CN115044675B - 一种检测bcr-abl1融合基因亚型p190型的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测BCR‑ABL1融合基因亚型P190型的引物组及试剂盒。所述引物组包括一对引物和一条探针，探针采用锁核酸标记后进行PCR扩增后收集荧光信号，可明显提高检测的灵敏度和特异性；本发明的检测引物组可以实现每10⁶个有核细胞中检出一个含BCR‑ABL1融合基因亚型P190型的白血病细胞，且1小时内即可得到检测结果，从而满足白血病早期诊断、早期治疗的要求。

Description

一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，更具体地，涉及一种检测慢性髓性白血病和急性髓性白血病BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组及试剂盒。

背景技术

慢性髓性白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，绝大多数患者缓慢起病，早期常无症状，临床逐步出现乏力、食欲不振、腹部胀满、盗汗和体重降低，偶因体检发现白细胞计数增高或左上腹包块而作进一步检查。Ph染色体或bcr/abl融合基因为诊断必备条件。急性髓细胞性白血病(acutemyelogenous leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。本病占小儿白血病的30％。目前主要根据细胞形态学、免疫分型和遗传特征对急慢性髓性白血病进行综合诊断。

随着分子生物学技术的发展及对白血病分子遗传学的深入研究，已知白血病中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，涉及至少数十种融合基因，融合基因形成是白血病的发生和发展的重要机制，对相关融合基因检测，可以达到精准诊断的目的，同时融合基因的定性和定量分析还可以作为预后评估的有效手段，在形态学完全缓解的基础上，使诊断更加准确。

BCR-ABL1融合基因是t(9；22)(q34；q11)易位(Ph染色体)导致，是由位于22q11.21的BCR基因和位于9q34.1的ABL1基因分别断裂并融合形成。根据BCR基因的断裂位点不同，可分为m-BCR(P190)、M-BCR(P210)和u-BCR(P230)三种，正确诊断这三种亚型对后续临床治疗判定预后具有重要的指导作用。在90％～95％的慢性髓性白血病患者中可检测到BCR-ABL1(P190和P210型)融合基因，该融合基因同时也是急性髓性白血病的检测指标之一。

目前检测融合基因mRNA表达的方法有高通量转录组测序分析、Northern blot、荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR(qPCR)。A.高通量转录组测序分析可对细胞mRNA及非编码RNA进行整体测序分析，能够一次性分析已知的白血病相关融合基因及基因表达谱，但这样技术仅能用于科研，费用高昂、耗时极长，仅后续生物信息学分析就需一周时间，而且不能针对一个位点，是一种“大撒网”式技术，不能应用于临床快速检测。B.Northernblot采用琼脂糖凝胶电泳，在变性条件下将待检的RNA样品通过印迹转移至固相支持物如纤维素膜等上面，在用标记过的cDNA探针，根据碱基互补原则进行杂交后显影，显示强度可表明RNA在所测样本中的相对含量。缺点是灵敏度低、信号弱，纤维素膜显示后有高背景，影响判断。C.FISH是一种非放射性原位杂交技术，将cDNA片段标记上生物素等报告分子，通过杂交后报告分子与亲和素之间的免疫化学反应，在荧光显微镜下对待测RNA进行定性或定位分析。它的优点是定位准确、荧光信号强。缺点是杂交不能达到100％的效率，特别是在应用较短的cDNA探针时效率会明显下降，容易造成漏检，同时因为是通过荧光显微镜观察，主观性强，对操作人员的技术要求高，很难在医院大规模应用。实时荧光定量PCR(qPCR)具有快速、精准的检测融合基因的优点，同时随着技术的进步，对mRNA表达水平的检测不再局限于首先将其第一步逆转录反应转化为cDNA，再通过第二步荧光PCR反应检测其表达水平，而是直接通过一步法RT-PCR即可得到结果，一步法带来的进步和快捷可应用于临床快速检测。中国专利CN111876486A公开了一种用于同时检测BCR-ABL1三个亚型基因(P190、P210、P23)的多重PCR引物探针组合物，其采用的传统的Taqman探针，虽然是多重PCR，但针对P190亚型的最高检测灵敏度是仅为32copies/μL，即32000copies/mL；另外，中国专利CN113718021A公开了定量检测BCR-ABL1融合基因主要型(P210)和次要型(P190)的引物、探针及其试剂盒，其采用的依然也是传统的Taqman探针，且检测下限也只能达到500copies/mL，检测下限依然有待进一步提高。由于BCR-ABL1融合基因亚型P190型在病程早期表达量低，目前的技术灵敏度很难达到其检测下限，容易导致假阴性，同时由于BCR-ABL1融合基因亚型P210型与P190型在引物探针的可设计序列上有诸多重叠，致有效设计序列非常有限、检测结果的非特异性可能大大增加，容易导致假阳性，因此在BCR-ABL1融合基因分型引物探针的设计上，往往灵敏度和特异性不能同时兼得，上述专利CN111876486A和CN113718021A在扩增时也容易导致假阳性。因此，亟需针对BCR-ABL1融合基因亚型P190型检测，开发出灵敏度高、特异性强的分子诊断产品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组。

本发明的第二个目的在于提供检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的产品。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组，包括一对引物和一条探针；所述外引物的上游引物序列为5’-ttgtcgtgtccgaggccacca-3’，下游引物序列为5’-gaccctgaggctcaaagtcaga-3’；所述探针序列为5’-aaGacCggGcAgatcTg-3’，大写碱基为LNA修饰位点，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

本发明通过对BCR、ABL1基因进行分析，找出对应断裂点及亚型P190型完全特异性的区域(与P210及P230没有重叠及交集的区域)设计上游引物及探针，下游引物设计在保守的ABL1基因序列中。由于其完全特异性的区域范围和有效可设计序列十分有限，本发明特别应用到锁核酸技术，在PCR的基础上做进一步的序列设计升级，通过锁核酸标记，提升探针引物的Tm值，使短片段寡核苷酸也能达到非常理想的灵敏度和特异性兼顾的目的，本发明中P190亚型锁核酸(LNA)标记的17mer左右碱基长度的探针，Tm值可升至63℃至64℃(常规情况下仅54℃左右)，这样具有更高灵敏度的短片段寡核苷酸探针也同时具备了高Tm值，改进后使低拷贝的BCR-ABL1融合基因亚型P190型模板的扩增特异性和灵敏度均得到显著提升。

具体地，锁核酸是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力、强大的亲和力和杂交的稳定性。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：a.和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性，显著提升寡核苷酸的熔解温度(ΔTm＝3～8℃)；b.抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；c.高效的自动寡聚化作用。基于LNA以上的优点，本发明在探针设计阶段，将探针长度控制在15～18bp，在短片段寡核苷酸探针特定的碱基位置，标记LNA，在GC含量不变且碱基数不变甚至略少的情况下可提升其Tm值至63℃至64℃。

优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5中的任意一种。

优选地，所述淬灭基团选自TAMRA、Cy3、BHQ-1中的任意一种。

进一步优选地，所述荧光基团为FAM或VIC。

进一步优选地，所述淬灭基团为BHQ-1。

本发明还提供上述任一所述引物组在非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型或在制备检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的产品中的应用。

本发明还提供一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的产品，包含上述任一所述引物组。

优选地，所述产品还包含PCR反应液、PCR反应酶系、BCR-ABL1融合基因亚型P190型阳性质控品以及阴性质控品。

进一步优选地，所述产品为试剂盒。

本发明还提供上述任一所述产品在非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型中的应用。

一种非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的方法，包括如下步骤：

S1.提取样品RNA；

S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板，利用上述任一所述引物组进行一步法荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则判定样品中有BCR-ABL1融合基因亚型P190型，反之，则样品中不存在BCR-ABL1融合基因亚型P190型。

优选地，所述一步法荧光定量PCR扩增体系为20μM引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs25mM 0.6μL。

优选地，所述一步法荧光定量PCR扩增程序为50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组包括一对引物和一条探针，通过在短片段寡核苷酸探针特定的碱基位置采用锁核酸标记，将探针长度控制在15～18bp，比常规探针长度短30％左右，Tm值为63℃至64℃，在提高灵敏度的同时特异性也得到显著提升；本发明的检测引物组可有效区分BCR-ABL1融合基因亚型P190型与P210型，实现绝对分型，且检测灵敏度达到1×10¹copies/mL，相当于可以稳定地达到每10⁶个有核细胞中检出一个含BCR-ABL1融合基因亚型P190型的白血病细胞，能完全满足临床的低拷贝模板(10⁶个有核细胞中含1个融合基因细胞)、快速检测、精确度和准确度高的要求，同时成本较低。

附图说明

图1为BCR-ABL1融合基因亚型P190型样本重复性实验扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道。

图2为BCR-ABL1融合基因亚型P190型扩增特异性测试结果(每条曲线代表测试的一种样本)。

图3为BCR-ABL1融合基因亚型P210阳性的临床样品RNA测试结果。

图4为BCR-ABL1融合基因亚型P190型阳性标准品浓度梯度的灵敏度扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物、探针组设计

用DNAMAN软件对BCR(SEQ ID NO.1)和ABL1(SEQ ID NO.2)进行基因的同源性分析，找出BCR、ABL1基因对应融合基因亚型P190型断裂点及特征性序列并设计引物探针。确认好断裂点的位置和序列后，首先在特异性的区域(与P210及P230没有重叠及交集的区域)设计上游引物，下游引物设计在保守的ABL1基因序列中，然后在P210及P230没有重叠及交集的区域设计检测探针。发明的关键点体现在，由于其完全特异性的区域范围和有效可设计序列十分有限，本发明特别应用到锁核酸技术，在PCR的基础上做进一步的序列设计升级，通过锁核酸标记，提升引物的Tm值，使短片段寡核苷酸也能达到非常理想的灵敏度和特异性兼顾的目的，本发明中P190亚型锁核酸(LNA)标记的17mer左右碱基长度的探针，设计样可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。探针5’端与断裂点距离不要超过35mer，同时在设计时两条引物的GC含量要基本一致，这样可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。设计完成后，通过Oligo7.0软件分析上述3条寡核苷酸的二级结构，并通过NCBI的BLAST功能比对分析判断序列的特异性。初筛后再通过最终筛选验证试验，最终筛选得到如下所示引物组：

上游引物：5’-ttgtcgtgtccgaggccacca-3’；

下游引物：5’-gaccctgaggctcaaagtcaga-3’；

探针：5’-FAM-aaGacCggGcAgatcTg-BHQ-1-3’，大写碱基为LNA修饰位点。

扩增体系：20μM引物1.0μL，20μM探针0.5μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

反应程序：50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。

实施例2 BCR-ABL1融合基因亚型P190型样本重复性实验

选择一个BCR-ABL1融合基因亚型P190型阳性样本提取后的总RNA，分装后同时在一个反应板同时上机，并设置空白对照，采用实施例1所述引物、探针组重复测试10次，测试设备为ABI 7500，扩增程序如下：

A.扩增体系为20μM引物1.0μL，20μM探针0.5μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

反应程序为50℃15min；95℃10min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。

B.标记基团：FAM标记BCR-ABL1融合基因亚型P190型，VIC标记内参基因。

C.BCR-ABL1融合基因亚型P190型样本重复性实验扩增结果如表1和图1所示，

表1

D.重复性实验结论：

①BCR-ABL1融合基因亚型P190型(FAM通道，蓝色)及内参(VIC通道，绿色)重复性样品检测结果均为阳性，CT值的变异系数均小于2％，说明实施例1所述引物对和探针具有优良的重复性。

②实验空白对照均没有非特异性扩增。

实施例3特异性测试

1、取用病毒培养方法鉴定为PML-RARA、TLS-ERG、MLL-AF6、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1、FIP1L1-PDGFRA、E2A-HLF、DEK-CAN、MLL-ELL的慢病毒样本作为特异性测试样本，每种病毒均经过核酸纯化、采用实施例1所述检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物、探针组，反应体系和反应程序进行PCR荧光扩增并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因亚型P190型)。

十种慢病毒测试结果如图2所示，所有慢病毒特异性测试样本均无特异性扩增曲线，为典型的阴性扩增(图示中蓝色曲线为BCR-ABL1融合基因亚型P190型扩增曲线，绿色曲线为内参扩增曲线)。同时阳性质控品扩增曲线为正常S型典型扩增，阴性质控品为典型阴性扩增。表明本发明的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物、探针组特异性强。

2、取用10例BCR-ABL1融合基因亚型P210阳性的临床样品RNA，采用实施例1所述检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物、探针组，反应体系和反应程序进行PCR荧光扩增并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因亚型P190型)。

10例P210阳性的临床样品RNA测试结果如图3所示，所有特异性测试样本均为典型的阴性扩增，表明本发明的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物、探针组在测试另一基因亚型P210型样本时能完全消除非特异性扩增干扰信号。

实施例4灵敏度测试

根据BCR-ABL1融合基因亚型P190型序列构建重组质粒，浓度为1×10⁶copies/mL，然后用DEPC水梯度稀释到较低拷贝数1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL、1×10²copies/mL、1×10¹copies/mL，采用实施例1中所述引物、体系、程序进行BCR-ABL1融合基因亚型P190型阳性标准品浓度梯度的灵敏度扩增测试并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(BCR-ABL1融合基因亚型P190型)。

标准品浓度梯度的灵敏度扩增测试结果如图4所述，每个梯度扩增的FAM与VIC双色在各浓度组均呈典型的阳性扩增，且扩增梯度明显，检测灵敏度低至1×10¹copies/mL，由于白血病患者白细胞数为1×10⁷/ml以上，1×10¹copies/mL则相当于每10⁶个白细胞细胞中检出一个copy，能完全满足临床的低拷贝模板(10⁶个有核细胞中含1个融合基因细胞)、快速检测、精确度和准确度高的要求。

序列表

<110> 广州血康陆道培生物技术有限公司

<120> 一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组及试剂盒

<141> 2022-06-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1765

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ggggagatag gtaggagtag cgtggtaagg gcgatgagtg tgggccgggc gggagtgcgg 60

cgagagccgg ctggctgagc ttagcgtccg aggaggcggc ggcggcggcg gcggcagcgg 120

cggcggcggg gctgtggggc ggtgcggaag cgagaggcga ggagcgcgcg ggccgtggcc 180

agagtctggc ggcggcctgg cggagcggag agcagcgccc gcgcctcgcc gtgcggagga 240

gccccgcaca caatagcggc gcgcgcagcc cgcgcccttc cccccggcgc gccccgcccc 300

gcgcgccgag cgccccgctc cgcctcacct gccaccaggg agtgggcggg cattgttcgc 360

cgccgccgcc gccgcgcggg gccatggggg ccgcccggcg cccggggccg ggcctggcga 420

ggccgccgcg ccgccgctga gacgggcccc gcgcgcagcc cggcggcgca ggtaaggccg 480

gccgcgccat ggtggacccg gtgggcttcg cggaggcgtg gaaggcgcag ttcccggact 540

cagagccccc gcgcatggag ctgcgctcag tgggcgacat cgagcaggag ctggagcgct 600

gcaaggcctc cattcggcgc ctggagcagg aggtgaacca ggagcgcttc cgcatgatct 660

acctgcagac gttgctggcc aaggaaaaga agagctatga ccggcagcga tggggcttcc 720

ggcgcgcggc gcaggccccc gacggcgcct ccgagccccg agcgtccgcg tcgcgcccgc 780

agccagcgcc cgccgacgga gccgacccgc cgcccgccga ggagcccgag gcccggcccg 840

acggcgaggg ttctccgggt aaggccaggc ccgggaccgc ccgcaggccc ggggcagccg 900

cgtcggggga acgggacgac cggggacccc ccgccagcgt ggcggcgctc aggtccaact 960

tcgagcggat ccgcaagggc catggccagc ccggggcgga cgccgagaag cccttctacg 1020

tgaacgtcga gtttcaccac gagcgcggcc tggtgaaggt caacgacaaa gaggtgtcgg 1080

accgcatcag ctccctgggc agccaggcca tgcagatgga gcgcaaaaag tcccagcacg 1140

gcgcgggctc gagcgtgggg gatgcatcca ggccccctta ccggggacgc tcctcggaga 1200

gcagctgcgg cgtcgacggc gactacgagg acgccgagtt gaacccccgc ttcctgaagg 1260

acaacctgat cgacgccaat ggcggtagca ggcccccttg gccgcccctg gagtaccagc 1320

cctaccagag catctacgtc gggggcatga tggaagggga gggcaagggc ccgctcctgc 1380

gcagccagag cacctctgag caggagaagc gccttacctg gccccgcagg tcctactccc 1440

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gcgagggcgc cttccatgga gacgc 1765

<210> 2

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

agaagccctt cagcggccag tagcatctga ctttgagcct cagggtctga gtgaagccgc 60

tcgttggaac tccaaggaaa accttctcgc tggacccagt gaaaatgacc ccaacctttt 120

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gttgatgaca ggggacacct acacagccca tgctggagcc aagttcccca tcaaatggac 1140

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cgtgcctgag atgcctcact ccaagggcca gggagagagc gatcctctgg accatgagcc 1620

tgccgtgtct ccattgctcc ctcgaaaaga gcgaggtccc ccggagggcg gcctgaatga 1680

agatgagcgc cttctcccca aagacaaaaa 1710

Claims (10)

1.一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的引物组，其特征在于，包括一对引物和一条探针；所述引物的上游引物序列为5’-ttgtcgtgtccgaggccacca-3’，下游引物序列为5’-gaccctgaggctcaaagtcaga-3’；所述探针序列为5’-aaGacCggGcAgatcTg-3’，5端’标记荧光基团，3’标记淬灭基团，探针5’端起第3、6、9、11、16个碱基为LNA修饰位点。

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5中的任意一种。

3.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Cy3、BHQ-1中的任意一种。

4.权利要求1～3任一所述引物组在非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型或在制备检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的产品中的应用。

5.一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的产品，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述引物组。

6.根据权利要求5所述产品，其特征在于，还包含PCR反应液、PCR反应酶系、BCR-ABL1融合基因亚型P190型阳性质控品以及阴性质控品。

7.权利要求5或6所述产品在非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型中的应用。

8.一种非疾病诊断目的检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取样品RNA；

S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板，利用权利要求1～3任一所述引物组进行一步法荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则判定样品中有BCR-ABL1融合基因亚型P190型。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述一步法荧光定量PCR扩增体系为20μM引物 0.8μL，20μM探针 0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液 5μL，热启动酶2U，MMLV酶 100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述一步法荧光定量PCR扩增程序为50℃15min；95℃ 10min；95℃ 15sec，58℃45sec，45个循环。

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