CN115960997A - 基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及基于数字PCR平台检测c‑MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合及试剂盒，其中，引物探针组合包括用于扩增c‑MET基因的13、15号外显子区域的c‑MET突变型检测引物对和检测荧光探针MET‑13/15‑P2，其中，所述c‑MET突变型检测引物对包括：MET‑E13‑F4，其序列如SEQ ID NO:4所示；MET‑E15‑R2，其序列如SEQ ID NO:6所示；荧光探针MET‑13/15‑P2的序列如SEQ ID NO:10所示。本发明依托于数字PCR检测技术，具有低丰度检出率高、特异性强、灵敏度高等优点，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
目前对于c-MET基因外显子14跳跃突变的检测常采用的方法有直接测序法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交(FISH)。
直接测序法检测步骤包括PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、产物切胶回收纯化、上机测序等步骤，步骤繁琐，耗费时间长，虽然检测成本较低，但其灵敏度也比较低，且假阴性率高。荧光定量PCR法是通过设计特异的探针和引物，结合荧光PCR检测技术来检测血液、外泌体或肿瘤组织中MET基因14外显子跳跃缺失的检测，但目前市场上用于检测MET基因14外显子跳读突变的实时荧光定量PCR的试剂盒非常少，且灵敏度较低，如公告号为CN106282339A的中国发明专利所描述的，其最低可检测到的MET基因外显子14跳跃突变RNA为450个拷贝数，并且需要额外加入BLOCK引物来提高特异性。荧光原位杂交(FISH)技术检测MET基因跳突特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，结果判读主观性和专业性较强，临床应用不易推广。少数研究机构使用高通量测序的方法，如公告号为CN106834515A的中国发明专利所描述的，利用该DNA探针库对MET基因14外显子及相邻内含子进行富集及检测，可以发现是否存在MET14外显子剪接突变，该方法灵敏度高，可以同时检测几十甚至几百个肿瘤相关基因，但是操作复杂，后期数据处理繁琐，检测周期长且检测的成本昂贵，对于操作和判读技术的要求很高，临床实际应用中仍存在许多不足。
因此，关于数字PCR平台的c-MET基因定量检测方法十分值得研究。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术灵敏度低，无法精准定量等问题，提高检测的灵敏度和准确性，并可计算出突变频率，为c-MET基因14号外显子跳跃突变的定量检测提供了一种行之有效的新方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一方面，提供基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合，包括用于扩增c-MET基因的13、15号外显子区域的c-MET突变型检测引物对和检测荧光探针MET-13/15-P2，其中，所述c-MET突变型检测引物对包括：MET-E13-F4，其序列如SEQ ID NO:4所示；MET-E15-R2，其序列如SEQ ID NO:6所示；荧光探针MET-13/15-P2的序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一实施方式中，用于扩增c-MET基因的14、15号外显子区域的c-MET野生型检测引物对和检测荧光探针MET-14/15-P1，所述c-MET野生型检测引物对包括：MET-E14-F4，其序列如SEQ ID NO:14所示；MET-E15-R1，其序列如SEQ ID NO:5所示；荧光探针MET-14/15-P1的序列如SEQ ID NO:15所示。
在本发明的一实施方式中，荧光探针MET-13/15-P2的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团MGB。
在本发明的一实施方式中，荧光探针MET-14/15-P1的5’端标记有荧光基团VIC，3’端标记有淬灭基团MGB。
本发明的第二方面，提供基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，包含有上述的用于扩增c-MET基因的13、15号外显子区域的c-MET突变型检测引物对和检测的荧光探针MET-13/15-P2。
在本发明的一实施方式中，试剂盒中还包括有用于扩增c-MET基因的14、15号外显子区域的c-MET野生型检测引物对和检测的荧光探针MET-14/15-P1。
在本发明的一实施方式中，试剂盒中还包括有阳性对照样品和/或阴性对照样品。
本发明的第三方面，提供基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括如下步骤：
S-1.提取样品RNA；
S-2.以RNA为模板，利用上述的引物对MET-E13-F4、MET-E15-R2，引物对MET-E14-F4、MET-E15-R1，荧光探针MET-13/15-P2，荧光探针MET-14/15-P1进行数字PCR扩增；
S-3.对扩增结果进行分析，判定c-MET基因14号外显子是否发生跳跃突变，若发生突变，计算突变频率。
突变频率计算公式如下：
突变频率＝Exon13/15拷贝数/(Exon13/15拷贝数+Exon14/15拷贝数)。
本发明的上述检测方法，操作简便，检测灵敏，准确度好，特异性好，定量结果可观，且实验过程仅需3小时。
综上，本发明以c-MET基因14号外显子跳读做为检测对象，通过特异性的引物以及荧光探针的组合，并对引物序列进行了优化。与此同时，还建立了野生型c-MET基因的检测，该体系的建立有助于质控样本质量，并且计算样本突变频率。该技术依托于数字PCR检测技术，具有低丰度检出率高、特异性强、灵敏度高等优点，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。
附图说明
附图1为不同突变引物探针组合检测的荧光分布图；
附图2为不同野生型引物探针组合的荧光分布图；
附图3为临床样本检测荧光分布图；
附图4为准确性参考品检测结果。
具体实施方式
结合以下具体实施，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括于本发明中，并且以所附的权利要求书保护范围为准。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
c-MET基因14号外显子跳读的数字PCR检测方法建立
一、临床样本RNA提取
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性临床样本1例(P1107529)，阴性临床样本3例(P0112491、P0112806、P1124104)，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7。
二、引物探针的设计合成
1.引物探针设计
采用Primer Express 3.0.1设计本技术的引物探针。首先，在c-MET基因13号外显子区域设计上游引物4条，在15号外显子区域设计下游引物4条，探针位置跨越13号外显子和15号外显子，荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB。与此同时，在c-MET基因14号外显子区域设计上游引物4条，探针位置跨越14号外显子和15号外显子，荧光基团为VIC，淬灭集团为MGB，作为内参检出c-MET野生型，用于样本质控以及突变频率的计算。各引物探针序列见下表1。
表1引物探针序列表
2.引物探针优化
2.1荧光PCR筛选
将不同的上下游引物进行组合测试，模板采用1例阳性临床样本(P1107529)和一例阴性样本(P0112491)，扩增试剂为艾科瑞的Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit(Probe)(UDG Plus)(货号：AG11704)，PCR扩增条件为25℃10min(UDG酶处理条件)，逆转录42℃5min，95℃预变性30sec，95℃变性5sec、60℃退火34sec、45个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪。检测结果见下表2、表3。最终根据Ct值、荧光强度、特异性的检测，筛选出6组突变检测的引物组合(表4)，以及1组野生型检测的引物探针组合(表4)，进行数字PCR的筛选。
表2不同突变引物探针组合的检测结果
表3不同内参引物探针组合的检测结果
表4荧光PCR平台初筛后引物探针组合
2.2数字PCR筛选
将2.1中筛选得到的6组突变检测引物探针组合，及1组野生型检测引物探针组合在数字PCR上进行测试。模板采用1例阳性临床样本(P1107529)和一例阴性样本(P0112491)。扩增试剂为新羿的一步法probe RT-dPCR试剂盒(货号23303)，其余数字PCR相关耗材包括新羿样本制备通用试剂盒(微流控生物芯片法)(货号10001)、微液滴检测通用试剂盒(货号10002)。
(1)体系配置
按照表5进行体系配置：
表5数字PCR扩增体系
(2)液滴制备及扩增
用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据使用说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下表6：
表6数字PCR扩增条件
(3)检测结果：
PCR完毕后，使用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。检测结果见表7、表8、附图1、附图2。在附图1中，简写的13/15-F1R1P1是指上游引物MET-E13-F1、下游引物MET-E15-R1和探针MET-13/15-P1的组合，其它简写类推。
根据检测拷贝数及荧光分布图情况，最终确定c-MET检测体系见表9。
表7不同突变引物组合检测拷贝数结果
表8不同内参引物组合检测拷贝数结果
表9 c-MET基因14号外显子跳跃突变检测体系引物探针
实施例2
临床样本的检测验证检测体系的特异性
一、临床样本RNA提取
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性临床样本1例(P1105997)，阴性临床样本1例(P1109778)，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7。
二、数字PCR检测
选用表9的引物探针，按照表5进行体系配置，按照表6进行PCR扩增。PCR完毕后，使用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。检测结果见下表10和附图3。
表10临床样本检测拷贝数结果
结果表明，本体系检测结果与理论相符，两例样本均有VIC信号，说明样本质量没有问题且有c-MET基因表达，此外，阴性样本FAM拷贝数为0，阳性样本FAM拷贝数为4123.9，说明该体系可准确区分阴阳性样本，特异性较好。
实施例3
检测体系准确度测试
一、细胞系RNA提取
采用康为固定组织RNA提取试剂盒抽提c-MET突变阳性细胞系H596，阴性细胞系PC-9，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7。
二、准确性参考品的制备
将阳性细胞系H596细胞系RNA稀释到50ng/μL,阴性细胞系PC-9RNA稀释到30ng/μL。使用本技术的检测体系对50ng的阳性细胞系进行拷贝数定量(实验结果：50ng阳性细胞系拷贝数为62801.8copies)，然后根据该结果配置c-MET突变准确性参考品(500copies/30ng、200copies/30ng、100copies/30ng、75copies/30ng、50copies/30ng)，参考品背景为30ng野生型PC-9细胞系RNA。
三、数字PCR检测
选用表9的引物探针，按照表5进行体系配置，按照表6进行PCR扩增。PCR完毕后，使用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。检测结果见下表11，附图4。
表11准确性参考品拷贝数检测结果
| 数字PCR检测结果 | 500cp/30ng | 200cp/30ng | 100cp/30ng | 75cp/30ng | 50cp/30ng |
| FAM拷贝数 | 505 | 253.3 | 93.5 | 72.5 | 56 |
| VIC拷贝数 | 13078 | 13254.5 | 12589.1 | 12987.6 | 13879.7 |
结果表明，检测结果与理论值相符，说明本体系准确度较高，体系较稳定。
Claims (10)
1.基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合，其特征在于，包括c-MET突变型检测引物对荧光探针MET-13/15-P2，其中，所述c-MET突变型检测引物对包括：MET-E13-F4，其序列如SEQ ID NO:4所示；MET-E15-R2，其序列如SEQ ID NO:6所示；荧光探针MET-13/15-P2的序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括c-MET野生型检测引物对和荧光探针MET-14/15-P1，所述c-MET野生型检测引物对包括：MET-E14-F4，其序列如SEQID NO:14所示；MET-E15-R1，其序列如SEQ ID NO:5所示；荧光探针MET-14/15-P1的序列如SEQ ID NO:15所示。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，荧光探针MET-13/15-P2的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团MGB。
4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，荧光探针MET-14/15-P1的5’端标记有荧光基团VIC，3’端标记有淬灭基团MGB。
5.基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有阳性对照样品和/或阴性对照样品。
7.非治疗与诊断目的的检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括如下步骤：
S-1.提取样品RNA；
S-2.以RNA为模板，利用上述的引物对MET-E13-F4、MET-E15-R2，引物对MET-E14-F4、MET-E15-R1，荧光探针MET-13/15-P2，荧光探针MET-14/15-P1进行数字PCR扩增；
S-3.对扩增结果进行分析，判定c-MET基因14号外显子是否发生跳跃突变，若发生突变，计算突变频率。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S-2中的扩增体系为：
。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S-2中的扩增条件为：
。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，突变频率计算公式如下：突变频率=Exon13/15拷贝数/( Exon13/15拷贝数+ Exon14/15拷贝数)。
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