgcgcgg gccatggggg ccgcccggcg cccggggccg ggctggcgag gcgccgcgcc 540

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tggacccggt gggcttcgcg gaggcgtgga aggcgcagtt cccggactca gagcccccgc 660

gcatggagct gcgctcagtg ggcgacatcg agcaggagct ggagcgctgc aaggcctcca 720

ttcggcgcct ggagcaggag gtgaaccagg agcgcttccg catgatctac ctgcagacgt 780

tgctggccaa ggaaaagaag agctatgacc ggcagcgatg gggcttccgg cgcgcggcgc 840

aggcccccga cggcgcctcc gagccccgag cgtccgcgtc gcgcccgcag ccagcgcccg 900

ccgacggagc cgacccgccg cccgccgagg agcccgaggc ccggcccgac ggcgagggtt 960

ctccgggtaa ggccaggccc gggaccgccc gcaggcccgg ggcagccgcg tcgggggaac 1020

gggacgaccg gggacccccc gccagcgtgg cggcgctcag gtccaacttc gagcggatcc 1080

gcaagggcca tggccagccc ggggcggacg ccgagaagcc cttctacgtg aacgtcgagt 1140

ttcaccacga gcgcggcctg gtgaaggtca acgacaaaga ggtgtcggac cgcatcagct 1200

ccctgggcag ccaggccatg cagatggagc gcaaaaagtc ccagcacggc gcgggctcga 1260

gcgtggggga tgcatccagg cccccttacc ggggacgctc ctcggagagc agctgcggcg 1320

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acgccaatgg cggtagcagg cccccttggc cgcccctgga gtaccagccc taccagagca 1440

tctacgtcgg gggcatgatg gaaggggagg gcaagggccc gctcctgcgc agccagagca 1500

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aggattgcgg aggcggctat accccggact gcagctccaa tgagaacctc acctccagcg 1620

aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca 1680

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gggagcagca gaagaagtgt ttcagaagct tctccctgac atccgtggag ctgcagatgc 3240

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aagatgatga gtctccgggg ctctatgggt ttctgaatgt catcgtccac tcagccactg 3360

gatttaagca gagttcaaaa gcccttcagc ggccagtagc atctgacttt gagcctcagg 3420

gtctgagtga agccgctcgt tggaactcca aggaaaacct tctcgctgga cccagtgaaa 3480

atgaccccaa ccttttcgtt gcactgtatg attttgtggc cagtggagat aacactctaa 3540

gcataactaa aggtgaaaag ctccgggtct taggctataa tcacaatggg gaatggtgtg 3600

aagcccaaac caaaaatggc caaggctggg tcccaagcaa ctacatcacg ccagtcaaca 3660

gtctggagaa acactcctgg taccatgggc ctgtgtcccg caatgccgct gagtatctgc 3720

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ggtccatctc gctgagatac gaagggaggg tgtaccatta caggatcaac actgcttctg 3840

atggcaagct ctacgtctcc tccgagagcc gcttcaacac cctggccgag ttggttcatc 3900

atcattcaac ggtggccgac gggctcatca ccacgctcca ttatccagcc ccaaagcgca 3960

acaagcccac tgtctatggt gtgtccccca actacgacaa gtgggagatg gaacgcacgg 4020

acatcaccat gaagcacaag ctgggcgggg gccagtacgg ggaggtgtac gagggcgtgt 4080

ggaagaaata cagcctgacg gtggccgtga agaccttgaa ggaggacacc atggaggtgg 4140

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tccttggggt ctgcacccgg gagcccccgt tctatatcat cactgagttc atgacctacg 4260

ggaacctcct ggactacctg agggagtgca accggcagga ggtgaacgcc gtggtgctgc 4320

tgtacatggc cactcagatc tcgtcagcca tggagtacct ggagaagaaa aacttcatcc 4380

acagagatct tgctgcccga aactgcctgg taggggagaa ccacttggtg aaggtagctg 4440

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acgtctgggc atttggagta ttgctttggg aaattgctac ctatggcatg tccccttacc 4620

cgggaattga cctgtcccag gtgtatgagc tgctagagaa ggactaccgc atggagcgcc 4680

cagaaggctg cccagagaag gtctatgaac tcatgcgagc atgttggcag tggaatccct 4740

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agggcggcct gaatgaagat gagcgccttc tccccaaaga caaaaagacc aacttgttca 5100

gcgccttgat caagaagaag aagaagacag ccccaacccc tcccaaacgc agcagctcct 5160

tccgggagat ggacggccag ccggagcgca gaggggccgg cgaggaagag ggccgagaca 5220

tcagcaacgg ggcactggct ttcaccccct tggacacagc tgacccagcc aagtccccaa 5280

agcccagcaa tggggctggg gtccccaatg gagccctccg ggagtccggg ggctcaggct 5340

tccggtctcc ccacctgtgg aagaagtcca gcacgctgac cagcagccgc ctagccaccg 5400

gcgaggagga gggcggtggc agctccagca agcgcttcct gcgctcttgc tccgcctcct 5460

gcgttcccca tggggccaag gacacggagt ggaggtcagt cacgctgcct cgggacttgc 5520

agtccacggg aagacagttt gactcgtcca catttggagg gcacaaaagt gagaagccgg 5580

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cctctgagtc gccagggagg gacaagggga aattgtccag gctcaaacct gccccgccgc 6000

ccccaccagc agcctctgca gggaaggctg gaggaaagcc ctcgcagagc ccgagccagg 6060

aggcggccgg ggaggcagtc ctgggcgcaa agacaaaagc cacgagtctg gttgatgctg 6120

tgaacagtga cgctgccaag cccagccagc cgggagaggg cctcaaaaag cccgtgctcc 6180

cggccactcc aaagccacag tccgccaagc cgtcggggac ccccatcagc ccagcccccg 6240

ttccctccac gttgccatca gcatcctcgg ccctggcagg ggaccagccg tcttccaccg 6300

ccttcatccc tctcatatca acccgagtgt ctcttcggaa aacccgccag cctccagagc 6360

ggatcgccag cggcgccatc accaagggcg tggtcctgga cagcaccgag gcgctgtgcc 6420

tcgccatctc taggaactcc gagcagatgg ccagccacag cgcagtgctg gaggccggca 6480

aaaacctcta cacgttctgc gtgagctatg tggattccat ccagcaaatg aggaacaagt 6540

ttgccttccg agaggccatc aacaaactgg agaataatct ccgggagctt cagatctgcc 6600

cggcgacagc aggcagtggt ccagcggcca ctcaggactt cagcaagctc ctcagttcgg 6660

tgaaggaaat cagtgacata gtgcagaggt agcagcagtc aggggtcagg tgtcaggccc 6720

gtcggagctg cctgcagcac atgcgggctc gcccataccc gtgacagtgg ctgacaaggg 6780

actagtgagt cagcaccttg gcccaggagc tctgcgccag gcagagctga gggccctgtg 6840

gagtccagct ctactaccta cgtttgcacc gcctgccctc ccgcaccttc ctcctccccg 6900

ctccgtctct gtcctcgaat tttatctgtg gagttcctgc tccgtggact gcagtcggca 6960

tgccaggacc cgccagcccc gctcccacct agtgccccag actgagctct ccaggccagg 7020

tgggaacggc tgatgtggac tgtctttttc atttttttct ctctggagcc cctcctcccc 7080

cggctgggcc tccttcttcc acttctccaa gaatggaagc ctgaactgag gccttgtgtg 7140

tcaggccctc tgcctgcact ccctggcctt gcccgtcgtg tgctgaagac atgtttcaag 7200

aaccgcattt cgggaagggc atgcacgggc atgcacacgg ctggtcactc tgccctctgc 7260

tgctgcccgg ggtggggtgc actcgccatt tcctcacgtg caggacagct cttgatttgg 7320

gtggaaaaca gggtgctaaa gccaaccagc ctttgggtcc tgggcaggtg ggagctgaaa 7380

aggatcgagg catggggcat gtcctttcca tctgtccaca tccccagagc ccagctcttg 7440

ctctcttgtg acgtgcactg tgaatcctgg caagaaagct tgagtctcaa gggtggcagg 7500

tcactgtcac tgccgacatc cctcccccag cagaatggag gcaggggaca agggaggcag 7560

tggctagtgg ggtgaacagc tggtgccaaa tagccccaga ctgggcccag gcaggtctgc 7620

aagggcccag agtgaaccgt cctttcacac atctgggtgc cctgaaaggg cccttcccct 7680

cccccactcc tctaagacaa agtagattct tacaaggccc tttcctttgg aacaagacag 7740

ccttcacttt tctgagttct tgaagcattt caaagccctg cctctgtgta gccgccctga 7800

gagagaatag agctgccact gggcacctgc gcacaggtgg gaggaaaggg cctggccagt 7860

cctggtcctg gctgcactct tgaactgggc gaatgtctta tttaattacc gtgagtgaca 7920

tagcctcatg ttctgtgggg gtcatcaggg agggttagga aaaccacaaa cggagcccct 7980

gaaagcctca cgtatttcac agagcacgcc tgccatcttc tccccgaggc tgccccaggc 8040

cggagcccag atacgggggc tgtgactctg ggcagggacc cggggtctcc tggaccttga 8100

cagagcagct aactccgaga gcagtgggca ggtggccgcc cctgaggctt cacgccggga 8160

gaagccacct tcccacccct tcataccgcc tcgtgccagc agcctcgcac aggccctagc 8220

tttacgctca tcacctaaac ttgtacttta tttttctgat agaaatggtt tcctctggat 8280

cgttttatgc ggttcttaca gcacatcacc tctttgcccc cgacggctgt gacgcagccg 8340

gagggaggca ctagtcaccg acagcggcct tgaagacaga gcaaagcgcc cacccaggtc 8400

ccccgactgc ctgtctccat gaggtactgg tcccttcctt ttgttaacgt gatgtgccac 8460

tatattttac acgtatctct tggtatgcat cttttataga cgctcttttc taagtggcgt 8520

gtgcatagcg tcctgccctg ccccctcggg ggcctgtggt ggctccccct ctgcttctcg 8580

gggtccagtg cattttgttt ctgtatatga ttctctgtgg ttttttttga atccaaatct 8640

gtcctctgta gtatttttta aataaatcag tgtttacatt agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8700

aaa 8703

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

atggctcgtt cggaacacca cctggatacg gctgcgctgc agaccgggca gaggagcagc 60

gccggcacca agatgggctg ccctacattg atgactcgcc ctcctcatcg ccccacctca 120

gcagcaaggg caggggcagc cgggatgcgc tggtctcggg agccctggag tccactaaag 180

cgagtgagct ggacttggaa aagggcttgg agatgagaaa atgggtcctg tcgggaatcc 240

tggctagcga ggagacttac ctgagccacc tggaggcact gctgctgccc atgaagcctt 300

tgaaagccgc tgccaccacc tctcagccgg tgctgacgag tcagcagatc gagaccatct 360

tcttcaaagt gcctgagctc tacgagatcc acaaggagtt ctatgatggg ctcttccccc 420

gcgtgcagca gtggagccac cagcagcggg tgggcgacct cttccagaag ctggccagcc 480

agctgggtgt gtaccgggcc ttcgtggaca actacggagt tgccatggaa atggctgaga 540

agtgctgtca ggccaatgct cagtttgcag aaatctccga gaacctgaga gccagaagca 600

acaaagatgc caaggatcca acgaccaaga actctctgga aactctgctc tacaagcctg 660

tggaccgtgt gacgaggagc acgctggtcc tccatgactt gctgaagcac actcctgcca 720

gccaccctga ccaccccttg ctgcaggacg ccctccgcat ctcacagaac ttcctgtcca 780

gcatcaatga ggagatcaca ccccgacggc agtccatgac ggtgaagaag ggagagcacc 840

ggcagctgct gaaggacagc ttcatggtgg agctggtgga gggggcccgc aagctgcgcc 900

acgtcttcct gttcaccgac ctgcttctct gcaccaagct caagaagcag agcggaggca 960

aaacgcagca gtatgactgc aaatggtaca ttccgctcac ggatctcagc ttccagatgg 1020

tggatgaact ggaggcagtg cccaacatcc ccctggtgcc cgatgaggag ctggacgctt 1080

tgaagatcaa gatctcccag atcaagaatg acatccagag agagaagagg gcgaacaagg 1140

gcagcaaggc tacggagagg ctgaagaaga agctgtcgga gcaggagtca ctgctgctgc 1200

ttatgtctcc cagcatggcc ttcagggtgc acagccgcaa cggcaagagt tacacgttcc 1260

tgatctcctc tgactatgag cgtgcagagt ggagggagaa catccgggag cagcagaaga 1320

agtgtttcag aagcttctcc ctgacatccg tggagctgca gatgctgacc aactcgtgtg 1380

tgaaactcca gactgtccac agcattccgc tgaccatcaa taaggaagat gatgagtctc 1440

cggggctcta tgggtttctg aatgtcatcg tccactcagc cactggattt aagcagagtt 1500

caa 1503

<210> 5

<211> 1428

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

atggctcgtt cggaacacca cctggatacg gctgcgctgc agaccgggca gaggagcagc 60

gccggcacca agatgggctg ccctacattg atgactcgcc ctcctcatcg ccccacctca 120

gcagcaaggg caggggcagc cgggatgcgc tggtctcggg agccctggag tccactaaag 180

cgagtgagct ggacttggaa aagggcttgg agatgagaaa atgggtcctg tcgggaatcc 240

tggctagcga ggagacttac ctgagccacc tggaggcact gctgctgccc atgaagcctt 300

tgaaagccgc tgccaccacc tctcagccgg tgctgacgag tcagcagatc gagaccatct 360

tcttcaaagt gcctgagctc tacgagatcc acaaggagtt ctatgatggg ctcttccccc 420

gcgtgcagca gtggagccac cagcagcggg tgggcgacct cttccagaag ctggccagcc 480

agctgggtgt gtaccgggcc ttcgtggaca actacggagt tgccatggaa atggctgaga 540

agtgctgtca ggccaatgct cagtttgcag aaatctccga gaacctgaga gccagaagca 600

acaaagatgc caaggatcca acgaccaaga actctctgga aactctgctc tacaagcctg 660

tggaccgtgt gacgaggagc acgctggtcc tccatgactt gctgaagcac actcctgcca 720

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gcatcaatga ggagatcaca ccccgacggc agtccatgac ggtgaagaag ggagagcacc 840

ggcagctgct gaaggacagc ttcatggtgg agctggtgga gggggcccgc aagctgcgcc 900

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ttatgtctcc cagcatggcc ttcagggtgc acagccgcaa cggcaagagt tacacgttcc 1260

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<210> 6

<211> 181

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

agttacacgt tcctgatctc ctctgactat gagcgtgcag agtggaggga gaacatccgg 60

gagcagcaga agaagtgttt cagaagcttc tccctgacat ccgtggagct gcagatgctg 120

accaactcgt gtgtgaaact ccagactgtc cacagcattc cgctgaccat caataaggaa 180

g 181

<210> 7

<211> 105

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

gtttcagaag cttctccctg acatccgtgg agctgcagat gctgaccaac tcgtgtgtga 60

aactccagac tgtccacagc attccgctga ccatcaataa ggaag 105

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

agggagaagc ttctgaaaca c 21

<210> 9

<211> 5325

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

aagcccttca gcggccagta gcatctgact ttgagcctca gggtctgagt gaagccgctc 60

gttggaactc caaggaaaac cttctcgctg gacccagtga aaatgacccc aaccttttcg 120

ttgcactgta tgattttgtg gccagtggag ataacactct aagcataact aaaggtgaaa 180

agctccgggt cttaggctat aatcacaatg gggaatggtg tgaagcccaa accaaaaatg 240

gccaaggctg ggtcccaagc aactacatca cgccagtcaa cagtctggag aaacactcct 300

ggtaccatgg gcctgtgtcc cgcaatgccg ctgagtatct gctgagcagc gggatcaatg 360

gcagcttctt ggtgcgtgag agtgagagca gtcctggcca gaggtccatc tcgctgagat 420

acgaagggag ggtgtaccat tacaggatca acactgcttc tgatggcaag ctctacgtct 480

cctccgagag ccgcttcaac accctggccg agttggttca tcatcattca acggtggccg 540

acgggctcat caccacgctc cattatccag ccccaaagcg caacaagccc actgtctatg 600

gtgtgtcccc caactacgac aagtgggaga tggaacgcac ggacatcacc atgaagcaca 660

agctgggcgg gggccagtac ggggaggtgt acgagggcgt gtggaagaaa tacagcctga 720

cggtggccgt gaagaccttg aaggaggaca ccatggaggt ggaagagttc ttgaaagaag 780

ctgcagtcat gaaagagatc aaacacccta acctggtgca gctccttggg gtctgcaccc 840

gggagccccc gttctatatc atcactgagt tcatgaccta cgggaacctc ctggactacc 900

tgagggagtg caaccggcag gaggtgaacg ccgtggtgct gctgtacatg gccactcaga 960

tctcgtcagc catggagtac ctggagaaga aaaacttcat ccacagagat cttgctgccc 1020

gaaactgcct ggtaggggag aaccacttgg tgaaggtagc tgattttggc ctgagcaggt 1080

tgatgacagg ggacacctac acagcccatg ctggagccaa gttccccatc aaatggactg 1140

cacccgagag cctggcctac aacaagttct ccatcaagtc cgacgtctgg gcatttggag 1200

tattgctttg ggaaattgct acctatggca tgtcccctta cccgggaatt gacctgtccc 1260

aggtgtatga gctgctagag aaggactacc gcatggagcg cccagaaggc tgcccagaga 1320

aggtctatga actcatgcga gcatgttggc agtggaatcc ctctgaccgg ccctcctttg 1380

ctgaaatcca ccaagccttt gaaacaatgt tccaggaatc cagtatctca gacgaagtgg 1440

aaaaggagct ggggaaacaa ggcgtccgtg gggctgtgag taccttgctg caggccccag 1500

agctgcccac caagacgagg acctccagga gagctgcaga gcacagagac accactgacg 1560

tgcctgagat gcctcactcc aagggccagg gagagagcga tcctctggac catgagcctg 1620

ccgtgtctcc attgctccct cgaaaagagc gaggtccccc ggagggcggc ctgaatgaag 1680

atgagcgcct tctccccaaa gacaaaaaga ccaacttgtt cagcgccttg atcaagaaga 1740

agaagaagac agccccaacc cctcccaaac gcagcagctc cttccgggag atggacggcc 1800

agccggagcg cagaggggcc ggcgaggaag agggccgaga catcagcaac ggggcactgg 1860

ctttcacccc cttggacaca gctgacccag ccaagtcccc aaagcccagc aatggggctg 1920

gggtccccaa tggagccctc cgggagtccg ggggctcagg cttccggtct ccccacctgt 1980

ggaagaagtc cagcacgctg accagcagcc gcctagccac cggcgaggag gagggcggtg 2040

gcagctccag caagcgcttc ctgcgctctt gctccgcctc ctgcgttccc catggggcca 2100

aggacacgga gtggaggtca gtcacgctgc ctcgggactt gcagtccacg ggaagacagt 2160

ttgactcgtc cacatttgga gggcacaaaa gtgagaagcc ggctctgcct cggaagaggg 2220

caggggagaa caggtctgac caggtgaccc gaggcacagt aacgcctccc cccaggctgg 2280

tgaaaaagaa tgaggaagct gctgatgagg tcttcaaaga catcatggag tccagcccgg 2340

gctccagccc gcccaacctg actccaaaac ccctccggcg gcaggtcacc gtggcccctg 2400

cctcgggcct cccccacaag gaagaagctg gaaagggcag tgccttaggg acccctgctg 2460

cagctgagcc agtgaccccc accagcaaag caggctcagg tgcaccaggg ggcaccagca 2520

agggccccgc cgaggagtcc agagtgagga ggcacaagca ctcctctgag tcgccaggga 2580

gggacaaggg gaaattgtcc aggctcaaac ctgccccgcc gcccccacca gcagcctctg 2640

cagggaaggc tggaggaaag ccctcgcaga gcccgagcca ggaggcggcc ggggaggcag 2700

tcctgggcgc aaagacaaaa gccacgagtc tggttgatgc tgtgaacagt gacgctgcca 2760

agcccagcca gccgggagag ggcctcaaaa agcccgtgct cccggccact ccaaagccac 2820

agtccgccaa gccgtcgggg acccccatca gcccagcccc cgttccctcc acgttgccat 2880

cagcatcctc ggccctggca ggggaccagc cgtcttccac cgccttcatc cctctcatat 2940

caacccgagt gtctcttcgg aaaacccgcc agcctccaga gcggatcgcc agcggcgcca 3000

tcaccaaggg cgtggtcctg gacagcaccg aggcgctgtg cctcgccatc tctaggaact 3060

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gcgtgagcta tgtggattcc atccagcaaa tgaggaacaa gtttgccttc cgagaggcca 3180

tcaacaaact ggagaataat ctccgggagc ttcagatctg cccggcgaca gcaggcagtg 3240

gtccagcggc cactcaggac ttcagcaagc tcctcagttc ggtgaaggaa atcagtgaca 3300

tagtgcagag gtagcagcag tcaggggtca ggtgtcaggc ccgtcggagc tgcctgcagc 3360

acatgcgggc tcgcccatac ccgtgacagt ggctgacaag ggactagtga gtcagcacct 3420

tggcccagga gctctgcgcc aggcagagct gagggccctg tggagtccag ctctactacc 3480

tacgtttgca ccgcctgccc tcccgcacct tcctcctccc cgctccgtct ctgtcctcga 3540

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actgtctttt tcattttttt ctctctggag cccctcctcc cccggctggg cctccttctt 3720

ccacttctcc aagaatggaa gcctgaactg aggccttgtg tgtcaggccc tctgcctgca 3780

ctccctggcc ttgcccgtcg tgtgctgaag acatgtttca agaaccgcat ttcgggaagg 3840

gcatgcacgg gcatgcacac ggctggtcac tctgccctct gctgctgccc ggggtggggt 3900

gcactcgcca tttcctcacg tgcaggacag ctcttgattt gggtggaaaa cagggtgcta 3960

aagccaacca gcctttgggt cctgggcagg tgggagctga aaaggatcga ggcatggggc 4020

atgtcctttc catctgtcca catccccaga gcccagctct tgctctcttg tgacgtgcac 4080

tgtgaatcct ggcaagaaag cttgagtctc aagggtggca ggtcactgtc actgccgaca 4140

tccctccccc agcagaatgg aggcagggga caagggaggc agtggctagt ggggtgaaca 4200

gctggtgcca aatagcccca gactgggccc aggcaggtct gcaagggccc agagtgaacc 4260

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aaagtagatt cttacaaggc cctttccttt ggaacaagac agccttcact tttctgagtt 4380

cttgaagcat ttcaaagccc tgcctctgtg tagccgccct gagagagaat agagctgcca 4440

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cttgaactgg gcgaatgtct tatttaatta ccgtgagtga catagcctca tgttctgtgg 4560

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acttgtactt tatttttctg atagaaatgg tttcctctgg atcgttttat gcggttctta 4920

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taaataaatc agtgtttaca ttagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 5325

<210> 10

<211> 174

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

aagcccttca gcggccagta gcatctgact ttgagcctca gggtctgagt gaagccgctc 60

gttggaactc caaggaaaac cttctcgctg gacccagtga aaatgacccc aaccttttcg 120

ttgcactgta tgattttgtg gccagtggag ataacactct aagcataact aaag 174

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

cctgaggctc aaagtcagat gctac 25

<210> 12

<211> 1875

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

ggggggaggg tggcggctcg atgggggagc cgcctccagg gggccccccc gccctgtgcc 60

cacggcgcgg cccctttaag aggcccgcct ggctccgtca tccgcgccgc ggccacctcc 120

ccccggccct ccccttcctg cggcgcagag tgcgggccgg gcgggagtgc ggcgagagcc 180

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ggctgtgggg cggtgcggaa gcgagaggcg aggagcgcgc gggccgtggc cagagtctgg 300

cggcggcctg gcggagcgga gagcagcgcc cgcgcctcgc cgtgcggagg agccccgcac 360

acaatagcgg cgcgcgcagc ccgcgccctt ccccccggcg cgccccgccc cgcgcgccga 420

gcgccccgct ccgcctcacc tgccaccagg gagtgggcgg gcattgttcg ccgccgccgc 480

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tggacccggt gggcttcgcg gaggcgtgga aggcgcagtt cccggactca gagcccccgc 660

gcatggagct gcgctcagtg ggcgacatcg agcaggagct ggagcgctgc aaggcctcca 720

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gggacgaccg gggacccccc gccagcgtgg cggcgctcag gtccaacttc gagcggatcc 1080

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aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca 1680

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<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

tcgcaacagt ccttcgacag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

atcgtgggcg tccgcaagac 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

cagagctgcc caccaagac 19

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

agaaggcgct catcttcatt cag 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

ctgagatgcc tcactccaag ggc 23

<210> 18

<211> 3416

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

gggaaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatct actagtcata tggattcatg 60

cagatggagc gcaaaaagtc ccagcacggc gcgggctcga gcgtggggga tgcatccagg 120

cccccttacc ggggacgctc ctcggagagc agctgcggcg tcgacggcga ctacgaggac 180

gccgagttga acccccgctt cctgaaggac aacctgatcg acgccaatgg cggtagcagg 240

cccccttggc cgcccctgga gtaccagccc taccagagca tctacgtcgg gggcatgatg 300

gaaggggagg gcaagggccc gctcctgcgc agccagagca cctctgagca ggagaagcgc 360

cttacctggc cccgcaggtc ctactccccc cggagttttg aggattgcgg aggcggctat 420

accccggact gcagctccaa tgagaacctc acctccagcg aggaggactt ctcctctggc 480

cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca tgttccggga caaaagccgc 540

tctccctcgc agaactcgca acagtccttc gacagcagca gtccccccac gccgcagtgc 600

cataagcggc accggcactg cccggttgtc gtgtccgagg ccaccatcgt gggcgtccgc 660

aagaccgggc agatctggcc caacgatggc gagggcgcct tccatggaga cgcagatggc 720

tcgttcggaa caccacctgg atacggctgc gctgcagacc gggcagagga gcagcgccgg 780

caccaagatg ggctgcccta cattgatgac tcgccctcct catcgcccca cctcagcagc 840

aagggcaggg gcagccggga tgcgctggtc tcgggagccc tggagtccac taaagcgagt 900

gagctggact tggaaaaggg cttggagatg agaaaatggg tcctgtcggg aatcctggct 960

agcgaggaga cttacctgag ccacctggag gcactgctgc tgcccatgaa gcctttgaaa 1020

gccgctgcca ccacctctca gccggtgctg acgagtcagc agatcgagac catcttcttc 1080

aaagtgcctg agctctacga gatccacaag gagttctatg atgggctctt cccccgcgtg 1140

cagcagtgga gccaccagca gcgggtgggc gacctcttcc agaagctggc cagccagctg 1200

ggtgtgtacc gggccttcgt ggacaactac ggagttgcca tggaaatggc tgagaagtgc 1260

tgtcaggcca atgctcagtt tgcagaaatc tccgagaacc tgagagccag aagcaacaaa 1320

gatgccaagg atccaacgac caagaactct ctggaaactc tgctctacaa gcctgtggac 1380

cgtgtgacga ggagcacgct ggtcctccat gacttgctga agcacactcc tgccagccac 1440

cctgaccacc ccttgctgca ggacgccctc cgcatctcac agaacttcct gtccagcatc 1500

aatgaggaga tcacaccccg acggcagtcc atgacggtga agaagggaga gcaccggcag 1560

ctgctgaagg acagcttcat ggtggagctg gtggaggggg cccgcaagct gcgccacgtc 1620

ttcctgttca ccgacctgct tctctgcacc aagctcaaga agcagagcgg aggcaaaacg 1680

cagcagtatg actgcaaatg gtacattccg ctcacggatc tcagcttcca gatggtggat 1740

gaactggagg cagtgcccaa catccccctg gtgcccgatg aggagctgga cgctttgaag 1800

atcaagatct cccagatcaa gaatgacatc cagagagaga agagggcgaa caagggcagc 1860

aaggctacgg agaggctgaa gaagaagctg tcggagcagg agtcactgct gctgcttatg 1920

tctcccagca tggccttcag ggtgcacagc cgcaacggca agagttacac gttcctgatc 1980

tcctctgact atgagcgtgc agagtggagg gagaacatcc gggagcagca gaagaagtgt 2040

ttcagaagct tctccctgac atccgtggag ctgcagatgc tgaccaactc gtgtgtgaaa 2100

ctccagactg tccacagcat tccgctgacc atcaataagg aagatgatga gtctccgggg 2160

ctctatgggt ttctgaatgt catcgtccac tcagccactg gatttaagca gagttcaaaa 2220

gcccttcagc ggccagtagc atctgacttt gagcctcagg gtctgagtga agccgctcgt 2280

tggaactcca aggaaaacct tctcgctgga cccagtgaaa atgaccccaa ccttttcgtt 2340

gcactgtatg attttgtggc cagtggagat aacactctaa gcataactaa aggtgaaaag 2400

ctccgggtct taggctataa tcacaatggg gaatggtgtg aagcccaaac caaaaatggc 2460

caaggctggg tcccaagcaa ctacatcacg ccagtcaaca gtctggagaa acactcctgg 2520

taccatgggc ctgtgtcccg caatgccgct gagtatctgc tgagcagcgg gatcaatggc 2580

agcttcttgg tgcgtgagag tgagagcagt cctggccaga ggtccatctc gctgagatac 2640

gaagggaggg tgtaccatta caggatcaac actgcttctg atggcaagct ctacgtctcc 2700

tccgagagcc gcttcaacac cctggccgag ttggttcatc atcattcaac ggtggccgac 2760

gggctcatca ccacgctcca ttatccagcc ccaaagcgca acaagcccac tgtctatggt 2820

gtgtccccca actacgacaa gtgggagatg gaacgcacgg acatcaccat gaagcacaag 2880

ctgggcgggg gccagtacgg ggaggtgtac gagggcgtgt ggaagaaata cagcctgacg 2940

gtggccgtga agaccttgaa ggaggacacc atggaggtgg aagagttctt gaaagaagct 3000

gcagtcatga aagagatcaa acaccctaac ctggtgcagc tccttggggt ctgcacccgg 3060

gagcccccgt tctatatcat cactgagttc atgacctacg ggaacctcct ggactacctg 3120

agggagtgca accggcagga ggtgaacgcc gtggtgctgc tgtacatggc cactcagatc 3180

tcgtcagcca tggagtacct ggagaagaaa aacttcatcc acagagatct tgctgcccga 3240

aactgcctgg taggggagaa ccacttggtg aaggtagctg attttggcct gagcaggttg 3300

atgacagggg acacctacac agcccatgct ggagccaagt tccccatcaa atggactgca 3360

cccgagagcc tggcctacaa caagttctcc atcaagtccg acgtctgggc agaatt 3416

<210> 19

<211> 580

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

gggaaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatct actagtcata tggattcctc 60

acctccagcg aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc aagccccacc 120

acctaccgca tgttccggga caaaagccgc tctccctcgc agaactcgca acagtccttc 180

gacagcagca gtccccccac gccgcagtgc cataagcggc accggcactg cccggttgtc 240

gtgtccgagg ccaccatcgt gggcgtccgc aagaccgggc agatctggcc caacgatggc 300

gagggcgcct tccatggaga cgcagaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag 360

cctcagggtc tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct cgctggaccc 420

agtgaaaatg accccaacct tttcgttgca ctgtatgatt ttgtggccag tggagataac 480

actctaagca taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca caatggggaa 540

tggtgtgaag cccaaatcgg atccccgggt accgagctcg 580

<210> 20

<211> 759

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

gggaaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatct actagtcata tggattgttg 60

gcagtggaat ccctctgacc ggccctcctt tgctgaaatc caccaagcct ttgaaacaat 120

gttccaggaa tccagtatct cagacgaagt ggaaaaggag ctggggaaac aaggcgtccg 180

tggggctgtg agtaccttgc tgcaggcccc agagctgccc accaagacga ggacctccag 240

gagagctgca gagcacagag acaccactga cgtgcctgag atgcctcact ccaagggcca 300

gggagagagc gatcctctgg accatgagcc tgccgtgtct ccattgctcc ctcgaaaaga 360

gcgaggtccc ccggagggcg gcctgaatga agatgagcgc cttctcccca aagacaaaaa 420

gaccaacttg ttcagcgcct tgatcaagaa gaagaagaag acagccccaa cccctcccaa 480

acgcagcagc tccttccggg agatggacgg ccagccggag cgcagagggg ccggcgagga 540

agagggccga gacatcagca acggggcact ggctttcacc cccttggaca cagctgaccc 600

agccaagtcc ccaaagccca gcaatggggc tggggtcccc aatggagccc tccgggagtc 660

cgggggctca ggcttccggt ctccccacct gtggaagaag tccagcacgc tgaccagcag 720

ccgcctagca atcggatccc cgggtaccga gctcgaatt 759

Claims (17)

1.一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的方法，其包括：

(1)在具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，以获得自对象的核酸试样作为模板、使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物来进行PCR的步骤；和

(2)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象具有minor BCR-ABL1基因的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰核酸具有BCR基因的外显子2至13的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述修饰核酸具有BCR基因的外显子12和13的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括约10个至约30个核苷酸。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括SEQ ID NO:8的碱基序列。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述修饰核酸包括PNA部分。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述核酸试样为通过对获得自对象的RNA试样进行逆转录而得到的cDNA。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述核酸试样为在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，对获得自对象的RNA试样进行逆转录而得到的cDNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其中用于逆转录的修饰核酸和用于PCR的修饰核酸具有相同的结构。

10.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其中用于逆转录的反向引物和用于PCR的反向引物具有相同的结构。

11.根据权利要求7至10任一项所述的方法，其中逆转录和PCR在同一容器中进行。

12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中PCR为定量PCR。

13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中PCR为定量实时RT-PCR。

14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述对象为人类。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述核酸试样是提取自末梢血白细胞或骨髓液有核细胞的核酸试样。

16.一种用于检测对象者中minor BCR-ABL1基因的表达的试剂盒，其包括：具有BCR基因的外显子2至14的一部分的碱基序列或与其互补的碱基序列的修饰核酸、具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的反向引物、和具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物。

17.一种检测对象中minor BCR-ABL1基因的表达的方法，其包括以下：

(1)在具有与BCR基因的外显子2至14的一部分互补的碱基序列的修饰核酸的存在下，使用具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第1反向引物对获得自对象的RNA试样进行逆转录的步骤；

(2)使用具有BCR基因的外显子1的一部分的碱基序列的正向引物以及具有与ABL1基因的外显子2至11的一部分互补的碱基序列的第2反向引物来进行PCR的步骤；和

(3)当通过PCR使核酸扩增时，判断对象表达minor BCR-ABL1基因的步骤。