CN115198004B - 一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测白血病患者中M‑bcr基因型的试剂盒。所述试剂盒包含一对检测引物和一条检测探针，本发明通过在检测探针特定的碱基位置采用锁核酸标记技术，将探针长度控制在15～18bp，比常规探针长度短30％左右，在提高灵敏度的同时特异性也得到显著提升，其检测灵敏度达到1×101copies/mL，能完全满足临床的低拷贝模板的检测，在病程早期表达量低时即可实现对BCR‑ABL1融合基因M‑bcr基因型的检测，满足白血病患者临床诊断和预后判断需求。

Description

一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，更具体地，涉及一种检测白血病患者中M-bcr基因型(BCR-ABL1融合基因P210亚型)的试剂盒。
背景技术
白血病(Leukemia)，亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤。病源是由于细胞内脱氧核糖核酸的变异形成的骨髓中造血组织的不正常工作。骨髓中的干细胞每天可以制造成千上万的红血球和白细胞。白血病病人过分生产不成熟的白细胞，妨害骨髓的其他工作，这使得骨髓生产其它血细胞的功能降低。白血病可以扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和其它器官。白血病居年轻人恶性疾病中的首位。白血病有多种类型，临床上，一般分急性白血病和慢性白血病。包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性骨髓细胞性白血病(CML)，年轻型骨髓单核细胞性白血病(JML)，成人T细胞淋巴性白血病(ATL)。成年人中最常见的是急性骨髓性白血病和慢性骨髓细胞性白血病，儿童中比较常见的是急性淋巴细胞性白血病。
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)，即慢性骨髓细胞性白血病，是首个被识别的与特定染色体或基因相关的肿瘤性疾病，其标志性特征为费城染色体(Ph染色体)，即9号和22号染色体异位t(9；22)(q34；q11)，致病基础为位九号染色体长臂上的上的原癌基因ABL(位置q34)与二十二号染色体上长臂的BCR基因(位置q11)发生并列性易位而产生一种新的融合基因，即BCR-ABL1融合基因。该融合基因存在于95％以上的慢性粒细胞白血病(CML)、25％-30％的成人和2％-5％的儿童急性白血病(ALL)，以及少数急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)等血液系统肿瘤患者中。BCR-ABL1融合基因是一种抗细胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，可激活多种信号传导途径使细胞过度增殖进而导致细胞调控发生紊乱，干扰细胞的正常增殖和凋亡程序，导致白血病的发生。
根据BCR基因的断裂位点不同，BCR基因与ABL1基因产生3种不同BCR-ABL1融合基因的异构体，分别为主要型(major bcr，M-bcr)即e13a2(原b2a2)或e14a2(原b3a2)，编码P210胞浆蛋白，见于90％以上的CML患者和部分Ph染色体阳性的ALL患者(Ph+-ALL)中；次要型(minor bcr，m-bcr)即e1a2编码P190融合蛋白，绝大部分Ph+ALL患者为该型别；微小型(μ-bcr)即e6a2，e8a2或e19a2等，编码P230融合蛋白，见于2-3％的CML患者。其中，主要型与次要型占95％以上。因此对BCR-ABL1融合基因的分型检测有助于了解疾病的表型，检测白血病患者中BCR-ABL1融合基因是诊断CML的最特异最敏感生物方法之。同时目前对CML患者的治疗已从传统的姑息性治疗、化疗发展到使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinase in-hibitors，TKI)进行分子靶向治疗。经过TKI治疗后可以达到完全的细胞遗传学的缓解(cytogenetic remission，CCR)，即Ph阳性的细胞消失，患者体内可能只存在微小残留病灶。临床上可通过定期监测患者的BCR-ABL1融合基因转录水平来评估酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效及微小残留情况，从而更好的指导患者分子靶向治疗和预后判断。
目前检测BCR-ABL1融合基因常用的检测方法包括高通量转录组测序分析、Northern blot、荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR(qPCR)。而实时荧光定量PCR(qPCR)相较于高通量转录组测序分析、Northern blot和荧光原位杂交(FISH)，具有操作简单、快速、精准等优点，是目前检测融合基因的常见方法。由于BCR-ABL1融合基因M-bcr型在病程早期表达量低，而目前qPCR技术难以检测到如此低含量的表达，因此容易导致假阴性，同时由于BCR-ABL1融合基因M-bcr型与m-bcr型的可设计引物的序列上有诸多重叠，非特异性大大增加，容易导致假阳性，无法实现对M-bcr型与m-bcr型的绝对分型。因此亟需开发灵敏度高且特异性检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的分子诊断产品。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的引物组。
本发明的第二个目的在于提供所述用于检测白血病患者中M-bcr基因型的引物组的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的引物组，包含如下所示的检测引物对和检测探针：
上游引物F：5’-ctcgtgtgtgaaactccagac-3’，
下游引物R：5’-actgggtccagcgagaaggtt-3’；
探针：5’-gGctCtaTggGtttCtg-3’，大写碱基为锁核酸标记修饰位点，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
本发明在设计上述引物组时，首先对BCR、ABL1基因同源性进行了分析比较，进而找出对应断裂点及在M-bcr基因型中(BCR-ABL1融合基因P210亚型)完全特异，与m-bcr基因型(BCR-ABL1融合基因P190亚型)及μ-bcr基因型(BCR-ABL1融合基因P230亚型)没有重叠及交集的区域去设计上游引物及探针，而下游引物则设计在保守的ABL1基因序列中。由于M-bcr基因型完全特异性的区域范围及有效可用于设计引物的序列长度十分有限，因此本发明采用锁核酸技术，对探针引物做进一步的序列设计升级，通过锁核酸标记，提升检测探针的Tm值，使短片段寡核苷酸也能达到非常理想的灵敏度和特异性兼顾的目的。本发明中采用锁核酸(LNA)标记的M-bcr基因型检测探针具有17mer左右碱基长度，Tm值可升至63℃～64℃(常规情况下仅54℃左右)，这样具有更高灵敏度的短片段寡核苷酸探针也同时具备了高Tm值，改进后使低拷贝的BCR-ABL1融合基因M-bcr型模板的扩增特异性和灵敏度均得到显著提升。
优选地，所述荧光基团选自Cy5、HEX、VIC或FAM。
进一步优选地，所述荧光基团为FAM或VIC。
优选地，所述淬灭基团选自BHQ-1、Cy3或TAMRA。进一步优选地，所述淬灭基团为BHQ-1。
本发明还提供上述任一所述引物组在检测白血病患者中M-bcr基因型或在制备检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒中的应用。
一种检测白血病患者中M-bcr基因型的方法，包括如下步骤：
S1.提取白血病患者的RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述的RNA为模板，利用上述任一所述引物组进行一步法荧光定量PCR扩增反应；
S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则患者中存在M-bcr基因型，反之，则患者中不存在M-bcr基因型。
优选地，所述一步法荧光定量PCR扩增体系为20μM引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。
优选地，所述一步法荧光定量PCR扩增程序为50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。
本发明还提供一种检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒，所述试剂盒包含上述任一所述引物组。
优选地，所述试剂盒还包含PCR反应液、PCR反应酶系、M-bcr基因型阳性质控品阳性质控品以及阴性质控品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的检测引物组，包括一对引物和探针。本发明通过在M-bcr基因型完全特异的区域设计上游引物和探针，同时在检测探针特定的碱基位置采用锁核酸标记技术，将探针长度控制在15～18bp，比常规探针长度短30％左右，Tm值提升至63℃～64℃，在提高灵敏度的同时特异性也得到显著提升；本发明所述检测引物组可实现M-bcr基因型与m-bcr基因型的绝对分型，不会有假阳性扩增，同时其检测灵敏度达到1×101copies/mL，相当于可以稳定地达到每106个有核细胞中检出一个含BCR-ABL1融合基因M-bcr基因型的白血病细胞，不会有假阴性，能完全满足临床的低拷贝模板(106个有核细胞中含1个融合基因细胞)、快速检测、精确度和准确度高的要求。
附图说明
图1为BCR-ABL1融合基因M-bcr型样本重复性实验扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道。
图2为BCR-ABL1融合基因M-bcr型扩增特异性测试结果(每条曲线代表测试的一种样本)。
图3为BCR-ABL1融合基因m-bcr型阳性的临床样品RNA测试结果。
图4为BCR-ABL1融合基因M-bcr型阳性标准品浓度梯度的灵敏度扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的引物、探针组设计
先对BCR(SEQ ID NO.1)和ABL1(SEQ ID NO.2)基因同源性进行了分析比较，进而找出BCR-ABL1融合基因M-bcr型断裂点及特征性序列。确认好断裂点的位置和序列后，首先在BCR-ABL1融合基因M-bcr型完全特异性的区域(与m-bcr型及μ-bcr型没有重叠及交集的区域)设计上游引物及检测探针，在保守的ABL1基因序列中设计下游引物。同时引物设计的关键点还在于：应用锁核酸技术，对检测探针做进一步的序列设计升级；由于M-bcr型完全特异性的区域范围和可用于引物设计的有效序列十分有限，因此在检测探针特定的碱基位置采用锁核酸标记，通过锁核酸标记来提升检测探针的Tm值，使短片段寡核苷酸的检测探针也能达到非常理想的灵敏度和特异性兼顾的目的。本发明中采用锁核酸(LNA)标记的M-bcr型检测探针具有17mer左右碱基长度，可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。探针5’端与断裂点距离不要超过35mer，同时在设计时两条引物的GC含量要基本一致，这样可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。设计完成后，通过Oligo7.0软件分析上述3条寡核苷酸的二级结构，并通过NCBI的BLAST功能比对分析判断序列的特异性。初筛后再通过最终筛选验证试验，最终筛选得到如下所示引物组：
上游引物序列为5’-ctcgtgtgtgaaactccagac-3’；
下游引物序列为5’-actgggtccagcgagaaggtt-3’；
探针序列为5’-gGctCtaTggGtttCtg-3’，大写碱基为LNA修饰位点，5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ-1。
扩增体系为20μM引物1.0μL，20μM探针0.5μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。
反应程序为50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。
实施例2BCR-ABL1融合基因M-bcr型样本重复性实验
1、方法
选择一个BCR-ABL1融合基因M-bcr型阳性样本提取后的总RNA，分装后同时在一个反应板同时上机，同时设置空白对照，采用实施例1所述引物、探针组按照如下扩增条件重复测试10次，测试设备为ABI 7500；
扩增体系为20μM引物1.0μL，20μM探针0.5μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。
反应程序为50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。
其中，采用FAM标记BCR-ABL1融合基因M-bcr型，VIC标记内参基因。
2、结果
BCR-ABL1融合基因M-bcr型样本重复性实验扩增结果如表1和图1所示，BCR-ABL1融合基因M-bcr型(FAM通道)及内参(VIC通道)重复性样品检测结果均为阳性，CT值的变异系数均小于2％，而实验空白对照则均没有非特异性扩增。说明所述引物、探针组具有优良的重复性。
表1
样品编号 FAM(CT值) VIC(CT值)
1 23.24 17.33
2 23.07 17.18
3 23.15 16.94
4 22.98 17.15
5 22.86 17.23
6 23.19 17.17
7 23.23 16.83
8 23.05 17.21
9 22.91 17.08
10 23.04 17.11
平均值 23.07 17.13
SD 0.194 0.203
CV％ 1.125 1.136
实施例3特异性测试
1、慢病毒测试
取用病毒培养方法鉴定为PML-RARA、TLS-ERG、MLL-AF6、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1、FIP1L1-PDGFRA、E2A-HLF、DEK-CAN、MLL-ELL的慢病毒样本作为特异性测试样本，每种病毒均经过核酸纯化、采用实施例1所述检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的引物、探针组，反应体系和反应程序进行PCR荧光扩增并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因M-bcr型)。
十种慢病毒测试结果如图2所示，所有慢病毒特异性测试样本均无特异性扩增曲线，为典型的阴性扩增(图示中蓝色曲线为BCR-ABL1融合基因M-bcr型扩增曲线，绿色曲线为内参扩增曲线)。同时阳性质控品扩增曲线为正常S型典型扩增，阴性质控品为典型阴性扩增。表明本发明的检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的引物、探针组特异性强。
2、BCR-ABL1融合基因m-bcr型测试
取用10例m-bcr型阳性的临床样品RNA，采用实施例1所述检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的引物、探针组，反应体系和反应程序进行PCR荧光扩增并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因M-bcr型)。
10例m-bcr型阳性的临床样品RNA测试结果如图3所示，所有特异性测试样本均为典型的阴性扩增，表明本发明的检测BCR-ABL1融合基因M-bcr型的引物、探针组在测试另一相似基因亚型m-bcr型样本时能完全消除非特异性扩增干扰信号，实现M-bcr基因型与m-bcr基因型的绝对分型，不会有假阳性扩增。
实施例4灵敏度测试
1、方法
根据BCR-ABL1融合基因M-bcr型序列构建重组质粒，浓度为1×106copies/mL，然后用DEPC水梯度稀释到较低拷贝数1×105copies/mL、1×104copies/mL、1×103copies/mL、1×102copies/mL、1×101copies/mL，采用实施例1中所述引物、体系、程序进行BCR-ABL1融合基因M-bcr型阳性标准品浓度梯度的灵敏度扩增测试并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因M-bcr型)。
2、结果
灵敏度扩增测试结果如图4所述，每个标准品浓度梯度扩增的FAM与VIC双色在各浓度组均呈典型的阳性扩增，且扩增梯度明显，检测灵敏度低至1×101copies/mL，由于白血病患者白细胞数为1×107/ml以上，1×101copies/mL则相当于每106个白细胞细胞中检出一个拷贝，不会有假阴性，能完全满足临床的低拷贝模板(106个有核细胞中含1个融合基因细胞)、快速检测、精确度和准确度高的要求。
序列表
<110> 广州血康陆道培生物技术有限公司
<120> 一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒
<141> 2022-06-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1342
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
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tgctgctgcc catgaagcct ttgaaagccg ctgccaccac tctcagccgg tgctgacgag 180
tcagcagatc gagaccatct tcttcaaagt gcctgagctc tacgagatcc acaaggagtt 240
ctatgatggg ctcttccccc gcgtgcagca gtggagccac cagcagcggg tgggcgacct 300
cttccagaag ctggccagcc agttgggtgt gtaccgggcc ttcgtggaca actacggagt 360
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ctggtaccat gggcctgtgt cccgcaatgc cgctgagtat ctgctgagca gcgggatcaa 360
tggcagcttc ttggtgcgtg agagtgagag cagtcctggc cagaggtcca tctcgctgag 420
atacgaaggg agggtgtacc attacaggat caacactgct tctgatggca agctctacgt 480
ctcctccgag agccgcttca acaccctggc cgagttggtt catcatcatt caacggtggc 540
cgacgggctc atcaccacgc tccattatcc agccccaaag cgcaacaagc ccactgtcta 600
tggtgtgtcc cccaactacg acaagtggga gatggaacgc acggacatca ccatgaagca 660
caagctgggc gggggccagt acggggaggt gtacgagggc gtgtggaaga aatacagcct 720
gacggtggcc gtgaagacct tgaaggagga caccatggag gtggaagagt tcttgaaaga 780
agctgcagtc atgaaagaga tcaaacaccc taacctggtg cagctccttg gggtctgcac 840
ccgggagccc ccgttctata tcatcactga gttcatgacc tacgggaacc tcctggacta 900
cctgagggag tgcaaccggc aggaggtgaa cgccgtggtg ctgctgtaca tggccactca 960
gatctcgtca gccatggagt acctggagaa gaaaaacttc atccacagag atcttgctgc 1020
ccgaaactgc ctggtagggg agaaccactt ggtgaaggta gctgattttg gcctgagcag 1080
gttgatgaca ggggacacct acacagccca tgctggagcc aagttcccca tcaaatggac 1140
tgcacccgag agcctggcct acaacaagtt ctccatcaag tccgacgtct gggcatttgg 1200
agtattgctt tgggaaattg ctacctatgg catgtcccct tacccgggaa ttgacctgtc 1260
ccaggtgtat gagctgctag agaaggacta ccgcatggag cgcccagaag gctgcccaga 1320
gaaggtctat gaactcatgc gagcatgttg gcagtggaat ccctctgacc ggccctcctt 1380
tgctgaaatc caccaagcct ttgaaacaat gttccaggaa tccagtatct cagacgaagt 1440
ggaaaaggag ctggggaaac aaggcgtccg tggggctgtg agtaccttgc tgcaggcccc 1500
agagctgccc accaagacga ggacctccag gagagctgca gagcacagag acaccactga 1560
cgtgcctgag atgcctcact ccaagggcca gggagagagc gatcctctgg accatgagcc 1620
tgccgtgtct ccattgctcc ctcgaaaaga gcgaggtccc ccggagggcg gcctgaatga 1680
agatgagcgc cttctcccca aagacaaaaa 1710

Claims (6)

1.一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的引物组，其特征在于，包含如下所示的检测引物对和检测探针：
上游引物F：5’-ctcgtgtgtgaaactccagac-3’，
下游引物R：5’-actgggtccagcgagaaggtt-3’；
探针：5’-gGctCtaTggGtttCtg-3’，其5端’标记荧光基团，3’标记淬灭基团，其中，大写碱基为锁核酸标记修饰位点。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述荧光基团为Cy5、HEX、VIC或FAM。
3.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ-1、Cy3或TAMRA。
4.权利要求1～3任一所述引物组在制备检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒中的应用。
5.一种检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述引物组。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应液、PCR反应酶系、M-bcr基因型阳性质控品以及阴性质控品。
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